專利名稱：藍(lán)莓提取物用于預(yù)防阿爾茨海默病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域。具體涉及藍(lán)莓提取物對β -淀粉樣蛋白及同型半胱氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s Disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病。主要的臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，并伴隨各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。在我國65歲以上的老年人中患病率約為5%。AD的主要病理特征之一是在大腦皮層和海馬出現(xiàn)由β -淀粉樣蛋白(Αβ)聚積形成的老年斑(SP)。大量研究已經(jīng)表明，Αβ在AD的病中起著相當(dāng)重要的作用。Αβ的神經(jīng)毒性能引起氧化應(yīng)激，線粒體損傷，激活凋亡因子，啟動細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，臨床研究證明血漿中同型半胱氨酸水平增高可增加AD的發(fā)病率。因此，減少Αβ的生 成，抑制Αβ或同型半胱氨酸引起的神經(jīng)損傷是研究AD治療的熱點(diǎn)之一。目前治療AD的藥物主要是神經(jīng)營養(yǎng)藥、擬膽堿藥或膽堿酯酶抑制劑，均屬對證治療藥物，不能減緩AD病情的發(fā)展。藍(lán)莓(Vaccinium myrtillus L.)制劑現(xiàn)已廣泛用于各種保健品，可預(yù)防眼科及心血管方面的疾病。然而藍(lán)莓提取物對AD的預(yù)防作用還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為藍(lán)莓物用于預(yù)防海默病提供細(xì)胞水平的依據(jù)。發(fā)明人經(jīng)過多次藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)含25 %總花青素的藍(lán)莓提取物可有效對抗A β 25_35及同型半胱氨酸引起的細(xì)胞毒性，抵制細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3的表過。該藥理作用在本發(fā)明以前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。


圖1，和對照組比較，經(jīng)Αβ25_35處理后細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡特征表現(xiàn)為細(xì)胞核變小或破碎，熒光增強(qiáng)。藍(lán)莓提取物預(yù)處理可有效抑制A β25_35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。藍(lán)莓提取物對A β 25_35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響(Α :對照組，B Α β 25_35處理組，C :25 μ M藍(lán)莓提取物預(yù)處理組，D :50 μ M藍(lán)莓提取物預(yù)處理組)圖2，和對照組比較Αβ 25_35處理后PC12細(xì)胞caspase-3的表達(dá)顯著增高。藍(lán)莓提取物預(yù)處理可有效降低caspase-3的表達(dá)。藍(lán)莓提取物抑制A β 25_35誘導(dǎo)的caspase-3表達(dá)增高。
具體實(shí)施例方式細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含8%胎牛血清，8%馬血清的DMEM培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期的細(xì)胞以1Χ 104/100 μ I接種于96孔板，37°C培養(yǎng)24h。藥物處理藍(lán)莓提取物由香港東方保健品公司提供。細(xì)胞加入終濃度為0-50 μ M的藍(lán)莓提取物，培養(yǎng)24h以觀察藍(lán)莓提取物的細(xì)胞毒性。細(xì)胞先不同濃度的藍(lán)莓提取物預(yù)處理lh，再加入O. 5 μ M A β 25_35或5mM同型半胱氨酸繼續(xù)培養(yǎng)24h以觀察藍(lán)莓提取物對Aβ 25-35及同型半胱氨酸毒性的對抗作用。MTT細(xì)胞活力測定藥物處理后，去除培養(yǎng)液，每孔加入50 μ IMTT溶液(終濃度
O.5mg/ml)，37°C培養(yǎng) 4h 后，每孔加入 50 μ IMTT 裂解液(20% SDS, 50% DMFpH4. 7)，37°C 反應(yīng)過夜。酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞570nm的OD值。將OD值轉(zhuǎn)換為百分比(％ )。未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞OD值設(shè)為100%。每組6空對照，結(jié)果用X土SD表示。熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡將生產(chǎn)良好的PC12細(xì)胞接種于6孔板，37°C孵育24h。分組及藥物處理同上。棄除培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛于4°C固定30min。用磷酸緩沖液(O. IMPBS, pH7. 4)漂洗后，加入終濃度為5 μ g/ml的Hochest33258避光染色lOmin，PBS漂洗后
封片，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核凋亡。Western blot 檢測 caspase-3 的表達(dá)方法將生長良好的PC12細(xì)胞接種于6孔板，37°C孵育24h。分組及藥物處理同上。用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。電泳后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液(含O. 05%Tween20的TBS緩沖液)室溫封閉lh。將膜與溶解于TBST緩沖液的caspase-3 —抗4°C孵育過夜。TBST洗滌5minX 3次后，將膜與溶解于TBST緩沖液的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育Ih。TBST洗滌5minX3次，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)。附圖I說明和對照組比較，經(jīng)Αβ25_35處理后細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡特征表現(xiàn)為細(xì)胞核變小或破碎，熒光增強(qiáng)。藍(lán)莓提取物預(yù)處理可有效抑制A β 25_35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。藍(lán)莓提取物對Αβ25_35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響(Α :對照組，B :Αβ25_35&理組，C : 25 μ M藍(lán)莓提取物預(yù)處理組，D : 50 μ M藍(lán)莓提取物預(yù)處理組)附圖2說明和對照組比較Αβ 25_35處理后PC12細(xì)胞caspase-3的表達(dá)顯著提高。藍(lán)莓提取物預(yù)處理可有效降低caspase-3的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.藍(lán)莓提取物對β-淀粉樣蛋白致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
2.藍(lán)莓提取物對同型半胱氨酸致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
3.藍(lán)莓提取物對β-淀粉樣蛋白致PC12細(xì)胞核凋亡的抑制作用。
4.藍(lán)莓提取物對β_淀粉樣蛋白致caspase-3表達(dá)增強(qiáng)的抑制作用。
5.藍(lán)莓提取物對阿爾茨海默病的預(yù)防作用。
6.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中的應(yīng)用，其中所述的藍(lán)莓提取物有效成分含25%的總花青素。
全文摘要
本發(fā)明藍(lán)莓提取物用于預(yù)防阿爾茨海默病，首次通過體外實(shí)驗(yàn)證明，含25％總花青素的藍(lán)莓提取物可有效抑制β-淀粉樣蛋白及同型半胱氨酸引起的PC12細(xì)胞凋亡。藍(lán)莓提取物可進(jìn)一步開發(fā)用于預(yù)防阿爾茨海默病。
文檔編號A61P25/28GK102641351SQ20111036751
公開日2012年8月22日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者劉靜怡, 張艷波, 施祖榮, 童瑤 申請人:張艷波