專利名稱：預(yù)防和治療阿爾茨海默病(ad)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療阿爾茨海默病(AD)的方法。
淀粉樣蛋白-β肽(AS)在阿爾茨海默病(AD)的神經(jīng)病理學(xué)中起重要作用(Roher等1993″β-淀粉樣蛋白-(1-42)是腦血管淀粉樣蛋白沉積物的主要成分阿爾茨海默病的病理學(xué)實質(zhì)″-PNAS 9010836)。該病的家族型與淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)和早老素基因中的突變有關(guān)。在這些基因中與疾病相關(guān)的突變導(dǎo)致作為阿爾茨海默病的淀粉樣蛋白斑中發(fā)現(xiàn)的主要形式的肽(Aβ42)的42-氨基酸形式的產(chǎn)生增加。該病的動物模型是商購的。超表達突變體人APP(其中第717位上的氨基酸是F而不是V)的PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠逐步發(fā)展成了年齡和腦依賴性形式的許多阿爾茨海默病的神經(jīng)病理學(xué)標志(Games等，1995″超表達V717F S-淀粉樣蛋白前體蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠中的阿爾茨海默型神經(jīng)病理學(xué)″-Nature 373523)。
已經(jīng)使用″正常的″、非基于模擬表位的疫苗進行了疫苗接種研究。在AD-型神經(jīng)病理學(xué)情況發(fā)作前(6周)或在老齡時(11個月)給轉(zhuǎn)基因動物免疫接種聚集的Aβ42，給幼小的動物免疫接種可以預(yù)防發(fā)生蝕斑形成、神經(jīng)炎性營養(yǎng)不良和星形神經(jīng)膠質(zhì)增生(astrogliosis)。治療老齡動物明量減輕了AD-樣神經(jīng)病理學(xué)情況。這種實驗性疫苗接種手段誘導(dǎo)針對能夠通過血腦屏障并攻擊淀粉樣蛋白斑的Aβ42的抗體產(chǎn)生(Schenk等，1999″用淀粉樣蛋白-β免疫接種弱化了PDAPP小鼠中的阿爾茨海默病樣病理情況″-Nature 400173)。斑塊隨后通過幾種機制除去，包括Fc-受體介導(dǎo)的吞噬作用(Bard等，2000″外周給藥的針對淀粉樣蛋白β-肽的抗體進入阿爾茨海默病小鼠模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并減輕病理情況″-Nature Med 6916)。這種疫苗也能夠延緩記憶缺失(Janus等，2000″Aβ肽免疫接種減輕了阿爾茨海默病模型中的行為缺陷并減少了斑塊″-Nature 408979)。
自1999年后期以來很有前途的AD免疫接種療法已經(jīng)用于臨床。推測免疫接種可以引起免疫系統(tǒng)攻擊斑塊并從受侵害的人腦中清除這些沉積物，不過，確切的機理仍需要更具體地表征。
這些臨床試驗由藥物公司Elan與其合伙人American Home Products(治療疫苗AN-1792，QS21作為佐劑)共同進行。I期試驗成功地在2000年中完成。II期試驗于2001年晚期開始以測試在患有輕度-中度AD的一組患者中的功效。
目前這些II期試驗已經(jīng)因在幾位患者中出現(xiàn)的神經(jīng)炎癥而永久地終止(Editorial 2002″無法解決的問題？″-Nature Med 8191)。癥狀包括導(dǎo)致全世界范圍的試驗即刻終止的無菌性腦膜腦炎。在最惡化的病例情況中，證實受侵害的患者具有確定的自身免疫反應(yīng)-在許多免疫療法中固有的危害。預(yù)計自身免疫并發(fā)癥產(chǎn)生同時普遍存在的APP，它當然帶有與其蛋白水解產(chǎn)物相同的抗原決定簇。近來集中在聚集的Aβ42免疫接種誘導(dǎo)的抗體(在人和小鼠中)性質(zhì)上的其它研究揭示出大部分抗體識別Aβ42的第4和第10位氨基酸(Aβ4-10)之間的小結(jié)構(gòu)域。小鼠抗體能夠阻斷Aβ原纖維生成并破壞預(yù)先存在的Aβ纖維(McLaurin等，2002″針對淀粉樣蛋白-肽靶淀粉樣蛋白-β殘基4-10并抑制細胞毒性和原纖維生成的治療有效抗體″-Nature Med 81263)。顯然人抗體不與在細胞表面上接觸的APP或任意其它前體的非聚集的蛋白水解產(chǎn)物反應(yīng)(Hock等，2002″對患有阿爾茨海默病的患者接種疫苗產(chǎn)生對β-淀粉樣蛋白具有特異性的抗體″-Nature Med 81270)。在人與小鼠血清之間觀察到明顯差異與人抗體相反，小鼠抗體檢出單體、寡聚和纖維狀A(yù)β。這具有重要性且可能是治療功效的先決條件，因為積累的證據(jù)表明不由人抗-Aβ識別的Aβ小寡聚體是該病中的主要毒性參與者(Walsh等，2002″天然分泌的淀粉樣蛋白β蛋白寡聚體有效抑制體內(nèi)海馬長時程增強″-Nature 416535)。因此，潛在的新策略在于使用含有β-淀粉樣蛋白氨基酸4-10(而不是聚集的Aβ42)的疫苗進行免疫接種。盡管功效未知，這種策略也可能面對自身免疫問題，因為應(yīng)對患者直接免疫接種(線性B細胞)″自身″表位。
盡管近來在AD疫苗接種策略中的這些研發(fā)令人失望，但是仍然將Aβ疫苗視為抗AD的最有希望的方法。然而，存在對AD疫苗接種中的改進和新策略的迫切需求。尤其是這類疫苗不應(yīng)誘導(dǎo)自體反應(yīng)的T和/或B細胞。
因此，本發(fā)明提供了含有如下氨基酸序列的化合物在制備用于阿爾茨海默病(AD)的疫苗中的用途X1X2X3X4X5X6其中
X1為除C以外的氨基酸；X2為除C以外的氨基酸；X3為除C以外的氨基酸；X4為除C以外的氨基酸；X5為除C以外的氨基酸；X6為除C以外的氨基酸；且其中X1X2X3X4X5X6不為DAEFRH，所述的化合物具有與天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特異性抗體結(jié)合的能力，且其5-鏈節(jié)具有與天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的所述特異性抗體結(jié)合的能力。
本發(fā)明的Aβ42模擬表位用于對AD的疫苗接種該模擬表位誘導(dǎo)針對Aβ42、但不針對天然APP的抗體產(chǎn)生。使用(單克隆)抗體和(商購)肽文庫鑒定該模擬表位(例如按照Reineke等，2002″由5520個隨機產(chǎn)生的序列的肽陣列鑒定不同的抗體表位和模擬表位″-J Immunol Methods 26737)。使用不識別APP但僅檢測帶有氨基末端天冬氨酸的不同Aβ種類的(單克隆)抗體(這類抗體的實例描述在Johnson-Wood等，1997″阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的淀粉樣蛋白前體蛋白加工和Aβ42沉積″-PNAS 941550)。已經(jīng)證實這類抗體為鑒定本發(fā)明過程中適合疫苗的模擬表位的理想工具。盡管證實當將這類單克隆抗體直接給藥于小鼠時在AD小鼠模型中具有有益作用(Bard等，2000″外周給藥的針對淀粉樣蛋白β-肽的抗體進入阿爾茨海默病小鼠模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并減輕病理情況″-Nature Med 6916)，但是始終未提出將這些抗體用作分離AD疫苗化合物的模擬表位的研究工具。
在現(xiàn)有技術(shù)中，所有的努力均集中在天然存在的Aβ肽。如上所述，因神經(jīng)炎癥事件而終止了Aβ肽疫苗的臨床試驗。實際上，T細胞表位預(yù)測程序(用于I類限制表位的BIMAS和用于II類限制表位的TEPITOPE)在序列中提示了高得分(自身)表位。這可能意味著神經(jīng)炎癥事件是因使得這類疫苗不適合于一般應(yīng)用的自身免疫反應(yīng)所致。
與現(xiàn)有技術(shù)中提出的這類Aβ疫苗相反，預(yù)計在使用含有本發(fā)明模擬表位的疫苗治療過程中沒有自身免疫反應(yīng)發(fā)生，因為用于本發(fā)明模擬表位鑒定的(單克隆)抗體不識別APP且模擬表位序列不同于迄今為止已經(jīng)用于試驗或應(yīng)用于未來試驗的Aβ42-自身衍生的序列。
用于本發(fā)明模擬表位鑒定的抗體檢測帶有游離氨基末端天冬氨酸的Aβ-衍生的氨基酸序列DAEFRH(＝原始表位)，由此它不識別天然APP。該抗體可以為單克隆或多克隆抗體制品或其任意的抗體部分或衍生物，先決條件僅在于抗體分子特異性識別DAEFRH表位，即它不會結(jié)合淀粉樣蛋白前體蛋白的天然N-末端延長形式，這意味著與DAEFRH表位的結(jié)合能力至少高于APP分子100倍、優(yōu)選至少1000倍、更優(yōu)選至少105倍。該抗體可以為表現(xiàn)出與Johnson-Wood等(1997)所述抗體相同或較高的與DAEFRH序列的結(jié)合能力的抗體。當然，也可以使用具有較低結(jié)合能力的抗體(＞10％、＞50％或80％的Johnson-Wood等所述抗體的結(jié)合能力)，不過，更優(yōu)選較高的結(jié)合能力。
本發(fā)明的化合物結(jié)合那些對DAEFRH序列具有相似特異性的抗體。
優(yōu)選本發(fā)明所用的化合物含有肽或由肽組成，其中X1為G或帶有羥基的氨基酸或帶負電荷的氨基酸，優(yōu)選E、Y、S或D；X2為疏水氨基酸或帶正電荷的氨基酸，優(yōu)選I、L、V、K、W、R、Y、F或A；X3為帶負電荷的氨基酸，優(yōu)選D或E；X4為芳族氨基酸或L，優(yōu)選Y、F或L；X5為H、K、Y、F或R，優(yōu)選H、F或R；且X6為S、T、N、Q、D、E、R、I、K、Y或G，優(yōu)選T、N、D、R、I或G，尤其是EIDYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、DKELRI、DWELRI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN、EYEFRG、DWEFRDA、WEFRT、DKELR或SFEFRG。
本發(fā)明的化合物(模擬表位)具有5-15個氨基酸的優(yōu)選長度。該化合物可以以分離(肽)形式的疫苗提供或該化合物可以與其它分子，諸如藥物載體物質(zhì)或多肽、脂質(zhì)或碳水化合物結(jié)構(gòu)偶聯(lián)或復(fù)合。優(yōu)選本發(fā)明的模擬表位具有5-15、6和12個、特別是9-11個氨基酸殘基(最短)長度。然而，所述的模擬表位可以與非特異性接頭或載體，尤其是肽接頭或蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)(通過共價或非共價方式)。此外，所述的肽接頭或蛋白質(zhì)載體可以由T-細胞輔助表位組成或含有T-細胞輔助表位。
優(yōu)選所述的藥物上可接受的載體為KLH、破傷風(fēng)毒素、白蛋白結(jié)合蛋白、牛血清白蛋白、樹枝狀聚合物(MAP；Biol.Chem.358581)以及Singh等在Nat.Biotech.17(1999)，1075-1081中(特別是在該文件中的表1中的那些)和O′Hagan等在Nature Reviews，Drug Discovery 2(9)(2003)，727-735(特別是其中所述固有的強化免疫的化合物和遞送系統(tǒng))所述的佐劑物質(zhì)或其混合物。此外，所述的疫苗組合物可以含有氫氧化鋁。
可以通過任何合適的施用方式、例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、皮下等和任意合適的遞藥裝置給藥包括本發(fā)明化合物(模擬表位)和藥物上可接受載體的疫苗(O′Hagan等，Nature Reviews，Drug Discovery 2(9)(2003)，727-735)。一般來說，該疫苗含有如下用量的本發(fā)明化合物0，1ng-10mg、優(yōu)選10ng-1mg，尤其是100ng-100μg；或者例如100fmole-10μmole，優(yōu)選10pmole-1μmole，尤其是100pmole-100nmole。該疫苗還可以包括典型的輔助物質(zhì)，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑等。
本發(fā)明的另一個方面進一步涉及分離與天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特異性抗體結(jié)合的化合物的方法，包括下列步驟-提供包括肽的肽化合物文庫，所述的肽含有如下氨基酸序列X1X2X3X4X5X6其中X1為除C以外的氨基酸；X2為除C以外的氨基酸；X3為除C以外的氨基酸；X4為除C以外的氨基酸；X5為除C以外的氨基酸；X6為除C以外的氨基酸；且其中X1X2X3X4X5X6不為DAEFRH；-使所述的肽文庫與所述的抗體接觸；和-分離與所述抗體結(jié)合的肽文庫中那些成員。
根據(jù)本發(fā)明該方面的具體實施方案，本發(fā)明涉及分離與天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特異性抗體結(jié)合的化合物的方法，包括下列步驟-提供包括肽的肽化合物文庫，所述的肽含有如下氨基酸序列X1X2X3X4X5X6其中
X1為除K和C以外的天然氨基酸；X2為除C以外的天然氨基酸；X3為除K和C以外的天然氨基酸；X4為除K和C以外的天然氨基酸；X5為除C以外的天然氨基酸；X6為除P和C以外的天然氨基酸；且其中X1X2X3X4X5X6不為DAEFRH；-使所述的肽文庫與所述的抗體接觸；和-分離與所述抗體結(jié)合的肽文庫中那些成員。
可以按照上述適合于具有5個氨基酸變體的文庫的方法對本發(fā)明的合適的5-鏈節(jié)進行分離且可以優(yōu)選通過篩選具有如本文所述的具有氨基酸變體X1-X5的文庫或通過鑒定6-鏈節(jié)-文庫中篩選的陽性成員中的合適的5-鏈節(jié)來進行(參見上文)。因此，用相同的方法還可以應(yīng)用7-鏈節(jié)、8-鏈節(jié)、9-鏈節(jié)、10-鏈節(jié)、...文庫以篩選與本發(fā)明抗體類型結(jié)合的合適的序列。例如，可以通過測試這些具有5、6、7、8、9、...個氨基酸殘基長度的用于結(jié)合本發(fā)明抗體的片段找到這類較長序列的合適的抗體結(jié)合片段。
已經(jīng)證實這類方法可以成功地用于提供本發(fā)明的Aβ模擬表位。
優(yōu)選以在所述文庫中的個體化形式，尤其是固定在固體表面的形式提供所述的肽，諸如能夠使用MULTIPIN肽技術(shù)進行。可以將文庫以肽混合物提供且可以在抗體結(jié)合后分離抗體肽復(fù)合物。另一方面，可以將抗體固定且然后使肽文庫(混懸液或溶液形式)與固定化抗體接觸。
優(yōu)選篩選的抗體(或肽文庫中的成員)包括合適的標記，這種標記允許在與文庫中的肽結(jié)合時檢測或分離抗體或抗體肽復(fù)合物。合適的標記體系(即生物素化、熒光、放射性、磁性標記、顯色標記、二次抗體)易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員得到。
必須構(gòu)建文庫以排除天然存在的Aβ序列(例如DAEFRH)，因為顯然將使用該序列進行疫苗接種排除在本發(fā)明外。
用于分離本發(fā)明表位的其它合適的技術(shù)為例如如WO 03/020750中所述在噬菌體-肽文庫中篩選。
本發(fā)明還涉及包括如本文所定義的抗N-末端Aβ42-抗體-結(jié)合肽(或在某些優(yōu)選的情況中為包括這類肽的較大分子(例如與載體或遞送分子連接的肽))(任選為單一有效成分)的組合物；本發(fā)明優(yōu)選涉及針對阿爾茨海默病的疫苗，包括這類抗原，尤其是包括至少一種肽的抗原，所述的肽選自如下的組EIDYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、DKELRI、DWELRI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN、EYEFRG、DWEFRDA、SWEFRT、DKELR或SFEFRG。包括本發(fā)明提供的其它肽在內(nèi)的這些肽特別適用于制備藥物組合物，尤其是用于制備AD疫苗。這些序列是純?nèi)斯さ腁β-模擬表位。用于疫苗接種目的的肽與合適的載體偶聯(lián)(通過共價或非共價方式)且可以將它們以肽化合物或與其它化合物或部分、例如佐劑、肽或蛋白質(zhì)載體等的復(fù)合物提供且按照合適的方式給藥(例如如O′Hagan等在Nature Reviews，Drug Discovery 2(9)(2003)，727-735中所述)。
在下列實施例和附圖中進一步描述本發(fā)明，當然，它們不用來限定本發(fā)明。
附

圖1表示用于本發(fā)明篩選方法的文庫4中的個體化肽成員。
附圖2表示使用用于DAEFRH的模擬表位進行的抑制試驗。
附圖3表示使用其它用于DAEFRH的模擬表位進行的抑制試驗。
附圖4和5描述了使用本發(fā)明的模擬表位肽進行的抑制試驗。
實施例1用于檢測帶有游離N-末端(在N-末端上的游離天冬氨酸)的Aβ42-衍生的肽種類的單克隆抗體(mAb)的制備給小鼠接種在CFA(第一次注射)和IFA(加強注射)中乳化的與蛋白質(zhì)牛血清白蛋白BSA連接的6鏈節(jié)肽DAEFRH(天然N-末端Aβ42序列)疫苗(以便利用半抗原-載體-作用)。通過ELISA(DAEFRH-肽-包被的ELISA平板)檢測產(chǎn)生DAEFRH-肽-特異性抗體的雜交瘤。將肽SEVKMDAEFRH(APP-衍生的含有Aβ42-衍生的序列DAEFRH的天然N-末端延長的序列)用作陰性對照肽排除識別延長肽的雜交瘤，因為它們無法在帶有N-末端上游離天冬氨酸的Aβ42-衍生的肽與不含游離天冬氨酸的APP-衍生的肽DAEFRH之間進行區(qū)分。
2.肽文庫的構(gòu)建已經(jīng)通過改進Reinke等(2000)的方法，通過篩選用于結(jié)合對帶有氨基末端天冬氨酸的Aβ種類具有特異性的抗體(優(yōu)選單克隆抗體)而找到了本發(fā)明的模擬表位。另一種方法是以MULTIP-INTM肽技術(shù)市場上可以得到的。
MultipinTM肽技術(shù)包括在以與用于許多生物試驗的標準8×12微量滴定板相容的方式固定在塊上的特別制備的聚乙烯大頭針(pin)上合成肽?？梢酝ㄟ^這種方法制備大頭針結(jié)合的肽(保持與大頭針共價結(jié)合的不可裂解的肽)和溶液相肽(已經(jīng)從大頭針表面裂解下)?；贛ultipin合成系的PepSets允許同時合成和篩選大量的肽。
PepSets由96個各自合成的肽的模塊組成，它們中的兩個為謹慎選擇的控制序列。通過反相HPLC確定裂解的控制序列的純度且通過氨基酸分析對肽含量進行定量。通過標準ELISA技術(shù)確定陽性和陰性不可裂解的控制序列。
使用各種化學(xué)修飾獲得PepSet肽，包括乙酰化、生物素化、磷酸化和環(huán)化。將溶液相(裂解的)肽以凍干粉運送。
為了制備溶液相肽，存在對C-末端的選擇，包括酸和酰胺，這取決于預(yù)計的肽應(yīng)用。將可裂解的鍵作為預(yù)制的C-末端氨基酸的酯衍生物引入到大頭針表面上或″Rink″酰胺接頭上。然后通過用強酸處理大頭針-結(jié)合的肽釋放含有酸或酰胺端基的肽。對合成規(guī)模的選擇為標稱的1微摩爾或5微摩爾等級。諸如疏水性和裂解效率的因素影響肽的回收，使得當以標稱1微摩爾規(guī)模合成肽時的預(yù)計肽產(chǎn)量為0.5-1微摩爾(接近1mg 15鏈節(jié)肽)，或在以標稱5微摩爾規(guī)模合成肽的產(chǎn)量為2.5-5微摩爾。
不可裂解的肽保持與大頭針共價結(jié)合且可以用于使用ELISA技術(shù)快速篩選有意義的肽。這類肽用于抗體表位掃描和結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系(SAR)研究的目的。除去結(jié)合抗體或其它蛋白重新產(chǎn)生了所述肽且將其再用于進一步的試驗中。PepSets用于各種應(yīng)用，包括根據(jù)經(jīng)蛋白質(zhì)序列的掃描鑒定生物學(xué)上有意義的肽接頭、使肽接頭最優(yōu)化和研發(fā)類似物的新的制備方法。通過使用各種合成設(shè)計顯著強化在用于篩選步驟的總體策略上的靈活性，所述的合成設(shè)計共同提供完全表征所述首位候選物的系統(tǒng)性方法。
從系統(tǒng)性肽類中獲得的綜合結(jié)果不僅鑒定了有意義的肽、而且表明了關(guān)鍵殘基，其可交換性和最佳肽長度。因此，作為該發(fā)現(xiàn)的結(jié)果可以分類相關(guān)肽的范圍。用D-氨基酸和其它不常用殘基取代L-氨基酸是控制肽結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的強有力手段。這種方法也是快速發(fā)現(xiàn)具有不同藥理學(xué)特性的新類似物的方法，所述的新類似物諸如具有增加的穩(wěn)定性的拮抗劑和肽。
以已知的蛋白質(zhì)序列開始，可以使用Multipin方法對所有序列抗體表位作圖。用于對序列B-細胞表位作圖的幾種可選方法目前是可行的。它們包括大頭針-結(jié)合的肽、直接包被在微量滴定板上的溶液相肽和俘獲在預(yù)先包被了抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素的微量滴定板上的生物素化肽。
就本發(fā)明的實施例而言，實施例1中所述的抗體用于篩選肽文庫，然而，例如，如Johnson-Wood等(1997)所述，任何抗體制品特異性識別DAEFRH-序列、但不識別Aβ分子天然N-末端延長的序列(例如MDAEFRH、KMDAEFRH、SEVKMDAEFRH或完整的淀粉樣蛋白(前體)蛋白APP)。
為該目的構(gòu)建了4個文庫2.1.文庫1這種6鏈節(jié)文庫含有具有如下序列(氨基酸位置1-6)的肽1位所有天然的aa，除D、K和C外(17種可能性)2位所有天然的aa，除A、K和C外(17種可能性)3位所有天然的aa，除E、K和C外(17種可能性)4位所有天然的aa，除F、K和C外(17種可能性)5位所有天然的aa，除R、K和C外(17種可能性)6位所有天然的aa，除H、K、C和P外(16種可能性)文庫1是六肽的混合物。理論上包括含有17種不同氨基酸(參見下文)的所有可能的肽。該混合物中不含任何賴氨酸和半胱氨酸殘基。此外，該混合物中不含特定1位上的天冬氨酸；特定2位上的丙氨酸；特定3位上的谷氨酸；特定4位上的苯丙氨酸；特定5位上的精氨酸；和特定6位上的組氨酸。
按照FastMoc方案，使用Applied Biosystems431A-合成儀進行合成，合成規(guī)模為0.25mmol。
使用重量為1mmol所有所需氨基酸(被保護的氨基和側(cè)鏈)開始合成。然后產(chǎn)生Asn、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val的混合物。加入下列位置特異性氨基酸Ala，Glu，Phe，Arg，His(位置/混合物1)；Asp，Glu，Phe，Arg，His(位置/混合物2)；Asp，Ala，Phe，Arg，His(位置/混合物3)；Asp，Ala，Glu，Arg，His(位置/混合物4)；Asp，Ala，Glu，Phe，His(位置/混合物5)；和Asp，Ala，Glu，Phe，Arg(位置/混合物6，不含Pro)。
混合物6用于加載樹脂(2-氯-三苯甲基氯樹脂，1.49mmol/g，AlexisGermany)1mmol氨基酸殘基混合物6611mg樹脂(＝0.91mmol反應(yīng)基團)15ml二氯甲烷5.5當量＝5mmol二異丙基乙胺(871μl)。
將該混合物在燒瓶中振搖1小時。然后加入1ml甲醇并將該混合物再振搖10分鐘。通過frit提取加載的樹脂并用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、異丙醇、甲醇和乙醚(各30ml)洗滌兩次。在高度真空中干燥過夜。稱出的量為737mg。
用1ml 20％在DMF中的哌啶將5.66mg等分試樣處理30分鐘以確定樹脂的密度。然后離心該混合物。通過光度測定法測定上清液中的游離Fmoc保護基(301nm，吸光系數(shù)＝7800M(e-1))。因此，樹脂的密度為0.49mmol/g。
下列所有步驟均使用其它混合物(放入5個不同的筒)在合成儀上進行。使用515mg加載的樹脂(相當于0.25mmol使用4倍過量的氨基酸混合物)。在合成結(jié)束時裂解N-末端Fmoc保護基。在用乙醇洗滌并干燥過夜后，用TFA/H2O(95∶5，v∶v)從樹脂上裂解肽。在Speed Vac上將TFA溶液濃縮至1/5體積并沉淀且用乙醚洗滌并凍干。
6鏈節(jié)肽EIDYHR、ELDYHR和EVDYHR是可以用按照上述實施例1制備的單克隆抗體檢測的模擬表位的實例。
2.2.文庫2該6鏈節(jié)文庫含有帶有下列序列(氨基酸位置1-6)的肽
1位D(固定的)2位所有天然aa，除A、K和C外(17種可能性)3位所有天然aa，除E、K和C外(17種可能性)4位所有天然aa，除F、K和C外(17種可能性)5位所有天然aa，除R、K和C外(17種可能性)6位所有天然aa，除H、K、C和P外(16種可能性)。
按照上述文庫1所述的方法(2.1項下)構(gòu)建肽文庫2。
6鏈節(jié)肽DIDYHR、DLDYHR和DVDYHR是可以用按照上述1制備的單克隆抗體檢測的模擬表位的實例。
2.3.文庫3第3個肽文庫用于另一種確定模擬表位序列的其他方法。該文庫含有原始序列且使模擬表位的檢測與原始表位更為密切相關(guān)。
這種6鏈節(jié)文庫含有帶有如下序列(氨基酸位置1-6)的肽1位均為天然的aa，除D、K和C外(17種可能性)2位均為天然的aa，除K和C外(18種可能性)3位均為天然的aa，除K和C外(18種可能性)4位均為天然的aa，除K和C外(18種可能性)5位均為天然的aa，除K和C外(18種可能性)6位均為天然的aa，除K、C和P外(17種可能性)按照上述文庫1所述的方法(2.1項下)構(gòu)建肽文庫3。
6鏈節(jié)肽DIDYRR、DLDYRR和DVDYRR是可以用按照上述1制備的單克隆抗體檢測的模擬表位的實例(1位上的D和5位上的R與原始表位相同)。
2.4.文庫4該肽文庫4由5×18＝90個肽組成、商購自Mimotopes Ltd.(Paris，F(xiàn)rance；參見制造商的指南)且按照天然N-末端Aβ42序列DAEFRH設(shè)計。
1位D(固定的)2位均為天然氨基酸，除K和C外(18種不同的肽)3位均為天然氨基酸，除K和C外(18種不同的肽)4位均為天然氨基酸，除K和C外(18種不同的肽)
5位均為天然氨基酸，除K和C外(18種不同的肽)6位均為天然氨基酸，除K和C外(18種不同的肽)。
文庫4中的個體化肽成員描述在圖1中。1、24、48、56和80號肽帶有Aβ42N-末端序列的原始序列。所有其它肽均為對其與DAEFRH-結(jié)合抗體的結(jié)合能力測試的候選肽。
2.5.使用肽文庫的ELISA如上所述，使用Applied Biosystems 431A肽合成儀、按照經(jīng)典的Fmoc-化學(xué)制備肽文庫1、2和3。按照制造商的描述得到商購的肽文庫4(參見上文和www.mimotopes.com)。使90個肽的C-末端與大頭針連接。
按照如下方案，使用各肽文庫進行ELISA將肽文庫溶于100％DMSO(終濃度10mg/ml)。
用PBS進一步稀釋肽溶液。
將肽混合物在ELISA平板(Nunc Maxisorp，Germany)上包被過夜(4℃)，以500μg/孔開始并滴定至100ng/孔。
用PBS/Tween 20(0.1％v/v)將平板洗滌3x次。
用PBS/BSA封閉平板(室溫下2小時)。
用PBS/Tween將平板洗滌3x次。
在室溫下將平板與生物素化DAEFRH-特異性mAb(在PBS中10μg/ml)一起保溫4小時。
用PBS/Tween將平板洗滌3x次。
將平板與鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶一起保溫(在室溫下30分鐘)。
用PBS/Tween將平板洗滌5x次。
將平板與ABTS+H2O2一起保溫(0.1％ w/v；10-45分鐘)并用檸檬酸終止反應(yīng)，隨后進行光度測定評價(波長405nm)。
3.通過抑制試驗驗證模擬表位3.1.其它文庫除上述4個文庫(參見2.1.、2.2.、2.3.、和2.4.)外，還將第5個文庫用于確定模擬表位序列。這種6鏈節(jié)文庫在EMC microcollections(TubingenGermany)商購且它含有114個不同的六肽混合物，通過所有除C以外的天然aa(19種可能性)中的一個確定每種混合物中的一個位置，剩余的5個位置為可變的混合物01-06(1個位置固定，丙氨酸A，剩余的5個位置可變，X)混合物01AXXXXX混合物02XAXXXX混合物03XXAXXX混合物04XXXAXX混合物05XXXXAX混合物06XXXXXA混合物07-12(1個位置固定，精氨酸R，剩余的5個位置可變，X)混合物07RXXXXX混合物08XRXXXX混合物09XXRXXX混合物10XXXRXX混合物11XXXXAX混合物12XXXXXR因此，使用除C以外的所有天然aa設(shè)計混合物13和14。
3.2.抑制試驗圖2和3描述了用包括在和獲自5個文庫(如上所述的)中的模擬表位肽進行的抑制試驗結(jié)果。模擬表位肽與原始表位競爭單由克隆抗體識別。原始表位和模擬表位肽在C-末端上含有用于與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的另一個C(如果需要)。
使用下列肽肽1737 DAEFRH肽3001 DKELRI肽3002 DWELRI肽3003 YREFFI肽3004 YREFRI肽3005 YAEFRG肽3006 EAEFRG
肽3007 DYEFRG肽3008 ELEFRG肽3009 SFEFRG肽3010 DISFRG肽3011 DIGWRG步驟以0.1μg/ml肽-BSA的濃度給ELISA平板(Nunc Maxisorp)包被原始肽表位DAEFRH(C-末端被C延長且與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián))(100μl/孔，12小時，4℃)。在用1％ PBS/BSA封閉(200μl/孔，12小時，4℃)后，用PBS/Tween將平板洗滌3x次。然后加入生物素化單克隆抗體(1∶2000，50μ/孔)和濃度50、5、0.5、0.05、0.005和0.0005μg/ml的肽(50μl/孔)，在37℃下20分鐘。用PBS/Tween將平板洗滌3x次并與辣根過氧化物酶(HRP)-標記的鏈霉抗生物素一起保溫(100μl/孔，30分鐘，RT)。用PBS/Tween將平板洗滌5x次并與ABTS+H2O2一起保溫(0.1％ w/v；10-45分鐘)且用檸檬酸終止反應(yīng)，隨后進行光度測定評價(波長405nm)。
正如圖2中預(yù)計和觀察到的，肽1737 DAEFRH可以與BSA-偶聯(lián)的平板結(jié)合的肽DAEFRH競爭且由此抑制單克隆抗體的識別。此外，證實肽3003不能抑制單克隆抗體與原始表位結(jié)合。相反，肽3001、3002、3004、3005、3006和3007(不同程度)阻斷表位識別。而肽3004僅在高濃度(50μg/ml)下具有抑制作用，肽3001、3006和3007具有強烈抑制作用，IC50低于0.5μg/ml。肽3002和3005是″中等″抑制劑，IC50大于0.5μg/ml。
正如圖3中預(yù)計和觀察到的，肽1737 DAEFRH可以成功地與BSA-偶聯(lián)的平板結(jié)合的肽DAEFRH競爭另外進行的單克隆抗體識而不依賴于實驗。此外，表明肽3010和3011在測試濃度下沒有抑制作用，而肽3008和3009為(相對)弱的抑制劑，IC50低于5μg/ml。
表1簡單概括了包括在和獲自文庫(如所述的)中的模擬表位的抑制能力表1模擬表位抑制能力肽3001 DKELRI強肽3002 DWELRI中等肽3003 YREFFI無肽3004 YREFRI弱肽3005 YAEFRG中等肽3006 EAEFRG強肽3007 DYEFRG強肽3008 ELEFRG弱肽3009 SFEFRG弱肽3010 DISFRG無肽3011 DIGWRG無4.按照本發(fā)明篩選的其它模擬表位的抑制試驗抑制試驗圖4和5描述了用包括在和獲自5個文庫(如所述的)中的模擬表位肽進行的抑制試驗結(jié)果。模擬表位肽與原始表位競爭單克隆抗體識別。原始表位和模擬表位肽在C-末端上(7位)含有用于與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的另一個C(如果需要)。
使用下列肽肽1737 DAEFRH(原始表位+C)肽1234 KKELRI肽1235 DRELRI肽1236 DKELKI肽1237 DRELKI肽1238 DKELR肽1239 EYEFRG肽1241 DWEFRDA肽4002 SWEFRT肽4003 GREFRN肽4004 WHWSWR步驟以0.1μg/ml肽-BSA的濃度給ELISA平板(Nunc Maxisorp)包被原始肽表位DAEFRH(C-末端被C延長且與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián))(100μl/孔，12小時，4℃)。在用1％ PBS/BSA封閉(200μl/孔，12小時，4℃)后，用PBS/Tween將平板洗滌3x次。然后加入生物素化單克隆抗體(1∶2000，50μl/孔)和不同濃度的肽(50μl/孔)，在37℃下20分鐘。用PBS/Tween將平板洗滌3x次并與辣根過氧化物酶(HRP)-標記的鏈霉抗生物素一起保溫(100μl/孔，30分鐘，RT)。用PBS/Tween將平板洗滌5x次并與ABTS+H2O2一起保溫(0.1％ w/v；10-45分鐘)且用檸檬酸終止反應(yīng)，隨后進行光度測定評價(波長405nm)。
正如圖4中預(yù)計和觀察到的，肽1737 DAEFRH可以與BSA-偶聯(lián)的平板結(jié)合的肽DAEFRH競爭且由此抑制單克隆抗體的識別。此外，表明肽4004不能抑制單克隆抗體與原始表位結(jié)合。相反，肽4002和4003(不同程度)阻斷表位識別。而肽4003僅在相對高濃度(10μg/ml)下具有抑制作用，肽4002具有強抑制作用，IC50低于0.4μg/ml。
正如附圖5中預(yù)計和觀察到的，肽1737 DAEFRH可以成功地與BSA-偶聯(lián)的平板結(jié)合的肽DAEFRH競爭另外進行的單克隆抗體識別而不依賴于實驗。此外，表明肽1234在測試濃度下幾乎沒有抑制作用，而肽1235、1236、1237、1238、1239和1241(不同程度)阻斷表位識別。肽1235，1238和1241是強抑制劑，IC50小于0.5μg/ml，而肽1236和1237是(相對)弱的抑制劑，IC50大于5μg/ml。肽1239是中等抑制劑，IC50大于0.5μg/ml。
表2簡單概括了包括在和獲自文庫(如所述的)中的模擬表位的抑制能力表2模擬表位抑制能力肽1234 KKELRI無肽1235 DRELRI強肽1236 DKELKI弱肽1237 DRELKI弱肽1238 DKELR強肽1239 EYEFRG中等肽1241 DWEFRDA強肽4002 SWEFRT強肽4003 GREFRN弱肽4004 WHWSWR無圖4和5中所示的結(jié)果表明除各種6鏈節(jié)肽(如此處和上文所述)外，5鏈節(jié)肽(即肽1238 DKELR)和7鏈節(jié)肽(即肽1241 DWEFRDA)也可以用作基于模擬表位的阿爾茨海默病疫苗中的表位。
權(quán)利要求
1.含有如下氨基酸序列的化合物在制備用于阿爾茨海默病(AD)的疫苗中的用途X1X2X3X4X5X6其中X1為除C以外的氨基酸；X2為除C以外的氨基酸；X3為除C以外的氨基酸；X4為除C以外的氨基酸；X5為除C以外的氨基酸；X6為除C以外的氨基酸；且其中X1X2X3X4X5X6不為DAEFRH，所述的化合物具有與天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特異性抗體結(jié)合的能力，且其5-鏈節(jié)具有與天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的所述特異性抗體結(jié)合的能力。
2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述的化合物含有肽或由肽組成，其中X1為G或帶有羥基的氨基酸或帶負電荷的氨基酸，優(yōu)選E、Y、S或D；X2為疏水氨基酸或帶正電荷的氨基酸，優(yōu)選I、L、V、K、W、R、Y、F或A；X3為帶負電荷的氨基酸，優(yōu)選D或E；X4為芳族氨基酸或L，優(yōu)選Y、F或L；X5為H、K、Y、F或R，優(yōu)選H、F或R；且X6為S、T、N、Q、D、E、R、I、K、Y或G，優(yōu)選T、N、D、R、I或G，尤其是EIDYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、VDYRR、DKELRI、DWELRI、YREFFI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN、EYEFRG、DWEFRDA、SWEFRT、DKELR或SFEFRG。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述的化合物為含有5-15個氨基酸殘基的多肽。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項的用途，其特征在于所述的化合物與藥物上可接受的載體、優(yōu)選KLH且任選氫氧化鋁偶聯(lián)。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項的用途，其特征在于它含有用量為0,1ng-10mg，優(yōu)選10ng-1mg，尤其是100ng-100μg的化合物。
6.分離與天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特異性抗體結(jié)合的化合物的方法，包括下列步驟-提供含有肽的肽化合物文庫，所述的肽含有如下氨基酸序列X1X2X3X4X5X6其中X1為除C以外的氨基酸；X2為除C以外的氨基酸；X3為除C以外的氨基酸；X4為除C以外的氨基酸；X5為除C以外的氨基酸；X6為除C以外的氨基酸；且其中X1X2X3X4X5X6不為DAEFRH；-使所述的肽文庫與所述的抗體接觸；和-分離與所述抗體結(jié)合的肽文庫中那些成員。
7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于在所述的文庫中提供個體化的所述肽，尤其是固定在固體表面的所述肽。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其特征在于所述的抗體包括合適的標記，該標記在與所述庫中的肽結(jié)合時能夠得到檢測或分離。
9.抗阿爾茨海默病的疫苗，含有包括至少一種選自下列組中的肽的抗原EI-DYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、DKELRI、DWELRI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN、EYEFRG、WEFRDA、SWEFRT、DKELR或SFEFRG。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有如下氨基酸序列X
文檔編號A61K38/08GK1826354SQ200480002213
公開日2006年8月30日 申請日期2004年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月14日
發(fā)明者弗蘭克·馬特納 申請人:阿法爾斯研發(fā)有限責(zé)任公司