專利名稱：誘導血管生成的組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明的實施方案涉及在血管形成不足相關病癥中誘導血管生成的藥物組合物和方法，所述病癥例如缺血和糖尿病性病癥，例如糖尿病性足潰瘍。
背景技術：
成人新血管形成對改善缺血性疾病具有潛力,缺血性疾病在美國是發(fā)病率和死亡率的首要原因(I)。缺血性疾病包括心血管病癥，包括心絞痛、周圍動脈病、組織潰瘍(tissuesore)。Ferrara和Kerbel最近明確表達‘治療性血管生成’是心血管醫(yī)學的新出現的和令人興奮的前沿(2)。促進新血管形成，對于傷口愈合、例如在糖尿病性潰瘍的處理是至關重要的。面對糖尿病的一個主要的基礎問題就是傷口愈合受損。在所有糖尿病人(2，600，000人)中預期有15%在其一生中會出現足潰瘍。這些潰瘍的特點傾向于慢性，因為它們不能愈合或愈合極其緩慢。在美國有超過750，000個患者患有糖尿病性足潰瘍，在歐洲有980，000個，而在世界其它地區(qū)有1，100，000個，總共有2，800，000個患者。糖尿病性足潰瘍是一個嚴重問題，因為多達25%糖尿病性足潰瘍最終將需要截肢。糖尿病性傷口愈合的醫(yī)學重要性并非言過其實。愈合能力對于人類健康而言是至關重要的，因為傷口愈合使患者能克服創(chuàng)傷性損傷、手術和因例如糖尿病等代謝障礙、微生物或其它物理或化學試劑所致的傷口。因此，需要促進新血管形成的藥物。然而，對于‘治療性血管生成’而言，盡管使用重組蛋白或基因治療的早期臨床前研究和I期臨床試驗顯示出有希望的結果，但是更嚴格的II期和III期研究卻報道了不一致的結果(3-6)。這些臨床試驗的最新綜述強調了載體‘洗出’(vector ‘washout’ )導致暴露給血管生成劑(angiogenic agent)的暴露持續(xù)時間不足，這是可削弱治療有效性的關鍵因素(7)。第二個挑戰(zhàn)是血管生成因子(angiogenc factor)的穩(wěn)定性，所述血管生成因子是大的蛋白質，在正常生理條件下通常不穩(wěn)定。此外，這些蛋白質的糖基化在臨床開發(fā)上具有重大挑戰(zhàn)性。希望具有能克服這些挑戰(zhàn)的組合物和方法。發(fā)明概述
在此，我們將蛋白質工程與納米技術結合起來，克服了在治療中使用血管生成因子所觀察到的挑戰(zhàn)。本發(fā)明的實施方案基于以下觀察結果與給予游離IKi相比，肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)的片段IKl當配制成納米粒時增強血管生成。具體地講，遞送裝載有IKl的納米粒，通過ERK磷酸化導致MAPK信號轉導的持續(xù)激活，并與單給予IKl片段相比在體外和體內顯著誘導更多 的小管形成(tubulogenesis)。因此，提供包含生物相容性聚合物和有效量的肝細胞生長因子/分散因子的IKl蛋白片段的納米粒的藥物組合物，其中生物可降解聚合物包裹IKl蛋白。在一個實施方案中，所述IKl蛋白包含SEQ ID. NOilo在一個實施方案中,所述藥物組合物的納米粒的平均粒度為約50 nm至約500 nm,或約60 nm至約150 nm。在所述納米粒的配制中可使用任何生物相容性聚合物，在一個實施方案中，所述生物相容性聚合物是生物可降解聚合物并且所述生物可降解聚合物選自聚酯、羥基脂族羧酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯、聚(乙二醇)、多糖、凝集素、糖胺聚糖、脫乙酰殼多糖、纖維素和丙烯酸酯聚合物。在一個實施方案中，所述生物相容性聚合物是聚酯，例如包含聚-乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的聚酯。在某些實施方案中，所述藥物組合物的納米粒在規(guī)定的天、周或月的時間周期內釋放治療有效量的IKl蛋白，即在規(guī)定時間周期內持續(xù)釋放。在一個實施方案中，所述納米粒在約2天、約3天、約4天、·約5天、約7天、或約14天的規(guī)定時間周期內釋放治療有效量的IKl蛋白。在某些實施方案中，在規(guī)定時間周期內從所述納米粒中釋放的治療有效量足以在釋放的規(guī)定時間周期內導致細胞ERK的持續(xù)磷酸化。在某些實施方案中，與所述化合物不存在時的血管生成相比，在規(guī)定時間周期內從所述納米粒中釋放的治療有效量足以增加受試者的血管生成達至少約5%、約10%、約20%、約 30%、約 40%、約 50% 或約 60%ο在某些實施方案中，所述治療有效量是約O. lmg/kg至約1000 mg/kg的劑量。可將所述藥物組合物配制用于局部給藥、腸內給藥和胃腸外給藥。在一個實施方案中，配制所述組合物用于局部給藥，所述組合物是軟膏劑、洗劑、噴霧劑、乳膏劑或凝膠劑。也提供了治療血管形成不足相關病癥的方法。所述方法包括給予受試者治療有效量的所述藥物組合物，所述藥物組合物包含生物相容性聚合物和有效量的肝細胞生長因子/分散因子的IKl蛋白片段的納米粒，其中所述生物可降解聚合物包裹IKl蛋白。在一個實施方案中，所述治療有效量是約O. lmg/kg至約1000 mg/kg IKl蛋白的劑量。在本發(fā)明的另一方面，提供治療血管形成不足相關病癥的方法，所述方法包括給予受試者有效量的IKl蛋白，其中以導致細胞ERK的持續(xù)磷酸化的方式給予所述IKl蛋白。例如，可使用在規(guī)定的天、周或月的時間周期內釋放IKl的持續(xù)釋放制劑例如膠囊劑、凝膠齊U、薄膜劑或其它基質進行給藥。使用IKl蛋白的持續(xù)釋放制劑進行的給藥，導致ERK的持續(xù)磷酸化并增強小管形成，從而在受試者中顯著增加血管生成。所述治療所考慮的病癥包括心肌缺血性病癥(例如心肌梗塞、壞死組織的血管再形成例如梗塞或血管成形術之后的心肌的血管再形成、心絞痛、心臟移植、血管移植以及重新開放血管以改善所述損傷的血管形成、灌注、膠原化(collagenization)和組織)、傷口愈合、以及組織和器官移植(例如自體的或異源的微血管移植的增強)。對傷口愈合的促進包括切口愈合、骨修復、燒傷愈合、心肌損傷的梗塞后修復、胃潰瘍愈合和胃腸道其它潰瘍愈合，通常促進組織的形成、糖尿病性潰瘍的愈合、維持和修復。也考慮了移植組織的新血管形成，尤其是在患有血管不足、例如糖尿病的受試者中。在一個實施方案中，所述血管形成不足相關病癥選自腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、肢體缺血、心肌缺血、組織缺血、冠狀動脈缺血、周圍動脈病、肢體缺血、糖尿病性潰瘍、壞疽、需要新血管形成以促進愈合的傷口、以及Buerger綜合征(Buerger’s syndrome)。在一個實施方案中，所述血管形成不足相關病癥是糖尿病性足潰瘍。本發(fā)明的藥物組合物可經局部給藥、腸內給藥或胃腸外給藥而給予。在一個實施方案中，所述藥物組合物給予多次，例如使用不同治療方案。附圖簡述


圖1A至IH顯示IKl-肝素復合物的結構特征和與MET受體的相互作用。圖1A顯示全長多結構域HGF/SF的結構域結構。α-鏈由N-端結構域(氨基酸32-121)和4個三環(huán)結構域(kringle domain) (K1、K2、K3和K4)組成，β-鏈含有絲氨酸蛋白酶(protinease)結構域(spdh結構域)。圖1B顯示NKl-肝素復合物的晶體結構(16) (PDB檢索1GM0)。顯示2個NKl 二聚體通過肝素連接。圖1C顯示IKl-肝素復合物的晶體結構(PDB檢索3MPK)。顯示2個IKl 二聚體通過肝素連接。圖1B和圖1C用Pymol劃出。將回復突變K132E和R134E引入IKl的Kl結構域，以滅活低親和力肝素-結合位點。圖1D是IKl的氨基酸序列，顯示出突變位點。下劃線的氨基酸表示經肝素連接的2個IKl 二聚體。圖1E和圖1F顯示使用表面等離振子共振，在12聚體肝素存在下NKl和IKl分別與MET567的結合。使用自最高濃度200 nm的濃度的每種蛋白的2倍稀釋。樣品和反應緩沖液中的12聚體肝素濃度是10 μ M0圖1G和圖1H分別顯示NKl-肝素-ΜΕΤ567的三元復合物和IKl-肝素-ΜΕΤ567的三元復合物的速度沉降分析。數據顯示C(S)針對s*20，w的圖。在10聚體肝素存在下，IKl比NKl的三元復合物的量明顯更高。圖2A至2D顯示HGF /SF和IKl誘導的內皮細胞增殖。圖2A顯示在2種不同濃度(10 10 M和10 7 M)的HGF/SF和IKl存在下人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖。圖2B顯示在24 h時PI3激酶抑制劑LY294002對IKl-誘導的細胞增殖的作用。圖2C顯示在48 h時Met抑制劑PHA 665752對IKl-誘導的HUVEC增殖的作用。圖2D顯示在72 h時MAP激酶抑制劑Η)98059對IKl-誘導的HUVEC增殖的作用。數據代表平均值土SEM(η = 3)。符號“***”表示對比于經溶媒處理的對照，P值小于O. 001 ;符號表示對比于經溶媒處理的對照，P值小于0.05 ;符號“###”表示對比于IKl [10 7 Μ]，P值小于O. 001 ;符號“#”表示對比于IKl [10 7 Μ]，P值小于O. 05。圖3Α至3C顯示IKl通過與MET激酶結合而誘導內皮小管形成。圖3Α和圖3Β顯示分別使用平均管長和平均結節(jié)(node)數的3種形態(tài)測定分析，關于在生長因子減少的基質膠(growth-factor-reduced matrigel)(圖未顯示)上藥理學抑制劑對IKl-誘導的HUVEC管形成的作用的圖像的定量測定。數據代表平均值土SEM像素(η = 3)。符號表示對比于經溶媒處理的對照，P值小于0.01 ;符號“ # ”表示對比于1Κ1([10 7 Μ])，P值小于0.05。圖3C是代表性的蛋白質印跡，顯示在經Met抑制劑PHA 665752 (10 6 Μ)、LY294002 (50 μ Μ)和 PD98059 (50 μ Μ)處理 2 h,再經 IKl 處理 10 分鐘的 HUVEC 中的磷酸Erk和總Erk以及磷酸Akt和總Akt表達。數字表示1:溶媒，2: HGF/SF (10 8M),3:1Kl (10 7M), 4:1Kl + PHA 665752 (10 6 M) 5:1Kl + LY294002 (50 μ M)，6:1Kl + PD98059 (50 μ Μ)。對于樣品號4、5和6，使用IKl (10 7M)以及所述抑制劑。圖4Α至4F顯示IKl-納米粒在體外誘導血管生成。圖4Α顯示包裹IKl的納米粒(IKl-NP)的透射電鏡(TEM)圖像(條=500nm)。圖4B顯示經動態(tài)光散射實驗所測的包裹IKl的納米粒的大小分布(nm)。圖4C顯示在PBS中在室溫下溫育時從納米粒中釋放IKl的釋放動力學。Y軸上的值代表從IKl-NP中釋放的IKl的量，Wyg為單位。圖4D顯示在48 h時Met抑制劑PHA 665752對IKl-NP誘導的HUVEC增殖的作用。圖4E顯示在48h時PI3激酶抑制劑LY294002對IKl-NP誘導的HUVEC增殖的作用。圖4F顯示在48 h時MAP激酶抑制劑PD98059對IKl-NP誘導的HUVEC增殖的作用。數據代表平均值土 SEM (η=3)。符號表示對比于經溶媒處理的對照，p值小于O. OOl ;符號表示對比于經溶媒處理的對照，P值小于O. 01 ;符號“###”表示對比于IKl (10 7 M)，P值小于O. 001 ；符號“##”表示對比于IKl (10 7 M)，P值小于0.01 ;符號“#”表示對比于1Κ1(10 7M),P值小于O. 05。圖5A至5C顯示通過IKl-NP的血管生成因子的持續(xù)釋放顯著誘導血管生成反應。圖5A顯示使用平均管長，關于在基質膠上藥理學抑制劑對IKl-NP誘導的HUVEC管形成的作用的圖像的定量測定。數據代表平均值土SEM像素(η = 3)。符號表示對比于經溶媒處理的對照，P值小于O. 05 ;符號“##”表示對比于IKl (10 7 Μ)，P值小于O. 01 ;符號“#”表示對比于IKl (10 7 Μ)，ρ值小于0.05。圖5Β是代表性的蛋白質印跡，顯示在經Met抑制劑 PHA 665752 (10 6 Μ)、LY294002 (50 μ Μ)和 PD98059 (50 μ Μ)處理 2 h，再經10 min IKl-NP和IKl處理的HUVEC中的磷酸Erk和總Erk以及磷酸Akt和總Akt0數字表示1:溶媒(PBS)，2:溶媒(空PLGA)，3:新鮮制備的IKl (0.5 X 10 7M), 4:在37 °C溫育 24 h 的 IKl (O. 5 X 10 7M), 5:在 37 °C溫育 24 h 的 1K1-NP (O. 5 X 10 7M), 6:1Kl-NP + PHA665752 (10 6M), 7:1Kl-NP + LY294002 (50 μ M)， 8:1Kl-NP +PD98059 (50 μ Μ)。對于樣品號6、7和8，使用(O. 5 X 10 7M) 1Κ1-ΝΡ以及所述抑制劑。圖5C是代表性的蛋白質印跡，顯示在經(O. 5x 10 7 Μ) IKl和(O. 5 X 10 7 Μ) IKl-NP處理8. 5 h的HUVEC中的磷酸Erk和總Erk。圖6A至6F顯示使用斑馬魚模型的IKl和IKl-NP在體內介導的血管生成作用。將IKl或IKl-NP與生長因子減少的基質膠(Mgel)注射到腸下血管(SIV)附近。在所示條件的SIV然后用堿性磷酸鹽染色并在明視野中觀察，如圖6A至6E所示。所示條件是圖6A:溶媒(Mgel);圖 6B:空 PLGA 在 Mgel 中；圖 6C:1Kl 在 Mgel 中；圖 6D:1Kl-NP 在 Mgel 中;和圖6E: 1K1-NP。圖6F顯示處理對血管生成的作用的形態(tài)測定定量測定。數據顯示平均值 SEM 土(η = 3)。圖7Α 至 7D 顯示 IKl (200 ng/塞(plug))和 1Κ1-ΝΡ (200 ng/塞)在體內在生長因子減少的基質膠植入物中誘導血管生成的作用。圖7A至7D顯示針對馮維勒布蘭德因子(von Willebrand factor)免疫標記并用DAPI對核進行復染的植入物的橫截面。圖7A (溶媒)和圖7B (空NP)顯示核DAPI染色，但對馮維勒布蘭德因子染色是陰性。圖7C (IKl)和圖7D (IKl-NP)顯示用馮維勒布蘭德因子免疫標記描繪的血管圖像。以512 X 512像素分辨率捕獲圖像。發(fā)明詳述
本發(fā)明的實施方案基于以下觀察結果肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF) IKl片段當配制成納米粒時與給予游離IKl相比增強血管生成。具體地講，遞送IKl納米粒，導致MAPK信號轉導的持續(xù)激活并與單給予IKl片段相比在體外和體內顯著誘導更多的小管形成。
肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF) (SEQ ID NO: 3)是多效性生長因子，其通過Met受體而促進內皮細胞增殖和遷移(9)。在先前的研究中，我們已經證明HGF/SF通過激活促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶途徑(P13K) (11-12)而獨立于血管內皮生長因子誘導血管生成(10)。此外，Met受體已經證明在低氧中被上調，這表明HGF/SF將會引發(fā)缺血組織激活(13)。這些結果表明HGF/SF在促血管生成治療中可起到重要作用。然而，HGF/SF是肝素結合蛋白，具有由N-端(N)結構域、4拷貝三環(huán)結構域(Kl至K4)和與絲氨酸蛋白酶(SP)同源的C-端結構域組成的復雜多結構域結構(圖1A) (14)。生物活性HGF/SF如下產生通過連接第4三環(huán)和SP結構域的接頭的蛋白酶剪切，得到雙鏈(α/β)雜二聚體，其中α鏈和β鏈因以下5個推定的糖基化位點而都表現出相當的異質性3個在α -鏈中(殘基289、397和471)，2個在β -鏈中(殘基561和648)。NKl片段是編碼N結構域和Kl結構域的HGF/SF轉錄物的可變剪接變體，其缺乏糖基化位點并在硫酸肝素共同受體或其結構類似肝素存在下表現為部分受體激動劑(15)。NKl含有2個肝素結合位點1個在N結構域中，I個在包含氨基酸K132、R134和R181的Kl結構域中(14，16) ο Kl結構域通過K132和R134的反轉電荷突變(reverse charge mutation)的肝素結合位點缺失，得到蛋白IKl (K132E:R134E)，一種在體外和體內具有強效活性的Met受體的穩(wěn)定的和非糖基化的激動劑(17)。本文所用的肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)的“ 1K1”片段是指肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)的NKl片段(SEQ ID NO: 2)，其含有HGF/SF的至少部分N-端結構域和至少部分第一三環(huán)(Kl)結構域，其中Kl結構域的肝素結合位點已經被消除，例如通過插入反轉電荷突變，參見美國專利號7，795，214。在一個實施方案中，IKl片段是SEQ IDNO:1。在某些實施方案中，IKl片段與SEQ ID NO:1的多肽具有至少70%相似性、至少80%相似性、至少90%相似性、或至少95%相似性。正如本領域所知,兩個多肽間的“相似性”是通過比較一個多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物與第二多肽的序列而測定的。在一個實施方案中，IKl片段與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50%氨基酸序列同一性、至少60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一性。也考慮本文所用IKl片段的氨基酸序列添加物。

本文所用的IKl片段具有血管生成活性，即促進血管生成，例如通過刺激血管內皮細胞生長和增殖。通過使用本領域常規(guī)測定，可檢測血管生成活性，所述測定包括所附實施例中描述的任何測定。額外測定包括但不限于包括使用非血管化小鼠眼(例如Kenyon等，Invest Opthalmol. Vis. Sc1. 37:625，1996)或兔眼(例如參見 Gaudric 等，Ophthal. Res. 24:181，1992)的角膜囊袋測定(cornea pocket assay)。該測定具有的優(yōu)勢是，容易測定新血管并且新血管基本上必須是正常無血管角膜中的新形成的血管。另一測定包括使用雞絨毛膜尿囊膜(CAM測定；參見Wilting等，Anat. Embryol. 183:259,
1991)。在大鼠中的其它測定例如大鼠主動脈環(huán)模型，提供可重現的測定，其通常用于鑒定血管生成激動劑(例如參見Lichtenberg等，Pharmacol Toxicol. 84:34，1999)。通過監(jiān)測作為MET受體拮抗劑的能力，可評估活性，例如如同美國專利號7，795，214所述。本文所用的術語“血管生成”是指血管的生長或形成。血管生成包括新血管從原先存在的血管上生長，以及血管發(fā)生(vasculogenesis)(是指自發(fā)血管形成)和套疊(intussusception)(是指通過已有血管的分開所致的新血管形成)。血管生成包括“新血管形成”、“血管再生”、“新血管產生”、“血管再形成”和“增加的側支循環(huán)”。術語“血管生成劑”是指刺激、加速、促進或增加血管生成的任何化合物或物質，無論是單用或與另一物質聯用。本發(fā)明的實施方案提供納米粒藥物組合物，所述組合物包含生物相容性聚合物和有效量的HGF/SF的IKl蛋白片段。通過本領域技術人員眾所周知的方法可產生IKl蛋白。技術人員使用本文所含信息和參考文獻以及本領域已知技術(例如參見Sambrook, Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,和 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,
1992)，可以容易地制備編碼本發(fā)明多肽和/或其調節(jié)元件的全部或部分的序列。這些技術包括使用編碼NKl (SEQ ID NO: 2)的核酸的定向誘變?？蓪⒕幋aHGF/SF的IKl片段(例如SEQ ID NO:1)的核酸摻入到重組表達載體中，例如與能夠供用于被宿主細胞表達編碼序列的控制序列可操作地連接。術語“可操作地連接”是指其中所述元件呈允許它們按照它們預定方式起作用的關系的并列?？刂菩蛄信c編碼序列“可操作地連接”是以這樣的方式連接，所述方式使得在與控制序列相容的條件下完成編碼序列的表達。可選擇或構建合適的載體，其含有合適的調節(jié)序列，包括啟動子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和其它合適序列。載體可以是質粒、病毒例如噬菌體噬菌?；驐U狀病毒、粘粒、 YAC、BAC或PAC，如果合適的話?？商峁┚哂袕椭破瘘c、任選表達所述多核苷酸的啟動子和任選所述啟動子的調節(jié)子的載體。載體可含有一個或多個選擇標記基因，例如就細菌質粒而言的氨芐青霉素抗性基因或對于哺乳動物載體而言的新霉素抗性基因?？稍隗w外使用載體，例如用于產生RNA或者用于轉染或轉化宿主細胞。在各種各樣不同宿主細胞中克隆和表達多肽的系統(tǒng)是熟知的。合適的宿主細胞包括細菌、真核細胞(例如哺乳動物和酵母)和桿狀病毒系統(tǒng)。在本領域中可用于異源多肽表達的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、COS細胞等。可選擇與宿主細胞相容的啟動子和其它表達調節(jié)信號，對于所述宿主細胞而設計表達載體。例如，酵母啟動子包括釀酒酵母CS cerevisiae) GAL4啟動子和ADH啟動子、粟酒裂殖酵母CS pombe) nmtl啟動子和adh啟動子。哺乳動物啟動子包括響應重金屬例如鎘的金屬硫蛋白啟動子。病毒啟動子例如SV40大T抗原啟動子或腺病毒啟動子也可使用。所有這些啟動子在本領域都易得。載體可包含其它序列(使得作為融合物產生所述多肽)和/或編碼分泌信號的核酸(使得宿主細胞產生的多肽從細胞中分泌出)。例如，在一個實施方案中，所述多肽經修飾，例如通過添加組氨酸殘基，以有助于其純化?？蓪⑤d體引入如上所述的合適宿主細胞中，以提供IKl多肽的表達?？蛇x擇與所述載體相容的細胞，并且所述細胞可以是例如細菌、酵母(例如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastor is))、昆蟲或哺乳動物。將載體引入宿主細胞，然后引起或允許所述核酸表達，例如通過在表達所述基因的條件下培養(yǎng)宿主細胞，使所編碼多肽得以產生。如果所述多肽與合適的信號前導肽一起表達，它可從細胞內分泌到培養(yǎng)基中。經表達產生之后，可從宿主細胞和/或培養(yǎng)基中分離和/或純化多肽。在一個實施方案中，IKl多肽呈基本純化的形式，在這種情況下通常在以下制劑中含有所述多肽，其中超過90%、例如95%、98%或99%所述多肽在制劑中。然后可測定IKl多肽的血管生成活性。
本文所用的“有效量”包括允許進行其預定功能(例如在本文所述的新血管形成不足相關病癥中刺激血管生成)的試劑(例如IKI多肽)量。有效量將取決于多種因素， 包括遞送方式、生物活性、年齡、體重、性別、一般健康、待治療病癥的嚴重程度、以及合適的藥物動力學特性。理解的是，當一種試劑例如IKI片段單用時，與該試劑與另一血管生成劑聯用時相比，其有效量可以是不同量。
術語“藥物組合物”是指配制在本領域通常接受的用于將生物活性化合物遞送到哺乳動物例如人的介質中的化合物的制劑。因此，這樣的介質包括所有藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本文所用的術語“納米?！笔侵附浝绻馍⑸浞椒y定的尺寸不大于1，000 nm的顆粒。在一個實施方案中，所述納米粒的平均粒度為約2. 5至約999 nm。在一個實施方案中，所述納米粒的平均粒度為約.5至約500 nm。在某些實施方案中，大小范圍為約25至約300 nm、約50至約200 nm。在某些實施方案中，納米粒大小不大于500 nm、不大于300 nm、不大于200 nm、不大于160 nm、或不大于150 nm、或不大于140 nm。
本文所述的藥物組合物的納米粒包含包裹蛋白片段IKl的生物相容性(例如生物可降解)聚合物。本文所用的術語“包裹”或“包入”是指生物相容性聚合物覆蓋或包住IKI 蛋白。在一個實施方案中，所述生物可降解聚合物用例如外部球形聚合物層完全覆蓋即包住IKl蛋白。在一個實施方案中，所述IKl蛋白僅被生物相容性聚合物部分覆蓋。在一個實施方案中，所述IKI蛋白在生物相容性聚合物表面上。在一個實施方案中，所述IKl蛋白存在于生物相容性聚合物內。
在某些實施方案中，在所述組合物中聚合物與IKl的比例范圍可為約1:20至約 20:1。比例范圍可為約1:120至約10:1、約1:30至約5:1、或約1:20至約1:1。在某些實施方案中，比例范圍為約1:20至約1:5。在某些實施方案中，比例為約1:13。在一個實施方案中，比例范圍為約1:1至約3:1。應當知道，該比例可基于重量、體積和/或摩爾。
在某些實施方案中，與納米粒締合的至少約5% 1K1、至少約10% 1K1、至少約15% IKl、至少約20% IKl、至少約30% IKl、至少約40% IKl、至少約50% IKl、至少約60% IKl、至少約70% 1K1、至少約80% 1K1、至少約90% 1K1、至少約95% 1K1、或至少約97%、約98%、或約99% 1K1、或100% 1K1，可在預定時間周期內從所述納米粒中釋放出來。在這樣的實施方案中，所需量的IKl可在至少約6小時、至少約12小時、至少約I天、至少約2天、至少約3 天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約I周、至少約2周、至少約I月或至少約2 月的時期內從所述納米粒中釋放出來。在一個實施方案中，所述IKl在至少約I周的時期內從所述納米粒中釋放出來。
在一個實施方案中，在規(guī)定時間周期內從納米粒中釋放的治療有效量的IKl在規(guī)定釋放時間周期內足以導致細胞ERK的持續(xù)磷酸化。測定ERK磷 酸化的方法是本領域技術人員眾所周知的。在一個實施方案中，ERK磷酸化經蛋白質印跡分析來測定，參見例如實施例I。在一個實施方案中，與使用不與納米粒締合的相當濃度的IKl所觀察到的ERK磷酸化相比，細胞ERK的磷酸化增加至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、或至少約90%。
在一個實施方案中， 在規(guī)定時間周期內釋放的治療有效量的IKl足以與所述化合物不存在時的血管生成相比，增加受試者的血管生成至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、或至少約90%。
合適的生物相容性聚合物(其中許多是生物可降解的)包括例如聚(丙交酯)、 聚(乙交酯)、乙交酯-丙交酯共聚物、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚酐、聚(酰胺)、聚(氨基酸)、聚乙二醇及其衍生物、聚原酸酯、聚縮醛類、聚氰基丙烯酸酯、聚醚酯、聚二氧雜環(huán)己酮、聚(亞烷基烷基酯)、聚乙二醇和聚原酸酯的共聚物、生物可降解的聚氨酯。其它聚合物包括聚(醚)例如聚(氧化乙烯)、 聚(乙二醇)、和聚(四亞甲基氧化物)；乙烯聚合物-聚(丙烯酸酯)和聚(甲基丙烯酸酯)例如甲基、乙基、其它烷基、羥乙基甲基丙烯酸酯、丙烯酸和甲基丙烯酸，和其它例如聚 (乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)和聚(乙酸乙烯酯)；聚(氨酯)；纖維素及其衍生物例如烷基、羥基烷基、醚類、酯類、硝基纖維素和不同醋酸纖維素；聚(硅氧烷)等。其它聚合材料包括基于天然存在的材料的那些，例如多糖(例如藻酸鹽)、脫乙酰殼多糖、瓊脂糖、透明質酸、明膠、膠原和/或其它蛋白、及其混合物和/或其修飾形式。也包括本文所公開的任何聚合物的化學衍生物(取代、化學基團(例如烷基、亞烷基)的添加、羥化、氧化和本領域技術人員常規(guī)進行的其它修飾)。聚合物可具有不同的平均鏈長，導致多種固有粘度和聚合特性，所述平均鏈長例如5，000-200, 000，優(yōu)選15，000-25, 000分子量。此外，混合物、接枝聚合物和共聚物，包括任何這些聚合物的嵌段共聚物，都可使用?？梢岳斫猓罅坎煌酆衔镒兓强傻玫降??？梢岳斫?，這些聚合物中的某些需要使用合適的引發(fā)劑或交聯劑，以導致聚合。
在一個實施方案中，用于本文所述聚合物的生物相容性聚合物是生物可降解的， 使得在給予受試者之后，所述基質被降解和代謝，從而在延長的時間周期內釋放出IKl蛋白。本發(fā)明所用生物可降解聚合物的某些實例包括羥基脂族羧酸，其為均聚物或共聚物，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯、聚(乙二醇)；多糖、例如凝集素、糖胺聚糖、例如脫乙酰殼多糖；纖維素、丙烯酸酯聚合物等。聚合物的選擇可通過給予所需組織之后的所需降解率而確定。
一般而言，以下標準對于用于遞送活性劑的材料的選擇而言是重要的(I)最小細胞毒性或無細胞毒性，(2)最小限度引發(fā)或不引發(fā)免疫應答和炎癥，(3)與水溶液和生理條件相容，(4)所述材料及其加工方法與IKl蛋白或所摻入的其它試劑的穩(wěn)定性的相容性。在本文所述的方法中，合意的是使用具有受控的生物降解率的材料?？蛇x擇交聯和單體濃度等特征，以提供所述試劑的降解和釋放的所需速率?？赏ㄟ^本領域技術人員眾所周知的方法或通過本文所述的方法(參見例如實施例1)來監(jiān)測試劑的釋放。
在一個實施方案中，所述聚合物是生物相容性聚酯。術語“生物相容性聚酯”包括通過聚合一種或多種單體而制備的任何聚酯，所述單體包括但不限于D，L-丙交酯、D-丙交酯、L-丙交酯、D, L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙交酯、乙醇酸、ε-己內酯、ε-羥基己酸、 Y-丁內酯、Y-羥基丁酸、S-戊內酯、δ-羥基戊酸、羥基丁酸、蘋果酸等。
在一個實施方案中，所述生物相容性聚合物是聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物或乳酸-天冬酰胺共聚物、例如PLGA或PEG/CS-PLGA (PLGA的聚乙二醇/脫乙酰殼多糖衍生物)。本文所用的術語“PLGA”意指以任何比例例如1:99至99:1、優(yōu)選3:1的乳酸或丙交酯和乙醇酸或乙交酯的共聚物。它們也被稱為聚丙交酯-乙交酯共聚物?？墒褂贸Ｒ?guī)方法自任何單體合成制備PLGA或可市購獲得PLGA?？墒匈彽腜LGA包括例如PLGA 7520 (乳酸乙醇酸=75:25,平均分子量20，000，Wako Junyaku, Japan)。在一個實施方案中，所述PLGA含有25-65% (重量)乳酸和乙醇酸。
在一個實施方案中，所述生物相容性聚合物的表面經修飾，例如經聚乙二醇(PEG) 修飾，導致水溶性蛋白與所述聚合物的親和力增加，這使得更容易包裹。其它修飾方法是本領域技術人員已知的。
在某些實施方案中，所述納米粒還包含用于將所述納米粒靶向目標位置(例如組織、細胞等)的靶特異性標簽(靶標部分)。本文所用的“靶向部分”是指能特異性結合特定靶分子并形成結合復合物的所有分子。因此，配體及其相應靶分子構成特異性結合對。
術語“特異性結合”是指發(fā)生在諸如酶/底物、受體/激動劑、抗體/抗原、以及凝集素/碳水化合物等配對物之間的結合，其可以經共價或非共價相互作用或者共價和非共價相互作用的組合而介導。當兩種物質相互作用產生非共價結合的復合物時，發(fā)生的結合通常是靜電、氫鍵合、或親脂性相互作用的結果。因此，〃特異性結合〃發(fā)生在配對物之間， 其中在這兩種物質之間有相互作用，其產生具有抗體/抗原或酶/底物相互作用的特征的結合復合物。具體地講，特異性結合的特征在于配對物的一個成員與特定物質結合，而不與該結合成員的相應成員所屬的化合物家族內的其它物質結合。因此，例如，抗體優(yōu)選與蛋白家族內的單一表位、而非另一表位結合。
靶向部分的實例包括但不限于抗體、淋巴因子、細胞因子、受體蛋白質例如CD4和 CD8、溶解的受體蛋白例如可溶性CD4、激素、生長因子、肽模擬物、合成配體等(其特異性結合所需靶細胞)以及核酸(其通過堿基對互補而結合相應核酸)。特別感興趣的靶向部分包括肽模擬物、肽、抗體和抗體片段(例如Fab’片段)。例如，β-D-乳糖已經連接在表面以革巴向肝細胞中存在的去唾液酸糖蛋白(aloglysoprotein, ASG),所述肝細胞與循環(huán)血池接觸。
細胞靶標包括組織特異性細胞表面分子，用于靶向特異性目標位點，例如神經組織、肝組織、肌肉細胞等。內皮細胞是特別感興趣的靶標，尤其是血管中或缺血組織附近或傷口附近存在的內皮細胞。內皮細胞上存在的標記中有整聯蛋白，已經表征了多種不同亞型的整聯蛋白。整聯蛋白可對參與特定生理過程的內皮細胞具有特異性，例如某些整聯蛋白與炎癥和白細胞運輸有關(參見Alon & Feigelson (2002) Semin Immunol. 14(2) :93-104 ;和Johnston & Butcher (2002) Semin Tmmunol 14(2) :83-92,通過引用結合到本文中)。對ICAM-1、VCAM-1等分子具有特異性的靶向部分可用于靶向發(fā)炎組織中的血管。靶向納米粒描述于例如美國專利申請2004/0126900。
納米粒的制備 可用本領域技術人員熟知的和實施的多種方法來制備本文所述的納米粒。形成包裹生物活性材料的納米粒的實例方法包括但不限于單體的乳液聚合、界面聚合、界面縮聚、 乳化/溶劑蒸發(fā)、相分離、溶劑置換和界面沉積、乳化/溶劑擴散(ESD)、鹽析方法、噴霧干燥和冷凍干燥，合適的方法和指南在以下文獻中提供例如Reis等，Nano capsulation1. “Methods for the preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles (用于制備裝載有藥物的聚合納米粒的方法)”，Nanomedicine: Nano technology, Biology, and Medicine 2 (2006) 8-21 ；和 Muthu, “Nanoparticles based on PLGA and its co-polymer: an overview (基于 PLGA 及其共聚物的納米粒綜述)” Asian J. Pharmaceutics 2009年10月-12月，第266-273頁。另見美國專利申請順序號 20080095856和20080131513。特定特性(例如流動性、溶出率、分散性、化學反應性、生物功效和親水性)至納米粒中的工程改造可用于于多種應用。(參見Davies等,Adv. Mater. 1998，10，1264-1270 ;Wang 等，7； Controlled Release, 1999，57，9-18 和 Zambaux M 等，Influence of experimental parameters on the characteristics of poly (lactic acid) nanoparticles prepared by double emulsion method (實驗參數對通過雙重乳劑方法制備的聚(乳酸)納米粒的特征的影響)· J. Control. Release 1998 ；50: 31-40)。
形成納米粒的一種方法是溶劑蒸發(fā)法。在該方法中，將聚合物溶于有機溶劑例如二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯中，其也可用作溶解疏水性藥物的溶劑。再將聚合物和藥物溶液的混合物在含表面活性劑或乳化劑的水溶液中乳化，形成水包油(Ο/V)乳劑。在形成穩(wěn)定乳劑之后，有機溶劑經減壓或經持續(xù)攪拌而蒸發(fā)。穩(wěn)定劑的種類和濃度、勻漿器速度和聚合物濃度可影響粒度。為了產生小粒度，通常可使用高速勻漿或超聲處理。
自發(fā)乳化或溶劑擴散方法是溶劑蒸發(fā)法的改良形式。在該方法中，可與水混溶的溶劑以及少量不與水混溶的有機溶劑用作油相。因為溶劑自發(fā)擴散，兩相之間產生界面擾動，導致形成小顆粒。隨著可與水混溶的溶劑濃度增加，粒度可下降。溶劑蒸發(fā)和溶劑擴散法都可用于疏水性藥物或親水性藥物。就親水性藥物的情況而言，需要形成將藥物溶于內部水相的多重w/o/w乳劑。
在一個實施方案中，通過本領域實施良好的雙重乳劑-溶劑擴散方法(參見例如 Rocha等，(2008) Biomaterials, 29:2884-2890)制備包含IKl蛋白和生物相容性聚合物的納米粒。例如，水包油包水(w/o/w)溶劑蒸發(fā)系統(tǒng)用于形成納米粒。將生物相容性聚合物與有機溶劑混合，所述有機溶劑例如乙酸乙酯、二甲基氯(也稱為亞甲基氯和二氯甲烷)、乙腈、丙酮、氯仿等?？商峁┰谟袡C溶劑中呈2-15%溶液的聚合物。聚合物越粘稠，活性劑例如IKl從納米粒中釋放得越慢。加入大致等量的藥物/試劑溶液并用例如超聲處理使聚合物溶液乳化。
活性劑(例如IKl和任選額外的活性劑)和聚合物的濃度、以及活性劑/聚合物的比例，允許控制粒度和包裹得率。選擇濃度以通過經本領域已知的優(yōu)化而提供所需終產物。一般而言，對于較小粒度而言選擇較低濃度的活性劑，對于較大粒度而言則選擇較高濃度的活性劑。聚合物與活性劑的比例較高，將會提供較厚的聚合物包裹，而聚合物與活性劑的比例較低則將提供較薄的包衣，其進而影響釋放。IKl濃度通常為至少約0.001 mg/ml、 更通常至少約0. 01 mg/ml、至少約0.1 mg/ml、或I mg/ml、和不超過約100 mg/ml,通常不超過約10 mg/ml。聚合物濃度通常為至少約0. 01 mg/ml,更通常為至少約0.1 mg/ml、至少約I mg/ml、和不超過約100 mg/ml、通常不超過約50 mg/ml。按照重量百分比的化合物與聚合物的比例可不同，為約1:1000 ;約1:500 ;約1:100、約1:50 ;約1:10 ;約1:20、約1:5等。
然后將乳劑與較大體積的乳化穩(wěn)定劑例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮的水溶液混合。通常提供呈約2-15%溶液、更通常約4-10%溶液的乳化穩(wěn)定劑。然后將所得混合物勻漿，得到穩(wěn)定的w/o/w雙重乳劑。然后蒸發(fā)有機溶劑；例如，參見實施例1。納米?？山涬x心收集。
可操縱制備參數以調節(jié)粒度和IKl釋放率。參見Zambaux M等，Influence of experimental parameters on the characteristics of poly (lactic acid) nanoparticles prepared by double emulsion method (實驗參數對通過雙重乳劑方法制備的聚(乳酸)納米粒的特征的影響)· · J. Control. Release 1998 ；50: 31-40，通過引用全部結合到本文中。通過低水相體積和高濃度PVA而產生小顆粒。
可通過凍干等,經粉末化(powderization),將納米粒轉化為可再分散的聚集粉末 (納米復合物(nanocomposit))。在一個實施方案中,將納米粒與有機物或無機物經再分散混合(redispersiably compIexed)并干燥。例如，通過使用糖醇或鹿糖，可有效控制負荷速率的變化。由于充當填充劑的糖醇所致，可改善處理的容易性。糖醇包括但不限于甘露醇、海藻糖、山梨醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、木糖醇等，優(yōu)選海藻糖。納米粒向聚集物的轉化簡化處理，并可在使用前通過將其與水接觸而將它們重構為高反應性納米粒(。或者，不用凍干，可通過流動床干燥制粒方法(使用例如Aggromaster AGM, Hosokawamicron, Japan) 將納米粒轉化為復合物，形成可再分散的聚集物。
在一個實施方案中，所述納米粒含有生物活性物(例如IKl蛋白)的比例為 O. 1-99% (w/v),優(yōu)選O. 1-30% (w/v),和更優(yōu)選1-10% (w/v)。在一個實施方案中，所述生物活性物包括IKl蛋白和一種或多種額外治療劑?？捎糜谒幬锝M合物的額外治療劑的實例包括但不限于新血管劑(neovascular agent)(例如已知增加血管形成的其它試劑)、抗生素、抗炎藥和維生素。另外，可將所述藥物組合物與額外治療劑一起配制，配制成納米粒或非納米粒。一般而言，額外試劑不應與IKl的血管生成促進作用發(fā)生抵觸。
本文所述的術語“治療劑”是指用于疾病的診斷、治療或預防的物質。本領域普通技術人員已知在疾病的診斷、治療或預防中有益的任何治療劑都預期為本發(fā)明情況中的治療劑。治療劑包括藥物活性化合物、激素、生長因子、酶、DNA、質粒DNA、RNA、siRNA、病毒、蛋白、脂質、促炎分子、抗體、抗生素、抗炎藥、反義核苷酸和轉化核酸或其組合。任何治療劑都可混合到這類組合是生物相容的程度。
藥物組合物在一個實施方案中，使用作為持續(xù)釋放制劑例如并非納米粒的持續(xù)釋放制劑的藥物組合物，將IKI蛋白遞送給受試者。適于持續(xù)釋放的制劑的載體包括但不限于膠囊劑、微球體、顆粒、凝膠劑、包衣、基質、糯米紙囊劑、丸劑或其它藥物遞送組合物。這類持續(xù)釋放制劑的實例先前已描述于例如美國專利號6，953，593,6, 946，146,6, 656，508,6, 541，033、 6，451，346，其內容都通過引用結合到本文中。制備持續(xù)釋放制劑的許多方法都是本領域已知的并公開于 Remington’s Pharmaceutical Sciences (第 18 版；Mack Publishing Company, Eaton, Pa. , 1990),其通過引用結合到本文中，是本領域技術人員眾所周知的。
例如，可將IKl包入固體疏水性聚合物的半透性基質中。所述基質可成形為薄膜劑或微膠囊劑。這類基質的實例包括但不限于聚酯、L-谷氨酸和Y乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman 等，Biopolymers 22:547-556 (1983))、聚丙交酯(美國專利號 3，773，919 和 EP 58，481)、聚乳酸聚乙醇酸(polyl actate polyglycolate, PLGA)例如乙交酯-丙交酯共聚物(參見例如美國專利號4，767，628和5，654，008)、水凝膠(參見例如Langer等(1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 ；Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982))、非降解性乙烯-醋酸乙烯酯(例如乙烯醋酸乙烯酯盤和乙烯-醋酸乙烯酯共聚物)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如Lupron Depot 、聚-D-(−)-3-輕基丁酸(EP 133，988)、透明質酸凝膠(參見例如美國專利號4，636，524)、藻酸懸液、聚原酸酯(POE)等。
能夠包裹IKl的合適微膠囊劑也可包括羥甲基纖維素或明膠的微膠囊劑以及經凝聚技術或經界面聚合制備而成的聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊劑。另外，也可使用微乳劑或膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)例如脂質體和白蛋白微球體。參見Remington’s Pharmaceutical Sciences (第 18 版；Mack Publishing Company Co. , Eaton, Pa. , 1990)。其它優(yōu)選的持續(xù)釋放組合物使用生物粘合劑，以將IKI保留在給藥部位。
所述持續(xù)釋放制劑可包含IKl試劑置于其中的生物可降解聚合物，其可提供非立即釋放。適于持續(xù)釋放制劑的生物可降解聚合物的非限制性實例包括聚(^-羥酸)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PG)、聚(α -羥酸)的聚乙二醇 (PEG)綴合物、聚原酸酯、聚阿司匹林(polyaspirin)、聚磷腈(polyphosphagene)、膠原、 淀粉、脫乙酰殼多糖、明膠、藻酸鹽、葡聚糖、乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇(PVA)、PVA-g-PLGA、 PEGT-PBT共聚物(polyactive)、甲基丙烯酸酯類、聚(N-異丙基丙烯酰胺)、ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0 (pluronics)、PEO-PPO-PAA共聚物、PLGA-PE0-PLGA、聚原酸酯(POE)、或其任何組合，如以下文獻所述例如美國專利號6，991，654和美國專利申請?zhí)?0050187631，其各自通過引用全部結合到本文中。
普通技術人員將會理解，持續(xù)釋放制劑的不同組合也適合本發(fā)明。例如，從業(yè)人員可配制IKl蛋白作為裝載至少一種Ikl的凝膠劑和微球體的組合，其中將凝膠劑和微球體的組合放置在靶部位。根據載體、持續(xù)釋放制劑和IKl總量的不同，可在約I天至約6個月的時間周期范圍內釋放IKI。
在一個實施方案中，在規(guī)定時間周期內從所述持續(xù)釋放制劑中釋放的IKl的量， 在規(guī)定時間周期內足以導致細胞ERK的持續(xù)磷酸化。評價ERK磷酸化的方法是本領域技術人員眾所周知的，并且可容易地確定劑量。在一個實施方案中，使用持續(xù)釋放制劑，與用在規(guī)定時間周期內并非以持續(xù)方式釋放的相同劑量的IKl所觀察到的小管形成相比，受試者的小管形成增加至少5%、至少10%、至少30%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%。在規(guī)定時間周期內釋放的有效量的IKl的范圍為約0.01 mg/kg至約1000 mg/kg、 約.1 mg/kg 至約 100mg/kg、約 0.1 mg/kg 至約 200 mg/kg、約 0. 2 mg/kg 至約 20 mg/kg。
本發(fā)明的納米?？膳渲圃谒幬锝M合物中，用于給予受試者。根據所需制劑的不同， 藥物組合物可包含藥學上可接受的、無毒稀釋劑載體，其限定為常用于配制供動物或人類給藥用的藥物組合物的溶媒。選擇稀釋劑，使其不影響組合的生物活性。這類稀釋劑的實例是蒸餾水、緩沖水、生理鹽水、PBS、林格液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。另外，所述藥物組合物或制劑可包含其它載體、或無毒、無治療性、非免疫原性的穩(wěn)定劑、賦形劑等。所述組合物也可包含接近生理條件的額外物質，例如pH調節(jié)劑和緩沖劑、毒性調節(jié)劑、潤濕劑和去垢劑。
可使用本領域技術人員眾所周知的方法配制所述藥物組合物。所述藥物組合物可包含0. 1%至99%(重量)的活性成分，例如包含IKl片段的納米粒。在一個實施方案中，所述組合物包含約1%至約80%、約1%至約70%、或約1%至約50%、或約1%至約20% (重量)的活性成分。有關適合不同給藥類型的制劑的進一步指南可參見Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa.,第 17 版(1985)。關于藥物遞送方法的簡要綜述,參見 Langer, Science 249:1527-1533 (1990)。
本文所述的藥物組合物可以各種不同方式給予。本發(fā)明的藥物組合物可經特別配制，用于以固體或液體形式給藥，包括適用于以下給予的那些形式(I) 口服給藥，例如，灌服劑(水性或非水性的溶液劑或混懸劑)、錠劑、糖錠劑、膠囊劑、丸劑、片劑(例如針對口腔、舌下和系統(tǒng)吸收靶向的那些)、大丸劑、粉劑、顆粒劑、用于施用于舌頭的貼劑；(2)胃腸外給藥，例如通過皮下、肌內、靜脈內或硬膜外注射，例如以無菌溶液劑或混懸劑、或持續(xù)釋放制劑的形式；(3)局部施應，例如，以乳膏劑、軟膏劑或控制釋放貼劑或施應于皮膚的噴霧劑的形式；(4)陰道內或直腸內，例如以子宮栓劑、乳膏劑或泡沫劑的形式；(5)舌下；(6) 眼部；(7)透皮；⑶跨黏膜；或(9)鼻腔。
對于口服給藥，活性成分可以固體劑型(例如膠囊劑、片劑和粉劑)或液體劑型 (例如酏劑、糖漿劑和混懸劑)給予?？蓪⑺龌钚猿煞峙c無活性成分和粉末狀載體一起包裹在明膠膠囊中，所述無活性成分和粉末狀載體例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石粉、碳酸鎂?？蔀榱颂峁┧桀伾⑽兜?、穩(wěn)定性、緩沖能力、分散性或其它已知所需特征而添加的額外無活性成分的實例是紅色氧化鐵、硅膠、月桂基硫酸鈉、二氧化鈦和可食用白色墨水。類似的稀釋劑可用于制造壓縮片劑。可將片劑和膠囊劑制備成持續(xù)釋放產品，以提供在幾小時的時間周期內的持續(xù)釋放藥物。可將壓縮片劑包糖衣或薄膜衣，以掩蔽任何令人不快的味道并保護片劑免遭空氣破壞，或者包腸溶衣，用于在胃腸道中選擇性崩解。用于口服給藥的液體劑型可含有著色劑和矯味劑，以增加患者的接受性。
可將所述活性成分(單用或與其它合適成分聯用)制備成經吸入給藥的氣溶膠制劑(即它們可以被“霧化”)?？蓪馊苣z制劑放入加壓的可接受拋射劑·例如二氯二氟甲烷、 丙烷、氮氣中。
適于胃腸外給藥(例如經關節(jié)內(在關節(jié)中)、靜脈內、肌內、皮內、腹膜內和皮下途徑)的制劑，包括水性和非水性的等滲無菌注射用溶液劑(其可含有抗氧化劑、緩沖劑、 抑菌劑和賦予制劑與預期受體的血液等滲的溶質)和水性和非水性無菌混懸劑(其可包含助懸劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑)。
用于配制所述藥物組合物的成分優(yōu)選是高純度的并且基本不含潛在有害的污染物(例如至少是國家食品(National Food, NF)級,通常至少是分析級,更通常至少是藥用級)。此外，預期用于體內使用的組合物是無菌的。在必須在使用之前合成給定化合物方面來說，所得產物通?；静缓诤铣苫蚣兓に嚻陂g可存在的任何潛在毒性劑，尤其是任何內毒素。用于胃腸外給藥(parental administration)的組合物也是無菌的,基本上是等滲的并在GMP條件下制備。
在血管形成不足受試者中促進血管生成的方法。
所述藥物組合物可用于治療或預防以受累組織的血管形成不足(或有其傾向性) 為特征的病癥，即其中在受累組織中需要新血管形成以達到充足的血管形成的病癥。
在某些實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于在生物體(biological matter)中治療或預防受益于刺激血管生成或增加血管生成的多種疾病和障礙中的任一種。例如， 本發(fā)明的組合物和方法可用于在體外或離體(例如在適用于移植到生物體例如哺乳動物中的組織或器官的培養(yǎng)、存儲或產生中)促進、增強或增加生物體中的血管生成。
本發(fā)明的組合物和方法也可用于在體內(例如在傷口部位或者在經歷缺血或低氧或處于缺血或低氧危險之中的生物體內的部位)促進、增強或增加血管生成，從而在經歷缺血或處于缺血危險之中的組織中增加血流和氧化并減少或預防所述部位的組織損傷。
在某些實施方案中，本發(fā)明包括用于治療或預防受益于增加血流的病理性病癥、 疾病和障礙的組合物和方法。這類病癥的實例包括缺血相關疾病。缺血相關疾病的實例包括心肌缺血、周圍缺血、腦缺血和深靜脈血栓形成。
此外，在相關實施方案中，本發(fā)明包括治療傷口愈合、糖尿病(例如糖尿病性足潰瘍)、眼病或眼障礙、心臟病、充血性心力衰竭、心肌缺血、周圍缺血、淋巴脈管障礙、冠狀動脈病、中風、心絞痛和周圍血管病的組合物和方法。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法用于傷口愈合或重建手術。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括通過給予有需要的受試者、得自所述受試者的細胞、組織或器官包含本文所述的IKl-納米粒的藥物組合物，治療新血管形成不足相關病癥的方法。所述給予呈有效刺激或增加血管生成的量。在具體實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在某些實施方案中，所述組合物局部給予例如需要血管生成的受試者體內的部位。 受試者體內的這些部位的實例包括傷口和經歷缺血或低氧或處于缺血或低氧危險之中的組織或器官。在其它實施方案中，IKl-納米粒經系統(tǒng)給予。在進一步的實施方案中，將IKl 納米粒離體給予得自所述受試者的細胞、組織或器官，并使所述細胞、組織或器官與所述納米粒接觸，再移植回所述受試者。
本文所用的“促進血管生成”、“增強血管生成”和“增加血管生成”是指新血管的數量和形成增加。
疾病或障礙的“治療”、“預防”或“改善”意指延遲或預防所述疾病或障礙的發(fā)作，逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或終止所述疾病或障礙的進展、惡化或變壞、所述疾病或障礙相關病癥的進展或嚴重程度。在一個實施方案中，疾病或障礙的癥狀減輕至少5%、至少 10%、至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%。
本文所用的短語“治療有效量”意指以適用于任何醫(yī)學治療的合理的利益/危險比，在受試者細胞的至少亞群體中有效產生某些所需治療效果的IKi蛋白或包含本發(fā)明 IKl蛋白的組合物的量。例如，給予受試者的化合物的量足以在與血管形成減少的病癥相關的至少一個癥狀方面產生統(tǒng)計學意義的可檢測的變化。癥狀可因受累組織的不同而異。一般而言，組織缺血與受累組織的氧減少、不適和疼痛以及組織死亡相關；腦缺血，一種流向腦部的血流不足的病癥，可能與視力、身體運動和講話的損害相關；心肌缺血可能與泵送效率下降、心臟病發(fā)作和異常心律相關；當流向腸或胃腸系統(tǒng)(腸)的血流減少時發(fā)生的腸系月旲缺血綜合征，與腹部疼痛、惡心和/或嘔吐和血便有關；等。技術人員可以容易地確定合適的癥狀，用于測定治療有效量。治療有效量的測定完全在本領域技術人員的能力范圍之內。通常，治療有效量可因受試者的病史、年齡、條件、性別以及受試者的醫(yī)學病癥的嚴重程度和種類和其它藥物活性劑的給予的不同而異。
在一個實施方案中，當與所述化合物不存在時的血管生成相比，所述治療有效量足以在受試者中增加血管生成(如在所述受試者中檢測，或如通過已建立的血管生成測定而檢測)達至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約 35%、至少約40%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、 至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。可在體外(例如增殖測定、體外管測定)或體內(例如CAM測定、角膜測定、斑馬魚模型)評價血管生成的％增加。測定人的血管生成的一個實例方法是通過瞬時氧測定(transient oxygen assay)。
治療有效量通常范圍為約O. 01 mg/kg至約1000 mg/kg、約· I mg/kg至約IOOmg/ kg、約O.1 mg/kg至約200 mg/kg、約O. 2 mg/kg至約20 mg/kg,每天給予一個或多個劑量， 持續(xù)一天或多天。在某些實施方案中，治療有效量在某時間周期(例如數小時、數天或數周)內從所述組合物中釋放。在一個實施方案中，治療有效量在約2天、約3天、約4天、約 5天、或約7天內釋放。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括在生物體中促進、增強或增加血管生成的方法，所述方法包括使所述生物體接觸有效量的包含IKl的納米粒。在具體的實施方案中,所述生物體是哺乳動物，例如哺乳動物的細胞、組織、器官或動物(例如人類受試者)。在具體的實施方案中，所述生物體是動物例如哺乳動物。在具體的實施方案中，與不存在用包含IKl的納米粒進行的治療相比，血管生成量增加至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少100%、 至少200%、至少500%或至少1000%。類似地，與不存在用包含IKl的納米粒進行的治療相比,血管生成量可增加至至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍。用本領域中的常規(guī)測定并如本文所述，可容易地測定血管生成量。
用于體內采用包含IKl-納米粒的組合物的額外應用包括缺血組織例如缺血性心臟組織和缺血性周圍組織的血管形成，以及慢性傷口、燒傷和移植組織的血管形成。
本文所用的術語“缺血”是指與充氧的血流向身體部分的不足流動相關的任何病癥。缺血發(fā)生在流向組織的血減少至低于臨界水平的任何時間。這種血流減少可因以下非限制性情況所致(i)因栓塞(血凝塊)所致的血管堵塞；( )因動脈粥樣硬化所致的血管堵塞；(iii)血管破裂(出血性中風)；(iv)因血管收縮(例如血管痙攣期間和可能在短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)期間和蛛網膜下出血之后發(fā)生的血管收縮)而導致的血管堵塞。 發(fā)生缺血的其它情況包括(i)在心肌梗塞期間(當心臟停止，流向器官的血流減少并導致缺血創(chuàng)傷；(iii)在心臟手術和神經手術期間(需要減少或停止血流，以達到手術的目的)JPiv)糖尿病性相關缺血。
可給予所述藥物組合物用于預防性和/或治療性治療?？砂凑諛藴仕帉W方法，在細胞培養(yǎng)和/或實驗動物中測定所述活性成分的毒性和療效，包括例如測定LD5tl (50%群體致死的劑量)和ED5tl (50%群體治療有效的劑量)。毒性作用和療效間的劑量比就是治療指數并可表示為LD5(i/ED5(i之比。優(yōu)選具有大治療指數的化合物。
得自細胞培養(yǎng)和/或動物研究的數據可用于配制人用劑量范圍，例如包括使用非血管化小鼠眼(例如 Kenyon 等，Invest Opthalmol. Vis. Sc1. 37:625，1996)或兔眼 (例如參見Gaudric等，Ophthal. Res. 24:181，1992)的角膜囊袋測定。該測定 具有的優(yōu)勢是，容易測定新血管并且該新血管基本上必須是正常無血管角膜中的新形成的血管。另一測定包括使用雞絨毛膜尿囊膜(CAM測定；參見Wilting等，Anat. Embryol. 183:259, 1991)。在大鼠例如大鼠主動脈環(huán)模型中的其它測定，提供可重現的測定，其通常用于鑒定血管生成激動劑(例如參見Lichtenberg等，Pharmacol Toxicol. 84:34，1999)?；钚猿煞值膭┝客ǔＯ拗圃诎ň哂械投拘缘腅D5tl的循環(huán)濃度范圍之內。劑量在該范圍內可以變動，這取決于所用劑型和所用的給藥途徑。在某些實施方案中，將所述IKl納米粒局部遞送，例如局部注射。
待給予具體受試者的治療組合物的有效量可因多種因素的不同而異，這些因素中的若干在不同患者之間是不同的。有能力的臨床醫(yī)生能夠確定治療劑的有效量?？蓪⑺鼋M合物多次給予受試者，例如在一系列不止一次的給予中。對于治療組合物，常規(guī)周期性給予(例如每2-3天一次)有時是需要的，或者可望降低毒性?？刹捎弥貜蛣┝糠桨福缫圆煌l率每天給予1-4次，例如每天一次、每兩天一次、每周一次、每兩周一次、每月一次等。這樣的頻率可取決于本領域技術人員已知的因素并且容易由醫(yī)生確定。技術人員容易理解，劑量水平可因癥狀的嚴重程度和受試者對副作用的敏感性的不同而異。
在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物用于治療糖尿病性足潰瘍?？蓪⑺幱?IKl-納米粒組合物直接施加在傷口部位或所述組合物可呈藥學上可接受的傷口愈合藥的形式。所述組合物可通過各種方式局部給予和遞送，所述方式例如通過噴霧、局部注射、局部輸注、乳膏劑、洗劑、混懸劑、乳劑、凝膠劑、軟膏劑、藥膏劑、貼條(stick)、肥皂、液體氣霧劑、粉末氣霧劑、滴劑、貼劑、經內窺鏡或抗微生物敷料劑例如繃帶。
對于適于表面損傷(例如糖尿病性足潰瘍)的局部給藥，采用使用例如10 ng/ ml-100 mg/ml溶液劑的標準局部制劑；優(yōu)選范圍為10 ug/ml-10 mg/ml。這樣的溶液劑每天可向受累區(qū)域施用多達6次。在某些應用例如燒傷中，優(yōu)選單個劑量。在其它應用例如潰瘍中，可優(yōu)選多個劑量。軟膏劑或其它制劑的濃度當然取決于傷口的嚴重程度或疾病分期和受試者性質。在大多數方案中，劑量隨時間而降低，以減少瘢痕形成的可能性。例如， 最嚴重的傷口，例如3度燒傷，通常用100 ug/ml組合物治療，但是隨著愈合開始，劑量逐步降至大約10 Ug/ml或更低，隨著傷口愈合。
在傷口(例如糖尿病性足潰瘍)的治療中，治療有效量可為這樣的量其足以減少傷口大小達至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約 35%、至少約40%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、 至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%。
技術人員將會知道，存在可將人類受試者以持續(xù)方式或其它方式暴露給蛋白、肽、 納米粒、組合物、小分子和/或其它試劑以對所述受試者進行有效治療的多種方式。進行這類暴露的不例性方法和裝置描述于W. Mark Saltzman, Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy (Topics in Chemical Engineering),第 I 版，Oxford University Press (USA), 2001 ；L. V. Allen 等，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第9版，Lippincott Williams & Wilkins, 2010 ；B. Wang 等，Drug Delivery: Principles and Applications,第 I 版，ffiley-1nterscience, 2007 ;和 Κ· K. Jain, Drug Delivery Systems,第 I 版，Humana Press, 2008,其各自通過引用全部結合到本文中。這些參考文獻也提供示例性的賦形劑(exipient)，其任選可與本發(fā)明的蛋白、肽、納米粒、組合物、小分子和/或其它試劑一起包括在內。
本申請所公開的各參考文獻都通過引用全部結合到本文中。
定義除非本文另外定義，否則結合本申請使用的科技術語都應具有本領域普通技術人員公知的含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括復數，而復數術語應包括單數。
本文所用的術語“包含”或“包括”用于提及對本發(fā)明必不可少的組合物、方法及其相應成分，但開放成包括未指明要素，無論其是否是必不可少的。
本文所用的術語“基本由...組成”是指給定實施方案所需的那些要素。該術語允許本質上不影響本發(fā)明該實施方案的基本的和新的或功能性的特征的額外要素的存在。
術語“由...組成”是指本文所述的組合物、方法及其相應成分，其不包括在所述實施方案的描述中未記載的任何要素。
除了工作實施例或另外指出的地方之外，本文所用的表示成分量或反應條件的所有數字都應理解為在所有情況下用術語“約”來修飾。術語“約”當結合百分率使用時可意指±1%。此外，術語“約”可意指值的±1%之內。
除非上下文另外明確指出，否則單數術語“一” “一個”和“所述”都包括復數所指物。同樣，除非上下文另外明確指出，單詞“或”旨在包括“和”。還應理解，對核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子質量值，都是近似值，并且為了描述而提供。
盡管在本說明書的實踐或檢測中可使用類似于或等同于本文所述的那些的方法和材料，但合適的方法和材料在下文描述。術語“包含”意指“包括”。縮略語“例如(e.g.)” 源自拉丁文例如(exempli gratia)，在本文中用于表示非限制性實例。因此，縮略語“例如 (e. g.) ”是術語“例如(for example) ”的同義詞。
術語“降低”、“降低的”、“減輕”、“降低”或“抑制”通常在本文中都用于意指統(tǒng)計學顯著量的降低。然而，為了避免疑惑，“降低的”、“減輕”或“降低”或“抑制”意指與參考水平相比降低至少10%，例如與參考水平相比降低至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、 或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%或至多并包括100% 降低(例如與參考樣品相比，水平為零)或介于10-100%之間的任何降低。
術語“增加的”、“增加”或“增強”或“活化”通常在本文中都用于意指統(tǒng)計學顯著量的增加；為了避免任何疑惑，術語“`增加的”、“增加”或“增強”或“活化”意指與參考水平相比增加至少10%，例如與參考水平相比增加至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%或至多并包括100%增加或介于10-100%之間的任何增加，或與參考水平相比至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍增加或介于2倍和10倍或更高倍之間的任何增加。
術語“統(tǒng)計學顯著性”或“顯著地”是指統(tǒng)計學顯著性并且通常意指參考水平之上或之下的兩個標準差(2SD)。該術語是指存在差異的統(tǒng)計學證據。它被定義為當無效假說實際為真時作出否決無效假說的決策的概率。通常用P值作出決策。
本文所用的術語“聚合物”旨在包括寡聚物和聚合物，即包含兩個或更多個單體單元的化合物，其可以是均聚物或共聚物。術語“均聚物”是含有單一種單體單元的聚合物。 術語“共聚物”是由兩種或更多種化學上不同種類的單體單元在同一聚合物鏈中構建的聚合物?！扒抖喂簿畚铩笔呛袃煞N或更多種不同種類的均聚物或共聚物的兩個或更多個區(qū)段的聚合物。
術語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”在本文中可互換使用，是指任何長度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可包含經修飾的氨基酸，并且其可被非氨基酸間斷。該術語也包括已經例如通過以下修飾的氨基酸聚合物二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙?；?、磷酸化；或任何其他操縱，例如與帶標記的成分綴合。
本文所用的術語“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括但不限于甘氨酸以及D型旋光異構體或L型旋光異構體，以及氨基酸類似物和肽類似物。標準的單字母或三字母碼用于命名氨基酸。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，并優(yōu)選經純化而同質。
術語“分離的”意指將材料從其原有環(huán)境(例如天然環(huán)境，如果是天然存在的話) 中移出。例如，活的動物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽就不是分離的，而從天然體系中的某些或所有共存的材料中分離出來的同樣的多核苷酸或DNA或多肽就是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的組成部分和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的組成部分，并且仍是分離的，因為這樣的載體或組合物并不是其天然環(huán)境的組成部分。
本文所用的術語“接頭”意指連接化合物的兩個部分的有機部分。接頭通常包括直接的鍵或例如氧或硫等原子，例如以下的單元NH、C(O)、C(0)NH、SO、SO2, SO2NH或原子鏈， 例如取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的C5-C12雜芳基、取代或未取代的C5-C12雜環(huán)基、取代或未取代的C3-C12環(huán)烷基，其中一個或多個亞甲基可被O、S、S(O)、SO2, NH、C(O)間斷或終止。
疾病或障礙的“治療”、“預防”或“改善”意指延遲或預防所述疾病或障礙的發(fā)作，逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或終止所述 疾病或障礙的進展、惡化或變壞、所述疾病或障礙相關病癥的進展或嚴重程度。在一個實施方案中，疾病或障礙的癥狀減輕至少5%、至少 10%、至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%。
本文所用的術語“藥學上可接受的”是指在合理的醫(yī)學判斷范圍之內適用于與人類和動物組織接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應或其它問題或并發(fā)癥且與合理的利益/ 危險比例相稱的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。
本文所用的術語“藥學上可接受的載體”意指藥學上可接受的材料、組合物或溶媒，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、制造輔料(例如潤滑劑、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸韓、硬脂酸鋅、或硬脂酸)、或溶劑包封材料(solvent encapsulating material),其涉及將主題化合物從某器官或身體的某部分攜帶或轉運到另一器官或身體的另一部分。每種載體都必需是在與制劑的其它成分相容并且對患者無害的意義上“可接受的”?？捎米魉帉W上可接受的載體的材料的某些實例包括(I)糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉類，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀西黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7) 潤滑劑，例如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石粉；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑用蠟；(9) 油類，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 二醇類，例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG) ;(12)酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16) 無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格液；(19)乙醇；(20) pH緩沖液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)填充劑，例如多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL ； (22) C2-C12醇，例如乙醇；和(23)用于藥物制劑的其它無毒的相容性物質。潤濕劑、 著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑、芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可存在于所述制劑中。術語例如“賦形劑”、“載體”、“藥學上可接受的載體”等在本文中可互換使用。
本文所用的術語“給予”是指通過導致組合物至少部分定位于所需部位使得產生所需效果的方法或途徑，將組合物放入受試者中。本文所述的組合物可經本領域已知的任何合適途徑來給予，所述途徑包括但不限于口服或胃腸外途徑，包括靜脈內、肌內、皮下、透皮、氣道(氣溶膠)、肺部、鼻腔、直腸和局部(包括含服和舌下)給予。
本文所用的“受試者”意指人或動物。受試者的實例包括靈長類(例如人和猴)。 通常所述動物是脊椎動物，例如靈長類、嚙齒類、家畜或狩獵動物。靈長類包括黑猩猩、食蟹猴(cynomologous monkey)、蜘蛛猴和短尾猴,例如恒河猴。卩齒齒類包括小鼠、大鼠、土撥鼠、 雪貂、兔和倉鼠。家畜和狩獵動物包括牛、馬、豬、鹿、野牛(bison)、水牛(buffalo)、貓科動物物種例如家貓、犬物種(例如狗、狐貍、狼)、禽物種(例如雞、鴯鹋、鴕鳥)和魚(例如鱒魚、貓魚和鮭魚)O患者或受試者包括前述任何亞類,例如上述所有,但不包括一組或多組或一種或多種，例如人、靈長類、嚙齒類。在本文所述方面的某些實施方案中，所述受試者是哺乳動物，例如靈長類，例如人。術語“患者”和“受試者”在本文中可互換使用。術語“患者” 和“受試者”在本文中可互換使用。受試者可以是雄性或雌性。
優(yōu)選地，所述受試者是哺乳動物。所述哺乳動物可以是人、非人類靈長類、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛，但不限于這些實例。非人類哺乳動物可有利地用作受試者，其代表與減少的脊柱/興奮性突觸形成和/或數量相關的病癥或障礙的動物模型。另外，本文所述的方法和組合物可用于治療家畜和/或寵物。
本發(fā)明可在任何以下編號的段落中定義段落1. 一種包含含有生物相容性聚合物和有效量的肝細胞生長因子/分散因子的 IKl蛋白片段的納米粒的藥物組合物，其中所述生物可降解聚合物包裹所述IKl蛋白。
段落2.段落I的藥物組合物，其中所述IKl蛋白包含SEQ ID. Ν0:1ο
段落3.段落1-2中任一個的藥物組合物，其中所述納米粒的平均粒度為約50 nm 至約500 nm。
段落4.段落1-2中任一個的藥物組合物，其中納米粒的平均粒度為約60 nm至約 150 nm。
段落5.段落1-4中任一個的藥物組合物，其中所述生物相容性聚合物是生物可降解聚合物和所述生物可降解聚合物選自聚酯、羥基脂族羧酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、 聚(dl-丙交酯/乙交酯、聚(乙二醇)、多糖、凝集素、糖胺聚糖、脫乙酰殼多糖、纖維素和丙烯酸酯聚合物。
段落6.段落1 -5中任一個的藥物組合物，其中所述生物相容性聚合物是聚酯。
段落7.段落6的藥物組合物，其中所述聚酯包括聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。
段落8.段落1-7中任一個的藥物組合物，其中所述納米粒在規(guī)定的天、周或月的時間周期內釋放治療有效量的IKI蛋白。
段落9.段落1-8中任一個的藥物組合物，其中所述納米粒在約2天、約3天、約4 天、約5天、約7天、或約14天的規(guī)定時間周期內釋放治療有效量的IKl蛋白。
段落10.段落8-9中任一個的藥物組合物，其中在規(guī)定時間周期內釋放的所述治療有效量足以在規(guī)定的釋放時間周期內導致細胞ERK的持續(xù)磷酸化。
段落11.段落8-10中任一個的藥物組合物，其中與所述化合物不存在時的血管生成相比，所述治療有效量足以增加受試者的血管生成達至少約5%、約10%、約20%、約30%、 約40%、約50%或約60%ο
段落12.段落8-11中任一個的藥物組合物，其中所述治療有效量是約O. lmg/kg 至約1000 mg/kg的劑量。
段落13.段落1-12中任一個的藥物組合物，其中所述組合物經配制用于通過選自以下的方法給予局部給藥、腸內給藥和胃腸外給藥。
段落14.段落13的藥物組合物，其中經配制用于局部給藥的所述組合物是軟膏劑、洗劑、噴霧劑、乳膏劑或凝膠劑。
段落15. —種治療血管形成不足相關病癥的方法，所述方法包括給予受試者治療有效量的段落1-14中任一個的藥物組合物。
段落16.段落15的方法，其中所述治療有效量是約O. lmg/kg至約1000 mg/kg Ikl蛋白的劑量。
段落17.段落15-16中任一個的方法，其中所述血管形成不足相關病癥選自腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、肢體缺血、心肌缺血、組織缺血、冠狀動脈缺血、周圍動脈病、肢體缺血、糖尿病性潰瘍、壞疽、需要新血管形成以促進愈合的傷口以及Buerger綜合征。
段落18.段落15-17中任一個的方法，其中所述病癥是糖尿病性足潰瘍。
段落19.段落15-18中任一個的方法，其中所述藥物組合物經局部給藥、腸內給藥或胃腸外給藥而給予。
段落20.段落15-19中任一個的方法，其中所述藥物組合物給予多次。
段落21.段落1-14中任一個的藥物組合物在治療血管形成不足相關病癥中的用途。
段落22.段落21的用途，其中所述血管形成不足相關病癥選自腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、肢體缺血、心肌缺血、組織缺血、冠狀動脈缺血、周圍動脈病、肢體缺血、糖尿病性潰瘍、壞疽、需要新血管形成以促進愈合的傷口、以及Buerger綜合征。
段落23.段落21的用途，其中所述病癥是糖尿病性足潰瘍。
就尚未指出的方面來說，本領域普通技術人員將會理解，本文所描述和說明的多個實施方案中的任一個都可被進一步修改，以結合本文所公開的任何其它實施方案所示的特征。
段落24. —種治療血管形成不足相關病癥的方法，所述方法包括給予受試者有效量的IKI蛋白，其中以持續(xù)釋放制劑的形式給予所述IKl蛋白，所述制劑例如具有這樣的劑量所述劑量足以導致ERK的持續(xù)磷酸化并增強小管形成，從而在受試者中顯著增加血管生成。
以下實施例說明本發(fā)明的某些實施方案和方面。對相關領域技術人員顯而易見的是，在不改變本發(fā)明的精神和范圍的情況下可進行多種修改、 添加、取代等，并且這樣的修改和變動都包括在所附權利要求書中限定的本發(fā)明范圍之內。以下實施例并不以任何方式限制本發(fā)明。實施例
本文給出的實施例涉及誘導血管生成的方法和組合物。正如本文所表明，將蛋白質工程與納米技術結合起來，以使HGF/SF的治療潛力最大化。蛋白質工程實驗靶向NKl (一種HGF/SF轉錄物的可變剪接變體)，得到蛋白IKl (一種穩(wěn)定的和非糖基化的Met受體激動劑)，其發(fā)揮強烈的血管生成活性。此外，IKl被包裹在自生物可降解D，L-乳酸-共-乙醇酸共聚物工程改造的納米粒中，使其能持續(xù)釋放。本文已證明，短暫釋放(temporal release)使通過MAPK途徑的獨特下游信號轉導能夠進行，在體外和體內導致增強的血管生成結果。我們的發(fā)現開啟了結合蛋白質工程與納米載體的獨特方法用于在受損的缺血性病癥中調節(jié)血管形成的可能性。
實施例1.工程化1K1，一種非糖基化HGF/SF變體。
在硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)或肝素存在下，NKl表現為部分受體激動劑(14)。為了開發(fā)IKl，采用基于NKl (15)、NKl-肝素復合物(16)和單個N結構域和Kl 結構域(17)的結構和功能研究的一種合理的蛋白質工程方法。NKl通過以下兩個不同位點與肝素結合位于N結構域內并由R73、K60、T61、R76、K62和K58的側鏈和T61、K63和 G79的主鏈原子形成的高親和力位點(18)，以及在包括K132、R134、K170和R181的側鏈的 Kl結構域內的低親和力位點。突變IKl攜帶在K132和R134的兩個反轉電荷突變(1K1: K132E:R134E)，其破壞肝素與三環(huán)結構域的結合(圖1A至1H)并在若干細胞種類上表現出與野生型相比增加的信號轉導活性(16)。不希望受到理論的束縛，IKl相對于NKl更高的生物活性可能因為以下兩個原因第一，作為Kl中缺失肝素結合位點的結果，肝素僅與N結構域中的第一結合位點相互作用并導致鄰近IKl 二聚體結合同一平面上的肝細胞生長因子受體(MNNG (N-甲基-N’ -硝基-N亞硝基-胍)HOS轉化基因)(MET)(圖1C)，不同于 NK1，其中Kl結構域的肝素結合位點導致肝素對齊不同平面上的鄰近NKl 二聚體(圖1B)。 因此，IKl可比NKl更容易形成寡聚配體-受體復合物。第二，與NKl-肝素復合物相比，預先形成的IKl-肝素復合物對MET具有更大的結合親和力，這是因為這兩種蛋白質與肝素結合的方式不同的結果，正如表面等離振子共振(圖1E和1F)和速度和沉降實驗(圖1G和 1H)所表明。
實施例2.1Kl通過與MET激酶結合而在體外誘導血管生成。
血管生成表型是以內皮細胞化學入侵(chemoinvasion)、增殖和小管形成為特征的不連續(xù)的細胞步驟的頂點(culmination) (18)。如圖2A至2D所示，HGF/SF和IKl都誘導內皮細胞增殖。此外，IKl-誘導的內皮細胞增殖以濃度依賴性方式受到MET激酶抑制劑 PHA 665752的抑制(圖2C)，這證實IKl通過Met受體而誘導血管生成。先前的研究已經揭示出HGF/SF配體的MET結合通過PI3K和MAPK而導致下游信號轉導(10)。然而，尚不知道PI3K途徑和MAPK途徑在IKl介導的內皮細胞增殖中是否被激活。因此，將所述細胞用分別抑制PI3K和MAPK的LY294002或PD98059進行預處理。如圖2A至2D所示，LY294002 和PD98059都以濃度依賴性方式抑制IKl-誘導的細胞增殖，表明PI3K途徑和MAPK途徑都牽連于IKl-誘導的內皮細胞增殖中。
然后再探索評價IKl是否能誘導內皮小管形成。如圖3A至3C所示，與溶媒處理相比，HGF/SF和IKl都誘導顯著的小管形成，當將內皮細胞接種在三維基質膠基質上時 。 與HGF/SF相比，IKl-誘導的管在表型上更長并具有更多結節(jié)(圖未顯示)。與細胞增殖結果一致，人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)用10 6 M PHA665752預處理，完全阻斷IKl-誘導的小管形成(圖3A至3B ；HUVEC管形成的形態(tài)學圖像在本文中未顯示)。另外，PD98059和 LY294002在該過程中都抑制牽涉這些信號轉導途徑的IKl-誘導的小管形成(圖3A至3B ; HUVEC管形成的形態(tài)學圖像在本文中未顯示)。正如蛋白質印跡(圖3C)所示，將內皮細胞與IKl 一起溫育，導致MAPK和PI3K信號轉導途徑的下游效應物ERK和Akt都快速磷酸化， MAPK和PI3K信號轉導途徑分別被LY294002和TO98059阻斷。蛋白質印跡也表明，用10 6 M PHA665752預處理細胞，阻斷IKl-誘導的ERK和Akt的磷酸化。這些結果證實IKl通過經由被HGF/SF激活的相同Met依賴性途徑的信號轉導而在體外誘導血管生成(10)。
實施例3.1Kl-納米粒的合成和表征。
治療性血管生成的一個關鍵性挑戰(zhàn)是在所需作用部位局部和持續(xù)遞送血管生成因子(6)。在先前的研究中，Richardson等人證明，VEGF-165和TOGF-BB從單一結構性聚合物支架中持續(xù)釋放(各自具有不同動力學)，導致成熟血管網絡的快速形成(19)。此外，已經報道血小板衍生的生長因子的受控的心肌內遞送，用增加的血管形成改善梗塞后的心室功能(20)。類似地,在最近的研究中,肌內注射裝載pivastatin的納米粒(其能持續(xù)釋放藥物)導致增強的血管生成(21)。然而，并無先前研究證明IKl的持續(xù)釋放制劑。因此，納米粒自聚乳酸-乙醇酸(PLGA)共聚物工程改造而來以便使IKl的持續(xù)釋放制劑成為可能， 所述共聚物是生物相容的和生物可降解的并被FDA批準。使用雙重乳劑/溶劑提取技術制備所述IKl納米粒(22)。透射電鏡數據證實納米粒為球形并證實納米粒直徑為60nm - 140 nm (圖4A)，其經動態(tài)光散射測定來驗證(圖4B)。IKl在納米粒中的總裝載效率經測定為 54.27 土 7. 12%。生物活性形式的治療用蛋白的持續(xù)釋放和隨后降解對于生物活性而言是至關重要的，并且取決于表面結合分子的解吸附、通過納米?；|的擴散以及后者的侵蝕。 通過酶聯免疫吸附測定來檢測IKl在7天時期內從納米粒釋放的動力學。如圖4C所示，納米粒在初始階段有特征性爆發(fā)式釋放(22，23)，然后在7天的時期內是穩(wěn)態(tài)釋放。該發(fā)現與其中包裹在PLGA微球體中的VEGF在30天時期內顯示類似的釋放動力學的先前報道一致(22)。
實施例4.1Kl-NP在體外誘導血管生成。
用HUVEC增殖作為生物學讀出測定IKl納米粒(IKl-NP)的血管生成活性。如圖 4D至4F所示，與用溶媒相比，用IKl-NP處理導致明顯的內皮細胞增殖，表明工程改造納米粒的過程不改變IKl的生物活性。此外，在MET抑制劑PHA 665752 (圖4D)、PI3K抑制劑 LY294002 (圖4E)和MAPK抑制劑PD98059 (圖4F)存在下，IKl-NP-誘導的細胞增殖受到抑制，表明在包裹在納米粒中之后，通過由可溶性IKl激活的相同途徑介導信號轉導。
與空載體或游離IKl相比，發(fā)現工程改造的IKl-NP誘導顯著更多的小管形成，表明血管生成因子的持續(xù)釋放明顯影響了血管生成反應(圖5A至5C)。為了機械地將表型差異與短暫釋放關聯，使用蛋白質印跡來評價IKl-NP對下游信號轉導途徑的作用。 如圖5B所示，將內皮細胞與IKl-NP和IKl兩者一起溫育，導致在10 min內快速磷酸化。用PHA665752 預處理所述細胞，阻斷由IKl-NP誘導的ERK和Akt的磷酸化。用50 μ M LY29400預處理所述細胞，制止了 Akt的磷酸化，而PD98059減少ERK的磷酸化，所述磷酸化與先前在本文所述的IKl活性一致。然而，不同于用IKl處理，就IKl-NP的情況而言，注意到持續(xù)活性，正如在治療后8. 5 h ERK磷酸化增加所示(圖5C)。先前已經報道，MAPK信號轉導途徑的持續(xù)激活對管形成而言是至關重要的，而瞬時激活則不足以誘導這樣的形態(tài)學變化(8，24， 25)。血管的表型定量測定也證實用PHA665752 (10 7 M)、PD98059 (50 μ Μ)或LY294002 (50 μ Μ)預處理HUVEC，阻斷IKl-NP-誘導的小管形成(圖5A ；HUVEC管形成的形態(tài)學圖像在本文中未顯示)。
實施例5.在體內血管生成和植入物測定斑馬魚血管生成測定。斑馬魚(JMnio rerio)正在快速出現為用于研究新血管形成的良好模型(26，27)。為了證實IKl和IKl-NP在體內的血管生成活性，將IKl或IKl-NP與生長因子減少的基質膠(Mgel)混合并注射到緊挨腸下血管的卵黃囊中。如圖6A至6F所示，如通過腸下血管出芽期間所形成的結節(jié)所定量測定的，與空載體相比，IKl誘導明顯的血管生成。在48 h時間點，IKl-NP表現出比IKl更大的血管生成，這證實了先前在本文中描述的體外發(fā)現血管生成因子的持續(xù)釋放可導致血管生成增強。
鼠基質膠植入物測定。為了進一步證實IKl在體內的血管生成功效，與生長因子減少的基質膠混合的IKl或1K1-NP，經皮下注射到小鼠中，劑量為200納克(ng) IKl/支架。將所述支架維持12 d，然后處死動物并將皮膚外翻以觀察血管生成反應。用IKl處理， 導致強烈血管生成反應，如圖7A至7D所示。與IKl相比，IKl-NP顯著誘導更大的血管生成反應(將鼠皮外翻之后的植入物的總體形態(tài)學圖未顯示)。為了進一步證實總體形態(tài)學，將植入物橫切，針對馮維勒布蘭德因子進行免疫標記，所述因子是用于內皮細胞的標記。如圖 7A至7D所示，IKl-NP處理(圖7D)導致相對于游離IKl更好的血管生成結果，這與在斑馬魚中的觀察結果一致。這些發(fā)現證明生長因子的持續(xù)釋放可發(fā)揮優(yōu)良的血管生成結果。
結論盡管針對在病理例如癌癥情況下對血管生成的抑制方面取得了顯著進步，但是在以血管形成不足為特征的疾病(例如冠狀動脈缺血、周圍動脈病或糖尿病性潰瘍)中的治療性血管生成(4，28 - 30)，仍然還處于初期。本發(fā)明人和其他人先前已經證明HGF/SF可引發(fā)強烈血管生成反應(12)，這兩者獨立于其它生長因子(10)并通過誘導VEGF的表達來實現 (31)。此外，評價經肌內注射HGF/SF質粒以改善嚴重肢體缺血患者的肢體灌注的安全性的研究(HGF-STAT試驗)目前已經證明，肌內注射HGF質粒是安全和良好耐受的，并且發(fā)現在嚴重肢體缺血患者中，通過經皮氧張力測定的肢體組織灌注在所用的最高劑量下具有顯著改善(32)。這些觀察結果建立了在缺血性疾病的處理中使用HGF/SF的堅固的臨床基本原理。然而，盡管血管生成劑的持續(xù)釋放在限定治療性血管生成的臨床結果中已經被認為是至關重要的，但是并沒有開發(fā)HGF/SF的持續(xù)釋放模型。本文所示的是整合到納米載體中的合理工程改造的HGF/SF變體，其改變了生長因子向靶細胞的暫時呈遞，并因此通過修飾下游信號轉導級聯而增強血管生成結果 。
將生長因子轉化到臨床的關鍵障礙通常在于多肽生長因子的異質性(這是因廣泛的蛋白糖基化所致)，其對制備而言帶來法規(guī)的挑戰(zhàn)。就HGF/SF的情況而言，額外挑戰(zhàn)是天然蛋白的復雜的多結構域結構，其導致低生產得率和在生理緩沖液中蛋白質傾向于聚集。如本文所表明，研究了 HGF/SF的截短突變體，其可被酵母細胞以高得率表達(不同于天然HGF/SF)，缺乏糖基化序列并保留強烈的信號轉導活性。通過將所述蛋白摻入到來自PLGA共聚物的納米粒中，進一步改進了 IKl的生物活性和治療潛力。盡管游離IKl和 IKl-NP在早期時間點誘導類似水平的ERK磷酸化，但所述納米粒導致MAPK信號轉導的持續(xù)激活，與游離IKl大不相同。在先前的研究中，報道了 MAPK的持續(xù)激活對小管形成而言是至關重要的，盡管已經證明瞬時激活足以誘導細胞增殖(8，24 - 25)。該觀察結果可能解釋，盡管IKl和IKl-NP表現出類似的細胞增殖水平，但是后者在體內基質膠植入物和斑馬魚血管生成測定中導致增強的新血管形成。本文所示的這一發(fā)現也突出了納米技術通過受控釋放而瞬時改變信號轉導途徑的潛在用途，因此使剖析生物學現象之下的不同調節(jié)控制成為可能。這些結果表明不斷出現的范例，即活性劑的持續(xù)的焦點濃度對于治療性血管生成而言是至關重要的，并且可提供用于處理缺血性疾病的穩(wěn)健策略。
材料與方法IKl和HGF/SF的表達.HGF/SF是自轉染了全長HGF/SF cDNA的小鼠骨髓瘤細胞系NSO 的衍生物制備而來的。IKl是自轉染了 IKl cDNA的巴斯德畢赤酵母的衍生物制備而來。將這兩種蛋白質用肝素-瓊脂糖色譜接著在Mono S上的陽離子交換色譜自培養(yǎng)上清液純化， 得到蛋白質純度>90% (經SDS凝膠電泳判定)。
表面等離振子共振實驗。對應于氨基酸25-567的Met胞外結構域的片段(MET567) 用于固定在CM5芯片的單個流動池上，所述芯片用以下試劑平衡20 mM磷酸鹽(pH 7.4)、 150 mM NaCl,50 μ M EDTA、0. 005% 表面活性劑 Ρ20。芯片表面首先在 BIACore Control 軟件中使用CM5胺偶聯的固定化方法激活(100 μ L O. 2 M1-乙基_3_(3 二甲氨基-丙基) 碳二亞胺并混合100 μ L O. 05 M N-羥基琥珀酰亞胺，以提供反應性琥珀酰亞胺酯基團)。 將Met567H在10 mM乙酸鈉中稀釋至終濃度為400 nM并注射，直到達到Λ RU為約1，500。 殘余活性基團通過注射70 ULlM乙醇胺(pH 8. 5)而封閉。作為陰性對照，CM5芯片的另一流動池用同樣程序處理，但無蛋白。再將芯片用10 mM HepesU50 mM NaCl,3 mM EDTA, O. 005% Tween 20 (HBS-EP) (10 mM Hepes (pH 7.4) ；150 mM NaCl ；50 μ M EDTA ；0. 005% 表面活性劑Ρ20) + 0.2 mg/ml BSA重新平衡，然后將一系列蛋白濃度(在HBS-EP + BSA 中稀釋)以20 uL / min速率注射60 min，接著是300 s離解時間。芯片用HBS-EP和I M NaCl再生。
分析型超速離心。野生型NKlUKl和MET567蛋白針對25 mM磷酸鹽、150 mM NaCl, pH 7. 4透析,然后離心。用Beckman Optima XLA分析型超速離心,利用中速沉降速度方法進行測定。以連續(xù)方式獲取數據并用程序Sedfit分析，其中計算最小二乘方g(s*)沉降系數分布，其中c是濃度(以吸光度單位計)，r是半徑(以cm計)，t是時間(以秒計)， CO是裝載濃度(以吸光度單位計)，w是轉子的角速度(以弧度/秒計)和rm是在新月形 (meniscus)的半徑(以cm計)。用設定在278 nm處的入射光采集數據。使用ProFit (— 種非線性最小二乘法擬合包(Quantum Soft)),用正態(tài)(高斯)分布來擬合g(s*)曲線。
工程改造的IKl納米粒.使用雙重乳劑/溶劑提取技術制備IKl納米粒(22)。 使用溶于10 mL乙腈的50 mg PLGA (50:50) (MW 40 - 75 KDa)制備乳劑I。通過超聲處理將約104 μ g IKl包裹在50 mg PLGA中。使用0. 5 g PVA (聚乙烯醇，Sigma, MW 9，000 - 10, 000)制備乳劑2，并將其溶于9. 3 mL雙蒸水和0. 7 mL乙腈。通過將0. 2 g PVA 溶于186 mL雙蒸水和14 mL乙腈制備有機提取緩沖液。將I mL乳劑2加入到乳劑I中并將所得溶液渦旋震蕩約I min，再加入到上述有機緩沖液中。將該溶液攪拌12 h以蒸發(fā)乙腈，將該溶液以193，190 X 4 g (Sorvall Ultra Pro 80)離心I h,以沉淀納米粒,將該納米粒再次用水洗漆后，用Nano-zetasizer (Malvern)和透射電鏡(TEM)表征其大小和形態(tài)學。將樣品在銅網上進行點樣并用乙酸雙氧鈾染色，用于TEM。
細胞增殖測定.將HUVEC在96孔板中生長并在O. 1% FBS中同步，然后用生長因子處理24、48或72 h。細胞用信號轉導抑制劑處理2 h，然后加入生長因子。用使用 Versamax 讀板器在 490 nm 處測量的來自 Cell Titer 96 Aqueous One Solution 試劑盒的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2 (4-磺基-苯基)-2H-四唑 (MTS)，定量測定活細胞百分率。從每個數據點中減去背景值之后，對對應于細胞增殖的最終吸光度作圖。
HUVEC管測定.將HUVEC (25，000個細胞/孔)接種到包被有生長因子減少的基質膠的96孔板中。細胞用抑制劑處理2 h，然后加入生長因子。8 h之后，在倒置光學顯微鏡下以IOX放大倍數獲取圖像(Nikon Eclipse)。
免疫印跡。將HUVEC (70%匯合)用IKlUKl-NP和HGF/SF (陽性對照)處理10 min并在3X上樣緩沖液中直接裂解。所述細胞用信號轉導抑制劑預處理至少2 h，然后用生長因子處理。將蛋白質在10% SDS-PAGE凝膠上解析。探測膜上的MET、Akt和Erk的磷酸化形式和總體形式。用辣根過氧化物酶綴合的抗兔第二抗體和Lum1-LightPLUS蛋白質印跡底物(Western Blotting Substrate) (Roche Applied Science)檢測蛋白質。用 GeneSnap使印跡顯影并用Gene Tools定量測定光密度(這兩者都來自SynGene)。使用預定分子量標準品作為標記。蛋白質針對肌動蛋白標準化。
斑馬魚血管生成測定·將斑馬魚(T bingen AB)(受精后2 d)在三卡因 (MESAB-間-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽、1% Na2HPO4, pH 7.0)中麻醉并側放于1%瓊脂糖注射模(injection mold),再使用 Nanoject II 注射裝置(Drummond Scientific)將 9· 2 nL 各樣品注射到腸下血管(SIV)附近的卵黃囊中。對注射了生長因子減少的基質膠和I μ M IKl (游離的或在納米粒中的)的斑馬魚監(jiān)測24 h和48 h。用Nikon SMZ1500立體顯微鏡和SPOT Flex相機進行明視野成像。
小鼠體內基質膠血管生成測定.將與生長因子混合的生長因子減少的基質膠 (BD)經皮下注射到balb/c小鼠中。將小鼠分為4組(A)溶媒對照加生長因子減少的基質膠，(B)溶媒對照加空PLGA和生長因子減少的基質膠，(C)基質膠塞加200 ng游離 IKl和(D)基質膠塞加200 ng 1K1-NP。在第12天，用高分辨率數字相機(Canon)記錄呈形成的血管(血管生成)形式的總體反應。在最佳切割溫度化合物下切離植入物并冷凍 (cryofrozen),用于免疫組織化學。
免疫組織化學.將基質膠冷凍切片(18 μπι)在20°C中用冰冷甲醇固定并用針對馮維勒布蘭德因子的第一兔抗體(Dako)在4°C在封閉緩沖液中探測過夜。然后，樣品用 Alexa fluor 594綴合的抗兔第二抗體在室溫下探測2 h。核用DAPI復染。用免疫熒光顯微鏡(Nikon Eclipse)以10X放大倍數獲取圖像。
統(tǒng)計學分析.通過使用單側ANOVA接著Dunnett或Friedman事后檢驗,來檢驗統(tǒng)計學顯著性。Bonferroni檢驗用于檢驗總體劑量-反應效應(Graphical Prism 3軟件)。 認為P值〈0. 05就是顯著的。
SEQ ID NO:1-檢索3mkp_b， 版本3mkp_b G1: 303325025，具有粗體的突變氨基酸的人(Homo sapiens) IKl片段，氨基酸號105從賴氨酸變?yōu)楣劝彼幔被崽?07從精氨酸變?yōu)楣劝彼?br> 權利要求
1.一種包含含有生物相容性聚合物和有效量的肝細胞生長因子/分散因子的IKl蛋白片段的納米粒的藥物組合物，其中所述生物可降解聚合物包裹所述IKl蛋白。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述IKl蛋白包括SEQID. NO:1。
3.權利要求1-2中任一項的藥物組合物，其中所述納米粒的平均粒度為約50nm至約500 nm。
4.權利要求1-2中任一項的藥物組合物，其中納米粒的平均粒度為約60nm至約150nm。
5.權利要求1-4中任一項的藥物組合物，其中所述生物相容性聚合物是生物可降解聚合物和所述生物可降解聚合物選自聚酯、羥基脂族羧酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯、聚(乙二醇)、多糖、凝集素、糖胺聚糖、脫乙酰殼多糖、纖維素和丙烯酸酯聚合物。
6.權利要求1-5中任一項的藥物組合物，其中所述生物相容性聚合物是聚酯。
7.權利要求6的藥物組合物，其中所述聚酯包括聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。
8.權利要求1-7中任一項的藥物組合物，其中所述納米粒在規(guī)定的天、周或月的時間周期內釋放治療有效量的IKl蛋白。
9.權利要求1-8中任一項的藥物組合物，其中所述納米粒在約2天、約3天、約4天、約5天、約7天或約14天的規(guī)定時間周期內釋放治療有效量的IKl蛋白。
10.權利要求8-9中任一項的藥物組合物，其中在規(guī)定時間周期內釋放的所述治療有效量足以在規(guī)定的釋放時間周期內導致細胞ERK的持續(xù)磷酸化。
11.權利要求8-10中任一項的藥物組合物，其中與所述化合物不存在時的血管生成相t匕，所述治療有效量足以增加受試者的血管生成達至少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%或約60%。
12.權利要求8-11中任一項的藥物組合物，其中所述治療有效量是約0.lmg/kg至約1000 mg/kg 的劑量。
13.權利要求1-12中任一項的藥物組合物，其中所述組合物經配制用于通過選自以下的方法給予局部給藥、腸內給藥和胃腸外給藥。
14.權利要求13的藥物組合物，其中經配制用于局部給藥的組合物是軟膏劑、洗劑、噴霧劑、乳膏劑或凝膠劑。
15.一種治療血管形成不足相關病癥的方法，所述方法包括給予受試者治療有效量的權利要求1-14中任一項的藥物組合物。
16.權利要求15的方法，其中所述治療有效量是約0.lmg/kg至約1000 mg/kg Ikl蛋白的劑量。
17.權利要求15-16中任一項的方法，其中所述血管形成不足相關病癥選自腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、肢體缺血、心肌缺血、組織缺血、冠狀動脈缺血、周圍動脈病、肢體缺血、糖尿病性潰瘍、壞疽、需要新血管形成以促進愈合的傷口以及Buerger綜合征。
18.權利要求15-17中任一項的方法，其中所述病癥是糖尿病性足潰瘍。
19.權利要求15-18中任一項的方法，其中所述藥物組合物經局部給藥、腸內給藥或胃腸外給藥而給予。
20.權利要求15-19中任一項的方法，其中所述藥物組合物給予多次。
21.權利要求1-14中任一項的藥物組合物在治療血管形成不足相關病癥中的用途。
22.權利要求21的用途，其中所述血管形成不足相關病癥選自腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、肢體缺血、心肌缺血、組織缺血、冠狀動脈缺血、周圍動脈病、肢體缺血、糖尿病性潰瘍、壞疽、需要新血管形成以促進愈合的傷口以及Buerger綜合征。
23.權利要求21的用途，其中所述病癥是糖尿病性足潰瘍。
全文摘要
本發(fā)明涉及在血管形成不足相關病癥中誘導血管生成的藥物組合物和方法，所述病癥例如缺血和糖尿病性病癥，例如糖尿病性足潰瘍。具體地講，提供了包含含有肝細胞生長因子/分散因子的1K1片段的持續(xù)釋放納米粒的藥物組合物。
文檔編號A61K38/18GK103037892SQ201180020351
公開日2013年4月10日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權日2010年2月22日
發(fā)明者S.森古普塔, R.辛哈羅伊, S.索尼, R.哈富歇 申請人:布里格姆婦女醫(yī)院