專利名稱：表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)基因測(cè)序檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因的檢測(cè)方法，更準(zhǔn)確地說(shuō)本發(fā)明涉及一種表皮生長(zhǎng)因子受體基因檢測(cè)分析方法。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
關(guān)于表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)及其小分子抑制劑基因靶向藥物吉非替尼(gefitinib)，表皮生長(zhǎng)因子受體家族是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的門戶蛋白，于1950年首次分離成功?，F(xiàn)已知有四個(gè)亞型，即Erb-B-1，Erb-B-2，Erb-B-3和Erb-B-4.，目前最著名的是Erb-B-1和Erb-B-2亞型，它們分別由Her1和Her2原癌基因產(chǎn)生，Her1即是產(chǎn)生EGFR的功能基因，Her2是產(chǎn)生Neu(Cerb-B2)的功能基因。EGFR在細(xì)胞內(nèi)外有三個(gè)功能域，即細(xì)胞膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)，前者以表皮生長(zhǎng)因子EGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGFα)為配體，后者有酪氨酸激酶活性，與配體結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化，從而啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)瀑布反應(yīng)。
EGFR與癌的發(fā)生和生長(zhǎng)關(guān)系密切a、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)氨基酸序列與逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因v-erb-B同源；b、多數(shù)腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)EGFR1和EGFR2，并與惡性程度呈正相關(guān)。
c、許多腫瘤也過(guò)度表達(dá)EGFR配體TGF-α，二者共同促進(jìn)腫瘤增殖，因此美國(guó)政府FDA在2003年5月批準(zhǔn)了美國(guó)阿斯力康(Aotrazeneca)公司生產(chǎn)的小分子基因靶點(diǎn)藥物-EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼(gefifinib，商品名Iressa，ZD1839)上市，我國(guó)在2005年2月批準(zhǔn)其上市。它可以特異性地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合癌細(xì)胞EGFR激酶功能區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制了該激酶的活性，抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增殖，卻無(wú)明顯的化療副作用等不良影響。中國(guó)目前尚未有檢測(cè)EGFR基因突變后進(jìn)行吉非替尼治療的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，但分析中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者該基因突變率明顯高于歐美白人和黑人，成為該藥在我國(guó)療效明顯的主要因素。分子靶向藥物的研制，是基于癌癥是起因于細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)和功能異常的病因發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，旨在尋找其特異的基因發(fā)病環(huán)節(jié)和靶點(diǎn)而針對(duì)性的精確治療，但在臨床應(yīng)用上卻一波三折，脫離常規(guī)，如Gleevec是最初針對(duì)Abl融合基因靶點(diǎn)而設(shè)計(jì)的治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物，其療效卻未達(dá)到理想設(shè)計(jì)要求，但在難以化療的胃腸道間質(zhì)瘤的治療方面表現(xiàn)出神奇療效，后來(lái)認(rèn)識(shí)到該藥物的靶點(diǎn)也作用于GIST的c-kit基因，更多的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)Gleevec的療效與GIST的c-kit基因蛋白產(chǎn)物CD117的免疫組化表達(dá)陽(yáng)性有關(guān)，所以現(xiàn)在對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤事先檢測(cè)CD117表達(dá)是否陽(yáng)性，已成為Gleevec分子靶向藥物治療的常規(guī)。而Gefitinib最初是由日本人依據(jù)其表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑的邏輯原理，應(yīng)用于上皮性惡性腫瘤特別是大腸癌的EGFR基因分子靶點(diǎn)和其內(nèi)含子CA重復(fù)序列多變性基因治療，但在臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，它對(duì)上皮性惡性腫瘤治療，以非小細(xì)胞肺癌的控制腫瘤生長(zhǎng)、減痛、止咳、止喘等效果明顯，以后由美國(guó)、加拿大和日本臨床醫(yī)師們組織了更精細(xì)的科學(xué)的臨床應(yīng)用調(diào)查，但基于其靶向藥物的機(jī)理，必須要找出肺非小細(xì)胞肺癌在基因水平上特別是EGFR基因靶點(diǎn)的發(fā)病和治療環(huán)節(jié)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，最終由《science》和《新英格蘭雜志》前后刊文并得出了幾乎一致的結(jié)論非小細(xì)胞肺癌的EGFR外顯子18、19和21存在著突變和大片段缺失，因而表達(dá)異?；钴S，促使腫瘤增生，而Gefitinib臨床作用于EGFR胞漿內(nèi)ATP功能區(qū)并阻斷其促腫瘤增生的作用，誘導(dǎo)其凋亡。該報(bào)告由世界最權(quán)威雜志發(fā)布，獲得世界腫瘤界公認(rèn)，于是很快獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，短短數(shù)月，該藥通過(guò)EAP計(jì)劃已積累了3萬(wàn)9千人的數(shù)據(jù)。
由于吉非替尼的療效與EGFR基因突變有關(guān)，而日本和中國(guó)人的EGFR突變率高于歐美和黑人數(shù)十倍，《science》刊文報(bào)道歐美和黑人非小細(xì)胞肺癌EGFR突變率僅2％，而日本達(dá)28％，美國(guó)I NTACT大規(guī)模臨床用藥結(jié)果顯示該藥對(duì)歐美和黑人運(yùn)用范圍極其有限，與化療藥物相比無(wú)療效差異，就美國(guó)兩億人口，0.7‰的肺癌發(fā)病率計(jì)算，每年新增肺癌不足10萬(wàn)人，其中2％的吉非替尼藥敏率，該藥適用人數(shù)不足500人/年，而亞洲有10倍于美國(guó)的人口和10倍于美國(guó)藥敏率，每年至少5萬(wàn)以上的藥物適用人群，如每人耗資1萬(wàn)美金，就達(dá)到5億美金/年的額度，再加之檢測(cè)各種腫瘤的EGFR基因人口會(huì)達(dá)10倍于肺癌的藥敏人口，國(guó)外公司在亞洲，中國(guó)可能獲取的利潤(rùn)空間十分驚人，可達(dá)300億/年人民幣元之巨。吉非替尼療效與EGFR基因突變直接相關(guān)，因此預(yù)檢基因突變實(shí)施個(gè)體化治療能夠更有針對(duì)性，《science》在2004年4月記載，執(zhí)行EAP計(jì)劃的125例非小細(xì)胞肺癌患者中，選擇5例有療效，4例無(wú)療效者，經(jīng)基因測(cè)序檢測(cè)，全部5例有效者存在EGFR外顯子突變(L858R 2239-2247Del 2240-2257Del 2238-2255Del)，而4例無(wú)效者無(wú)一例突變。體外培養(yǎng)的對(duì)吉非替尼50倍敏感的肺癌的細(xì)胞株H2355也存在著L858R突變?！缎掠⒏裉m雜志》在同期刊文對(duì)275例服用吉非替尼的非小細(xì)胞肺癌病例臨床應(yīng)用分析，有25人有臨床療效，其中9人檢測(cè)EGFR全長(zhǎng)密碼子，發(fā)現(xiàn)8例存在突變，突變方式和位點(diǎn)與《science》報(bào)導(dǎo)和基本相同，而7例未顯療效者無(wú)一例突變發(fā)生。另16例有療效者因針刺標(biāo)本未能獲得DNA而放棄檢測(cè)。另一方面，未進(jìn)行基因檢測(cè)而在歐美進(jìn)行了2600例大范圍的聯(lián)合健擇和紫杉醇和卡鉑治療晚期非小細(xì)胞肺癌的III期臨床試驗(yàn)(INTACT2)被證明患者生存率無(wú)明顯改善，原因在于歐美非小細(xì)胞肺癌病人存在大量EGFR突變陰性人群(95-98％)，所以絕大多數(shù)臨床工作者提出，吉非替尼服藥前需預(yù)檢非小細(xì)胞肺癌組織的EGFR基因突變，如有突變則療效超過(guò)無(wú)突變者100倍。應(yīng)視突變存在與否實(shí)施個(gè)體化治療，因?yàn)殚L(zhǎng)達(dá)16個(gè)月以上的用藥將會(huì)怡誤病情，耗資巨大，且有一定的副作用。
《science》刊文記述了16位未接受吉非替尼治療的非小細(xì)胞肺癌患者，基因測(cè)序顯示了各種EGFR基因突變，其中15位是日本人，均為肺腺癌，10人為女性。因此認(rèn)為，EGFR突變及與吉非替尼治療反應(yīng)性，在日本和美國(guó)人間存在巨大差異，提示分子病理發(fā)病機(jī)制與種族、性別和病理類型有著明顯的關(guān)系。日本人報(bào)道101例服用吉非替尼的非小細(xì)胞肺癌患者20人有效，總的有效率為19.8％，遠(yuǎn)高于歐美和黑人11.8％的有效率，而中國(guó)人執(zhí)行EAP計(jì)劃統(tǒng)計(jì)的有效率為22.2％，經(jīng)過(guò)基因檢測(cè)已發(fā)現(xiàn)在亞洲人肺腺癌和女性人群中EGFR的突變率14％-57％不等，遠(yuǎn)高于歐美人平均2％的低突變率，而日本人對(duì)277例肺癌EGFR基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)111例(40％)存在基因突變，其中52例19外顯子缺失，54例21和18外顯子點(diǎn)突變，5例有復(fù)制和插入。
我國(guó)EGFR基因突變檢測(cè)現(xiàn)狀與其它EGFR檢測(cè)方法分析國(guó)際權(quán)威雜志《science》刊文，明確指出用免疫組化方法檢測(cè)EGFR表達(dá)水平與吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌無(wú)關(guān)，目前尚未見(jiàn)有類似的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，肯定免疫組化和ELISA方法檢測(cè)EGFR蛋白水平與吉非替尼療效有關(guān)，因此，用基因測(cè)序方法檢測(cè)EGFR18、19和21外顯子全長(zhǎng)的DNA序列，成為預(yù)測(cè)吉非替尼療效的肯定的方法?，F(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題和缺點(diǎn)表皮生長(zhǎng)因子受體基因測(cè)序檢測(cè)分析技術(shù)是在2004年4月首先由美國(guó)PaezJG和Lynch TJ分別在《science》和《新英格蘭雜志》發(fā)布的，他們均是采用的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)EGFR20條外顯子全長(zhǎng)的DNA基因，以巢式PCR方法擴(kuò)增EGFR106條基因短片段，以相同的基因測(cè)序方法和儀器類型得到檢測(cè)結(jié)果。
主要是發(fā)現(xiàn)了檢測(cè)出EGFR第18外顯子、第19外顯子和第21外顯子發(fā)生上述基因突變(第21外顯子2497位T＞G突變，2504位A＞T突變例外，由發(fā)明人獨(dú)自首先發(fā)現(xiàn))。
上述發(fā)現(xiàn)解釋了吉非替尼和Tarciva治療非小細(xì)胞肺癌有療效和無(wú)療效的分子靶點(diǎn)機(jī)制，但是上述技術(shù)存在若干問(wèn)題1、設(shè)計(jì)了EGFR外顯子106條短片段可以更全面地檢測(cè)序列，不至遺漏EGFR外顯子DNA全長(zhǎng)，但不能實(shí)際應(yīng)用于臨床檢測(cè)應(yīng)用，否則僅一例病人的EGFR基因常規(guī)外顯子檢測(cè)耗時(shí)將達(dá)1個(gè)月以上，耗資更相當(dāng)可觀。故發(fā)明人設(shè)計(jì)了三個(gè)完整的外顯子片斷包括了部份內(nèi)含子、剪切子，調(diào)控區(qū)，既可完整檢測(cè)上述EGFR外顯子所報(bào)道的全部病變位點(diǎn)和突變方式，也可使PCR程序更為優(yōu)化，提高檢出率，更可讓該項(xiàng)檢測(cè)進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用。
2、Paez JG和Lynch TJ公布的EGFR外顯子檢測(cè)方法，主要反應(yīng)歐美高加索人種和黑人的基因狀態(tài)，但基因事件已公認(rèn)存在人種、地域等差異性，發(fā)明人設(shè)計(jì)的EGFR第18、19和21外顯子基因片段，可以逐個(gè)從堿基和氨基酸水平與觀察分析中國(guó)人特有的該基因序列特征和突變特點(diǎn)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的第21外顯子T＞G突變和A＞T及852位密碼子始插入G突變是國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道的新的雜合性突變，用于分析中國(guó)人靶向藥物治療具有針對(duì)性。
3、Paez JG和Lynch TG的EGFR外顯子檢測(cè)項(xiàng)目，僅是2004年新發(fā)現(xiàn)的基因檢測(cè)技術(shù)，主要是用于實(shí)驗(yàn)研究。2004年底日本人利用總RNA提取技術(shù)進(jìn)行CDNA PCR擴(kuò)增，將該技術(shù)應(yīng)用于臨床病理科的分子病理基因檢測(cè)，但該技術(shù)人工地額外增添了RNA-DNA逆轉(zhuǎn)錄PCR環(huán)節(jié)，有可能對(duì)雜合性單鏈基因突變事件增加假陽(yáng)性污染或假陰性漏檢，并增加了檢測(cè)的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，且缺乏臨床基因病理申請(qǐng)和報(bào)告書(shū)樣本以及技術(shù)操作規(guī)范。
4、國(guó)內(nèi)各醫(yī)療機(jī)構(gòu)、醫(yī)院部門尚未設(shè)立該項(xiàng)臨床基因病理檢測(cè)項(xiàng)目，甚至未能檢索到醫(yī)學(xué)、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的EGFR外顯子檢測(cè)報(bào)告或數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上面所述的現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種表皮生長(zhǎng)因子受體基因檢測(cè)分析方法。
本發(fā)明是采取以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因測(cè)序檢測(cè)方法(1)檢測(cè)材料和對(duì)象各種途徑獲取的非小細(xì)胞癌的體細(xì)胞組織，肺癌的石蠟包埋組織的切片，肺癌晚期轉(zhuǎn)移灶組織和血液中的癌細(xì)胞、肺癌胸水和穿刺細(xì)胞、痰細(xì)胞；(2)使用試劑和儀器V-gene公司、Roche公司DNA提取的市售試劑盒promega PCR純化市售試劑盒ABI測(cè)序市售試劑盒儀器DNA定量?jī)x 電泳儀 自動(dòng)凝膠顯像系統(tǒng) PCR儀 冷凍離心機(jī) 基因測(cè)序儀 基因分析軟件(3)檢測(cè)流程①首先對(duì)檢測(cè)材料進(jìn)行病理學(xué)技術(shù)制片，觀察，出具病理診斷報(bào)告，備案，判斷是否為非小細(xì)胞肺癌并病理分類，選定病灶區(qū)域后取材切片納入基因測(cè)序檢測(cè)；②組織前處理及抽提DNA，每批組設(shè)立肺癌周圍組織對(duì)照；③DNA定量?jī)x檢測(cè)樣本質(zhì)量(260nm吸光率大于0.05，A260/A280比值1.6-1.8，320nm波長(zhǎng)處吸光率接近零)；
④使用已設(shè)定的引物(EGFR外顯子18、19和21全長(zhǎng)DNA序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Touchdown技術(shù))；⑤凝膠自顯影電泳觀察分析PCR效果⑥PCR產(chǎn)物純化⑦PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)⑧使用基因測(cè)序儀進(jìn)行EGFR基因的測(cè)序和分析；如陰性結(jié)果時(shí)做雙向測(cè)序檢測(cè)；⑨依據(jù)病理診斷，臨床檢查治療情況和序列分析結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估，完成EGFR病理基因測(cè)序報(bào)告；(4)觀察指標(biāo)依據(jù)美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(www.NCBI.NLM.NIH.GOV)提供的EGFRDNA公開(kāi)序列(NM-005228)和mRNA的序列，確定EGFR第18、19和21外顯子全長(zhǎng)片斷；①EGFR第18外顯子片段長(zhǎng)度為437bp，序列見(jiàn)后述主要觀察核苷酸2155G＞A突變，即氨基酸G719s改變②EGFR第19外顯子片斷長(zhǎng)度為411bp，序列見(jiàn)后述主要觀察核苷酸2235-2249Del，即氨基酸E746-A750del缺失現(xiàn)象核苷酸2236-2250Del，即氨基酸E746-A750del缺失現(xiàn)象核苷酸2254-2277Del，即氨基酸S752-I759del缺失現(xiàn)象其它核苷酸片段缺失、插入、重復(fù)等現(xiàn)象，如氨基酸L747-T751insS，L747-P753insS和L747-A750del等；③EGFR第21外顯子，片段長(zhǎng)度為399bp，序列見(jiàn)后述主要觀察核苷酸2576T＞G，即氨基酸L858R突變核苷酸2497T＞G(L833V)2504A＞T(H835L)其它核苷酸雜合突變等現(xiàn)象如氨基酸L861Q突變；核苷酸第2556位插入堿基G(Q852)首先確定EGFR第18、19和21外顯子基因堿基序列及其突變位點(diǎn)根據(jù)美國(guó)國(guó)立圖書(shū)館(www.NCBI.NLM.NI H.gov)公開(kāi)提供的EGFR全基因序列(NM-005228)和mRNA序列，參照美國(guó)ABI公司Celerar數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)基因文獻(xiàn)和《(science》2004、304(5676)1457-1500，Epub EGFR全基因組文獻(xiàn)，本發(fā)明選定需要測(cè)序的EGFR基因外顯子如下Exon18EGFR18外顯子序列 ccgtgtcctggcacccaagcccatgccgtggctgctggtccccctgctgggccatgtctggcactgctttccagcatggtgagggctgaggtgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGG CTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGgtaaggtccctggcacaggcctctgggctgggccgcagggcctctcatggtctggtggggagcccagagtccttgcaagctgtatatttccatcatctactttactcttt Exon19EGFR19外顯子序列
acccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA ACA CTCGATgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttctcatgtctggcagctgctctgctct Exon21EGFR21外顯子序列 atgaccctgaattcggatgcagagcttcttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC GGCCAAACAGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgttt 對(duì)上述基因片段的觀察突變位點(diǎn)主要包括三方面(1)已報(bào)道的突變位點(diǎn)Exon 18核苷酸第2155位 G＞A突變 (G719S)Exon19 核苷酸第2235-2249缺失 (E746-A750del)核苷酸第2236-2250缺失 (E746-A750del)核苷酸第2254-2277缺失 (S752-I759del)核苷酸缺失(L747-T751insS)核苷酸缺失(L747-P753insS)核苷酸缺失(L747-A750del)
Exon21 核苷酸第2573 T＞G突變(L858R)核苷酸突變(L861Q)(2)中國(guó)人新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)Exon21 核苷酸第2497位T＞G(L833V)核苷酸第2504位A＞T(H835L)核苷酸第2556位插入堿基G (Q852)(3)由發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的EGFR18、19和21外顯子新突變位點(diǎn)(5)設(shè)計(jì)引物依據(jù)上述EGFR基因片段，確定了EGFR第18、19和21外顯子，利用Oligo軟件獨(dú)立設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，并參考優(yōu)化的PCR條件和測(cè)序適應(yīng)性分析，合成引物序列如下18外顯子 上游引物5’TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG 3’下游引物5’TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC 3’19外顯子 上游引物5’GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC 3’下游引物5’TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT 3’21外顯子 上游引物5’GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC 3’下游引物5’CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT 3’(6)、提取模板DNA新鮮組織V-gene公司DNA提取試劑盒固定和石蠟Roche公司DNA提取試劑盒血液和液體細(xì)胞Promega公司DNA提取試劑盒以上均按說(shuō)明書(shū)指示方法操作，以凝膠電泳系統(tǒng)檢測(cè)DNA模板和質(zhì)量，然后用eppendorf核酸定量?jī)x測(cè)定DNA濃度，選擇dsDNA為測(cè)定目標(biāo)，260nm吸光率大于0.05以上(DNA含量大于2.0ug/ul)，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之間，320nm波長(zhǎng)處吸光率接近為0的樣本作為適用模板；(7)、PCR擴(kuò)增和純化對(duì)獲取的符合條件DNA模板，以touch down技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)體系如下PCR體系(總體系20μl)10×PCR Buffer(含15mM MgCl2×)2μl，HotStarTaq DNA Polymerase(QI AGEN公司)0.2μl ，5×Q-Solution 4μl ，dNTP mix(10mM of each)2μl ，Primer 1 1μl ，Primer 2 1μl ，模板DNA 1μl ，Distilled water8.8μl ；PCR條件置ABI-2700型擴(kuò)增儀中95℃預(yù)變性15min，用TouchdownPCR，94℃變性50sec，63℃-58℃退火1min(-0.5℃/1min，72℃延伸1min，共循環(huán)10次，94℃變性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循環(huán)30次，最后于72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物質(zhì)量控制PCR反應(yīng)產(chǎn)物要求條帶單一，濃度30-100ngPCR酶應(yīng)用QIAGEN公司HotStarTaq DNA Polymerase、ABI公司金牌酶及優(yōu)質(zhì)的國(guó)內(nèi)外其它酶；PCR產(chǎn)物純化A、過(guò)柱純化上海生物工程公司純化試劑盒
Promega公司PCR純化試劑盒Qiagen公司PCR純化試劑盒B、酒精/EDTA純化產(chǎn)物純化后凝膠顯像電泳評(píng)估純化質(zhì)量，編號(hào)、存檔(-80℃)C、測(cè)序反應(yīng)及純化因目前所知的EGFR第18、19和21外顯子均為雜合突變、缺失，故將10um的正反向引物均稀釋到1um，按下列體系添加反應(yīng)物1ul BigDye(2.5X)+1.5 ul BigDye Seq Buffer(5X)+3ul引物+1ulPCR純化產(chǎn)物+3.5ul ddH2O；(8)、測(cè)序結(jié)果分析和報(bào)告測(cè)序結(jié)果形成書(shū)面報(bào)告操作人和鑒報(bào)告人簽字、注期，并附上原始測(cè)序電泳圖、序列圖交給臨床或患方；(9)、檔案處理登記所有檢測(cè)對(duì)象均填寫(xiě)登記申請(qǐng)單，注明病史、病理診斷、復(fù)查HE切片；全部DNA模板，PCR純化產(chǎn)物均編號(hào)-80度超低溫保存?zhèn)洳椤?br> EGFR基因外顯子檢測(cè)，主要的發(fā)明目的和要解決的任務(wù)如下(一)所有的非小細(xì)胞肺癌臨床藥物應(yīng)用療效分析表明吉非替尼和Tarciva顯效者均有高達(dá)70％-90％的EGFR外顯子突變率，而無(wú)效者相應(yīng)的突變率幾乎為零，所以臨床用藥前，預(yù)檢EGFR基因突變存在與否是解決針對(duì)性個(gè)體化治療的有效方法。
(二)EGFR基因外顯子檢測(cè)，必須由實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)化、開(kāi)發(fā)可操作的臨床應(yīng)用性檢測(cè)項(xiàng)目，國(guó)外Paez JG等設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法，采用28個(gè)EGFR全部外顯子，設(shè)計(jì)了106對(duì)DNA堿基短片段，進(jìn)行DNA雙鏈正向和反向的檢測(cè)，這在實(shí)驗(yàn)研究階段進(jìn)行系統(tǒng)而全面的探索是必要的，但進(jìn)行臨床檢測(cè)將會(huì)形成天文數(shù)字的工作量和經(jīng)費(fèi)，經(jīng)發(fā)明人研究，綜合各方報(bào)道，已明確Exon18有G＞A突變(G719S)，Exon 19有E746-A750del，S752-I759del，L747-T751insS，L747-P753insS，L747-A750del。Exon 21有L858R、L861Q、2497位T＞G突變和2504A＞T突變，核苷酸第2556位插入堿基G(Q852)，發(fā)明人設(shè)計(jì)的外顯子片段，包容了上述全部觀察點(diǎn)，簡(jiǎn)縮成3對(duì)外顯子片段；在單一鏈無(wú)陽(yáng)性序列發(fā)現(xiàn)后再測(cè)量另一DNA鏈，首先使該項(xiàng)目臨床病理檢測(cè)在技術(shù)上可行。
本申請(qǐng)內(nèi)容屬于基因檢測(cè)技術(shù)方法項(xiàng)目，其原理是1、治療非小細(xì)胞肺癌的分子靶向藥物是不同于傳統(tǒng)化療的里程碑式的發(fā)明，但有EGFR基因突變者用吉非替尼治療70％-90％會(huì)有療效，其效率高于EGFR基因突變陰性者100倍。
2、應(yīng)用吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌，國(guó)內(nèi)外資產(chǎn)顯示對(duì)亞洲人療效最好，主要原因是亞洲人EGFR基因突變率在世界上最高。
3、該類藥物2004年通過(guò)FDA申批，2005年3月即將進(jìn)入中國(guó)，而國(guó)內(nèi)在應(yīng)用發(fā)明之前尚未有該項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目的研究臨床應(yīng)用。
4、中國(guó)人的EGFR基因有自身的特征，國(guó)人的類似基因突變檢測(cè)項(xiàng)目反應(yīng)中國(guó)特色。
發(fā)明應(yīng)用對(duì)象和材料1、應(yīng)用對(duì)象適用于非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤體細(xì)胞的EGFR基因突變測(cè)序檢測(cè)。
2、使用材料指離體的腫瘤新鮮組織、細(xì)胞、痰液、腫瘤蠟塊，已固定組織，血液轉(zhuǎn)移細(xì)胞、穿刺組織細(xì)胞、轉(zhuǎn)移灶組織細(xì)胞等可檢測(cè)材料。
工藝條件1、環(huán)境條件DNA模板提取PCR擴(kuò)增和測(cè)序反應(yīng)必須分區(qū)或分室操作，嚴(yán)防交叉污染，規(guī)范污染物處理。
2、人員條件相關(guān)操作人員須經(jīng)《國(guó)家實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可制度》培訓(xùn)班培訓(xùn)合格，具有病理執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格碩士研究生畢業(yè)以上，臨床病理診斷從業(yè)三年以上，有分子病理實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
3、硬件條件DNA分光光度定量?jī)x，自動(dòng)凝膠顯像儀，測(cè)序級(jí)PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，冷凍離心機(jī)，高速離心機(jī)，DNA分析儀(基因測(cè)序儀)，寬帶互聯(lián)網(wǎng)。
4、軟件條件具有熟練的分子生物和分子病理知識(shí)技能查閱NCBI和相關(guān)文獻(xiàn)庫(kù)會(huì)使用3100-AvantDate Collection 2.0軟件運(yùn)行測(cè)序儀會(huì)分析DNA sequencing analysis 5.1軟件分析原始數(shù)據(jù)DNA seqScape軟件自動(dòng)比較基因突變DNA star seqman軟件手工比較基因突變納入標(biāo)準(zhǔn)1、病理診斷標(biāo)準(zhǔn)肺非小細(xì)胞癌腸腺癌脾癌乳腺癌前列腺癌腎細(xì)胞癌胰腺癌食道癌甲狀腺癌頭頸部癌2、觀察基因突變納入標(biāo)準(zhǔn)(1)目前已報(bào)道的8個(gè)突變位點(diǎn)和異?，F(xiàn)象G719S E746-A750del S752-I759del L747-T751insS L747-P753insS L747-A750delL858R L861Q(2)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的以下突變位點(diǎn)Exon21T＞G(L833V)A＞T(H835L)核苷酸第2556位插入堿基G(Q852)(3)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的EGFR18、19和21外顯子新突變和異常現(xiàn)象.
有益效果(一)EGFR基因突變測(cè)序檢測(cè)可以明確預(yù)報(bào)分子靶向藥物治療非小細(xì)胞肺癌的良好療效。
1、2004年《science》刊文在125例非小細(xì)胞肺癌患者中對(duì)吉非替尼治療有效的5例全部存在EGFR外顯子18、19和21的突變(100％)，而無(wú)效的4例患者無(wú)一例存在上述突變，在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中顯示對(duì)吉非替尼抗癌療效是50倍高敏感的非小細(xì)胞肺腺癌株H2355，也具有EGFR第21外顯子的L858R突變。
2、同期《新英格蘭雜志》刊文，在275例非小細(xì)胞肺癌病例，對(duì)選擇9例有療效者檢測(cè)EGFR基因外顯子18、19和21發(fā)現(xiàn)8例存在突變(88％)而7例治療無(wú)效者無(wú)一例發(fā)生上述突變。
(二)EGFR基因突變檢測(cè)對(duì)亞洲人更有效1、上述《science》和《新英格蘭雜志》均報(bào)道了日本人的EGFR基因突變率為26％，而美國(guó)人和黑人相應(yīng)突變率均只有2％，而兩個(gè)大型的Iressa(易瑞沙)單藥II期臨床治療非小細(xì)胞肺癌的國(guó)際大規(guī)模研究(IDEAL I和II)對(duì)亞洲女性腺癌更有效，而隨后的國(guó)際更大型EAP計(jì)劃中，日本108例和中國(guó)238例的療效率分別是19.8％和22.2％，歐美人種的相應(yīng)療效率僅11.8％。227例日本人肺癌的EGFR基因突變率為40％，遠(yuǎn)高于歐美人種。
2、相反，近期的INTACT項(xiàng)目對(duì)2600例非小細(xì)胞肺癌未測(cè)EGFR基因突變和未作人種、地域的分組，僅作了吉非替尼與健擇、順鉑、紫杉醇、卡鉑聯(lián)合用藥，與非聯(lián)合用藥比較，未顯示出吉非替尼單藥療效的差異性，有力說(shuō)明不做這項(xiàng)基因檢測(cè)盲目服藥未見(jiàn)療效。
(三)檢測(cè)EGFR基因突變后再?zèng)Q定是否服藥，可明顯控制吉非替尼的不良副作用減少不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
1、各種國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均顯示靶向藥物吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌比各種化療藥物毒副作用明顯降低。一般僅有腹瀉、皮疹、重癥者可有間質(zhì)性肺炎，如濫用也可致死，日本曾報(bào)道濫用該藥有14例間質(zhì)性肺炎死亡的病例。所以檢測(cè)基因是否存在突變后用藥可減少副作用。
2、吉非替尼國(guó)內(nèi)尚未引進(jìn)，更不能生產(chǎn)，用藥者需耗昂貴的價(jià)格從國(guó)外購(gòu)入($80元/顆)，因該藥主要是對(duì)晚期肺癌減少胸痛、咳喘起控制病情急劇惡化的作用，故需長(zhǎng)期服藥達(dá)16-18個(gè)月，檢測(cè)是否存在基因突變后用藥，可減少國(guó)家和患者巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
(四)本技術(shù)方法是實(shí)驗(yàn)技術(shù)轉(zhuǎn)化應(yīng)用到臨床檢測(cè)的重大創(chuàng)新1、無(wú)論是《science》和《新英格蘭雜志》均是200多短片段進(jìn)行巢式PCR EGFR全長(zhǎng)基因組檢測(cè)，這在實(shí)驗(yàn)科研方法是必須的，但在臨床上是不能投入應(yīng)用的，發(fā)明人設(shè)計(jì)了EGFR基因第18、19和21外顯子有針對(duì)性的觀察序列，使冗長(zhǎng)繁瑣的檢測(cè)變致簡(jiǎn)潔、可觀察到目前各國(guó)報(bào)道的全部突變位點(diǎn)，并結(jié)合了臨床病理切片觀察更具科學(xué)性。
2、發(fā)明人設(shè)計(jì)的基因觀察序列片段，不僅可以觀察已有的基因突變情況，還能檢查出中國(guó)人特有的或未曾報(bào)道的EGFR突變方式，比如已經(jīng)在一例男性肺腺癌體細(xì)胞發(fā)現(xiàn)EGFR基因第21外顯子T＞G、A＞T雜合性突變，未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外資料報(bào)道。
3、病理基因檢測(cè)項(xiàng)目在國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)比較普遍應(yīng)用于臨床，除發(fā)明人所在單位外我國(guó)尚未見(jiàn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)有類似的臨床應(yīng)用項(xiàng)目進(jìn)入常規(guī)診療服務(wù)。


圖1是本發(fā)明的EGFR測(cè)序效果圖
具體實(shí)施例方式一、取材核對(duì)患者姓名某某，病理號(hào)0406013，病理診斷為肺腺癌。取其肺癌標(biāo)本蠟塊，經(jīng)常規(guī)切片HE染色后顯微鏡下觀察，確保病灶癌組織區(qū)域結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)自溶、壞死和大片出血后切取10μm厚切片6片。
二、DNA的提取用Roche公司石蠟基因組DNA提取試劑盒，按說(shuō)明提取DNA。
三、DNA質(zhì)量鑒定先用eppendorf核酸定量?jī)x測(cè)定提取后DNA濃度。(260nm吸光率大于0.05以上(DNA含量大于2.0ug/ul)，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之間，320nm波長(zhǎng)處吸光率接近為0)，然后在1％瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳，以JD-801凝膠電泳圖象分析系統(tǒng)顯示單一、明亮條帶為合格模板。
四、PCR擴(kuò)增1、引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI相關(guān)文獻(xiàn)提供的研究結(jié)果，確定EGFR目的基因片斷(見(jiàn)上述)，利用genebank上提供的序列，通過(guò)Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行測(cè)序適應(yīng)性評(píng)估，由上海生物工程公司合成。序列為18外顯子 上游引物5’TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG 3’下游引物5’TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC 3’
19外顯子 上游引物5’GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC 3’下游引物5’TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT 3’21外顯子 上游引物5’GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC 3’下游引物5’CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT 3’2、PCR反應(yīng)體系(總體系20μl)10×PCR Buffer(含15mMMgCl2×)2μl，HotStarTaq DNA Polymerase(QIAGEN公司)0.2μ1，5×Q-Solution 4μl ，dNTP mix(10mM of each)2μl ，Primer 1 1μl ，Primer 2 1μl ，模板DNA 1μl ，Distilled water 8.8μl 。
3、PCR反應(yīng)條件置ABI-2700型擴(kuò)增儀中95℃預(yù)變性15min，用TouchdownPCR，94℃變性50sec，63℃-58℃退火1min(-0.5℃/1min，72℃延伸1min，共循環(huán)10次，94℃變性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循環(huán)30次，最后于72℃延伸10min。
4、PCR產(chǎn)物純化用1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一目的條帶，根據(jù)Promega公司提供的PCR純化試劑盒，對(duì)PCR產(chǎn)物過(guò)柱純化后，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。
五、測(cè)序反應(yīng)1、反應(yīng)體系1ul BigDye(2.5X)+1.5ul BigDye Seq Buffer(5X)+3ul引物(1pmol/ul)+1ulPCR純化產(chǎn)物(3-10ng)+3.5ul ddH2O。(確保Bi gDye的終濃度為1X)2、測(cè)序PCR熱循環(huán)條件96℃，10sec→(96℃10sec→50℃5sec→60℃4min)×25個(gè)循環(huán)→60℃，4min→4℃保溫3、測(cè)序反應(yīng)后純化
1)每管加入1μL 125mM EDTA到管底，再加入1μL 3M NaAc。
2)每管加入25μL 100％酒精，鋁箔封嚴(yán)密，震蕩混勻4次，室溫放置15min。
3)1600×g離心45min，馬上倒置96孔ABI板，離心至185×g停止離心。
4)每管加入35μL 70％酒精，1650×g 4℃離心15min(JOUAN-BR4i)；馬上倒置96孔板，離心至185×g停止離心。
5)重復(fù)第4步1次。
6)室溫?fù)]發(fā)凈酒精，加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA；7)樣品在95℃變性4min，迅速置冰中冷卻4min。
4、基因測(cè)序1)測(cè)序電泳前，在數(shù)據(jù)采集(Datecollection2.0)軟件中選擇正確的運(yùn)行模塊和分析模塊。
2)樣品制備，上樣至3100-Avant遺傳分析儀進(jìn)行測(cè)序。
3)Datecollection軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
六、結(jié)果分析將測(cè)序結(jié)果用DNA sequencing analysis5.1自動(dòng)分析原始測(cè)序數(shù)據(jù)，獲取測(cè)序電泳圖和序列。將樣品序列用DNA star seqman與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，觀察樣本基因序列觀察樣品是否存在突變或缺失等改變。
七、測(cè)序結(jié)果基因檢測(cè)申請(qǐng)單及報(bào)告表省中醫(yī)院病理科DNA基因測(cè)序申請(qǐng)單某某中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院聯(lián)號(hào) 檢測(cè)號(hào)G050035


注意1.取材或抽取不凝血后立即送病理科，不需固定，貼好標(biāo)簽。
2.檢測(cè)結(jié)果需參考病理診斷咨詢醫(yī)師。
3.如對(duì)檢測(cè)結(jié)果有疑問(wèn)，請(qǐng)與病理科聯(lián)系。
聯(lián)號(hào)聯(lián)號(hào)聯(lián)號(hào)聯(lián)號(hào)


江蘇省中醫(yī)院病理科DNA基因測(cè)序報(bào)告單某某中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院基因測(cè)序檢測(cè)號(hào)G050035

注1.組織細(xì)胞基因測(cè)序結(jié)果需參考病理診斷評(píng)估。
2.測(cè)序結(jié)果可咨詢臨床和病理醫(yī)師。
權(quán)利要求
1.表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因測(cè)序檢測(cè)方法，它包括下列步驟(1)檢測(cè)材料和對(duì)象各種途徑獲取的非小細(xì)胞癌的體細(xì)胞組織、肺癌的石蠟包埋組織的切片、肺癌晚期轉(zhuǎn)移灶組織和血液中的癌細(xì)胞、肺癌胸水和穿刺細(xì)胞或痰細(xì)胞；(2)使用試劑和儀器DNA提取的試劑盒PCR純化試劑盒ABI測(cè)序試劑盒儀器DNA 定量?jī)x 電泳儀 自動(dòng)凝膠顯像系統(tǒng) PCR儀 冷凍離心機(jī) 基因測(cè)序儀 基因分析軟件(3)檢測(cè)流程首先對(duì)檢測(cè)材料進(jìn)行病理學(xué)技術(shù)制片，觀察，出具病理診斷報(bào)告；備案，判斷是否為非小細(xì)胞肺癌并病理分類，選定病灶區(qū)域后取材切片納入基因測(cè)序檢測(cè)；組織前處理及抽提DNA，每批組設(shè)立肺癌周圍組織對(duì)照；DNA定量?jī)x檢測(cè)樣本質(zhì)量(260nm吸光率大于0.05，A260/A280比值1.6-1.8，320nm波長(zhǎng)處吸光率接近零)；使用已設(shè)定的引物(EGFR外顯子18、19和21全長(zhǎng)DNA序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；凝膠自顯影電泳觀察分析PCR效果；PCR產(chǎn)物純化；PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)；使用基因測(cè)序儀進(jìn)行EGFR基因的測(cè)序和分析；如陰性結(jié)果時(shí)做雙向測(cè)序檢測(cè)；依據(jù)病理診斷，臨床檢查治療情況和序列分析結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估；完成EGFR病理基因測(cè)序報(bào)告；(4)觀察指標(biāo)依據(jù)美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(www.NCBI.NLM.NIH.GOV)提供的EGFRDNA公開(kāi)序列(NM-005228)和mRNA的序列，確定EGFR第18、19和21外顯子全長(zhǎng)片斷；①EGFR第18外顯子片段長(zhǎng)度為437bp，主要觀察核苷酸2155G＞A突變，即氨基酸G719s改變②EGFR第19外顯子片斷長(zhǎng)度為411bp，主要觀察核苷酸2235-2249Del，即氨基酸E746-A750del缺失現(xiàn)象核苷酸2236-2250Del，即氨基酸E746-A750del缺失現(xiàn)象核苷酸2254-2277Del，即氨基酸S752-I 759del缺失現(xiàn)象其它核苷酸片段缺失、插入、重復(fù)現(xiàn)象，如氨基酸L747-T75linsS，L747-P753insS和L747-A750del；③EGFR第21外顯子，片段長(zhǎng)度為399bp，主要觀察核苷酸2576T＞G，即氨基酸L858R現(xiàn)象改變核苷酸2497T＞G(L833V)2504A＞T(H835L)核苷酸q852其它核苷酸雜合突變現(xiàn)象，如氨基酸L861Q改變；首先確定EGFR第18、19和21外顯子基因堿基序列及其突變位點(diǎn)根據(jù)美國(guó)國(guó)立圖書(shū)館(www.NCB5.NLM.NIH.gov)公開(kāi)提供的EGFR全基因序列(NM-005228)和mRNA序列，參照美國(guó)ABI公司Cerelar數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)基因文獻(xiàn)和《science》2004、304(5676)1457-1500，Epub EGFR全基因組文獻(xiàn)，本發(fā)明選定需要測(cè)序的EGFR基因外顯子如下Exon18EGFR18外顯子序列 cctgctgggccatgtctggcactgctttccagcatggtgagggctgaggtgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAA GTTCGGCACGGTGTATAAGgtaaggtccctggcacaggcctctgggctgggccgcagggcctctcatggtctggtggggagcccagagtccttgcaagctgtatatttccatcatctactttac Exon19EGFR19外顯子序列 cagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT Exon21EGFR21顯子序列 tgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCAC AAtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcc 對(duì)上述基因片段的觀察突變位點(diǎn)主要包括三方面(1)已報(bào)道的突變位點(diǎn)Exon18核苷酸第2155位 G＞A突變 (G719S)Exon19核苷酸第2235-2249缺失 (E746-A750del)核苷酸第2236-2250缺失 (E746-A75 0del)核苷酸第2254-2277缺失 (S752-I759del)核苷酸缺失(L747-T751insS)核苷酸缺失(L747-P753insS)核苷酸缺失(L747-A750del)Exon21核苷酸第2573 T＞G突變 (L858R)核苷酸突變(L861Q)(2)中國(guó)人的突變位點(diǎn)Exon21核苷酸第2497位 T＞G (L833V)核苷酸第2504位 A＞T (H835L)核苷酸第2556位插入堿基G (Q852)(3)由發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的EGFR18、19和21外顯子新突變位點(diǎn)(4)設(shè)計(jì)引物依據(jù)上述EGFR基因片段，確定了EGFR第18、19和21外顯子，利用Oligo軟件獨(dú)立設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，并參考優(yōu)化的PCR條件和測(cè)序適應(yīng)性分析，合成引物序列如下
18外顯子 上游引物5’TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG 3’下游引物5’TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC 3’
19外顯子 上游引物5’GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC 3’下游引物5’TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT 3’
21外顯子 上游引物5’GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC3’下游引物5’CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT 3’(5)、提取模板DNA新鮮組織用DNA提取試劑盒固定和石蠟用DNA提取試劑盒血液和液體細(xì)胞用DNA提取試劑盒以上均按說(shuō)明書(shū)指示方法操作，以凝膠電泳系統(tǒng)檢測(cè)DNA模板和質(zhì)量，然后用核酸定量?jī)x測(cè)定DNA濃度，選擇dsDNA為測(cè)定目標(biāo)，260nm吸光率大于0.05以上(DNA含量大于2.0ug/ul)，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之間，320nm波長(zhǎng)處吸光率接近為0的樣本作為適用模板；(6)、PCR擴(kuò)增和純化對(duì)獲取的符合條件DNA模板，以擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)體系如下PCR體系(總體系20μl)10×PCR Buffer(含15mM MgCl2x)2μ1，HotStarTaq DNA Polymerase 0.2μl，5×Q-Solution 4μ1，dNTP mix(10mM of each)2μl，Primerl 1μl，Primer21μl，模板DNA 1μl，Distilled water 8.8μl；PCR條件置擴(kuò)增儀中95℃預(yù)變性15min，用TouchdownPCR，94℃變性50sec，63℃-58℃退火1min(-0.5℃/1min，72℃延伸1min，共循環(huán)10次，94℃變性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循環(huán)30次，最后于72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物質(zhì)量控制PCR反應(yīng)產(chǎn)物要求條帶單一，濃度30-100ng；PCR產(chǎn)物純化A、過(guò)柱純化分別使用純化試劑盒和PCR純化試劑盒B、酒精/EDTA純化產(chǎn)物純化后凝膠顯像電泳評(píng)估純化質(zhì)量，編號(hào)、存檔(-80℃)C、測(cè)序反應(yīng)及純化因目前所知的EGFR第18、19和21外顯子均為雜合突變、缺失，故將10um的正反向引物均稀釋到1um，按下列體系添加反應(yīng)物1ul BigDye(2.5X)+1.5ul BigDye Seq Buffer(5X)+3ul引物+1ulPCR純化產(chǎn)物+3.5ul ddH2O；(7)、測(cè)序結(jié)果分析和報(bào)告測(cè)序結(jié)果形成書(shū)面報(bào)告操作人和報(bào)告人簽字、注期，并附上原始測(cè)序電泳圖；(8)、檔案處理登記所有檢測(cè)對(duì)象均填寫(xiě)登記申請(qǐng)單，注明病史、病理診斷、復(fù)查HE切片；全部DNA模板，PCR純化產(chǎn)物均編號(hào)-80度超低溫保存?zhèn)洳椤?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種表皮生長(zhǎng)因子受體基因檢測(cè)分析方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)社會(huì)應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明設(shè)計(jì)的EGFR第18、19和21外顯子基因片段，可以逐個(gè)從堿基和氨基酸水平與觀察分析中國(guó)人特有的該基因序列特征和突變特點(diǎn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的第21外顯子T＞G突變和A＞T及852位密碼子始插入G突變是國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道的新的雜合性突變，用于鑒定中國(guó)人靶向藥物治療，具有針對(duì)性。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)EGFR基因突變的檢測(cè)方法，檢測(cè)后再?zèng)Q定是否服藥，可明顯控制吉非替尼的不良副作用，減少不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提示非小細(xì)胞肺癌分子靶向藥物治療的良好效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1737162SQ200510038448
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日
發(fā)明者賴仁勝, 謝玲, 申龍樹(shù), 朱長(zhǎng)樂(lè) 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院), 賴仁勝, 謝玲