一種豬瘟疫苗感染性cDNA及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用反向遺傳操作獲得一種豬瘟弱毒疫 苗C株感染性cDNA克隆，同時(shí)涉及該感染性cDNA克隆在構(gòu)建高效價(jià)重組豬瘟活疫苗和豬 瘟疫苗載體中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬瘟是豬的一種傳染性極強(qiáng)的病毒性疾病，早期稱為豬霍亂（HogCholera，HC)， 可感染各種年齡豬，一年四季流行，發(fā)病率和死亡率均很高，危害巨大。豬瘟的病原體是豬 癌病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV)，在國(guó)際獸疫局（0IE)制定的《國(guó)際動(dòng)物衛(wèi) 生法典》中，豬瘟被列入A類16種法定報(bào)告的傳染病之一。我國(guó)近年來(lái)豬瘟頻發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè) 造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，妨礙了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和出口貿(mào)易。加強(qiáng)對(duì)豬瘟的有效防控，是促進(jìn)養(yǎng)豬 業(yè)健康發(fā)展、提高養(yǎng)殖效益和讓國(guó)民吃上放心肉的必然要求；發(fā)展高效的豬瘟控制技術(shù)和 疫苗制品，提升豬瘟防控水平是科技工作的重大課題。
[0003]CSFV基因組為長(zhǎng)約12. 3kb的單股正鏈RNA，由5'末端非編碼區(qū)（5'Untranstaled 1'叩1〇11，5'^'1〇、一個(gè)大的開放閱讀框架（01^)和3'末端非編碼區(qū)（3'^'1〇構(gòu)成。01^編碼 一個(gè)由3898個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白，多聚蛋白在翻譯過程中或翻譯后，被病毒自身 編碼的蛋白酶和宿主細(xì)胞的蛋白酶加工成12種成熟蛋白質(zhì)，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白C、Ems、El、 ￡2和8種非結(jié)構(gòu)蛋白『。、？7、呢2、呢3、呢44、548、呢5八和呢58。其中41:'￡1和￡2嵌入 脂質(zhì)雙層膜中，在病毒粒子表面形成突觸，介導(dǎo)病毒的吸附與入侵，是CSFV毒力相關(guān)因子 和保護(hù)性抗原蛋白。E2常以同源二聚體或E1E2異源二聚體存在于病毒粒子和宿主細(xì)胞的 表面；CSFV感染豬體能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Ems和E2抗體，對(duì)豬體再次感染豬瘟有保護(hù)作用。
[0004] 豬瘟疫苗接種是預(yù)防和控制豬瘟的最有效方法。早在1951年，我國(guó)研究人員篩選 出免疫原性優(yōu)良的CSFV石門毒株（殷震，1997)，該毒株作為中國(guó)CSFV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株沿用至 今。當(dāng)時(shí)使用CSFV石門毒株，滅活制成豬瘟結(jié)晶紫甘油滅活疫苗，使用后迅速控制了我國(guó) 的豬瘟疫情。1954-1956年間，中國(guó)獸藥監(jiān)察所等單位的研究人員將CSFV強(qiáng)毒株（其中包括 標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒石門株）適應(yīng)家兔，在兔體內(nèi)連續(xù)傳代，選育出一株對(duì)豬基本無(wú)毒力，并保持CSFV 免疫原性的兔化毒株，即中國(guó)豬癌兔化弱毒疫苗株（hogcholeralapinizedvaccine, HCLV)，簡(jiǎn)稱豬瘟疫苗C株。豬瘟兔化弱毒疫苗的成功研制和應(yīng)用，對(duì)我國(guó)豬瘟的預(yù)防和控 制起了決定性作用。然而，豬瘟兔化弱毒疫苗60年來(lái)的廣泛使用，并未控制豬瘟的發(fā)生。盡 管疫苗的接種劑量和免疫次數(shù)增加，不僅沒有根除豬瘟，近年來(lái)，我國(guó)豬瘟的發(fā)生出現(xiàn)了許 多新特點(diǎn)，表現(xiàn)為從頻發(fā)的大流行轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)律的散發(fā)流行；臨床癥狀從典型變?yōu)榉堑湫?豬瘟，病毒毒力降低，病程由急性、亞急性轉(zhuǎn)變?yōu)橐月詾橹?，出現(xiàn)持續(xù)感染、胎盤感染、母 豬繁殖障礙以及新生仔豬的先天性感染等。豬瘟疫苗株在細(xì)胞中增殖滴度不高、制備高效 價(jià)疫苗困難是導(dǎo)致疫苗保護(hù)效力低下和豬瘟防控困難的重要原因之一。豬瘟的發(fā)生、傳播 和流行是嚴(yán)重制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展、增加農(nóng)民收入和發(fā)展國(guó)際貿(mào)易的瓶頸。
[0005] 為滿足我國(guó)預(yù)防、控制和最終根除豬瘟的需要，研制新一代高效價(jià)豬瘟疫苗制品， 提高豬瘟疫苗免疫保護(hù)效力，勢(shì)在必行。此外，提高豬瘟疫苗細(xì)胞生長(zhǎng)滴度也是降低疫苗生 產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)成本、提高疫苗質(zhì)量和效益的根本保證。
[0006] 另一方面，CSFV感染引起豬體的免疫抑制，感染CSFV的豬體更容易發(fā)生圓環(huán)病 毒、豬繁殖和呼吸綜合癥病毒、乙型腦炎病毒等的混合感染，導(dǎo)致豬死亡率更高，危害更加 巨大?；谪i瘟活疫苗載體表達(dá)其他病原保護(hù)性抗原蛋白構(gòu)建雙價(jià)疫苗，能同時(shí)防控豬瘟 及相關(guān)豬病，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的首要目的是提供一種豬瘟疫苗的全長(zhǎng)感染性cDNA，該全長(zhǎng)感染性cDNA 包含了豬瘟疫苗種毒全長(zhǎng)cDNA、在該cDNA5'末端融合豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子，在cDNA 3'插入鼠RNA聚合酶I終止子；
[0008] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供豬瘟疫苗C株的全長(zhǎng)感染性cDNA，該全長(zhǎng)感染性cDNA包 含了豬瘟疫苗C株全長(zhǎng)cDNA、在該cDNA5'末端融合豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子（GenBank No.L31782. 1)，其序列為SEQIDNO:1 ;在cDNA3'插入鼠RNA聚合酶I終止子，其序列為 SEQIDNO：2 ；
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種構(gòu)建上述豬瘟疫苗C株的全長(zhǎng)感染性cDNA克隆 的方法，包括：
[0010] 1)以豬瘟疫苗C株RNA為模板，應(yīng)用根據(jù)豬瘟疫苗C株全長(zhǎng)基因組序列（Genbank No.AF091507)設(shè)計(jì)合成的6對(duì)特異性PCR擴(kuò)增引物（SEQIDNO:3-14)，采用RT-PCR，獲得 豬瘟疫苗C株全長(zhǎng)基因組6個(gè)cDNA片段（CSf1-6);
[0011] 2)將所擴(kuò)增的PCR片段采用限制性內(nèi)切酶消化、T4連接酶連接的策略，克隆到質(zhì) 粒載體中；
[0012] 3)豬瘟疫苗C株感染性cDNA克隆質(zhì)粒的構(gòu)建：
[0013] (1)構(gòu)建5'端半長(zhǎng)基因組大片段：即將片段CSfl、CSf2和CSf3依次連接到低拷 貝質(zhì)粒PACNR1180 (由N.Ruggli和J.D.Tratschin博士贈(zèng)送），構(gòu)建pA-CSf123;
[0014] (2)構(gòu)建3'端半長(zhǎng)基因組大片段：即將片段CSf4、CSf5和CSf6依次連接到低拷 貝質(zhì)粒PACNR1180,構(gòu)建pA-CSf456;
[0015] (3)構(gòu)建融合豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子的豬瘟疫苗5 '末端的重組質(zhì)粒 pSPI-CSfl23；
[0016]A).豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子（pSPolI)片段制備：根據(jù)豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子序列 (GenBankNo.L31782. 1)設(shè)計(jì)啟動(dòng)子片段PCR擴(kuò)增引物（SEQIDN0:15-16)，以豬源PK-15 細(xì)胞的DNA為模板，擴(kuò)增豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子，采用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，測(cè)序 確證，-70°C保存?zhèn)溆茫?br>[0017]B).豬瘟疫苗C株5 '末端784bp片段擴(kuò)增：構(gòu)建豬瘟疫苗cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì) PCR引物（SEQIDN0:17-18)，擴(kuò)增基因組Y末端784bp片段，以pA-CSfl23重組質(zhì)粒為 模板，采用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，測(cè)序確證，-70°C保存?zhèn)溆茫?br>[0018]C).pACNR1180載體骨架片段擴(kuò)增：根據(jù)pACNR1180載體序列（SEQIDN0 :19)設(shè) 計(jì)擴(kuò)增引物（SEQIDN0 :20-21)，以pA-CSf123重組質(zhì)粒為模板，獲得pACNR1180載體片段 PCR產(chǎn)物，采用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，測(cè)序確證，-70°C保存?zhèn)溆茫?br>[0019] D).融合豬瘟疫苗C株5'末端和豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子的PACNR1180載體骨 架片段擴(kuò)增：以上述制備的豬瘟疫苗C株5'末端784bp片段、豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子和 PACNR1180載體片段混合物為模板，以SEQ ID N0 :20為上游引物、SEQ ID N0 :18為下游引 物，PCR擴(kuò)增獲得融合豬瘟疫苗5'末端和豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子的pACNR1180載體骨架片 段PCR產(chǎn)物A-SPI-CS-5'，采用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，測(cè)序確證，-70°C保存?zhèn)溆茫?br>[0020] E).融合豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子的豬瘟疫苗5'末端重組質(zhì)粒PSPI-CSH23構(gòu)建： 分別用限制性內(nèi)切酶Pmll和Mlul雙酶切消化質(zhì)粒pA-CSfl23和A-SPI-CS-5' DNA片段， DNA回收試劑盒純化制備A CSfl23和A-SPI-CS-5'片段，兩種片段按1:2混合，T4DNA連 接酶連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序確證得到PSPI-CSH23 ;
[0021] (4)構(gòu)建融合鼠RNA聚合酶I終止子〇\)的豬瘟疫苗3'末端重組質(zhì)粒 pA-CSf456-TI:
[0022] 根據(jù)鼠RNA聚合酶I終止子序列（SEQIDNO:2)和豬瘟疫苗C株3'末端序列， 設(shè)計(jì)合成融合鼠終止子序列的長(zhǎng)序列引物（SEQIDN0:9、22)，以重組質(zhì)粒pA-CSf456為模 板，通過PCR獲得融合鼠RNA聚合酶I終止子的豬瘟疫苗3'末端PCR產(chǎn)物05€456-1'1片 段；
[0023] 分別用限制性內(nèi)切酶SphI和Mlul雙酶切消化質(zhì)粒pA-CSf456和03€456-1'1片 段，DNA回收試劑盒純化制備雙酶切粘性末端的線性化pA-CSf456和CSfASe-t片段，兩 種片段按1:3-1:10摩爾比例混合，T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序確證得到 pA-CSf456-TI；
[0024] (5)基于豬RNA聚合酶I啟動(dòng)子（pSPolI)和鼠RNA聚合酶I終止子〇\)的豬瘟 疫苗感染性cDNA克隆pASPITfCS構(gòu)建：
[0025] 將上述構(gòu)建的豬瘟疫苗5'末端大片段質(zhì)粒pSPI_CSfl23和3'末端大片段質(zhì)粒 pA-CSf456-TAv別用BamHI和Mlul雙酶切消化，回收線性化pSPI-CSf123和CSf456-T:片 段，兩者按4:1摩爾比例混合，T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆