專利名稱：一種豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
豬瘟(ClassicalSwine fever，簡(jiǎn)稱 CSF)又稱為豬霍亂(Hog cholera)或歐洲型 豬瘟(European swine fever)，是一種豬急性或超急性發(fā)熱的病毒傳染性疾病，臨床上的 特征是散播迅速、發(fā)燒，解剖檢驗(yàn)時(shí)可看到典型的出血病變。豬瘟可感染各種年齡的豬只， 一年四季流行，發(fā)病率和死亡率均高，對(duì)豬危害極大。本病是威脅養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之 一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為A類16種法定傳染病之一，中國(guó)則定為一類烈性 傳染病。許多國(guó)家和地區(qū)使用豬瘟活疫苗強(qiáng)制接種免疫，也是目前防治豬瘟的最佳方法。目前，我國(guó)生產(chǎn)豬瘟活疫苗效力檢測(cè)方法都是采用兔體反應(yīng)熱方法。不僅需要很 多試驗(yàn)大白兔，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且由于我國(guó)純系大耳白兔的逐漸減少和品系越來(lái)越雜，導(dǎo)致 現(xiàn)如今很難用兔體反應(yīng)熱來(lái)準(zhǔn)確檢測(cè)活疫苗的效力
發(fā)明內(nèi)容

鑒于此，本發(fā)明提供一種新的豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，具體地說(shuō)，通過(guò)用間接免 疫熒光(IFA)方法檢測(cè)活疫苗在傳代細(xì)胞中病毒含量來(lái)評(píng)價(jià)活疫苗的效力，替代傳統(tǒng)的兔 體反應(yīng)熱方法，以達(dá)到快速準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)出豬瘟活活疫苗效力的目的。本發(fā)明提供了一種豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，包括如下步驟(1)準(zhǔn)備傳代細(xì)胞將長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞，用EDTA-胰酶消化分散，得到傳代細(xì)胞懸液；(2)豬瘟活疫苗在傳代細(xì)胞中的病毒含量測(cè)定用細(xì)胞維持液將凍干豬瘟活疫苗回溶并稀釋，將活疫苗稀釋液和步驟(1)中細(xì)胞 懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立不接毒正常細(xì)胞對(duì)照；(3)間接免疫熒光(IFA)方法檢測(cè)步驟(2)所得細(xì)胞中病毒含量①將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)板孔內(nèi)液體，用PBS洗滌；②加入丙酮水溶液固定；③棄去丙酮水溶液，用PBS洗滌；④加入PBS稀釋的豬瘟陽(yáng)性血清(一抗)；⑤棄去一抗，PBS洗滌；⑥加入PBS稀釋的FITC標(biāo)記兔抗豬IgG (二抗)；⑦棄去二抗，用PBS洗滌，最后加入PBS保存；⑧置于熒光顯微鏡下觀察熒光情況，判定豬瘟活疫苗效力。較佳的，步驟(1)中在細(xì)胞板中加入細(xì)胞懸液的同時(shí)，加入步驟(2)中經(jīng)稀釋的豬
瘟活疫苗液。較佳的，步驟(2)中所述豬瘟活疫苗稀釋是在0_8°C低溫環(huán)境下進(jìn)行。
較佳的，步驟(2)中培養(yǎng)箱是CO2培養(yǎng)箱，溫度為36-37°C，C02含量為2. 5% -5%, 培養(yǎng)時(shí)間為2-5天。較佳的，步驟(3)中PBS洗滌的次數(shù)為2-7次。較佳的，步驟(3)中丙酮水溶液溫度為0-8°C，濃度為30% -90 %。較佳的，步驟(3)中一抗的稀釋倍數(shù)選擇范圍為50-1000倍，二抗的稀釋倍數(shù)選擇 范圍為50-10000倍。優(yōu)選的，步驟(3)中一抗的稀釋倍數(shù)是400倍，二抗的稀釋倍數(shù)是500倍。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下技術(shù)效果1.檢測(cè)時(shí)間短，只需要3天，而通常用兔體感染劑量檢測(cè)至少需要11天。2.用細(xì)胞感染病毒，操作簡(jiǎn)單，成本低，不需要買大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)不需要專 人測(cè)定實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物體溫。3.利用細(xì)胞感染病毒，條件均一、穩(wěn)定，不會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異而引起的實(shí)驗(yàn)
結(jié)果差異顯著。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法1.準(zhǔn)備傳代細(xì)胞將長(zhǎng)滿單層的豬睪丸(ST)細(xì)胞(來(lái)源于ATCC，美國(guó)典型菌毒種保藏中心)，用 0. 25%的胰酶(含0. 02%的EDTA)消化分散后加入含3%胎牛血清的α -MEM細(xì)胞維持培 養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞板中，每孔100 μ 1。2.豬瘟活疫苗的稀釋本實(shí)施例制備了三批活疫苗，并分別測(cè)定了其抗原含量。豬瘟活疫苗的毒株為豬瘟兔化弱毒株(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏，保藏號(hào) AV1412)。將豬瘟兔化弱毒株接種ST細(xì)胞，將收獲的病毒抗原液配以適當(dāng)凍干保護(hù)劑制成 豬瘟活疫苗。用含3%胎牛血清的α-MEM細(xì)胞維持培養(yǎng)液將凍干豬瘟活疫苗回溶，在冰上 或其他可保持0-8°C的低溫環(huán)境中進(jìn)行10倍系列稀釋，取KT1-KT7稀釋度加入步驟1中的 細(xì)胞培養(yǎng)板的96孔板內(nèi)，每孔100 μ 1，每個(gè)稀釋度做8孔重復(fù)，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為36-37°C，CO2含量為2.5%-5%，培養(yǎng)時(shí)間為2-5天。優(yōu)選地，溫度為 37°C、CO2含量為5%、培養(yǎng)時(shí)間為3天，即可進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)判定毒價(jià)。同時(shí)，設(shè) 立不接毒正常細(xì)胞對(duì)照。具體步驟如下(1)棄去96孔板內(nèi)液體，用0. 01mol/L的PBS(pH值為7. 4)洗2-7次，每次3min， 最優(yōu)地，洗滌次數(shù)為3次，每次3min ；(2)加入溫度為0-8 °C的30% -90%丙酮水溶液，最優(yōu)地，80%的丙酮水溶液 IOOul/ 孔，4°C冰箱固定 30min ；(3)棄去丙酮，用0. 01mol/L的PBS (pH值為7. 4)洗2-7次，每次3min，最優(yōu)地，洗 滌次數(shù)為3次，每次3min;(4)加入用0. 01mol/L的PBS(pH值為7. 4)作50-1000倍稀釋的豬瘟陽(yáng)性血清 (一抗，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，最優(yōu)地，稀釋倍數(shù)為400倍，抗體含量5 μ g/ml，每孔100 μ 1，37°C 作用 60min ；(5)棄去一抗，用O.Olmol/L的PBS(pH值為7.4)洗2-7次，每次3min，最優(yōu)地，洗 滌次數(shù)為3次，每次3min;(6)加入用0. 01mol/L的PBS (pH值為7. 4)作50-10000倍稀釋的異硫氰酸熒光 素(FITC)標(biāo)記兔抗豬IgG (二抗，購(gòu)自Sigma公司)，最優(yōu)地，稀釋倍數(shù)為500倍，抗體含量 6μ g/ml，每孔 100 μ 1，37°C 作用 60min ；(7)棄去二抗，用0. 01mol/L的PBS (pH值為7. 4)洗滌3次，每次lOmin，最后加入 0. 01mol/L 的 PBS (pH 值為 7. 4)，每孔 50 μ 1 ；(8)置于熒光顯微鏡下觀察熒光情況，記錄熒光孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算 TCID50 結(jié)果；(9) IFA熒光判定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)立的不接毒正常對(duì)照細(xì)胞胞漿內(nèi)未出現(xiàn)特異黃綠色熒 光，而接毒的細(xì)胞板孔內(nèi)細(xì)胞胞漿內(nèi)可觀察到特異性的黃綠色熒光，判定為陽(yáng)性孔。觀察結(jié) 果如下表1。
表1間接免疫熒光(IFA)觀察結(jié)果 按照Reed-Muench法計(jì)算TCID50結(jié)果如下為表2所示。表2三批活疫苗的毒價(jià)測(cè)定結(jié)果 (1)活疫苗稀釋具體稀釋方法如下(每瓶疫苗按20頭份計(jì)算)I、II、III批疫苗，兩瓶?jī)龈梢呙缬蒙睇}水混合回溶至40ml，每頭份1ml，取其中 Iml回溶后的疫苗液分別加入5. 325ml,8. 290ml,6. 431ml生理鹽水，然后再依次進(jìn)行10倍 系列稀釋和5倍稀釋，最終將每批疫苗稀釋為病毒含量5TCID5(1/ml、lTCID5(1/ml、0. 2TCID50/ ml的疫苗使用液。具體操作如下取稀釋后疫苗液Iml加入9ml生理鹽水；取上步稀釋后疫苗液Iml加入9ml生理 鹽水；取上步稀釋后疫苗液Iml加入9ml生理鹽水；取上步稀釋后疫苗液2ml加入8ml生理 鹽水；取上步稀釋后疫苗液2ml加入8ml生理鹽水。(2)動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)
此項(xiàng)試驗(yàn)用39頭仔豬(豬瘟抗原抗體均為陰性、體重均勻、健康)，隨機(jī)分為 10組，攻毒對(duì)照組為3頭，免疫組每組4頭。每批疫苗分別免疫3組，免疫劑量分別為 0. 2TCID50/頭份、ITCID5q/頭份、5TCID5(1/頭份。免疫后14日，免疫組連同條件相同的對(duì)照 組一起注射IO5最小致死量(MLD)的豬瘟石門系血毒Iml (IO5MLD是指將豬瘟石門系血毒稀 釋IO5倍后給豬攻毒1ml，豬仍然死亡，是行業(yè)內(nèi)的攻毒標(biāo)準(zhǔn))。觀察16日，判定結(jié)果，如下 表3所示。根據(jù)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)毒價(jià)與攻毒保護(hù)之間的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)出最小免疫劑量。表3動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 攻毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，I、II、ΙΙΙ批豬瘟活疫苗(ST傳代細(xì)胞)分別稀釋到ITCID5tl/ ml，注射1ml，即可達(dá)到仔豬全數(shù)保護(hù)量。即3批活疫苗對(duì)豬瘟石門系強(qiáng)毒的最小免疫劑量 均為ITCID5tl/頭份。目前豬瘟疫苗國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均是以一頭份的疫苗稀釋3000倍后免疫豬仍 可以抵抗強(qiáng)毒攻擊，而根據(jù)本發(fā)明方法，當(dāng)檢測(cè)的豬瘟活疫苗效價(jià)大于等于IO3 5TCID5tl/頭 份時(shí)，稀釋3000倍后免疫豬，即能達(dá)到全數(shù)的保護(hù)效果，符合國(guó)家的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。因此，根據(jù) 本發(fā)明之方法，可以提出鑒定豬瘟活疫苗符合國(guó)家檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，本發(fā)明提供一種新的豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，具體地說(shuō)，通過(guò)用間接 免疫熒光(IFA)方法檢測(cè)活疫苗在傳代細(xì)胞中病毒含量來(lái)評(píng)價(jià)活疫苗的效力。該方法檢測(cè) 時(shí)間短，并且操作簡(jiǎn)單、成本低、得到的結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性好，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊 的市場(chǎng)前景。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于包括如下步驟(1)準(zhǔn)備傳代細(xì)胞將長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞，用EDTA-胰酶消化分散，得到傳代細(xì)胞懸液；(2)豬瘟活疫苗在傳代細(xì)胞中的病毒含量測(cè)定用細(xì)胞維持液將凍干豬瘟活疫苗回溶并稀釋，將活疫苗稀釋液與步驟(1)中細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立不接毒正常細(xì)胞對(duì)照；(3)間接免疫熒光(IFA)方法檢測(cè)步驟(2)所得細(xì)胞中病毒含量①將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)板孔內(nèi)液體，用PBS洗滌；②加入丙酮水溶液固定；③棄去丙酮水溶液，用PBS洗滌；④加入PBS稀釋的豬瘟陽(yáng)性血清(一抗)；⑤棄去一抗，PBS洗滌；⑥加入PBS稀釋的FITC標(biāo)記兔抗豬IgG(二抗)；⑦棄去二抗，用PBS洗滌，最后加入PBS保存；⑧置于熒光顯微鏡下觀察熒光情況，判定豬瘟活疫苗效力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于步驟(1)中在細(xì)胞 板中加入細(xì)胞懸液的同時(shí)，加入步驟(2)中經(jīng)稀釋的豬瘟疫苗液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于步驟(2)中所述豬 瘟活疫苗稀釋是在0-8 °C低溫環(huán)境下進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于步驟(2)中培養(yǎng)箱 是CO2培養(yǎng)箱，溫度為36-37°C，CO2含量為2. 5% _5%，培養(yǎng)時(shí)間為2-5天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于步驟(3)中PBS洗 滌的次數(shù)為2-7次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于步驟(3)中丙酮水 溶液溫度為0-8°C，濃度為30% -90%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法，其特征在于步驟(3)中一抗的 稀釋倍數(shù)選擇范圍為50-1000倍，二抗的稀釋倍數(shù)選擇范圍為50-10000倍。
全文摘要
本發(fā)明屬于獸藥生物新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬瘟活疫苗的效力檢驗(yàn)方法。通過(guò)用間接免疫熒光(IFA)方法檢測(cè)活疫苗的病毒含量來(lái)評(píng)價(jià)活疫苗的效力。該方法檢測(cè)時(shí)間短，并且操作簡(jiǎn)單、成本低、得到的結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性好，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101846683SQ20101021008
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進(jìn)忠, 張?jiān)S科 申請(qǐng)人:洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司