用于調(diào)節(jié)血管生成和血管發(fā)生的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本文中公開(kāi)了使用源自骨髓粘附基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞刺激血管生成的方法和組合物，所述骨髓粘附基質(zhì)細(xì)胞已用編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列轉(zhuǎn)染。這些方法和組合物的應(yīng)用包括治療缺血性障礙例如中風(fēng)。
【專利說(shuō)明】用于調(diào)節(jié)血管生成和血管發(fā)生的方法和組合物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年1月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/591，486、2012年4 月24日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/637, 740和2012年10月4日提交的美國(guó)臨時(shí)專利 申請(qǐng)?zhí)?1/709, 619的利益；為了所有目的將所述美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的說(shuō)明書和附圖通過(guò) 引用整體并入本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的聲明
[0004] 不適用的。
[0005] 領(lǐng)域
[0006] 本公開(kāi)內(nèi)容在血管生成和血管發(fā)生的領(lǐng)域內(nèi)；例如用于治療缺血性事件例如中 風(fēng)。其也在干細(xì)胞和通過(guò)基因操作從干細(xì)胞衍生的細(xì)胞的領(lǐng)域內(nèi)。
[0007] 背景
[0008] 在穩(wěn)定的中風(fēng)中，恢復(fù)血管流量是恢復(fù)腦的營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)所必需的。為了修復(fù)長(zhǎng)期 缺血后血管損傷，需要至少兩個(gè)連續(xù)步驟。第一步驟是內(nèi)皮細(xì)胞（EC)的芽生式血管生成； 該過(guò)程必需內(nèi)皮細(xì)胞的初始增殖和周圍細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。VEGF-介導(dǎo)的EC的增殖和基質(zhì) 金屬蛋白酶屬于血管生成性萌芽的主要組成部分。第二步驟是血管穩(wěn)定化，該過(guò)程依賴于 血管平滑肌細(xì)胞的募集以包圍新生成的血管。單核細(xì)胞和周細(xì)胞也參與血管穩(wěn)定化，其產(chǎn) 生適當(dāng)?shù)膭?dòng)脈生成因子（arteriogenic factor)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。在利用平滑肌細(xì)胞和 周細(xì)胞的血管穩(wěn)定化不存在的情況下，可發(fā)生新生血管的退化。
[0009] 已顯示骨髓基質(zhì)細(xì)胞（MSC，也稱為間充質(zhì)干細(xì)胞））在腦動(dòng)脈閉塞和創(chuàng)傷性腦損 傷后促進(jìn)血管再生（revascularization)(參見(jiàn) Omori 等人（2008) Brain Res. 1236:30-38 ; Onda 等人（2008)J.Cereb. Blood Flow Metab. 28:329-340 ;Pavlichenko 等人（2008) fcain Res. 1233:203-213 ;Xiong 等人（2009)fcain Res.1263:183-191)。SB623 細(xì)胞 是通過(guò)用包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NI⑶）的序列的載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞獲得 的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的衍生物（參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)7, 682, 825和Dezawa等人（2004) J. Clin. Investig. 13:1701-1710)。SB623細(xì)胞引發(fā)實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)模型中的功能改善（參 見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào) 8, 092,792 和 Yasuhara 等人（2009)Stem Cells and Development 18:1501-1514)。雖然SB623細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組與親代MSC的分泌蛋白質(zhì)組是相當(dāng)?shù)模?但已觀察到相較于SB623細(xì)胞，MSC分泌不同水平的特定營(yíng)養(yǎng)因子（參見(jiàn)，例如，Tate等人 (2010)Cell Transplantation 19:973-984;美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào) 2010/0266554。此外，已 報(bào)導(dǎo)許多其表達(dá)水平在MSC與SB623細(xì)胞之間相異的因子參與血管再生。
[0010] 因?yàn)橹酗L(fēng)是美國(guó)成人失能的首要原因，是世界范圍內(nèi)死亡的第二大原因，因此仍 然存在治療的需要以恢復(fù)對(duì)中風(fēng)誘發(fā)的腦的缺血性損傷的區(qū)域的血液供應(yīng)和促進(jìn)該區(qū)域 的再灌注。
[0011] 概述
[0012] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)利用編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞的后 代（即，SB623細(xì)胞）具有令人驚訝的能夠合成和分泌促進(jìn)血管生成的因子的性質(zhì)。因?yàn)?血管生成即新血管的形成是在腦損傷和疾病中內(nèi)源性修復(fù)過(guò)程的至關(guān)重要的部分，所以該 發(fā)現(xiàn)提供了新的用于治療血管障礙例如中風(fēng)的方法。
[0013] 因此，本公開(kāi)內(nèi)容除其它以外提供了：
[0014] 1. 一種用于增強(qiáng)受試者的血管生成的方法，所述方法包括給所述受試者施用 SB623細(xì)胞的群體；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：（a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 物，（b)將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多核苷 酸接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b)的多核苷酸的細(xì) 胞，和（d)在選擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（c)的選擇的細(xì)胞。
[0015] 2.實(shí)施方案1的方法，其中血管生成的增強(qiáng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生。
[0016] 3.實(shí)施方案2的方法，其中血管生成的增強(qiáng)在腦中發(fā)生。
[0017] 4. 一種用于修復(fù)受試者的缺血性損傷的方法，所述方法包括給所述受試者施用 SB623細(xì)胞的群體；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：（a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 物，（b)將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多核苷 酸接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b)的多核苷酸的細(xì) 胞，和（d)在選擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（c)的選擇的細(xì)胞。
[0018] 5.實(shí)施方案4的方法，其中所述缺血性損傷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生。
[0019] 6.實(shí)施方案5的方法，其中所述缺血性損傷在腦中發(fā)生。
[0020] 7.實(shí)施方案6的方法，其中所述缺血性損傷因中風(fēng)引起。
[0021] 8. -種用于增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的存活的方法，所述方法包括將內(nèi)皮細(xì)胞與SB623細(xì)胞 的群體接觸；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：（a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物，（b) 將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多核苷酸接觸， 其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b)的多核苷酸的細(xì)胞，和 (d)在選擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（c)的選擇的細(xì)胞。
[0022] 9.實(shí)施方案8的方法，其中所述方法阻止內(nèi)皮細(xì)胞死亡。
[0023] 10.實(shí)施方案8或9的任一個(gè)的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞存在于受試者中。
[0024] 11.實(shí)施方案10的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞存在于受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
[0025] 12.實(shí)施方案11的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞存在于受試者的腦中。
[0026] 13. -種用于刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的方法，所述方法包括將內(nèi)皮細(xì)胞與SB623細(xì) 胞的群體接觸；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物， (b)將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多核苷酸接 觸，其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b)的多核苷酸的細(xì)胞， 和（d)在選擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（c)的選擇的細(xì)胞。
[0027] 14.實(shí)施方案13的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞存在于受試者中。
[0028] 15.實(shí)施方案14的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞存在于受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
[0029] 16.實(shí)施方案15的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞存在于受試者的腦中。
[0030] 17. -種用于增加血管分支的方法，所述方法包括將血管與SB623細(xì)胞的群體接 觸；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：（a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物，（b)將步驟 (a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多核苷酸接觸，其中所 述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b)的多核苷酸的細(xì)胞，和（d)在選 擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（C)的選擇的細(xì)胞。
[0031] 18.實(shí)施方案17的方法，其中所述血管存在于受試者中。
[0032] 19.實(shí)施方案18的方法，其中所述血管存在于受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
[0033] 20.實(shí)施方案19的方法，其中所述血管存在于受試者的腦中。
[0034] 21. -種用于增強(qiáng)受試者的血管生成的方法，所述方法包括給所述受試者施用 (1)SB623細(xì)胞的群體；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：（a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞的 培養(yǎng)物，（b)將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多 核苷酸接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b)的多核苷酸 的細(xì)胞，和（d)在選擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（c)的選擇的細(xì)胞；和（2)促血管生 成劑。
[0035] 22.實(shí)施方案21的方法，其中血管生成的增強(qiáng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生。
[0036] 23.實(shí)施方案22的方法，其中血管生成的增強(qiáng)在腦中發(fā)生。
[0037] 24.實(shí)施方案21的方法，其中所述促血管生成劑是核酸。
[0038] 25.實(shí)施方案21的方法，其中所述促血管生成劑是多肽。
[0039] 26.實(shí)施方案25的方法，其中所述促血管生成劑是激活促血管生成蛋白的表達(dá)的 轉(zhuǎn)錄因子。
[0040] 27.實(shí)施方案26的方法，其中所述促血管生成蛋白是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)。
[0041] 28.實(shí)施方案27的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是激活VEGF基因的轉(zhuǎn)錄的非天然存在 的鋅指蛋白。
[0042] 29. -種用于修復(fù)受試者的缺血性損傷的方法，所述方法包括給所述受試者施用 (1)SB623細(xì)胞的群體；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：（a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞的 培養(yǎng)物，（b)將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多 核苷酸接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b)的多核苷酸 的細(xì)胞，和（d)在選擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（c)的選擇的細(xì)胞；和（2)促血管生 成劑。
[0043] 30.實(shí)施方案29的方法，其中所述缺血性損傷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生。
[0044] 31.實(shí)施方案30的方法，其中所述缺血性損傷在腦中發(fā)生。
[0045] 32.實(shí)施方案31的方法，其中所述缺血性損傷因中風(fēng)引起。
[0046] 33.實(shí)施方案29的方法，其中所述促血管生成劑是核酸。
[0047] 34.實(shí)施方案29的方法，其中所述促血管生成劑是多肽。
[0048] 35.實(shí)施方案34的方法，其中所述多肽是激活促血管生成蛋白的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因 子。
[0049] 36.實(shí)施方案35的方法，其中所述促血管生成蛋白是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)。
[0050] 37.實(shí)施方案36的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是激活VEGF基因的轉(zhuǎn)錄的非天然存在 的鋅指蛋白。
[0051] 38. -種用于治療受試者的中風(fēng)的方法，所述方法包括給所述受試者施用（1) SB623細(xì)胞的群體；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：（a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 物，（b)將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多核苷 酸接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b)的多核苷酸的細(xì) 胞，和（d)在選擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（C)的選擇的細(xì)胞；和（2)促血管生成 劑。
[0052] 39.實(shí)施方案38的方法，其中所述促血管生成劑是核酸。
[0053] 40.實(shí)施方案38的方法，其中所述促血管生成劑是多肽。
[0054] 41.實(shí)施方案40的方法，其中所述多肽是激活促血管生成蛋白的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因 子。
[0055] 42.實(shí)施方案41的方法，其中所述促血管生成蛋白是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)。
[0056] 43.實(shí)施方案42的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是激活VEGF基因的轉(zhuǎn)錄的非天然存在 的鋅指蛋白。
[0057] 44.實(shí)施方案8、9或13的任一項(xiàng)的方法，其還包括將促血管生成劑與SB623細(xì)胞 一起施用。
[0058] 45.實(shí)施方案44的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞存在于受試者中。
[0059] 46.實(shí)施方案45的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞存在于受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
[0060] 47.實(shí)施方案46的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞存在于受試者的腦中。
[0061] 48.實(shí)施方案44的方法，其中所述促血管生成劑是核酸。
[0062] 49.實(shí)施方案44的方法，其中所述促血管生成劑是多肽。
[0063] 50.實(shí)施方案49的方法，其中所述多肽是激活促血管生成蛋白的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因 子。
[0064] 51.實(shí)施方案50的方法，其中所述促血管生成蛋白是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)。
[0065] 52.實(shí)施方案51的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是激活VEGF基因的轉(zhuǎn)錄的非天然存在 的鋅指蛋白。
[0066] 53.實(shí)施方案17的方法，其還包括將促血管生成劑與SB623細(xì)胞一起施用。
[0067] 54.實(shí)施方案53的方法，其中所述血管存在于受試者中。
[0068] 55.實(shí)施方案54的方法，其中所述血管存在于受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
[0069] 56.實(shí)施方案55的方法，其中所述血管存在于受試者的腦中。
[0070] 57.實(shí)施方案53的方法，其中所述促血管生成劑是核酸。
[0071] 58.實(shí)施方案53的方法，其中所述促血管生成劑是多肽。
[0072] 59.實(shí)施方案58的方法，其中所述多肽是激活促血管生成蛋白的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因 子。
[0073] 60.實(shí)施方案59的方法，其中所述促血管生成蛋白是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)。
[0074] 61.實(shí)施方案60的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是激活VEGF基因的轉(zhuǎn)錄的非天然存在 的鋅指蛋白。
[0075] 62. -種用于給受試者提供血管生成因子的方法，其中所述方法包括給所述受試 者施用SB623細(xì)胞的群體接觸；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：（a)提供間充質(zhì)干 細(xì)胞的培養(yǎng)物，（b)將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序 列的多核苷酸接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b)的多 核苷酸的細(xì)胞，和（d)在選擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（c)的選擇的細(xì)胞。
[0076] 63.實(shí)施方案62的方法，其中所述受試者患有缺血性障礙。
[0077] 64.實(shí)施方案63的方法，其中所述受試者患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或障礙。
[0078] 65.實(shí)施方案62的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)因子選自血管生成素、血管生成素-2、表 皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝素結(jié)合上皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因 子、瘦素、血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB、胎盤生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的一種或多種。
[0079] 66.實(shí)施方案65的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。
[0080] 67. -種用于給受試者提供血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的方法，其中所述方法包括給所述 受試者施用SB623細(xì)胞的群體接觸；其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得：（a)提供間充 質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物，（b)將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD) 的序列的多核苷酸接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白，（c)選擇包含步驟（b) 的多核苷酸的細(xì)胞，和（d)在選擇不存在的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（c)的選擇的細(xì)胞。
[0081] 68.實(shí)施方案67的方法，其中所述受試者患有缺血性障礙。
[0082] 69.實(shí)施方案68的方法，其中所述受試者患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或障礙。
[0083] 附圖概述
[0084] 圖1顯示已針對(duì)血清和生長(zhǎng)因子進(jìn)行饑餓的HUVEC的培養(yǎng)物中碘化丙啶可透過(guò)的 細(xì)胞的分?jǐn)?shù)的測(cè)量。最左邊的條塊顯示從對(duì)照血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC獲得的結(jié)果； 中間的條塊顯示在來(lái)自MSC的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)7天的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的 HUVEC的結(jié)果，以及最右邊的條塊顯示在來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)7 天的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié)果。顯示的值為3個(gè)單獨(dú)的MSC和SB623細(xì)胞的供 體的平均值土SD ;*表示相較于對(duì)照組p〈0. 05。
[0085] 圖2顯示已進(jìn)行了血清和生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的培養(yǎng)物中表達(dá)Bcl-2的細(xì)胞的 分?jǐn)?shù)的測(cè)量。最左邊的條塊顯示從對(duì)照血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC獲得的結(jié)果；中間的 條塊顯示在來(lái)自MSC的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)7天的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC 的結(jié)果，以及最右邊的條塊顯示在來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)7天的 血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié)果。通過(guò)測(cè)量利用綴合有熒光素的抗-Bcl-2抗體染色 的細(xì)胞的熒光，隨后扣除暴露于綴合有熒光素的IgG的細(xì)胞的熒光來(lái)獲得結(jié)果。顯示的值 為3個(gè)單獨(dú)的MSC和SB623細(xì)胞的供體的平均值土SD ;*表示相較于對(duì)照組p〈0. 05。
[0086] 圖3顯示已針對(duì)血清和生長(zhǎng)因子進(jìn)行饑餓的HUVEC的培養(yǎng)物中表達(dá)Ki67的細(xì)胞 的分?jǐn)?shù)的測(cè)量。最左邊的條塊顯示從對(duì)照血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC獲得的結(jié)果；中間的 條塊顯示在來(lái)自MSC的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)7天的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC 的結(jié)果，以及最右邊的條塊顯示在來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)7天的 血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié)果。通過(guò)測(cè)量利用綴合有熒光素的抗-Ki67抗體染色的 細(xì)胞的熒光，隨后扣除暴露于綴合有熒光素的IgG的細(xì)胞的熒光來(lái)獲得結(jié)果。顯示的值為 3個(gè)單獨(dú)的MSC和SB623細(xì)胞的供體的平均值土SD ;*表示相較于對(duì)照組p〈0. 05。
[0087] 圖4顯示在于來(lái)自MSC或SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)后HUVEC的相 差顯微照片。最左邊的照片顯示在來(lái)自MSC的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞；中間的照片顯示 在于來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞；以及最右邊的照片顯示在未添加條件培 養(yǎng)基的商業(yè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞。
[0088] 圖5顯示條件培養(yǎng)基對(duì)于HUVEC的管形成的作用的測(cè)量。最左邊的條塊顯示從對(duì) 照血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC獲得的結(jié)果；中間的條塊顯示在來(lái)自MSC的條件培養(yǎng)基存 在的情況下培養(yǎng)16小時(shí)的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié)果，以及最右邊的條塊顯示在 來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)16小時(shí)的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC 的結(jié)果。顯示的值為3個(gè)單獨(dú)的MSC和SB623細(xì)胞的供體的平均值+SEM。
[0089] 圖6A-6C顯示在于非條件培養(yǎng)基（A)、MSC條件培養(yǎng)基（B)或SB623細(xì)胞條件培養(yǎng) 基（C)中培養(yǎng)10天后主動(dòng)脈環(huán)的照片。
[0090] 圖7A和7B顯示主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定中血管萌芽和分枝的測(cè)量。圖7A顯示新血管的計(jì) 數(shù)和新血管中分支點(diǎn)的計(jì)數(shù)。對(duì)于3對(duì)條塊的每一對(duì)條塊，左邊的條塊顯示新血管形成的 測(cè)量，右邊的條塊顯示血管分支的測(cè)量。最左邊對(duì)的條塊（"對(duì)照"）顯示從對(duì)照主動(dòng)脈環(huán) 獲得的結(jié)果；中間對(duì)的條塊（"MSC CM"）顯示從在MSC條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天的主動(dòng)脈 環(huán)獲得的結(jié)果；以及最右邊對(duì)的條塊（"SB623 CM"）顯示從在SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培 養(yǎng)10天的主動(dòng)脈環(huán)獲得的結(jié)果。圖7B顯示對(duì)照主動(dòng)脈環(huán)（左邊條塊）、在MSC條件培養(yǎng)基 中培養(yǎng)10天的環(huán)（中間條塊）和在SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天的環(huán)（右邊條塊） 的分支點(diǎn)對(duì)新血管的比率。
[0091] 顯示的值為7個(gè)供體對(duì)的平均值土SEM ;*表示相較于對(duì)照組p〈0. 05。
[0092] 圖8顯示來(lái)自MSC(淺色條塊）和SB623細(xì)胞（深色條塊）的條件培養(yǎng)基中4種 不同營(yíng)養(yǎng)因子的水平。蛋白質(zhì)水平表達(dá)為皮克/ml的條件培養(yǎng)基/10 6個(gè)細(xì)胞。如圖中所 指示的，測(cè)試來(lái)自4個(gè)不同人供體的MSC(和來(lái)源于其的SB623細(xì)胞）的條件培養(yǎng)基。顯示 了血管生成素，血管生成素-2,肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子（HB-EGF)和胎盤生長(zhǎng) 因子（PIGF)的水平。
[0093] 圖9顯示來(lái)自MSC和SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中10種不同細(xì)胞因子的水平。用于 產(chǎn)生條件培養(yǎng)基的細(xì)胞獲自4個(gè)不同的供體（Dl、D2、D3和D4)，如圖中所指示的。本圖突 出顯示了相較于測(cè)試的其它營(yíng)養(yǎng)因子的水平非常大量的由MSC和SB623細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF。 表1(實(shí)施例6)的圖例中給出了縮寫詞。
[0094] 圖10A和10B顯示VEGF受體抑制劑對(duì)通過(guò)SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn)的HUVEC存 活力的改善的作用。圖10A顯示已針對(duì)血清和生長(zhǎng)因子進(jìn)行饑餓的HUVEC的培養(yǎng)物中碘化 丙啶可透過(guò)的細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。最左邊的條塊顯示從對(duì)照血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC獲得的 結(jié)果；中間的條塊顯示在來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)5天的血清/生 長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié)果，以及最右邊的條塊顯示在來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和50 nM SU5416存在的情況下培養(yǎng)5天的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié)果。結(jié)果為兩個(gè)供 體的平均值；表示相對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)物p〈0. 05 表示相對(duì)于暴露于SB623細(xì)胞條件培 養(yǎng)基和SU5416的培養(yǎng)物p〈0. 05。
[0095] 圖10B顯示已針對(duì)血清和生長(zhǎng)因子進(jìn)行饑餓的HUVEC的培養(yǎng)物中表達(dá)Bcl-2的細(xì) 胞的分?jǐn)?shù)的測(cè)量。最左邊的條塊顯示從對(duì)照血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC獲得的結(jié)果；中 間的條塊顯示在來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)5天的血清/生長(zhǎng)因子饑 餓的HUVEC的結(jié)果，以及最右邊的條塊顯示在來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和50nM SU5416 存在的情況下培養(yǎng)5天的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié)果。通過(guò)測(cè)量利用綴合有熒光 素的抗-Bcl-2抗體染色的細(xì)胞的熒光，隨后扣除暴露于綴合有熒光素的IgG的細(xì)胞的熒光 來(lái)獲得為一式兩份供體的平均值的結(jié)果。
[0096] 圖11顯示在VEGFR2抑制劑SU5416存在和不存在的情況下暴露于SB623細(xì)胞條 件培養(yǎng)基的HUVEC培養(yǎng)物中表達(dá)Ki67的細(xì)胞以及在CM不存在的情況下培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞表 達(dá)Ki67的細(xì)胞的分?jǐn)?shù)的測(cè)量。最左邊（空白）的條塊顯示從對(duì)照血清/生長(zhǎng)因子饑餓的 HUVEC獲得的結(jié)果；中間（黑色）的條塊顯示在來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在的情況下 培養(yǎng)的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié)果，以及最右邊（灰色）的條塊顯示在來(lái)自SB623 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和50nM SU5416存在的情況下培養(yǎng)的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié) 果。顯示的值為兩個(gè)單獨(dú)的SB623細(xì)胞的供體的平均值+SEM 表示相對(duì)于陰性對(duì)照培 養(yǎng)物（無(wú)條件培養(yǎng)基）P〈〇. 05 表示相對(duì)于SU5416處理的培養(yǎng)物p〈0. 05。
[0097] 圖12顯示VEGF受體抑制劑對(duì)通過(guò)MSC-和SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn)的HUVEC的 管形成的增強(qiáng)的作用。頂行顯示在抑制劑不存在的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞。頂行的最左邊的圖 框（"neg"）顯示在Opti-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)后的對(duì)照HUVEC的相差顯微照片。從左 邊開(kāi)始的第二圖框（"+l〇ng VEGF"）顯示在向其添加了 10ng/ml VEGF的Opti-MEM培養(yǎng)基 中培養(yǎng)16小時(shí)后的HUVEC的相差顯微照片。從左邊開(kāi)始的第三圖框（"+MSC-CM"）顯示在 于MSC條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)后HUVEC的相差顯微照片。最右邊的圖框（"+SB623-CM"） 顯示在SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)后的HUVEC的相差顯微照片。底行中的圖框 顯示在與頂行中的條件相同但添加了 50nM SU5416的條件下HUVEC的顯微照片。
[0098] 圖13顯示在VEGFR2抑制劑SU5416存在和不存在的條件下暴露于SB623細(xì)胞條 件培養(yǎng)基的HUVEC的，和在CM不存在的情況下培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞的管形成的定量。
[0099] 對(duì)于每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，最左邊（空白）的條塊顯示從對(duì)照血清/生長(zhǎng)因子饑餓的 HUVEC獲得的結(jié)果；中間（黑色）的條塊顯示在來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在的情況下 培養(yǎng)的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié)果，以及最右邊（灰色）的條塊顯示在來(lái)自SB623 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和50nM SU5416存在的情況下培養(yǎng)的血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC的結(jié) 果。顯示的值為3個(gè)單獨(dú)的SB623細(xì)胞的供體的平均值+SEM 表示相較于陰性對(duì)照培 養(yǎng)物（無(wú)條件培養(yǎng)基）P〈〇. 05 表示相對(duì)于SU5416處理的培養(yǎng)物p〈0. 05。
[0100] 圖14顯示在主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定中VEGF受體抑制劑對(duì)通過(guò)SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn) 的血管長(zhǎng)出和分支的增強(qiáng)的作用。在頂行中，左邊的圖框顯示在OptiMEM培養(yǎng)基（"陰性對(duì) 照"）中于RGF-基底凝膠上培養(yǎng)10天后主動(dòng)脈環(huán)的顯微照片。中間圖框顯示在SB623細(xì) 胞條件培養(yǎng)基（"+SB623-CM"）中培養(yǎng)10天后主動(dòng)脈環(huán)的顯微照片。右邊的圖框顯示在包 含50nM SU5416的SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基（"+SB623-CM+SU5416"）中培養(yǎng)10天后主動(dòng)脈 環(huán)的顯微照片。每一張顯微照片的某些區(qū)域的放大示于下行中。
[0101] ML
[0102] 本文中公開(kāi)了用于調(diào)節(jié)血管生成的新方法和組合物。具體地，由SB623細(xì)胞（源 于已用包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列的載體轉(zhuǎn)染的MSC的細(xì)胞）分泌的因子在去除 血清和生物因子的條件下在體外促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖，并且刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 形成血管。此外，來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在嚙齒類動(dòng)物主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定中促進(jìn)內(nèi)皮萌 芽和分枝。
[0103] 除非另有所指，否則本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)踐使用細(xì)胞生物學(xué)、毒理學(xué)、分子生物學(xué)、生 物化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)、、腫瘤學(xué)、重組DNA的領(lǐng)域以及相關(guān)領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法和常規(guī)技 術(shù)，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。這樣的技術(shù)描述于文獻(xiàn)中，從而可被本領(lǐng)域技術(shù)人員 獲得。參見(jiàn)，例如，Alberts, B.等人，"Molecular Biology of the Cell,"第 5版，Garland Science, New York, NY, 2008 ;Voet，D.等人"Fundamentals of Biochemistry:Life at the Molecular Level," 第 3版，John Wiley & Sons, Hoboken, NJ，2008;Sambrook，J. 等人，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,，' 第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 ;Ausubel, F.等人，"Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley&Sons, New York, 1987 以及定期更新資料；Freshney，R. I. , "Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,，'第 4 版，John Wiley & Sons, Somerset，NJ, 2000;和系列"Methods in Enzymology," Academic Press, San Diego, CA。
[0104] 為了本公開(kāi)內(nèi)容的目的，"血管生成"是指新脈管系統(tǒng)（例如，血管；例如，靜脈、動(dòng) 脈、小靜脈、小動(dòng)脈、毛細(xì)血管）的形成。血管生成可通過(guò)新血管從現(xiàn)有血管的萌芽，和/或 通過(guò)血管的分支發(fā)生。血管生成還包括基質(zhì)重塑和細(xì)胞募集（例如平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞 和/或周細(xì)胞的募集）的伴隨而來(lái)的過(guò)程。
[0105] "MSC"是指獲自骨髓的粘附非造血干細(xì)胞。這些細(xì)胞被不同地稱為間充質(zhì)干細(xì)胞、 間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、骨髓粘附基質(zhì)細(xì)胞、髓粘附干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
[0106] 中風(fēng)
[0107] "中風(fēng)"是賦予因腦中血流的病損而引起的病況的名稱。這樣的腦血管病損可因 例如顱內(nèi)出血或因腦中血流的減少或阻斷（即，腦缺血癥）而引起。缺血性阻斷可因血栓 (即，顱部血管或供應(yīng)腦的血管中原位凝塊的形成）形成或因腦栓塞（即，凝塊至腦中部位 的遷移）而引起。因缺血或出血性中風(fēng)而引起的損傷通常導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能的病損。關(guān) 于不同類型的中風(fēng)以及它們的特征的額外信息見(jiàn)于共同擁有的美國(guó)專利號(hào)8, 092, 792 ;為 了描述不同類型的中風(fēng)及其特征的目的，將所述美國(guó)專利的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本 文。
[0108] 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)
[0109] 本公開(kāi)內(nèi)容提供了通過(guò)將SB623細(xì)胞移植至受試者的缺血性損傷的部位來(lái)促進(jìn) 血管生成的方法。通過(guò)在MSC中表達(dá)Notch蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域來(lái)從也稱為間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)的骨髓粘附基質(zhì)細(xì)胞獲得SB623細(xì)胞。通過(guò)從骨髓選擇粘附細(xì)胞（S卩，附著于組織培 養(yǎng)塑料的細(xì)胞）來(lái)獲得MSC。
[0110] MSC的示例性公開(kāi)內(nèi)容提供于美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2003/0003090 ; Prockop(1997)Science 276:71-74 和 Jiang(2002)Nature 418:41-49 中。用于 MSC 的分離和純化的方法可見(jiàn)于例如美國(guó)專利號(hào)5, 486, 359 ;Pittenger等人（1999) Science284:143-147 和 Dezawa 等人（2001)Eur.J.Neurosci. 14:1771-1776 中。人 MSC 是 商購(gòu)可得的（例如，BioWhittaker, Walkersville, MD)或可通過(guò)例如骨髓抽吸，隨后選擇粘 附骨髓細(xì)胞來(lái)獲得。參見(jiàn)，例如，W02005/100552。
[0111] MSC還可從臍帶血分離而來(lái)。參見(jiàn)，例如，Campagnoli等人（2001)Blood 98:2396-2402 ;Erices 等人（2000) &· J. Haematol. 109:235-242 和 Hou 等人（2003)1拉· J. Hematol. 78:256-261。
[0112] Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域
[0113] Notch蛋白是在所有后生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的跨膜受體，其通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響細(xì) 胞分化。Notch細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與Notch配體（例如，Delta, Serrate, Jagged)的接觸導(dǎo)致 Notch蛋白的兩個(gè)蛋白水解切割，所述切割的第二切割由γ -分泌酶催化并將Notch細(xì)胞內(nèi) 結(jié)構(gòu)域（NI⑶）釋放入細(xì)胞質(zhì)。在小鼠 Notch蛋白中，該切割在氨基酸glyl743與vall744 之間發(fā)生。NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中其用作轉(zhuǎn)錄因子，招募另外的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白（例 如，MAM、組蛋白乙酰化酶）以解除各種靶基因（例如，Hes 1)的轉(zhuǎn)錄阻遏。
[0114] 關(guān)于Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它細(xì)節(jié)和信息見(jiàn)于例如Artavanis-Tsakonas等 人（1995)Science 268:225-232 ;Mumm 和 Kopan(2000)Develop. Biol. 228:151-165 和 Ehebauer 等人（2006) Sci.STKE 2006 (364)，cm7. [DOI :10.1126/stke.3642006cm7]中。
[0115] 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0116] 用于細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法在本領(lǐng)域是已知的。參見(jiàn)，例如，R. I. Freshney"Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,，'第 5 版，Wiley, New York, 2005。
[0117] 用于將外源DNA引入細(xì)胞（S卩，轉(zhuǎn)染）的方法在本領(lǐng)域也是公知的。參見(jiàn)，例 如，Sambrook 等人"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,，'第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 ;Ausubel 等人，"Current Protocols in Molecular Biology, " John Wiley & Sons, New York, 1987 及定期更新資料。
[0118] SB623 細(xì)胞
[0119] 在用于制備SB623細(xì)胞的一個(gè)實(shí)施方案中，將MSC的培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì) 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多核苷酸接觸；例如通過(guò)轉(zhuǎn)染；隨后通過(guò)藥物選擇和進(jìn)一步培 養(yǎng)富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)7,682,825(2010年3月23日）；美國(guó)專利申 請(qǐng)公布號(hào) 2010/0266554 (2010 年 10 月 21 日）；和 TO 2009/023251 (2009 年 2 月 19 日）；將 所有的其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文，以描述間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和間充質(zhì)干細(xì)胞至 SB623細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（在這些文獻(xiàn)中稱為"神經(jīng)前體細(xì)胞"和"神經(jīng)再生細(xì)胞"）。
[0120] 在這些方法中，可使用任何編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的多核苷酸（例如，載體）， 以及可使用任何用于選擇和富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的方法。例如，在某些實(shí)施方案中，用包含編碼 Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列并且還包含編碼抗藥性標(biāo)記（例如對(duì)G418的抗性）的序列的載 體轉(zhuǎn)染MSC。在其它實(shí)施方案中，將兩個(gè)載體（一個(gè)包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列， 另一個(gè)包含編碼抗藥性標(biāo)記的序列）用于轉(zhuǎn)染MSC。在這些實(shí)施方案中，在用載體轉(zhuǎn)染細(xì) 胞培養(yǎng)物后，通過(guò)以足以殺死不含所述載體的細(xì)胞但不傷害含所述載體的細(xì)胞的量向細(xì)胞 培養(yǎng)物添加選擇劑（例如，G418)來(lái)實(shí)現(xiàn)選擇。選擇的不存在使得必需除去所述選擇劑或 將其濃度降至不殺死不包含所述載體的細(xì)胞的水平。選擇（例如，進(jìn)行7天）后，除去選擇 齊U，進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞（例如，進(jìn)行2次傳代）。
[0121] SB623細(xì)胞的制備從而包括在MSC中瞬時(shí)表達(dá)外源Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。為此目 的，可用包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列的載體轉(zhuǎn)染MSC，其中所述序列不編碼全長(zhǎng) Notch蛋白。所有這樣的序列是公知的并且可被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地獲得。例如，Del Amo等人（1993)Genomics 15:259-264提供了小鼠 Notch蛋白的全氨基酸序列；而Mumm和 Kopan (2000) Devel. Biol. 228:151-165提供了來(lái)自小鼠 Notch蛋白的圍繞所謂的S3切割位 點(diǎn)（該位點(diǎn)釋放細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域）的氨基酸序列?？傊?，這些參考資料為本領(lǐng)域技術(shù)人員提 供了每一個(gè)包含Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、不為全長(zhǎng)Notch蛋白的肽；從而也為本領(lǐng)域技術(shù)人員 提供了每一個(gè)包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，但不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白的序列的多核苷酸。 將上述文獻(xiàn)（Del Amo和Mumm)通過(guò)引用整體并入本文，以分別公開(kāi)全長(zhǎng)Notch蛋白的氨基 酸序列和Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
[0122] 來(lái)自另外的物種的Notch蛋白和核酸的類似信息是可獲得的，所述物種包括大 鼠、爪蟾、果蠅和人。參見(jiàn)，例如，Weinmaster 等人（1991)Development 113:199-205; Schroeter 等人（1998)Nature393:382-386 ;NCBI 參照序列 No. NM_017167(和其中引用的 參考資料）；SwissProt P46531(和其中引用的參考資料）；SwissProt Q01705(和其中引用 的參考資料）；和GenBank CAB40733(和其中引用的參考資料）。將上述參考資料通過(guò)引用 整體并入本文以公開(kāi)許多不同物種的全長(zhǎng)Notch蛋白的氨基酸序列和Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 的氨基酸序列。
[0123] 在其它實(shí)施方案中，通過(guò)將包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列的核酸引入 MSC (以便MSC不表達(dá)外源Notch細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域）來(lái)制備SB623細(xì)胞。這可以例如通過(guò)用包 含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的序列的載體轉(zhuǎn)染MSC來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述序列不編碼全長(zhǎng)Notch 蛋白。
[0124] 關(guān)于SB623細(xì)胞的制備以及用于制備具有與SB623細(xì)胞的那些性質(zhì)相似的性質(zhì)的 細(xì)胞（所述細(xì)胞可用于本文中公開(kāi)的方法）的方法的其它細(xì)節(jié)見(jiàn)于美國(guó)專利號(hào)7, 682, 825 ; 和美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2010/0266554(2010年10月21日）和2011/0229442(2011年9 月22日）；將所述專利和專利申請(qǐng)公布的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文，以提供關(guān)于SB623 細(xì)胞的其它細(xì)節(jié)和用于SB623細(xì)胞的制備的可選擇方法，以及用于提供用于制備具有與 SB623細(xì)胞的那些性質(zhì)相似的性質(zhì)的細(xì)胞的方法。也參見(jiàn)Dezawa等人（2004)J.Clin. Invest. 113:1701-1710。
[0125] 用途
[0126] 如本文中所述，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)其中已瞬時(shí)表達(dá)Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的間充質(zhì)干 細(xì)胞的后代（即，SB623細(xì)胞）具有血管生成活性；以及所述細(xì)胞合成和分泌血管生成因 子。因此，SB623細(xì)胞的移植對(duì)于其中治療益處可通過(guò)增加受試者的血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)的障 礙的治療是有用的。這樣的障礙包括但不限于腦缺血癥（例如，中風(fēng)）、心肌缺血（例如，缺 血性心臟?。⒛c的缺血（例如，缺血性結(jié)腸炎、腸系膜缺血）、肢體的缺血、皮膚缺血、眼缺 血綜合征（例如，視網(wǎng)膜缺血）和腦癱。
[0127] 因此，本文中描述的SB623細(xì)胞可用于許多與血管生成的刺激相關(guān)的方法。這些 方法包括但不限于前面段落中提及的障礙的任何障礙的治療、血管生成的增強(qiáng)、缺血性損 傷的修復(fù)、阻止內(nèi)皮細(xì)胞死亡、增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的存活、刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和/或增加血管 的分支。
[0128] 這樣的方法可在體外或在受試者中進(jìn)行。受試者可以是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。SB623 細(xì)胞對(duì)血管生成的刺激以及如本文中所述的這樣的刺激的伴隨而來(lái)的作用，可以例如在中 樞神經(jīng)系統(tǒng)（例如，在腦中）發(fā)生。
[0129] SB623細(xì)胞的移植還可用于給受試者提供一種或多種血管生成營(yíng)養(yǎng)因子的方法。 這樣的因子包括但不限于血管生成素、血管生成素-2、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子、肝素結(jié)合上皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、瘦素、血小板衍生生長(zhǎng)因 子-BB、胎盤生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。
[0130] 在另外的實(shí)施方案中，可將SB623細(xì)胞與第二促血管生成劑組合用于聯(lián)合治療以 增加受試者的血管生成。所述聯(lián)合治療可用于上文所示的所有目的。第二促血管生成劑可 以是例如小分子藥物、核酸或多肽（例如，抗體、轉(zhuǎn)錄因子）。示例性核酸是激活血管生成蛋 白的表達(dá)和/或阻斷抗血管生成蛋白表達(dá)的三鏈形成核酸、核酶和siRNA。示例性抗體是 結(jié)合血管生成蛋白（或其它血管生成劑）和/或抑制其活性的那些抗體。示例性轉(zhuǎn)錄因子 是抑制編碼一種或多種抗血管生成蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄的那些轉(zhuǎn)錄因子，以及激活一種或多 種促血管生成蛋白的轉(zhuǎn)錄的那些轉(zhuǎn)錄因子?？寡苌珊痛傺苌傻鞍自诒绢I(lǐng)域是已知 的。示例性抗血管生成蛋白包括色素上皮衍生因子（PEDF)和胎盤生長(zhǎng)因子（PIGF)。示例 性促血管生成蛋白包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)、血管生成素和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)。
[0131] 在某些實(shí)施方案中，上文中公開(kāi)的轉(zhuǎn)錄因子是非天然存在的（工程化）轉(zhuǎn)錄因 子。這樣的非天然存在的轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)例是已被工程化以結(jié)合細(xì)胞染色質(zhì)中的調(diào)節(jié)靶基因 (例如，VEGF基因）的轉(zhuǎn)錄的DNA序列的非天然存在的鋅指蛋白。所述工程化鋅指轉(zhuǎn)錄因 子除工程化鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域外還包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（例如，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄 抑制結(jié)構(gòu)域），這在本領(lǐng)域中是已知的。
[0132] 用于工程化鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以結(jié)合選擇的DNA序列的方法在本領(lǐng)域中是公知 的。參見(jiàn)，例如，Beerli 等人（2002)Nature Biotechnol. 20:135-141 ;Pabo等人（2001)Αηη· Rev.Biochem. 70:313-340 ;Isalan 等人（2001)Nature Biotechnol. 19:656-660 ;Segal 等人（2001) Curr.Opin. Biotechnol. 12:632-637 ;Choo 等人（2000) Curr.Opin. Struct. Biol. 10:411-416。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域經(jīng)工程化而相較于天然存在的鋅指蛋白具有新型結(jié)合 特異性。工程化方法包括但不限于合理設(shè)計(jì)和各種類型的經(jīng)驗(yàn)選擇法。合理設(shè)計(jì)包括例 如使用包括三聯(lián)體（或四聯(lián)體）核苷酸序列和單個(gè)鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中每一 個(gè)三聯(lián)體或四聯(lián)體核苷酸序列與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合特定三聯(lián)體或四聯(lián)體序列的鋅指的氨基 酸序列相關(guān)。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利 Nos. 6, 140,081 ;6, 453, 242 ;6, 534, 261 ;6, 610, 512 ; 6,746,838 ;6, 866, 997 ;7, 067, 617 ;美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào) 2002/0165356 ;2004/0197892 ; 2007/0154989 ;2007/0213269 ;和國(guó)際專利申請(qǐng)公布號(hào) W0 98/53059 和 W02003/016496。
[0133] 示例性選擇法，包括噬菌體展示、相互作用捕獲、雜交體選擇和雙雜交系統(tǒng)，公開(kāi) 于美國(guó)專利 Nos. 5, 789, 538 ;5, 925, 523 ;6, 007, 988 ;6, 013, 453 ;6, 140, 466 ;6, 200, 759 ; 6, 242, 568 ;6, 410, 248 ;6, 733, 970 ;6, 790, 941 ;7, 029, 847 和 7, 297, 491 ;以及美國(guó)專利申 請(qǐng)公布號(hào) 2007/0009948 和 2007/0009962 ;W0 98/37186 ;W0 01/60970 和 GB2, 338, 237。
[0134] 鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性的增強(qiáng)已描述于例如美國(guó)專利號(hào)6, 794, 136(2004 年9月21日）中。關(guān)于鋅指間接頭序列的鋅指工程化的其它方面公開(kāi)于美國(guó)專利 號(hào)6, 479, 626和美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2003/0119023中。也參見(jiàn)Moore等人（2001a) Proc. Natl. Acad. Sci.USA98:1432-1436 ;Moore 等人（2001b)Proc. Natl. Acad. Sci. USA98:1437-1441 和 TO 01/53480。
[0135] 轉(zhuǎn)錄激活和抑制結(jié)構(gòu)域在本領(lǐng)域是已知的。參見(jiàn)，例如，Science269:630(1995)。 示例性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域包括p65, VP16和VP64。示例性轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域包括 KRAB，KAP-1，MAD，F(xiàn)KHR，ERD和SID。來(lái)自細(xì)胞核激素受體的功能性結(jié)構(gòu)域可用作激活物或 阻遏物，這取決于配體的存在。也參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)7, 985, 887。
[0136] 制劑、試劑盒和施用的途徑
[0137] 還提供了包含本文中公開(kāi)的SB623細(xì)胞的治療性組合物。這樣的組合物通常包 含SB623細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體。還可將補(bǔ)充性活性化合物摻入SB623細(xì)胞組合物中 (參見(jiàn)下文）。
[0138] 本文中公開(kāi)的治療性組合物用于，除其它以外，在中風(fēng)或其它缺血性損傷發(fā)生后 刺激受試者的血管生成。因此，包含SB623細(xì)胞的組合物的"治療有效量"可以是刺激血 管生成的任何量。例如，給藥量可從約100 ;500 ;1，000 ;2,500 ;5,000 ;10,000 ;20,000 ; 50, 000 ; 100, 000 ;500, 000 ;1，000, 000 ;5, 000, 000變化至 10, 000, 000個(gè)細(xì)胞或更多（或其 間的任何整數(shù)值）；取決于例如體重、施用途徑、疾病嚴(yán)重度等，施用頻率為例如每日1次、 每周2次、每周1次、每月2次、每月1次。
[0139] 根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，各種藥物組合物以及用于它們的制備和使用的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域 技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。關(guān)于適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物和它們的施用技術(shù)的詳細(xì)列表，可參考教 科書例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第 17版· 1985 ;Brunton等人，"Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, ^McGraw-Hill, 2005 ； University of the Sciences in Philadelphia(eds. ), "Remington:The Science and Practice of Pharmacy,，'Lippincott Williams & Wilkins, 2005 ；和 University of the Sciences in Philadelphia (eds.), "Remington: The Principles of Pharmacy Practice,，'Lippincott Williams & Wilkins, 2008。
[0140] 可將本文中描述的細(xì)胞懸浮于生理上相容的載體以用于移植。如本文中所用，術(shù) 語(yǔ)"生理上相容的載體"是指與SB623細(xì)胞和與制劑的任何其它成分相容的載體，并且對(duì)其 受體無(wú)害。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知生理上相容的載體。適當(dāng)?shù)妮d體的實(shí)例包括細(xì)胞培養(yǎng)基 (例如，伊格爾最小必需培養(yǎng)基）、磷酸緩沖鹽溶液、Hank' s平衡鹽溶液+/-葡萄糖（HBSS) 和復(fù)方電解質(zhì)溶液例如Plasma-Lyte? A(Baxter)。
[0141] 給患者施用的SB623細(xì)胞懸浮液的體積將取決于植入部位、治療目的和溶液中細(xì) 胞的數(shù)目而變化。通常地，給患者施用的細(xì)胞的量將是治療有效量。如本文中所用，"治療 有效量"或"有效量"是指實(shí)現(xiàn)特定障礙的治療，即產(chǎn)生與該障礙相關(guān)的癥狀的量和/或嚴(yán) 重度的減少所需的移植細(xì)胞的數(shù)目。例如，在中風(fēng)的情況下，治療有效量的SB623細(xì)胞的移 植導(dǎo)致例如在被缺血損傷的區(qū)域中新血管生長(zhǎng)、血管萌芽和血管分支。治療有效量隨缺血 性損傷的類型和程度的變化而變化，并且還可取決于受試者的總體狀況而變化。
[0142] 公開(kāi)的治療性組合物還可包含藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒介物，例如液體 或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料，即載體。這些載體可以例如穩(wěn)定SB623細(xì)胞 和/或促進(jìn)SB623細(xì)胞在體內(nèi)存活。每一種載體在與制劑的其它成分是可相容并且對(duì)受試 者無(wú)害的意義上應(yīng)當(dāng)是"可接受的"?？捎米魉帉W(xué)上可接受的載體的材料的一些實(shí)例包括： 糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例 如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；粉末黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例 如可可脂和栓劑蠟；油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二 醇類,例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，例如油酸乙酯和 月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；藻朊酸；無(wú)熱原水；等滲鹽溶液；林 格氏溶液；乙醇；磷酸緩沖鹽溶液；和其它用于藥物制劑的無(wú)毒相容性物質(zhì)。濕潤(rùn)劑、乳化 齊_潤(rùn)滑劑例如月桂硫酸鈉和硬脂酸鎂以及著色劑、脫離劑、包衣劑、增甜劑、調(diào)味劑和芳 香劑、防腐劑和抗氧化劑也可存在于組合物中。
[0143] 示例性制劑包括但不限于適合用于胃腸外施用例如肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、眼內(nèi)、 顱內(nèi)、腦膜下或皮下施用的制劑，包括封裝在微膠粒、脂質(zhì)體或藥物釋放膠囊中（摻入生物 相容性包衣內(nèi)被設(shè)計(jì)用于緩釋的活性劑）的制劑；可攝取制劑；用于局部使用的制劑，例如 滴眼劑、乳膏劑、軟膏和凝膠；以及其它制劑例如吸入劑、氣霧劑和噴霧劑。本公開(kāi)內(nèi)容的組 合物的劑量將根據(jù)治療所需的程度和嚴(yán)重度、施用的組合物的活性、受試者的一般健康狀 況和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它考慮而變化。
[0144] 在其它實(shí)施方案中，本文中描述的組合物被局部遞送至缺血性損傷的部位。局部 遞送允許組合物非全身性地遞送，從而相較于全身性遞送減輕組合物的身體負(fù)荷。這樣的 局部遞送可以例如通過(guò)顱內(nèi)注射，或通過(guò)使用各種醫(yī)學(xué)植入裝置包括但不限于支架和導(dǎo)管 來(lái)實(shí)現(xiàn)，或可通過(guò)吸入、靜脈切開(kāi)術(shù)或手術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。用于將期望的試劑涂覆、植入、包埋以及 另外地附著于醫(yī)療裝置例如支架和導(dǎo)管的方法在本領(lǐng)域已被建立并且在本文中得到考慮。
[0145] 本公開(kāi)內(nèi)容的另一個(gè)方面涉及用于給受試者施用SB623細(xì)胞（任選地與另一種治 療劑組合）的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括于藥物載體中配制的SB623細(xì)胞的 組合物，所述組合物任選地包含例如促血管生成劑（參見(jiàn)下文），視情況而定配制于一種或 多種單獨(dú)的藥物制劑中。
[0146] 聯(lián)合治療
[0147] 在某些實(shí)施方案中，可將SB623細(xì)胞組合物與包含刺激血管生成的物質(zhì)（"促血管 生成劑"）的其它組合物組合使用，例如以治療中風(fēng)。可以以任何順序相繼地施用或同時(shí)施 用組合物。因此，本文中公開(kāi)的治療組合物可包含SB623細(xì)胞和促血管生成劑。在其它實(shí) 施方案中，可將分開(kāi)的治療性組合物（一種包含SB623細(xì)胞，另一種包含促血管生成劑）分 開(kāi)地或一起給受試者施用。
[0148] 在某些實(shí)施方案中，促血管生成劑為蛋白質(zhì)（例如，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板 衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、音猬因子（sonic hedgehog)、MAGP-2、HIF-1、PR-39、RTEF-1、c-Myc、TFII、Egr-1、ETS-1)或編碼這樣的蛋白 質(zhì)的核酸。參見(jiàn)，例如，Vincent等人（2007)Gene Therapy 14:781-789。在其它實(shí)施方案 中，促血管生成劑可以是靶向編碼血管生成的抑制劑的核酸的小RNA分子（例如，siRNA、 shRNA、micr〇RNA)或核酶。在其它實(shí)施方案中，促血管生成劑可以是三鏈形成核酸，其結(jié)合 調(diào)節(jié)抑制血管生成的蛋白質(zhì)表達(dá)的DNA序列，以阻斷編碼所述蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。
[0149] 在其它實(shí)施方案中，促血管生成劑是激活促血管生成分子（例如，蛋白質(zhì)）表達(dá)的 轉(zhuǎn)錄因子。調(diào)節(jié)促血管生成蛋白的表達(dá)的天然存在的轉(zhuǎn)錄因子（例如，HIF-1 α )是已知的。 此外，合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可通過(guò)基因工程來(lái)構(gòu)建。例如，已描述了用于設(shè)計(jì)結(jié)合目標(biāo)序列 的鋅指DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法和用于將這樣的鋅指DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合于轉(zhuǎn)錄激活和 抑制結(jié)構(gòu)域的方法。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利6, 534, 261 ;6, 607, 882 ;6, 785, 613 ;6, 794, 136 ; 6, 824, 978 ;6, 933, 113 ;6, 979, 539 ;7, 013, 219 ;7, 177, 766 ;7, 220, 719 和 7, 788, 044。這些 方法可用于合成激活編碼促血管生成蛋白的任何基因的轉(zhuǎn)錄的非天然存在的蛋白。此外， 已描述了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)基因的合成的鋅指轉(zhuǎn)錄激活因子。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專 利號(hào) 7, 026, 462 ;7, 067, 317 ;7, 560, 440 ;7, 605, 140 和 8, 071，564。因此，可將激活 VEGF 基 因的轉(zhuǎn)錄的非天然存在的（即，合成的）鋅指蛋白與SB623細(xì)胞組合用于例如在中風(fēng)治療 中增強(qiáng)血管生成。
[0150] 在其它實(shí)施方案中，抑制抗血管生成分子的轉(zhuǎn)錄的天然或合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白（例 如，合成的鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白）可用作促血管生成劑。 實(shí)施例
[0151] 實(shí)施例1 :條件培養(yǎng)基
[0152] 如所描述的獲得和/或制備MSC和SB623細(xì)胞。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào) 7, 682, 825 (2010年3月23日）和美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2010/0266554 (2010年10月 21 日）、2010/0310529(2010 年 12 月 9 日）、2011/0229442(2011 年 9 月 22 日）和 2011/0306137(2011年12月15日）；將所述專利和專利申請(qǐng)公布的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用 整體并入本文，以描述SB623細(xì)胞（這些文獻(xiàn)中其被不同地稱為"神經(jīng)前體細(xì)胞"和"神 經(jīng)再生細(xì)胞"）的制備。將細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有補(bǔ)充有10%胎 牛血清（FBS，Hy Cl〇ne，L〇gan，UT)、2mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素（兩者來(lái)自 Invitrogen, Carlsbad, CA)的 a-MEM(Mediatech, Herndon, VA)。MSC 和 SB623 細(xì)胞通常表 達(dá)⑶29、⑶90和⑶105 ;并且不表達(dá)⑶31、⑶34或⑶45,如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的。
[0153] 為了用于本文中描述的實(shí)驗(yàn)，將來(lái)自相同人供體的冷凍的MSC和SB623細(xì)胞解 凍，再涂板于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，讓其恢復(fù)將近1周。為了獲得條件培養(yǎng)基，將細(xì)胞生長(zhǎng)至 約90%的匯合（?15, 000個(gè)細(xì)胞/cm2)，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS)漂洗板一次，隨后用 OptiMEM?:培養(yǎng)基（Irwitrogen，Carlsbad，CA)替換培養(yǎng)基，維持相同細(xì)胞密度。72小 時(shí)后收集條件培養(yǎng)基。將條件培養(yǎng)基的冷凍樣品緩慢地加溫至37°C，隨后使用。
[0154] 實(shí)施例2:SB623細(xì)胞分泌的因子對(duì)HUVEC存活的作用
[0155] 腦缺血癥可導(dǎo)致受影響區(qū)域的營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)的喪失。為了確定來(lái)自SB623細(xì)胞和 MSC的可溶性因子是否對(duì)除去了營(yíng)養(yǎng)物的內(nèi)皮細(xì)胞具有恢復(fù)作用，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)在耗盡了血清和生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，隨后暴露于來(lái)自MSC或SB623 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（CM)。對(duì)照培養(yǎng)物仍然保留在未添加 CM的血清和生長(zhǎng)因子耗盡的培養(yǎng) 基中。隨后評(píng)估HUVEC的存活力和增殖能力。
[0156] 為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞傳代2次，隨后將7. 5xl05個(gè) 細(xì)胞于EBM-2/ECGS培養(yǎng)基（內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2/內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑； Lonza，Walkersville，MD)中涂板在涂覆有0. 1 %明膠的T-75培養(yǎng)瓶上，培養(yǎng)24小時(shí)。用 溫PBS漂洗HUVEC單層2次，用12ml新鮮EBM-2培養(yǎng)基在37°C，5% C02條件下溫育過(guò)夜。 隨后通過(guò)從每一個(gè)培養(yǎng)瓶取出6ml培養(yǎng)基，用6ml新鮮OptiMEM (對(duì)照）、6ml MSC條件培養(yǎng) 基或6ml SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基（如實(shí)施例1中所述制備條件培養(yǎng)基）替代其來(lái)評(píng)估CM 的作用。7天后，收集非粘附和粘附細(xì)胞，以1400rpm離心5min，將其分成3個(gè)部分以用于 隨后染色分析（PI、Bcl-2和Ki67)。
[0157] 為了定量細(xì)胞死亡，用碘化丙啶（PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，因?yàn)樗劳黾?xì)胞對(duì)PI是可滲 透的。在室溫用5ug/ml PI對(duì)細(xì)胞染色30min，隨后使用BD FACSCalibur CellQuest程序 (BD Biosciences，San Jose, CA)的FL-2對(duì)數(shù)型通道進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)獲取和分析。對(duì)于該 測(cè)定，測(cè)試了 3個(gè)不同的人供體對(duì)。結(jié)果示于圖1中。在對(duì)照HUVEC培養(yǎng)物中（其在去除了 營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中維持了 7天），超過(guò)70%的細(xì)胞對(duì)于碘化丙啶染色是陽(yáng)性的。SB623-或 MSC-條件培養(yǎng)基的添加顯著降低了碘化丙啶陽(yáng)性細(xì)胞的百分比（p〈0. 05)。
[0158] 這些結(jié)果表明MSC條件培養(yǎng)基和SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基顯著減少因血清和生長(zhǎng)因 子饑餓而引起的內(nèi)皮細(xì)胞死亡（即，減少碘化丙啶陽(yáng)性HUVEC的數(shù)目）。
[0159] Bcl-2是最初被鑒定為在某些B細(xì)胞淋巴瘤中過(guò)表達(dá)的抗細(xì)胞凋亡蛋白。因此，表 達(dá)Bcl-2蛋白的細(xì)胞的分?jǐn)?shù)在血清/生長(zhǎng)因子饑餓的HUVEC中被測(cè)量為它們的細(xì)胞凋亡潛 能的指標(biāo)。為了進(jìn)行Bcl-2測(cè)量，將細(xì)胞于4%多聚甲醛中固定，用0. 1% Triton-ΧΙΟΟ透 化1小時(shí)。透化后,將細(xì)胞在冰上用綴合有熒光素的抗-Bcl-2抗體染色1小時(shí)，隨后洗漆 樣品，獲取樣品，在BD FACSCalibur的FL-1通道上進(jìn)行分析。暴露于綴合有熒光素的IgG 的細(xì)胞用作陰性對(duì)照。對(duì)于這些測(cè)定，測(cè)試3個(gè)不同的人供體對(duì)。
[0160] 圖2中顯示的結(jié)果表明MSC條件培養(yǎng)基或SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基的存在顯著增加 了 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞在血清饑餓的內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物中的分?jǐn)?shù)。
[0161] 來(lái)自MSC或來(lái)自SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基減少死亡（PI-陽(yáng)性）細(xì)胞的數(shù)目和增 加表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2蛋白的細(xì)胞的數(shù)目的事實(shí)顯示MSC和SB623細(xì)胞都分泌增強(qiáng)內(nèi) 皮細(xì)胞存活的因子。
[0162] 實(shí)施例3:SB623細(xì)胞分泌的因子對(duì)HUVEC增殖的作用
[0163] Ki67是存在于從細(xì)胞周期的G0 (靜止）期脫離的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)；因此Ki67水 平可用作細(xì)胞增殖的量度。測(cè)量已針對(duì)血清和生長(zhǎng)因子進(jìn)行了饑餓，隨后利用來(lái)自MSC或 SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的HUVEC中表達(dá)Ki67蛋白的細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。
[0164] 為了進(jìn)行Ki67測(cè)量，培養(yǎng)HUVEC，如實(shí)施例2中所述將其暴露于CM。將細(xì)胞在4% 多聚甲醛中固定，利用0. 1% Triton-ΧΙΟΟ透化1小時(shí)。透化后，將細(xì)胞在冰上用綴合有熒 光素的抗-KI67抗體染色1小時(shí)，隨后洗滌樣品，獲取樣品，在BD FACSCalibur的FL-1通 道上進(jìn)行分析。暴露于綴合有熒光素的IgG的細(xì)胞用作陰性對(duì)照。對(duì)于這些測(cè)定，測(cè)試3 個(gè)不同的人供體對(duì)。
[0165] 圖3顯示在來(lái)自MSC或SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在的情況下培養(yǎng)饑餓的HUVEC 導(dǎo)致相較于未暴露于條件培養(yǎng)基的對(duì)照HUVEC增加的表達(dá)Ki67的細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。來(lái)自MSC 或SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基增加表達(dá)增殖相關(guān)Ki67蛋白的細(xì)胞的數(shù)目的事實(shí)顯示MSC和 SB623細(xì)胞都分泌增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的因子。
[0166] 本實(shí)施例和先前實(shí)施例中提供的結(jié)果顯示了當(dāng)用MSC-或SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基 培養(yǎng)這些內(nèi)皮細(xì)胞7天時(shí)，相較于在非條件培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，HUVCE的存活和增殖顯著增加 (p〈0. 05)。
[0167] 實(shí)施例4:SB623細(xì)胞分泌的因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的管形成的作用
[0168] HUVEC管形成測(cè)定用于測(cè)試MSC和SB623細(xì)胞加工刺激血管形成的因子的能力。參 見(jiàn)，例如，EJ Smith & CA Staton, "Tubule formation assays,，'in Angiogenesis Assays-A Critical Appraisal of Current Techniques, (Staton, Lewis & Bicknell, eds. ). John Wiley & Sons，Ltd.，West Sussex，UK，pp.65_87,2006;和 Goodwin(2007)Microvasc. Res.74:172-183。
[0169] 將HUVEC在EBM-2/ECGS培養(yǎng)基中傳代5次，隨后以1x10s個(gè)細(xì)胞/ml的密度轉(zhuǎn)移 至α -ΜΕΜ/0. 5 % FBS/2mM谷氨酰胺/pen-str印。24小時(shí)后，使用0. 25 %胰蛋白酶-EDTA收 獲HUVEC，漂洗，以lxlO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度重懸浮于a -MEM/2mM谷氨酰胺/pen-strep中。 將75ul HUVEC+75ul MSC-或SB623-條件培養(yǎng)基（實(shí)施例1)或75ul OptiMEM培養(yǎng)基（作 為陰性對(duì)照）的混合物添加至96孔板的每一個(gè)孔中，所述板已通過(guò)添加每孔50ul的降低 生長(zhǎng)因子（RGF)-基底凝膠（In Vitrogen，Carslsbad，CA)并在37°C將板溫育45分鐘來(lái)進(jìn) 行了預(yù)處理。為了進(jìn)行該測(cè)定，從3個(gè)不同的人供體獲得MSC，將一部分來(lái)自每一個(gè)供體的 MSC轉(zhuǎn)化成SB623細(xì)胞。
[0170] 16小時(shí)后，通過(guò)相差顯微鏡檢查培養(yǎng)物并拍照。由對(duì)組不知情的實(shí)驗(yàn)者定量完全 管（由連續(xù)細(xì)胞形成的）的數(shù)目。顯示來(lái)自3個(gè)供體之一的結(jié)果的照片示于圖4中。使用 來(lái)自所有3個(gè)供體的MSC和SB623細(xì)胞的測(cè)定的結(jié)果（概述于圖5中）顯示來(lái)自MSC或 SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯著增強(qiáng)管的形成。因此，MSC和SB623細(xì)胞分泌促進(jìn)血管生成的 因子。
[0171] 實(shí)施例5:SB623細(xì)胞分泌的因子對(duì)血管長(zhǎng)出和分支的作用
[0172] 缺血性損傷后脈管系統(tǒng)的恢復(fù)需要存活的內(nèi)皮細(xì)胞接受促進(jìn)它們遷移和侵入的 信號(hào)。這樣的信號(hào)可產(chǎn)生自血管平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞等。為了測(cè)試參與血 管萌芽和分支的因子的分泌，使用主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定。參見(jiàn)，例如，Nicosia & Ottinetti (1990) Lab. Invest. 63:115-122 和 Nicosia(2009)J. Cell. Mol. Med. 13:4113-4136。
[0173] 為了制備主動(dòng)脈環(huán)，將成年Sprague-Dawley大鼠無(wú)痛致死，隨后解剖。在夾斷其 兩個(gè)末端后，取出主動(dòng)脈，將其置于冰冷的a -MEM/pen-strep培養(yǎng)基中，隨后除去外部脂 肪層。用冰冷的EBM-2/pen-strep培養(yǎng)基漂洗無(wú)脂肪主動(dòng)脈2次，隨后將其橫切成1. 0mm 厚的環(huán)。隨后將主動(dòng)脈環(huán)轉(zhuǎn)移至包含EBM-2/pen-str印培養(yǎng)基的板，并在37°C，5% C02溫 育6天，在第3天用新鮮EBM-2/pen-str印培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，以耗盡任何內(nèi)源性大鼠血管 生成因子。在那時(shí)，用α-ΜΕΜ/pen-strep培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
[0174] 在主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定的第0天（培養(yǎng)開(kāi)始后7天），在24孔板的每一個(gè)孔加入 50 μ 1降低生長(zhǎng)因子（RGF)基底凝膠。將單個(gè)主動(dòng)脈環(huán)置于每一個(gè)凝膠涂覆的孔的中央， 覆蓋另外的25μ1 RGF-基底凝膠。在于37°C/5%C02進(jìn)行30分鐘的凝膠固化后，將 500 μ 1 a -MEM/2mM谷氨酰胺/pen-strep添加至每一個(gè)孔，繼續(xù)溫育另外30分鐘。隨后， 添加500ul MSC-或SB623-來(lái)源的條件培養(yǎng)基（實(shí)施例1)。作為陰性對(duì)照，使用500 μ 1 OptiMEM培養(yǎng)基替代條件培養(yǎng)基。
[0175] 為了評(píng)估MSC-和SB623-來(lái)源的因子的血管生成活性，在第10天拍攝相差照片， 由對(duì)組不知情的實(shí)驗(yàn)者通過(guò)計(jì)數(shù)血管長(zhǎng)出和分支來(lái)定量結(jié)果。通過(guò)測(cè)量從環(huán)長(zhǎng)出的血管的 數(shù)目定量新血管的生長(zhǎng)；通過(guò)測(cè)量存在于從主動(dòng)脈環(huán)長(zhǎng)出的血管中的分支點(diǎn)的數(shù)目來(lái)定量 血管分支。對(duì)于該測(cè)定，測(cè)試7個(gè)不同的人供體對(duì)。
[0176] 來(lái)自第10天樣品的代表性結(jié)果示于圖6中，來(lái)自7組10天培養(yǎng)基物的結(jié)果概述和 定量于圖7中。圖7A顯示來(lái)自MSC和SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基刺激新萌芽的血管的數(shù)目 以及分支程度的增加（相較于對(duì)照主動(dòng)脈環(huán)）。此外，相較于在MSC-條件培養(yǎng)基（圖6B， 圖7A)中培養(yǎng)的環(huán)或在非條件培養(yǎng)基（圖6A，圖7A)中培養(yǎng)的環(huán)，在SB623細(xì)胞條件培養(yǎng) 基（圖6C，圖7A)中培養(yǎng)的環(huán)中觀察到血管分支的顯著增加。這些結(jié)果表明MSC和SB623 細(xì)胞分泌增強(qiáng)血管萌芽和血管分支的因子。特別地，SB623細(xì)胞分泌極大地增強(qiáng)血管分支 的因子（參見(jiàn)圖7B)。
[0177] 上述實(shí)施例中提供的數(shù)據(jù)表明SB623細(xì)胞分泌的可溶性因子促進(jìn)血管生成的幾 個(gè)方面，其促成了受損大腦中的恢復(fù)。
[0178] 實(shí)施例6:統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)
[0179] 對(duì)于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)（其包括3-4個(gè)孔/組），獲得如下條件的平均值：（1)每一個(gè)細(xì) 胞類型的處理?xiàng)l件（MSC-或SB623細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基；每測(cè)試的人供體一個(gè)值）和（2) 未處理組（每一輪測(cè)試一個(gè)值）。對(duì)于統(tǒng)計(jì)比較（SigmaStat, SystatSoftware, Chicago, I L)，使用這些值的每一個(gè)值，使用單因素 AN0VA進(jìn)行下列組的比較：⑴對(duì)照（非條件培養(yǎng) 基；η = 3)，（2)MSC條件培養(yǎng)基（η = 3-5);和（3)SB623細(xì)胞條件培養(yǎng)基（η = 3-5)。使用 Tukey' s檢驗(yàn)進(jìn)行其它配對(duì)比較。0.05的α值用于確定平均值是否差異顯著。
[0180] 實(shí)施例7:由MSC和SB623細(xì)胞分泌的血管生成因子的鑒定
[0181] 測(cè)量來(lái)自MSC和SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的某些細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)因子的 水平。為了獲得條件培養(yǎng)基，將MSC或SB623細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至?90 %的 匯合（?15, 000個(gè)細(xì)胞/cm2)，在那時(shí)除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞于PBS中進(jìn)行漂洗，添加 Opti-MEM?培養(yǎng)基（Invitrogen，Carlsbad, CA)以獲得?150, 000 個(gè)細(xì)胞/ml 的濃度。 72小時(shí)后收集條件培養(yǎng)基，按照制造商的說(shuō)明書，使用quantibody'?人血管生成陣列 l(RayBiotech，Norcross，GA)進(jìn)行分析。對(duì)于MSC的每一個(gè)來(lái)源，將一部分細(xì)胞直接作為 MSC培養(yǎng)，和將一部分轉(zhuǎn)化成SB623細(xì)胞。因此，來(lái)自特定供體的MSC的培養(yǎng)物和從那些MSC 制備的SB623細(xì)胞的培養(yǎng)物被稱為匹配的"供體對(duì)"。在本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定4個(gè)供體對(duì)。將表達(dá) 為蛋白質(zhì)濃度的結(jié)果針對(duì)當(dāng)收集條件培養(yǎng)基時(shí)存在于培養(yǎng)物中的細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 圖8顯示供體的血管生成素、ANG-2、HB-EGF和PIGF的結(jié)果。圖9顯示這4個(gè)因子和也是 供體的6個(gè)其它因子的結(jié)果，并且突出顯示了由MSC和SB623細(xì)胞產(chǎn)生的大量的VEGF。
[0182] 表1顯示在4個(gè)供體對(duì)中平均的10個(gè)測(cè)試因子的蛋白質(zhì)水平。雖然分泌的營(yíng)養(yǎng) 因子的水平在不同供體間是可變的（如例如圖8和9中顯示的），但其中4個(gè)因子（血管生 成素、血管生成素-2、HB-EGF和PIGF)的水平在MSC與SB623細(xì)胞之間始終不同。血管生 成素、ANG-2和HB-EGF由SB623細(xì)胞更高地表達(dá)，然而更高濃度的PIGF由MSC表達(dá)。
[0183] 表1:來(lái)自MSC和SB623細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的血管生成營(yíng)養(yǎng)因子的水平
[0184]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于修復(fù)受試者的缺血性損傷的組合物，所述組合物包含SB623細(xì)胞的群體； 其中所述SB623細(xì)胞通過(guò)如下步驟獲得： (a) 提供間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物， (b) 將步驟（a)的細(xì)胞培養(yǎng)物與包含編碼Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD)的序列的多核苷 酸接觸，其中所述多核苷酸不編碼全長(zhǎng)Notch蛋白， (c) 選擇包含步驟（b)的多核苷酸的細(xì)胞，和 (d) 在不存在選擇的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)步驟（c)的選擇的細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中缺血性損傷的修復(fù)選自血管生成的增強(qiáng)、內(nèi)皮細(xì)胞死亡 的阻止、內(nèi)皮細(xì)胞存活的增加、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的刺激、血管分支的增加和一種或多種血管生 成因子的提供。
3. 權(quán)利要求1或2的任一項(xiàng)的組合物，其中所述血管生成因子選自血管生成素、血管生 成素-2、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、瘦素、血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB和胎盤 生長(zhǎng)因子的一種或多種。
4. 權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的組合物，其中所述缺血性損傷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生。
5. 權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的組合物，其中所述缺血性損傷在腦中發(fā)生。
6. 權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)的組合物，其還包含促血管生成劑。
7. 權(quán)利要求6的組合物，其中所述促血管生成劑是多肽。
8. 權(quán)利要求6的組合物，其中所述促血管生成劑是核酸。
9. 權(quán)利要求7的組合物，其中所述多肽是激活促血管生成蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。
10. 權(quán)利要求9的組合物，其中所述促血管生成蛋白為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)。
11. 權(quán)利要求9或10的任一項(xiàng)的組合物，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是激活VEGF基因的轉(zhuǎn)錄的 非天然存在的鋅指蛋白。
12. 權(quán)利要求6-11的任一項(xiàng)的組合物，其還用于中風(fēng)的治療。
【文檔編號(hào)】A61K35/28GK104254337SQ201380006611
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月27日
【發(fā)明者】M·道, C·泰特, C·凱斯 申請(qǐng)人:桑比歐公司