專利名稱：提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體及用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是當(dāng)今最常見的發(fā)病和死亡原因之一，全世界每年有1000多萬新發(fā)病例和 620萬患者死亡。最新統(tǒng)計資料顯示，近二十年來，中國癌癥死亡率上升了近百分之三十，每四、五個死亡者中就有一個死于癌癥，居死亡原因之首。但目前癌癥化療藥物由于缺乏靶向性，在殺死癌細(xì)胞的同時也導(dǎo)致正常細(xì)胞死亡，致使患者全身毒副作用較大。因此發(fā)展高效靶向的基因/藥物載體在腫瘤治療中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞穿透肽(Cell penetrating ρ印tides)是一類可快速直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的多肽，且可以攜帶多種不同大小和性質(zhì)的生物活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，包括小分子物質(zhì)、 多肽、多肽核酸(ρ印tidenucleo acid, PNA)、蛋白質(zhì)、DNA、siRNA、納米顆粒和膠束等，這一性質(zhì)使其可能成為良好的藥物載體。其中，TAT多肽是目前研究較多的一個細(xì)胞穿透肽，來
(Transcriptional activator of transcription, TAT)，序列為YGRKKRRQRRR，主要是由堿性氨基酸精氨酸和賴氨酸組成，帶有大量正電荷，并具有良好的親水性。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)TATp修飾脂質(zhì)體可明顯提高其體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率，體外的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)30% _50%，并且明顯減少了單純脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染時的毒性。但是由于TATp 直接穿膜進(jìn)入細(xì)胞而非依賴受體，缺乏組織細(xì)胞靶向性。提高腫瘤靶向性治療的主要策略是針對腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原(tumor-associated antigens, TAAs)對載體材料進(jìn)行修飾，使其對腫瘤細(xì)胞具有更高的選擇性并借此提高腫瘤細(xì)胞對基因的攝入。研究發(fā)現(xiàn)，黃體生成素釋放激素受體(luteinizing hormone-releasing hormone receptor, LHRHR)在肝癌及多數(shù)性激素依賴腫瘤如乳腺癌、 卵巢癌和前列腺癌等細(xì)胞膜上過量表達(dá)，明顯高于在相應(yīng)組織正常細(xì)胞膜上的表達(dá)，且在正常的肝、腎、脾、心、肺、腦、胸腺和骨骼肌組織的細(xì)胞膜上未有可檢測到的表達(dá)。黃體生成素釋放激素(LHRH)是由10個氨基酸組成的短肽(序列EHWSYGLRPG)。已有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，LHRH修飾可明顯提高所載藥物對乳腺癌、卵巢癌細(xì)胞的靶向性。鑒于以上討論的問題，期望提供一種針對腫瘤的強(qiáng)靶向性且高效的載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的基因/藥物載體靶向性差及轉(zhuǎn)染效率低的難題，提供一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體。本發(fā)明的第二個目的是提供一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體的用途。本發(fā)明的第三個目的是提供一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體修飾殼聚糖形成的共聚物。
本發(fā)明的第四個目的是提供一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體修飾殼聚糖形成的共聚物的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體，所述多肽載體具有式(I) 的結(jié)構(gòu)TATp-Cys-LHRHp (I)其中TATp為HIV的TAT片段；Cys為半胱氨酸；LHRHp為促黃體生成激素釋放激素LHRH的類似物。所述TATp 的氨基酸序列為N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg ；或其反向序列為N 端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg ；所述LHRHp 的氨基酸序列為N 端-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-TyrIer-Trp-His-Glu ；或其反向序列N端-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp(D 型)-Leu-Arg-Gly。所述TATp-Cys-LHRHp 序列為 SEQ ID NO. 1 所示N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-Tyr-Ser-Trp-Hi s-Glu ；或SEQ ID NO. 2 所示=N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp(D 型)-Leu-Arg-Gly ；或SEQ ID NO. 3 所示=N 端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；或SEQ ID NO. 4 所示 N 端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Cys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp(D 型)-Leu-Arg-Gly。上述多肽載體的用途。多肽載體修飾殼聚糖形成的共聚物。上述共聚物的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下本發(fā)明涉及的一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體帶有大量的正電荷，具有良好的水溶性另外還具有很強(qiáng)的針對性激素依賴性腫瘤及肝癌的靶向性，可直接攜帶帶負(fù)電荷的核酸或藥物并介導(dǎo)其進(jìn)入細(xì)胞，也可修飾其它基因或藥物載體提高其腫瘤靶向性和轉(zhuǎn)染效率。為基因/藥物輸送提供了一種新型載體。本發(fā)明涉及的兩個多肽TATp和LHRHp通過半胱氨酸連接，可將兩個多肽分子以Y 狀形式定向交聯(lián)到其它載體，可充分發(fā)揮兩個多肽分子的功能，并可減少TATp的非特異性副作用，為基因/藥物載體的高效靶向修飾提供了一種新穎方法。本發(fā)明涉及的一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體對其它載體修飾時，對其它載體表面化學(xué)基團(tuán)沒有特殊的要求，因此使用較廣。
本發(fā)明涉及的多肽TATp-Cys-LHRHp與殼聚糖形成的共聚物可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因載體和藥物制劑(例如載藥納米粒，凝膠)等。


圖1多肽載體質(zhì)譜圖譜。圖2多肽載體高效液相圖譜。圖3.多肽修飾殼聚糖共聚物合成路線圖。圖4.多肽修飾殼聚糖共聚物紅外光譜圖。其中，實(shí)線為殼聚糖，虛線為多肽修飾殼聚糖共聚物。圖5.多肽修飾殼聚糖共聚物等電點(diǎn)測定結(jié)果。圖6.多肽修飾殼聚糖共聚物載基因納米粒子凝膠阻滯結(jié)果。圖7.多肽修飾殼聚糖共聚物載基因納米粒子原子力顯微鏡。圖8.多肽修飾殼聚糖共聚物載基因納米粒子穩(wěn)定性結(jié)果。其中圖8-1多肽修飾殼聚糖共聚物載基因納米粒子kta電位變化情況。圖8-2多肽修飾殼聚糖共聚物載基因納米粒子粒徑變化情況。圖9.多肽修飾殼聚糖共聚物載基因納米粒子載熒光素酶基因pGL3-C0ntr0l納米粒子對人正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞H印G2的轉(zhuǎn)染結(jié)果。圖10.細(xì)胞轉(zhuǎn)染M后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果A多肽修飾殼聚糖共聚物載基因納米粒子載基因納米粒子轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞L02 24小時；B多肽修飾殼聚糖共聚物載基因納米粒子轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞H印G2 24小時；C為Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞L02 24小時；D 為 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞 HepG2 24 小時。圖11細(xì)胞轉(zhuǎn)染M小時后流式細(xì)胞分析結(jié)果。A:多肽修飾殼聚糖共聚物載pEGFP基因納米粒子轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞L02 M小時后，流式結(jié)果顯示0. 06%細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白；B 多肽修飾殼聚糖共聚物載pEGFP基因納米粒子轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞H印G2 24小時后，流式結(jié)果顯示7. 77%細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白；C =Lipofectamine 2000載pEGFP基因納米粒子轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞L02 M小時后，流式結(jié)果顯示2. 7%細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白；D =Lipofectamine 2000載pEGFP基因納米粒子轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞H印G2 M小時
后，流式結(jié)果顯示9.細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明本發(fā)明的多肽TATp-Cys-LHRHp由于是通過半胱氨酸將長短相當(dāng)?shù)膬煞N多肽分子 (TATp和LHRHp)連接形成的雙功能肽，通過3-(2-吡啶二巰基)丙酸n_羥基琥珀酰亞胺酯 (SPDP)等巰基交聯(lián)劑可將該雙功能肽(TATp-Cys-LHRHp)以Y狀形式定向交聯(lián)到其他基因 /藥物載體，如殼聚糖，以充分發(fā)揮兩個多肽(TATp和LHRHp)各自的功能，如LHRHp的腫瘤特異靶向識別作用和TATp攜帶其它物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的功能，并減少TATp引起的非特異性細(xì)胞攝入。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1多肽TATp-Cys-LHRHp合成及表征應(yīng)用多肽合成儀，采用固相多肽合成技術(shù)進(jìn)行多肽合成，所得多肽經(jīng)質(zhì)譜分析結(jié)果顯示其分子離子峰為沈57 (見圖1)，與預(yù)期的多肽分子量一致，經(jīng)HPLC分析，其純度大于 99% (見圖2)實(shí)施例2TATp-Cys-LHRHp載基因納米粒子的制備將多肽載體(TATp-Cys-LHRHp)和質(zhì)粒DNA分別溶于水中制得水溶液，然后分別將兩水溶液于37°C水浴10分鐘；按N/P(是摩爾比嗎？)比為10 1將兩溶液快速混勻并漩渦震蕩50秒，即得TATp-Cys-LHRHp載基因納米粒子。納米粒子的平均粒徑約為82nm， zeta電位為26mV。Ν/Ρ可以在2 1 20 1中選擇，震蕩時間在40 60秒中選擇，得到的 TATp-Cys-LHRHp載基因納米粒子，其平均粒徑約為70 90nm，zeta電位在20_40mY。實(shí)施例3TATp-Cys-LHRHp載基因納米粒子的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例2TATp-Cys-LHRHp載基因納米粒子的制備方法，制備N/P比10 1的 TATp-Cys-LHRHp載基因納米粒子，然后將該納米粒子分別轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞BEL-7402和人正常肝細(xì)胞L02，轉(zhuǎn)染納米粒子的量以DNA計算為5 μ g DNA/ml，轉(zhuǎn)染M小時后，高內(nèi)涵活細(xì)胞成像結(jié)果顯示該納米粒子對肝癌細(xì)胞BEL-7402具有較強(qiáng)的靶向性，對其轉(zhuǎn)染效率較高， 而對正常肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)染效率則很低。實(shí)施例4TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物的制備具體方法包括如下步驟(1)稱取分子量為5000-8000的殼聚糖(⑶)溶于水中，制成質(zhì)量濃度為的水溶液；⑵將3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)溶于二甲基亞砜(DMSO) 中，制成濃度為20mM溶液；(3)按SPDP分子與CS分子上的游離氨基的摩爾比為1 3的比例將所述步驟(1) 獲得的溶液和步驟( 獲得的溶液混合，室溫反應(yīng)60分鐘；(4)用pH = 7. 5含ImM乙二胺四乙酸的磷酸鹽緩沖液平衡截留分子量5000的脫鹽柱，然后以4000xg的離心力離心步驟(3)獲得的反應(yīng)液25分鐘，并離心3次以去除游離的SPDP分子；(5)將TATp-Cys-LHRHp多肽溶于去氧雙蒸水中，制成質(zhì)量濃度為1 %的水溶液；所述TATp-Cys-LHRHp多肽的氨基酸序列為N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp(D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；(6)按一定比例(TATp-Cys-LHRHp多肽分子與CS分子上的游離氨基的摩爾比為1 3)將步驟(4)獲得的產(chǎn)物與步驟(5)獲得的溶液混合，在室溫攪拌反應(yīng)12小時；(7)用pH = 7. 5含ImM乙二胺四乙酸的磷酸鹽緩沖液平衡第二個截留分子量5000 的脫鹽柱，然后以離心力為4000xg離心步驟(6)所得反應(yīng)液25分鐘，并離心3次以純化產(chǎn)物即獲得TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物；將所述TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物冷凍干燥后密封置于-20°C備用。圖3所示為TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物的合成示意圖。注TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物的合成過程中，反應(yīng)中分別加入相應(yīng)量的 SPDP和TATp-Cys-LHRHp分子，以制備不同取代度的TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物。
圖4為TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物的紅外光譜圖，CS的氨基峰在 1658. 07cm"1處，而在TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物中氨基峰明顯減小，同時亞氨基峰 1555. 56cm-1峰處明顯增強(qiáng)。由圖3所示TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物即是通過多肽上的巰基與殼聚糖分子上氨基反應(yīng)，使得TATp-Cys-LHRHp多肽通過取代氨基上的氫將多肽交聯(lián)到殼聚糖分子上。因此根據(jù)該紅外光譜分析結(jié)果說明TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物合成成功。實(shí)施例5TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物等電點(diǎn)的滴定將TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物配成濃度為0. 5mg/ml的水溶液，用 0. 5N NaOH水溶液和0.05N NaOH水溶液作為滴定劑，采用激光粒度儀通過酸堿自動滴定方法，從初始PH開始滴定至pH值=12，每間隔pH 0.5測定一次zeta電位，最終測得TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物的等電點(diǎn)為11. 3 (如圖5所示)，由此推測， TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物在pH值為7左右的水中應(yīng)帶正電荷，理論該共聚物可與帶負(fù)電荷的DNA或藥物通過正負(fù)電荷相互作用形成納米復(fù)合體。實(shí)施例6TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物載基因納米復(fù)合體的制備將TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物與EGFP-C1質(zhì)粒DNA按照不同N/P比制備不同納米粒子。首先將TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物與DNA分別溶于水中，DNA水溶液的濃度為0. 2mg/ml, TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物溶液濃度根據(jù)不同N/P比而不同。將兩溶液分別置于37°C水浴10分鐘，然后將兩溶液等體積混合，立即漩渦震蕩45-55 秒，即得所需納米粒子。將所得納米粒子進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，由圖6顯示N/P比為1 1時 TATp-Cys-LHRHp修飾殼聚糖共聚物即可將DNA完全包裹。將所得納米粒子采用激光粒度儀進(jìn)行粒徑及^ta電位測定，結(jié)果如下表和圖7所示，多數(shù)納米粒子的粒徑在70-85nm之間， 電位在30mV左右，原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示各納米粒子呈較規(guī)則的圓形。將各納米粒子置于室溫，分別于第1、2、3、7、14天對納米粒子進(jìn)行粒徑和kta電位測定，以觀測納米粒子的穩(wěn)定性。圖8-1和圖8-2所示除N/P比1 4的納米粒子的粒徑和kta電位變化較大， 即穩(wěn)定性較差外，其它所選配比納米粒子都相對穩(wěn)定。表.不同N/P的多肽修飾殼聚糖共聚物載基因納米粒子的粒徑及kta電位
權(quán)利要求
1.一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體，其特征是所述多肽載體具有式⑴的結(jié)構(gòu)TATp-Cys-LHRHp(I)其中TATp為HIV的TAT片段；Cys為半胱氨酸；LHRHp為促黃體生成激素釋放激素LHRH的類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽載體，其特征是所述TATp的氨基酸序列為N端-Arg-Ly s-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg ；或其反向序列為N端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg ；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽載體，其特征是所述LHRHp的氨基酸序列為N 端-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；或其反向序列N 端-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp (D 型)-Leu-Arg-Gly0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽載體，其特征是所述TATp-Cys-LHRHp序列為SEQID NO. 1所示N 端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-GIn-Arg-Arg-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp (D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；或SEQ ID NO. 2所示N端-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp (D 型)-Leu-Arg-Gly ；或SEQ ID NO. 3所示N端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Cys-Gly-Arg-Leu-Trp(D 型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu ；或SEQ ID NO. 4所示N端-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Cys-Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-Trp (D 型)-Leu-Arg-Gly。
5.權(quán)利要求1-4之一的多肽載體的用途。
6.權(quán)利要求1-4之一的多肽載體修飾殼聚糖形成的共聚物。
7.權(quán)利要求6的共聚物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高藥物/基因的靶向性和轉(zhuǎn)染效率的多肽載體及用途，多肽載體具有式(I)的結(jié)構(gòu)TATp-Cys-LHRHp(I)其中TATp為HIV的TAT片段；Cys為半胱氨酸；LHRHp為促黃體生成激素釋放激素LHRH的類似物。本發(fā)明的多肽載體帶有大量的正電荷，具有良好的水溶性另外還具有很強(qiáng)的針對性激素依賴性腫瘤及肝癌的靶向性，可直接攜帶帶負(fù)電荷的核酸或藥物并介導(dǎo)其進(jìn)入細(xì)胞，也可修飾其它基因或藥物載體提高其腫瘤靶向性和轉(zhuǎn)染效率。為基因/藥物輸送提供了一種新型載體。
文檔編號A61P35/00GK102516395SQ201110435698
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者冷希崗, 劉蘭霞, 宋麗萍, 朱敦皖, 董霞 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所