專利名稱：菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因及其重組蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌肽，具體涉及一種菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因及其重組蛋白、以及構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗菌肽是生物體內(nèi)存在的一種具有抗菌活性的小分子蛋白，氨基酸數(shù)目小于100， 常帶正電荷，并具廣譜抗菌性的一類小肽，是生物體免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性多肽活性物質(zhì)，具有廣譜抗菌作用，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、 真菌均有抑殺作用，還可以抗原蟲、病毒，殺傷動物體內(nèi)的腫瘤細胞，卻不破壞動物體內(nèi)的正常細胞?？咕目咕鷷r一般沒有特殊受體，直接通過物理作用造成細胞膜的穿孔而達到廣譜抗菌的效果，因而不會誘導(dǎo)抗藥株的產(chǎn)生，它屬于小分子多肽，在動物體內(nèi)容易降解，并且無毒副作用及藥物殘留問題，是綠色環(huán)保型藥物。根據(jù)抗菌肽序列、結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象以及抗菌特性的差異，通常將已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽分為以下四類(1)不含半胱氨酸的線型α螺旋抗菌肽，如蜂毒肽、蛙皮肽、天蠶抗菌肽等；( 含有二硫鍵的β折疊結(jié)構(gòu)，如防御素、昆蟲防御肽等；(3)由一種或多種氨基酸為主構(gòu)成的多肽，如富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)前體蛋白剪切而來的多肽，如淡水螯蝦O^cifastacus leniusculus)的血藍蛋白C-端酶解后可產(chǎn)生具有抗菌活性的多肽。在目前許多病原菌對現(xiàn)有抗生素逐步產(chǎn)生抗藥性，而新抗生素的發(fā)現(xiàn)極其困難的情況下，抗菌肽為開發(fā)新型的抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤藥物開辟了廣闊的前景。因此，抗菌肽的研究近年來倍受重視，已經(jīng)深入到分子結(jié)構(gòu)、作用機制、基因的表達與調(diào)控等方面。長期以來，抗菌肽的研究主要集中在昆蟲和高等動物上，少數(shù)的海洋動物抗菌肽的研究則主要集中于鱟、對蝦和幾種魚類上，貝類抗菌肽方面的研究起步則相對較晚。在海洋貝類中，貽貝的抗菌肽研究較為透徹，到目前為止，共發(fā)現(xiàn)了十余種富含半胱氨酸的抗菌肽，這些多肽在生理條件下均帶正電荷，而且具有典型的雙親性結(jié)構(gòu)。根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)和二硫鍵形成的不同形式，貽貝抗菌肽又可分為四種類型貽貝防御素(MGD)、貽貝素 (mytilins)、貽貝肽(myticins)和貽貝霉素(mytimycins)。目前國內(nèi)外關(guān)于菲律賓蛤仔抗菌肽及其抗菌活性的研究較少。趙建民等利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，體外重組表達菲律賓蛤仔大防御素(VpBD)蛋白，具有廣譜的抗革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因及其重組蛋白、以及構(gòu)建方法和應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因所述防御素Defensin B基因為序列表 SEQ ID NO. 1中堿基序列所示。一種菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因重組蛋白所述防御素Defensin B基因重組蛋白為序列表SEQ ID NO. 2中氨基酸序列所示。菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因重組蛋白的應(yīng)用所述防御素Defensin B基因重組表達產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。所述防御素Defensin B基因重組表達產(chǎn)物可作為制備革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的抑菌藥物。革蘭氏陽性菌為巴氏葡萄球菌或金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌或副溶血弧菌都。所述防御素 Defensin B基因重組表達產(chǎn)物可作為制備對惡臭假單胞菌或金黃色葡萄球菌的抑菌藥物。本發(fā)明所具有的優(yōu)點1.本發(fā)明從菲律賓蛤仔中克隆到防御素Defensin B的全長cDNA序列，實現(xiàn)其重組表達并測定其抗菌譜和最小抑菌濃度，為菲律賓蛤仔的病害防治、基因輔助選育及進一步開發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品和保鮮防腐劑奠定基礎(chǔ)。2.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的防御素Defensin B為菲律賓蛤仔抗菌肽，對海洋來源的多種革蘭氏陽性和陰性病原微生物均具有很強的抑制活性，具有開發(fā)為廣譜抗菌類藥物、遺傳選育和飼料添加劑等方面的應(yīng)用價值。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。本發(fā)明通過PCR技術(shù)，擴增編碼防御素Defensin B成熟肽的基因片斷并將其克隆到pET21(a)表達載體中，在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中實現(xiàn)了原核體外重組表達。本發(fā)明的菲律賓蛤仔防御素Defensin B cDNA序列克隆及其體外重組表達，包括下列步驟1)菲律賓蛤仔總RNA的提取及mRNA的純化；2)菲律賓蛤仔cDNA文庫構(gòu)建；3)菲律賓蛤仔cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定；4)菲律賓蛤仔EST序列的同源性分析及防御素基因片段的篩5)用基因特異性引物 DBF 5 ‘ AAGTGCTTCGGCAAATCCTCAG 3 ‘和 DBR 5' TTCAACACTAGGCCGTCTCC 3'進行3’和5’RACE克隆得到菲律賓蛤仔防御素Defensin B
cDNA全長序列；
6)菲律賓蛤仔防御素Defensin B的體外重組表達及其活性分析。
實施例1
菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因為SEQ ID No. 1中所示的堿基序列。
序列表SEQ ID No. 1為:
cataactgacgagtcaacaagttccaaaaaatgttcgcaaaagcatgctttgttttgttc
tttgtgtgtataatggttggaagtgcttcggcaaatcctcagaagagattaacttgtgag
tttggaggtgtccaggcatgtgccgctcactgtatcctgttaggttacactggtggatgg
tgcgacggtcataactactgtcattgcaagacgagtgggaaaagggaggcggagacggcc
tagtgttgaaatatcaagcagtcctgtatcatagaaatct3.3.3.3. 3. cagaacaaaa
agcattagaa
(a)序列特征
長度333bp (編碼區(qū) 31_243bp) 類型堿基序列 鏈型單鏈 拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)(f)特異性名稱cDNA菲律賓蛤仔中克隆到防御素Defensin B的cDNA序列，該序列全長33!3bp，5，非編碼區(qū)長30bp，3’非編碼區(qū)長90bp，有多聚腺苷酸尾巴。該基因包括21!3bp的開放閱讀框，編碼70個氨基酸，其中編碼序列的1-21位氨基酸為信號肽序列，成熟肽為49個氨基酸實施例2菲律賓蛤仔防御素Defensin B的制備一、菲律賓蛤仔總RNA的提取及mRNA的純化用Trizol試劑從感染鰻弧菌的菲律賓蛤仔的血淋巴中提取總RNA，提取方法依^witrogen公司的Trizol試劑說明書進行取菲律賓蛤仔血細胞50ml，2000g離心lOmin，棄上清，向沉淀細胞中加入20ml的 TRIZOL ,用高速分散器將細胞分散，室溫下劇烈震蕩IOs ；加入氯仿，劇烈震蕩30s ； 40C 10，OOOg高速離心IOmin ；吸取上清液于一個新離心管中，加入預(yù)冷的等體積異丙醇 (約15ml)，置于-20°C靜置1小時以上；4°C 10，OOOg高速離心IOmin ；小心棄去上清液；用 5ml 70%乙醇清洗沉淀；4°C 10，OOOg高速離心lOmin，小心棄去上清液；真空干燥5min，用約600 μ 1無RNA酶水溶解RNA，待完全溶解后儲存于_80°C備用。用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化，具體純化方法依QIAGENE公司的Ol igotex mRNA純化試劑盒說明書進行包括在37°C水浴加熱Oligotex Suspension，震蕩混勻，室溫放置；70°C水浴加熱OEB 緩沖液；向500 μ 1總RNA溶液(RNA含量約為^ig)中加入650 μ Iof OBB緩沖液，135 μ 1 of Oligotex Suspension，650y 1無RNA酶水，70°C加熱體系:3min ；取出反應(yīng)體系后，室溫下放置IOmin, 15，OOOg離心2min,小心吸走上清液，用600 μ 1 0W2重懸Oligotex-mRNA沉淀，劇烈震蕩。然后將懸濁液移入放在1.5ml離心管中的離心柱內(nèi)，15，OOOg離心1 min，將離心柱轉(zhuǎn)移到一個新的1. 5ml離心管中，加入600 μ 1 0W2，15，000g離心lmin，將進入離心管的液體丟棄，將離心柱轉(zhuǎn)移到另一新的1. 5ml離心管中；向離心柱中加入50 μ 1已經(jīng)加熱到 70°C 的 OEB buffer,輕輕混勻，15，OOOg 離心 Imin ；向 spin column 再加入 50 μ 1 OEB 緩沖液，混勻后15，OOOg離心Imin ；回收離心管中的mRNA溶液約100 μ 1。二、菲律賓蛤仔cDNA文庫構(gòu)建用Mratagene公司cDNA合成試劑盒將上述mRNA 逆轉(zhuǎn)錄并酶切為酶切片段，具體操作依試劑盒說明書進行包括雙鏈cDNA末端補平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內(nèi)切酶酶切等，用QIAGEN公司QIAEX II膠純化試劑盒對大于IOObp的酶切片段進行回收，并與hvitrogen公司Uni-ZAP )(R載體連接，得到 cDNA質(zhì)粒，并用 Mratagene 公司的 ZAP- cDNA Gigapack III Gold Cloning試劑盒對 cDNA質(zhì)粒進行噬菌體包裝、滴度測定和噬菌體文庫擴增，具體方法參照說明書進行，擴增后的文庫加入終濃度為的DMSO溶液，得到cDNA模板溶液，存于_80°C備用。
逆轉(zhuǎn)錄方法包括一鏈cDNA合成在無RNA酶的200μ 1離心管中依次加入5X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液10 μ 1與2. 5mM的dNTP 8. 5 μ 1，然后再加入30 μ 1多聚腺苷酸(poly (A))引物和RNA (5 μ g)，混勻后室溫下放置lOmin，向體系中加入1. 5 μ 1的一鏈合成酶Mratakript RT(50U/l·! 1)，終體積達到50 μ 1，輕輕混勻反應(yīng)體系，離心數(shù)s，42°C溫育1小時。二鏈合成在冰上依次向含有一鏈cDNA的離心管中加入IOX反應(yīng)緩沖液10 μ 1，27 μ 1無核酸酶去離子水。然后再向反應(yīng)體系中加入2μ 1核糖核酸酶H (RNase H) (1. 5U/μ 1)，11 μ 1 DNA 聚合酶I (9. OU/ μ 1)，輕輕混勻反應(yīng)體系，離心數(shù)s，16°C放置2. 5小時后立即將反應(yīng)體系置于冰上。補平cDNA末端向二鏈合成體系中加入需用反應(yīng)物(IOmM dNTP 6μ 1，T4DNA聚合酶2 μ 1與2 μ 1濃度為10mg/ml的BSA)，快速震蕩反應(yīng)體系離心后，于72°C反應(yīng)30min ；加入200 μ 1酚-氯仿[1 1 (ν/ν)]，震蕩混勻體系，室溫下高速離心2min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中；加入等體積的氯仿，震蕩混勻，室溫下高速離心aiiin，然后轉(zhuǎn)移上清至新管中； 加入下列試劑使cDNA沉淀，并震蕩體系20μ 1 3Μ醋酸鈉，400 μ 1無水乙醇，_20°C沉淀過夜；4°C高速離心60min，小心棄去上清，保留沉淀；加入500 μ 1的70%乙醇輕輕洗滌沉淀，室溫高速離心anin ；輕輕吸去乙醇，在真空離心機中干燥沉淀；用9μ 1含有EcoR I接頭的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30min。EcoR I接頭的連接向體系中加入下列成分 1 μ 1 IOX連接緩沖液，1 μ 1 IOmM rATP，1 μ 1 T4DNA連接酶GU/ μ 1)，離心后8°C放置過夜；70°C 30min滅活連接酶。磷酸化EcoR I末端離心反應(yīng)物k，室溫放置5min冷卻，加入下列反應(yīng)物用于磷酸化接頭1μ 1 IOX連接緩沖液，2μ 1 IOmM rATP，5 μ 1無菌水，2 μ 1 Τ4多聚核苷酸激酶(5U/ μ 1)，37°C溫育30min，70°C 30min滅活激酶，離心2s后室溫放置 5min冷卻。Bio I內(nèi)切酶酶切向體系中加入下列成分28μ 1 Xho I酶切緩沖液，3 μ 1 Xho Ι(40υ/μ 1)，37°C溫育1.5小時，加入125 μ 1的無水乙醇，_20°C放置過夜，4°C離心60min， 棄去上清，完全干燥沉淀，用50 μ 1雙蒸水溶解沉淀。溶解后的cDNA溶液用1. 0%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離。cDNA片段回收方法從濃度為1. 0%的瓊脂糖凝膠上將大于IOObp的cDNA條帶切下，將大約250mg的膠塊放入1. 5ml離心管中，加入相當(dāng)于3倍膠塊體積的QXl緩沖液充分混勻，而后向含有膠塊的QXl緩沖液中加入60 μ 1 QIAEX II，劇烈震蕩30s，充分混勻，以 50°C加熱lOmin，溶解膠塊；每^iin震蕩一次，保持溶液始終為黃色；13，OOOrpm離心30s， 小心吸去上清液；用500 μ 1 QXl緩沖液清洗沉淀，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30s并小心吸去上清液；用500 μ 1 PE緩沖液清洗沉淀2次，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30s，棄上清液，真空干燥15min至沉淀變白，加入20 μ 1 ρΗ8. 5的IOmM Tris-Cl溶液室溫下溶解5min。cDNA與載體Uni-ZAP XR(Invetrogen)連接在另一干凈的200 μ 1離心管中依次加入下列試劑2. 5μ 1重懸cDNA( > 100ng)，0. 5μ 1 10 X連接緩沖液，0. 5 μ 1 IOmM rATP (ρΗ7· 5)，1· 0 μ 1 Uni-ZAP XR 載體(1 μ g)，0. 5 μ 1 T4DNA 連接酶(4U/ μ 1)。12°C放置過夜。噬菌體文庫的包裝從-80°C冰箱中取出包裝蛋白，迅速用手握住融化，立即加入 4μ 1重組cDNA，用微量移液器吸頭混勻體系(不要產(chǎn)生氣泡)，離心5s，室溫(22°C )溫育 2小時，加入500 μ 1的SM緩沖液和20 μ 1氯仿，輕輕混勻反應(yīng)體系?？焖匐x心數(shù)s，沉淀蛋白碎片，轉(zhuǎn)移上清至新管中。包裝反應(yīng)的滴度測定在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基含有氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，pH7. 5)上將菌株XLl-Blue MRF’劃線37°C過夜培養(yǎng)；用LB液體培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基含有氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7. 5) 培養(yǎng)單克隆菌落，300C，200rpm搖床培養(yǎng)過夜；4°C，IOOOg下離心IOmin沉淀細菌。用25ml IOmM MgSO4重懸細菌；用IOmM MgSO4重懸XLl-Blue MRF，細胞，使?jié)舛冗_到OD600 = 0 . 5 ；將包裝產(chǎn)物按下列比例與宿主菌混合(1) 1 μ 1包裝產(chǎn)物和200 μ 1濃度達到OD6tltl = 0. 5大腸桿菌 XLl-Blue MRF’ (OD600 = 0 . 5) ； (2)0. 1 μ 1 包裝產(chǎn)物和 200 μ 1 濃度達到 0D_ = 0. 5 大腸桿菌XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5)；將混合體系置于37°C溫育15min使噬菌體充分附著在宿主細胞表面；加入3ml融化狀態(tài)下約48°C的NYZ上層培養(yǎng)基(1升培養(yǎng)基含有氯化鈉5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺IOg,酵母提取物5g，瓊脂糖7g，ρΗ7· 5)；迅速鋪在干燥預(yù)熱過的NYZ瓊脂培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基含有氯化鈉5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g， 瓊脂粉15g，pH7. 5)上，靜置IOmin后，倒置于37°C過夜培養(yǎng)；8小時后可見噬菌斑；分別計數(shù)兩個平板的噬菌斑數(shù)目，計算其滴度(每毫升生長的噬菌斑數(shù)目，Pfu/ml)。30°C 200rpm條件下，用LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)大腸桿菌XLl-Blue MRF，細胞 50ml ； IOOOg離心宿主細胞IOmin ；用25ml IOmM MgSO4重懸細胞，測定600納米可見光下菌液吸光度，然后用IOmM MgSO4將菌液稀釋至濃度為OD6tltl = 0. 5 ；將含有大約5X 104pfu噬菌體顆粒的懸濁液與600 μ 1濃度為OD6tltl = 0. 5的大腸桿菌XLl-Blue MRF，細胞混合，置于Falcon 2059聚丙烯管中，37°C溫育混合液15min，使噬菌體充分附著在宿主菌表面； 將混合液加入約48°C的6. 5ml液態(tài)NZY上層培養(yǎng)基中，混勻后倒入新鮮的150mm NZY瓊脂糖培養(yǎng)基平板上，靜置平板lOmin，倒轉(zhuǎn)平板置于37°C約8小時(噬菌斑直徑不超過2mm)； 在每塊平板上倒入大約10ml SM緩沖液(1升緩沖液中含有5. 8g NaCl, 2. Og MgS04 ·7Η20， 50. 0ml IM Tris-HCl [ρΗ7. 5], 5. Oml 2% [w/v]白明膠)，4°C放置過夜；將所有平板上的 SM 緩沖液回收入新的聚丙烯管中，每塊平板再用ani SM緩沖液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入終濃度為5% (ν/ν)的氯仿，室溫下放置15min，混勻，500g離心IOmin去除細胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新聚丙烯管中，并重復(fù)步驟8、9至上清液澄清，加入終濃度為7% (ν/ ν)的DMS0，儲存于-80°C。測定擴增文庫滴度(方法同前)。三、菲律賓蛤仔cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引物T3 (AATTAACCCTCACTAAAGGG)在MegaBACElOOO測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*. abi，*. abd文件)數(shù)據(jù)經(jīng)Phred程序處理轉(zhuǎn)化為序列文件(*. seq)和質(zhì)量文件(*. seq. qual)，依據(jù)質(zhì)量文件提供的數(shù)值確定獲得序列的誤差概率，去除低質(zhì)量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數(shù)據(jù)中的載體序列，從得到的數(shù)據(jù)中選取連續(xù)堿基質(zhì)量大于 Q13(準(zhǔn)確率大于95% )且長度大于IOObp的序列作為EST數(shù)據(jù)，具體的操作參照《基因表達序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)分析手冊》(胡松年著，浙江大學(xué)出版社，2005年)。四、菲律賓蛤仔EST序列的同源性分析及防御素基因片段的篩選將獲得的全部有效的EST數(shù)據(jù)進行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲的Contigs與 Singletons在數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn和BLASTx分析，具體的操作參照《基因表達序列標(biāo)簽 (EST)數(shù)據(jù)分析手冊》(胡松年著，浙江大學(xué)出版社，2005年)。根據(jù)相似性分析結(jié)果尋找出與防御素基因同源的EST序列。五、菲律賓蛤仔防御素Defensin B cDNA全長序列的克隆根據(jù)與防御素基因同源的EST序列設(shè)計基因特異性引物DBF 5 ‘ AAGTGCTTCGGCAAATCCTCAG 3 ‘和DBR 5 ‘ TTCAACACTAGGCCGTCTCC 3 ‘，分別利用載體通用引物 T3 (AATTAACCCTCACTAAAGGG)、 T7 (GTAATACGACTCACTATAGGGC)進行3’和5’末端的擴增，PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用膠回收試劑盒(上海中科開瑞生物芯片公司)進行PCR產(chǎn)物的回收和純化， 再與PMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，參照《分子克隆第三版》(黃培堂譯， 科學(xué)出版社，2002年)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10F，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，用載體引物 Ml3-47 (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)和 RV-M (GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)進行 PCR 檢測， 確認(rèn)插入片段大小后進行序列測定，測得的序列經(jīng)CLUSTER分析拼接后得到全長序列。3，RACE的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10XPCR buffer溶液2. 5μ 1、 25mM 的 MgCl2 溶液 1. 0μ 1、2. 5mM 的 dNTP 溶液 2. 0μ 1、10μΜ 的 DBF 弓| 物溶液 (5 ‘ AAGTGCTTCGGCAAATCCTCAG) 1 μ 1、10 μ M 的通用引物 T3 溶液 1 μ 1、濃度為 5U/ μ 1 的 Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1，cDNA模板(文庫)溶液1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1 ；反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5min，然后進入下列循環(huán)94°C變性 30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共進行；34個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；5，RACE反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10XPCR buffer 溶液 2. 5 μ l、25mM 的 MgCl2 溶液 1. 0μ 1、2. 5mM 的 dNTP 溶液 2. 0 μ 1、10 μ M 的 DBR 引物溶液(5 ‘ TTCAACACTAGGCCGTCTCC 3' )1.0μ IUOyM 的通用引物Τ7溶液1 μ 1、濃度為IU/ μ 1的Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1所述cDNA模板溶液1 μ 1， 用PCR水定容到25 μ 1，反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性 5min,然后進入下列循環(huán)94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共進行；34個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；PCR篩選陽性克隆的反應(yīng)條件2. 5μ 1 10XPCR緩沖液，1. 0 μ 1 MgCl 2 (2. 5mM)，2· 0 μ 1 dNTP (2. 5mM)，1 μ 1 弓丨物 Μ13-47 (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC) (10 μ Μ)， 1 μ 1 引物 RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG) (10 μ Μ)，16. 3 μ 1 PCR 水，0· 2 μ 1 (IU) Taq 聚合酶(!Iomega)，1 μ 1菌液模板。反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進行，反應(yīng)條件為首先94°C 預(yù)變性5min，然后進入下列循環(huán)94°C變性25s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共進行30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。六、菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因的的體外重組表達PCR擴增反應(yīng)的正向引物為含有Nde I酶切位點的核苷酸序列5，-CATATGAATCCTCAGAAGAGATTAAC-3，，反向引物為含》ιο I酶切位點和6個His純化標(biāo)簽的核苷酸序列5’ -CTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGT GGTGGGCCGTCTCCGCCTCCC-3，)；將擴增出的編碼防御素Defensin B成熟肽的基因片斷純化回收，導(dǎo)入PMD18-T載體，構(gòu)建亞克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10F感受態(tài)細胞中，篩選陽性亞克隆質(zhì)粒，提取陽性亞克隆質(zhì)粒，用Nde I和B10 I雙酶切亞克隆質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒對酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白的抗菌肽重組基因，測序該抗菌肽重組基因，將該抗菌肽重組基因?qū)虢?jīng)同樣雙酶切的表達載體pET-21 (a)，得到重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒構(gòu)建具體依《分子克隆第三版》操作方法。擴增反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性 5min,然后進入下列循環(huán)94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共進行30個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin ；將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達宿主菌BL21(DE3)plysS，(購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，篩選陽性重組質(zhì)粒，測序確認(rèn)，挑取單克隆重組質(zhì)粒，將單克隆重組質(zhì)粒接種于200ml LB液體培養(yǎng)基中，220rpm，37°C培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5-0. 7，加入IPTG，使終濃度達到 0. 6mM,繼續(xù)培養(yǎng)5h, 4°C，5000rpm,離心IOmin,收集菌液；
對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進行洗滌、溶解、鎳柱親和層析純化。最后對重組蛋白進行透析復(fù)性得到具有抗菌活性的重組蛋白，即本發(fā)明的菲律賓蛤仔防御素Defensin B。在收集的菌體沉淀中，加入適量的菌體裂解液(0. 5M NaCl, IOmM Tris-HCl, 0. 5% Triton X-IOOpH 8.5)重懸沉淀，超聲波處理，條件為300W，處理 200次，每次5s，間隔15s ；菌體裂解液在4°C下IOOOOrpm離心20min收集包涵體；包涵體沉淀分別用洗液 I (0. 5M NaCl，IOmM Tris-HCl, 0. 5% Triton X_100，2M 尿素 pH 8. 5)和洗液 11(0. 5M NaCl, IOmM Tris-HCl, 0. 5% Triton X-100，2%脫氧膽酸鈉 pH 8.5)洗滌一次后用8M尿素溶液(20mM PBS，0. 5M NaCl，8M尿素，20mM咪唑pH 7.4)溶解；經(jīng)鎳柱親和層析純化后的重組蛋白采用逐漸降低尿素濃度的方法進行透析復(fù)性，透析緩沖液成分如下 IOOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, ImM EDTA，2mM還原型谷胱甘肽，0. 02mM氧化型谷胱甘肽，10% 甘油，甘氨酸，尿素(6M，4M，3M，2M，0M)，pH 8.5?！ね肝鼍彌_液依次降低尿素的濃度，每次于4°C透析12小時，最后在TBS緩沖液(50mM Tris-HCl，IOOmM NaCl，pH 8. 5)中透析兩次。重組蛋白濃度測定采用碧云天生物公司的BCA法測定蛋白濃度試劑盒(P0012)。具體操作依試劑盒說明書進行根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B配制適量BCA工作液，充分混勻；完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 μ 1用PBS稀釋至100 μ 1，使終濃度為0. 5mg/ml ；將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12，16，20 μ 1加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，用PBS溶液補足到20 μ 1 ；加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中并用PBS補足到到20 μ 1 ；各孔加入 200 μ 1 BCA工作液，37°C放置30min ；測定A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。菲律賓蛤仔防御素Defensin B編碼蛋白具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，分子量為7511. 74Da，等電點為8. 16，其中編碼序列的1_21位為信號肽序列，成熟肽分子量為 5286. 96Da，等電點為7. 79，有4個凈正電荷。應(yīng)用例將上述得到菲律賓蛤仔防御素Defensin B加入試管中制成濃度為0. 46mg/mL 抗菌肽液共9管，分別接種巴氏葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌以及副溶血弧菌各5 μ 1，使每管最終菌液濃度約為 5 X 105CFU/ml，培養(yǎng)M小時后，利用酶標(biāo)儀測定600nm的光吸收值，確定MIC值，得到如表1 所示的結(jié)果，從表1中可以看出，菲律賓蛤仔防御素Defensin B對上述革蘭氏陽性菌(巴氏葡萄球菌和金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、副溶血弧菌)都有效，說明本發(fā)明的菲律賓蛤仔防御素Defensin B是一種廣譜抗菌肽，且療效較好。其中巴氏葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌 37°C培養(yǎng)；溶藻弧菌、惡臭假單胞菌以及副溶血弧菌培養(yǎng)。具體步驟調(diào)節(jié)各菌至OD6tltl為1后，稀釋1000倍備用。在96孔板中每孔中加入 100 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，再在每一行第一個孔中加入100 μ 1抗菌肽，混勻后從第一個孔中吸出100 μ 1加到第二個空中，混勻后吸出100 μ 1加到第三個孔中，依此類推，第10個孔中吸出的100 μ 1不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接種稀釋好的相應(yīng)菌種5 μ 1，第12 孔為只含培養(yǎng)基的對照。培養(yǎng)Mh以上，測定吸光值，并計算相應(yīng)MIC。最終發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔防御素 Defensin B對以上各種菌都有很強的抑制作用，其中對惡臭假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強，最小抑菌濃度分別為0. 014mg/mL和0. 029mg/mLo表1 菲律賓蛤仔防御素Defensin B抗菌素療效表
權(quán)利要求
1.一種菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因，其特征在于所述防御素Defensin B基因為序列表SEQ ID NO. 1中堿基序列所示。
2.一種菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因重組蛋白，其特征在于所述防御素 Defensin B基因重組蛋白為序列表SEQ ID NO. 2中氨基酸序列所示。
3.—種權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述防御素Defensin B基因重組表達產(chǎn)物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。
4.權(quán)利要求3所述的菲律賓蛤仔防御素DefensinB基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述防御素Defensin B基因重組表達產(chǎn)物可作為制備革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的抑菌藥物。
5.權(quán)利要求4所述的菲律賓蛤仔防御素DefensinB基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于革蘭氏陽性菌為巴氏葡萄球菌或金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌或副溶血弧菌都。
6.權(quán)利要求5所述的菲律賓蛤仔防御素DefensinB基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述防御素Defensin B基因重組表達產(chǎn)物可作為制備對惡臭假單胞菌或金黃色葡萄球菌的抑菌藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗菌肽，具體涉及一種菲律賓蛤仔防御素Defensin B基因及其重組蛋白、以及構(gòu)建方法和應(yīng)用。所述防御素Defensin B基因為序列表SEQ ID NO.1中堿基序列所示?；蛑亟M蛋白為序列表SEQ ID NO.2中氨基酸序列所示。本發(fā)明的防御素Defensin B為菲律賓蛤仔抗菌肽，對海洋來源的多種革蘭氏陽性和陰性病原微生物均具有很強的抑制活性，具有開發(fā)為廣譜抗菌類藥物、遺傳選育和飼料添加劑等方面的應(yīng)用價值。
文檔編號A61P31/04GK102363784SQ201110321040
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者吳惠豐, 張林寶, 王清, 趙建民 申請人:中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所