一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導(dǎo)物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種真菌毒素合成的誘導(dǎo)物及方法，具體涉及一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導(dǎo)物及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]禾谷鐮刀菌是引起小麥赤霉病(Fusarium head blight or scab)的病原真菌，不僅嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量，而且可以產(chǎn)生多種對(duì)人畜有害的真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，使糧食或飼料的品質(zhì)降低。脫氧雪腐鐮刀菌稀醇(deoxynivalenol，D0N)是一種倍半萜烯化合物，不易降解、穩(wěn)定性高，被認(rèn)為是主要由鐮刀菌在缺乏營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，合成并作為主要天然毒素存在于赤霉病發(fā)病小麥中。DON毒素是污染率最高的真菌毒素之一，主要污染小麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，如面包、餅干、麥制點(diǎn)心等；另外，在動(dòng)物的奶、蛋中也有DON殘留的報(bào)道。該毒素可抑制真核生物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，破壞人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，可隨食品、飼料進(jìn)入食物鏈，嚴(yán)重威脅人畜健康。
[0003]我國是世界上受DON危害最嚴(yán)重的國家之一。因此，對(duì)谷物類制品中DON毒素的篩查及危害評(píng)估勢(shì)在必行，對(duì)DON毒素形成機(jī)理的研究也同樣需要大規(guī)模、大范圍的開展起來。事實(shí)上，我國檢驗(yàn)檢疫部門一直十分重視這種毒素的檢測(cè)監(jiān)控研究，相關(guān)的科學(xué)研究也一直是赤霉病科研工作者的工作重點(diǎn)。然而，這些工作由于需要用到大量的DON毒素標(biāo)準(zhǔn)品，這些毒素標(biāo)準(zhǔn)品的價(jià)格又非常昂貴(lmg價(jià)格約為1000元人民幣)，而且多是從國外出口，由此這些因素嚴(yán)重限制了相關(guān)工作的開展。由于真菌毒素涉及食品安全、環(huán)保、醫(yī)療等領(lǐng)域，需求廣泛。因此，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物制備已成為世界上各國研究的熱點(diǎn)。
[0004]我國在真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方面的工作起步較晚，當(dāng)前，合成真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品主要利用化學(xué)合成的方法，通過菌株培養(yǎng)、發(fā)酵、提取、純化等制備工藝獲得，雖然經(jīng)歷了不斷的優(yōu)化和工藝的完善，提取效率相對(duì)上世紀(jì)已有明顯提高，但是真菌毒素得率仍相當(dāng)有限，且純化成本高昂。因此，若篩選出一種較為低廉的化學(xué)物質(zhì)刺激毒素的合成，必然是一條可行的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種可提高產(chǎn)毒量及縮短毒素合成周期的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導(dǎo)物及方法，以達(dá)到在工業(yè)生產(chǎn)中利用少量原材料菌絲大量合成脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，同時(shí)縮短周期提高產(chǎn)量的目的。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案，一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導(dǎo)物，為,57 -環(huán)單磷酸、,57 -環(huán)單磷酸鈉鹽或8?12mg/ml的咖啡因。
[0007]進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)物為4mM的腺苷-3' ,57 -環(huán)單磷酸、4mM的腺苷-3' ,57 -環(huán)單磷酸鈉鹽或10mg/ml的咖啡因。
[0008]進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)物為10mg/ml的咖啡因，。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案，一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，包括以下步驟:
[0010](3)產(chǎn)孢培養(yǎng):將CMC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4?6天的禾谷鐮刀菌孢子，轉(zhuǎn)入到液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基至終濃度0.8?1.2 X 104個(gè)孢子/毫升(優(yōu)選終濃度為1 X 104個(gè)孢子/毫升)；
[0011 ] (4)誘導(dǎo)合成:加入濃度2mM?4mM的腺苷-3' ,57 -環(huán)單磷酸、2mM?4mM的腺苷-3'，57 -環(huán)單磷酸鈉鹽或8?12mg/ml的咖啡因，黑暗靜置誘導(dǎo)培養(yǎng)3?7天(優(yōu)選誘導(dǎo)時(shí)間為5?7天，更優(yōu)選7天)，即成；
[0012]禾谷鐮刀菌在產(chǎn)毒階段的細(xì)胞內(nèi)的腺苷-3'，5。環(huán)單磷酸(cAMP)水平要遠(yuǎn)高于在普通菌絲生長階段。因此，本發(fā)明采用cAMP、誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成，可大大提高產(chǎn)毒量及縮短毒素合成周期。再則利用相對(duì)易溶的cAMP鈉鹽作為cAMP的替代物，同樣可以誘導(dǎo)DON的生物合成；尤其篩選到了價(jià)格低廉，且相對(duì)穩(wěn)定、高效的咖啡因作為cAMP的替代物誘導(dǎo)物同樣可以誘導(dǎo)DON的合成。
[0013]本發(fā)明采用cAMP、cAMP鈉鹽或咖啡因誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成，可大大提高產(chǎn)毒量及縮短毒素合成周期。尤其，cAMP的替代物咖啡因是廉價(jià)、高效、相對(duì)穩(wěn)定的毒素合成誘導(dǎo)物。
[0014]實(shí)驗(yàn)證明，4mM濃度的cAMP可以大幅提高禾谷鐮刀菌DON的生物合成，幾乎上調(diào)了40倍;4mM cAMP處理禾谷鐮刀菌菌絲5天，合成的毒素量甚至已經(jīng)達(dá)到對(duì)照組第7天毒素合成量的5倍以上；10mg/ml的咖啡因產(chǎn)毒量可達(dá)170?180ppm。
【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明中不同濃度cAMP誘導(dǎo)毒素合成的對(duì)比。
[0016]圖2為本發(fā)明中4mM cAMP處理禾谷鐮刀菌菌絲不同時(shí)間的結(jié)果對(duì)比。
[0017]圖3為本發(fā)明中cAMP對(duì)毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)量的誘導(dǎo)。
[0018]圖4為本發(fā)明中作為cAMP替代物的咖啡因誘導(dǎo)毒素合成的情況。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0020]實(shí)施例1:不同濃度cAMP誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成
[0021 ]收集CMC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天的禾谷鐮刀菌孢子，加入到液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基至終濃度104個(gè)孢子/毫升;然后分別加入終濃度lmM，2mM以及4mM的cAMP，黑暗靜置培養(yǎng)7天;最后對(duì)培養(yǎng)基中的毒素進(jìn)行測(cè)定。
[0022]液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基(1升):30克蔗糖、1克硝酸銨、1克磷酸二氫銨、0.5克七水硫酸鎂、
0.5克氯化鉀、10毫克七水硫酸亞鐵、0.03%植物凝膠以及200微升微量元素混合液，pH值用氫氧化鈉調(diào)至6.5。微量元素混合液(100毫升):5g檸檬酸、5克七水硫酸鋅、0.25克五水硫酸銅、50毫克一水硫酸錳、50毫克硼酸、50毫克二水鉬酸鈉)。
[0023]毒素測(cè)定利用Beacon公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒，具體操作為:先吸取培養(yǎng)基，離心去除菌絲，獲得樣品；然后向試劑盒中配備的反應(yīng)杯中依次加入酶、樣品、抗體，混合均勻，靜置反應(yīng)10分鐘，棄反應(yīng)液;接著用試劑盒中的清洗液，洗反應(yīng)杯5次;然后加入底物反應(yīng)5分鐘，最后用終止液終止反應(yīng)。
[0024]在酶標(biāo)儀中測(cè)0D45()數(shù)值并與標(biāo)樣所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，算出具體數(shù)值，不同濃度cAMP誘導(dǎo)毒素合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知，ImM濃度的cAMP對(duì)產(chǎn)毒幾乎沒有誘導(dǎo)作用，2mM濃度的cAMP可以輕微的誘導(dǎo)產(chǎn)毒，而4mM濃度的cAMP可以大幅提高禾谷鐮刀菌DON的生物合成，幾乎上調(diào)了 40倍。
[0025]實(shí)施例2:cAMP誘導(dǎo)不同時(shí)間禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的合成
[0026]收集CMC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天的禾谷鐮刀菌孢子，加入到液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基至終濃度104個(gè)孢子/毫升;然后加入終濃度4mM的cAMP，在黑暗靜置分別培養(yǎng)1天、3天、5天和7天，并對(duì)培養(yǎng)基中的毒素進(jìn)行測(cè)定，由此對(duì)cAMP誘導(dǎo)毒素合成進(jìn)一步觀察。
[0027]4mM cAMP處理禾谷鐮刀菌菌絲不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，由圖2可知，未經(jīng)處理的對(duì)照組直到培養(yǎng)5天后才開始產(chǎn)毒，而用cAMP處理后的菌絲第3天就可以檢測(cè)到一定量的毒素，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天，cAMP處理組所產(chǎn)的毒素量甚至已經(jīng)達(dá)到對(duì)照組第7天毒素合成量的5倍以上，表明采用cAMP處理樣品可以大大縮短毒素合成周期以及提高產(chǎn)毒量，對(duì)生產(chǎn)中縮短周期提高產(chǎn)量至關(guān)重要。
[0028]實(shí)施例3:分析cAMP誘導(dǎo)下的TRI基因的表達(dá)模式
[0029]DON的生物合成是由一個(gè)基因簇完成的，基因簇中的基因被稱之為TRI基因，因此，為了進(jìn)一步確認(rèn)cAMP對(duì)DON生物合成的誘導(dǎo)作用，對(duì)cAMP誘導(dǎo)下的TRI基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。
[0030]收集液體誘導(dǎo)產(chǎn)毒培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天的菌絲(未加cAMP的樣品和加入4mMcAMP的樣品)，液氮研磨后，轉(zhuǎn)入2毫升的離心管中，然后加入1毫升的Trizol (購自Invitrogen公司)，渦旋混勻后靜置5分鐘，加入200微升的氯仿，混勻靜置2分鐘，離心10分鐘，吸取上清，加入等體積的氯仿，混勻離心5分鐘，吸取上清加入三分之二體積的異丙醇，靜置15分鐘，離心棄上清，用70 %乙醇清洗沉淀一次，晾干，加入一定體積的DEPC水溶解。
[0031 ]利用B1-Rad公司的cDNA試劑盒iScript? cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，利用iQ SYBR Green Supermix試劑盒進(jìn)行定量PCR。
[0032]cAMP對(duì)毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)量的誘導(dǎo)效果見圖3，由圖3可知，所有TRI基因的表達(dá)都明顯上調(diào)，有的甚至上調(diào)了幾百倍，這表明cAMP可以通過調(diào)控毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)來刺激毒素的合成。
[0033]實(shí)施例4:cAM的替代物誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成。
[0034 ] cAMP對(duì)毒素合成具有極為顯著的誘導(dǎo)作用，但是cAMP價(jià)格比較昂貴，細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度會(huì)受到cAMP磷酸二酯酶的負(fù)調(diào)控。因此，cAMP磷酸二酯酶抑制劑的添加就可以達(dá)到提高cAMP濃度的目的。
[0035]咖啡因是公認(rèn)的較為廉價(jià)的cAMP磷酸二酯酶抑制劑，為了進(jìn)一步節(jié)省成本，采用化學(xué)物質(zhì)咖啡因代替較為昂貴的cAMP，添加了終濃度10mg/ml的咖啡因到產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，具體操作同cAMP誘導(dǎo)和產(chǎn)毒方法，cAMP替代物的咖啡因誘導(dǎo)毒素合成的結(jié)果見圖4。由圖4可知，禾谷鐮刀菌毒素合成大幅提高，說明咖啡因是一種廉價(jià)高效的毒素合成誘導(dǎo)物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導(dǎo)物，其特征在于，所述誘導(dǎo)物為2mM?,57 -環(huán)單磷酸、2mM?4mM的腺苷-3' ,57 -環(huán)單磷酸鈉鹽或8?12mg/ml的咖啡因。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導(dǎo)物，其特征在于，所述誘導(dǎo)物為4mM的腺苷-3' ,57 -環(huán)單磷酸、4mM的腺苷-3' ,57 -環(huán)單磷酸鈉鹽或10mg/ml的咖啡因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導(dǎo)物，其特征在于，所述誘導(dǎo)物為1 Omg/ m 1的咖啡因。4.一種如權(quán)利要求1?3之一所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)產(chǎn)孢培養(yǎng):將CMC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4?6天的禾谷鐮刀菌孢子，轉(zhuǎn)入到液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基至終濃度0.8?1.2 X 104個(gè)孢子/毫升； (2)誘導(dǎo)合成:加入濃度Y-環(huán)單磷酸、,5,-環(huán)單磷酸鈉鹽或8?12mg/ml的咖啡因，黑暗靜置誘導(dǎo)培養(yǎng)3?7天，即成。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述禾谷鐮刀菌孢子終濃度為1 X 104個(gè)孢子/毫升。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，步驟(2)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為5?7天。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，步驟(2)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為7天。
【專利摘要】一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導(dǎo)物及方法，所述誘導(dǎo)物為2mM～4mM的腺苷-3′，5′-環(huán)單磷酸、2mM～4mM的腺苷-3′，5′-環(huán)單磷酸鈉鹽或8～12mg/ml的咖啡因。本發(fā)明還包括一種誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法。本發(fā)明采用cAMP、cAMP鈉鹽或咖啡因誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成，可大大提高產(chǎn)毒量及縮短毒素合成周期。
【IPC分類】C12R1/77, C12P17/18
【公開號(hào)】CN105483175
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610041250
【發(fā)明人】江聰, 王晨芳, 許金榮, 劉慧泉, 王建華, 項(xiàng)萍, 張強(qiáng), 尹濤, 唐喆
【申請(qǐng)人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2016年1月21日