專利名稱：腦膜炎奈瑟球菌orf2086抗原的非脂質化變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及如本文所述的免疫原性組合物中的腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis) 0RF2086抗原的非脂質化變體。本發(fā)明亦涉及保持腦膜炎奈瑟球菌0RF2086抗原的非脂質化變體的構象的方法。本發(fā)明另外包括相比于相應野生型抗原，非脂質化腦膜炎奈瑟球菌0RF2086抗原的表達改良相關的組合物及方法。
背景技術：
rLP2086為一種重組28_kDa脂蛋白，其誘導針對許多腦膜炎奈瑟球菌菌株，包括腦膜炎奈瑟球菌血清型B(MnB)菌株或更準確地血清群B(MnB)菌株的交叉反應性細菌抗體?；谕茢嗟陌被嵝蛄型葱?，鑒別出2個不同rLP2086亞家族A及B。此2個亞家族用于配制于IOmM組氨酸(pH6.0)、150mM NaCl及0.5mg/mL招及不同含量的聚山梨醇酯80 (PS-80)中各含 20、60、120 及 200 μ g/mL 的 MnB_rLP2086 疫苗樣品。天然 LP2086 為脂蛋白。Fletcher 等人 Infection & Immunity,第 72 卷(4):2088-2100(2004)證明在小鼠中，具有氨基端脂質的rLP2086比相同蛋白的非脂質化形式更具免疫原性。其它臨床前及臨床研究已證明此兩種脂質化蛋白的組 合可提供跨越fHBP家族的廣泛作用范圍(coverage)。腦膜炎奈瑟球菌性腦膜炎(Meningococcal meningitis)為一種不論抗生素的可用性如何，可在數小時內殺死兒童及青少年的毀滅性疾病。仍然需要適合的血清群B腦膜炎奈瑟球菌免疫原性組合物。發(fā)明概述為了滿足對腦膜炎奈瑟球菌疫苗的這些及其它需要，已對其他組合物進行評估以提供使用腦膜炎奈瑟球菌0RF2086多肽的非脂質化變體的作用范圍。本發(fā)明的第一方面提供一種包含非脂質化0RF2086蛋白的免疫原性組合物，其中該0RF2086蛋白為B44、B02、B03、B22、B24、B09、A05、A04、A12 或 A22 變體。在一些實施方案中，0RF2086 蛋白為 B44、B22、B09、A05、A12 或 A22 變體。本發(fā)明的另一方面提供一種包含非脂質化0RF2086蛋白亞家族B變體(P2086亞家族B多肽)的免疫原性組合物。在一些實施方案中，P2086亞家族B多肽為B44、B02、B03、B22、B24或B09變體。在一些實施方案中，免疫原性組合物另外包含非脂質化0RF2086蛋白亞家族A變體(P2086亞家族A多肽)。在一些實施方案中，P2086亞家族A多肽為A05、A04、A12 或 A22 變體。在一些實施方案中，免疫原性組合物另外包含佐劑。在一些實施方案中，佐劑為鋁佐劑、皂苷(saponin)、CpG核苷酸序列或其任何組合。在一些實施方案中，鋁佐劑為A1P04、Al (OH) 3、A12 (SO4)3或明礬。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度介于0.125 yg/ml與0.Syg/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度為0.25 μ g/ml。在優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度介于0.125mg/ml與0.5mg/ml之間。在一些優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度為0.25mg/ml。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度介于I μ g/ml與250 μ g/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度介于10 μ g/ml與100 μ g/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度為10 μ g/ml。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度為 οομ g/ml。在一些實施方案中，皂苷為QS-21 Stimulon (Agenus, Lexington, MA)或 ISCOMATRIX(丨 ) (CSL Limited, Parkville, Australia)。在一些實施方案中，在向對象施用多劑量的免疫原性組合物之后，免疫原性組合物會賦予引起對腦膜炎奈瑟球菌的免疫原性反應的能力。在一些實施方案中，在向對象施用2個劑量之后賦予免疫原性反應。在一些實施方案中，在向對象施用3個劑量之后賦予免疫原性反應。本發(fā)明的另一方面提供一種賦予非脂質化P2086抗原的增加的免疫原性的組合物，其中該組合物包含皂苷及至少一種非脂質化P2086抗原。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度介于I μ g/ml與250 μ g/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度介于10 μ g /ml與100 μ g/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度為10 μ g/ml。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度為100 μ g/ml。在一些實施方案中，皂苷為QS-21或ISCOMATRIX。在一些實施方案中，組合物另外包含鋁。在一些實施方案中，鋁是以aipo4、Al (OH) 3、A12 (SO4) 3或明礬形式存在。在一些實施方案中，組合物中的鋁濃度介于0.125 μ g/ml與0.5 μ g/ml之間。在一些實施方案中，組合物中的鋁濃度為0.25 μ g/ml。在優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度介于0.125mg/ml與0.5mg/ml之間。在一些優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度為0.25mg/ml。在一些實施方案中，在向對象施用多劑量的免疫原性組合物之后，免疫原性組合物會賦予引起對腦膜炎奈瑟球菌的免疫原性反應的能力。在一些實施方案中，在向對象施用2個劑量之后賦予免疫原性反應。在一些實施方案中，在向對象施用3個劑量之后賦予免疫原性反應。在一些實施方案中，非脂質化P2086抗原為P2086亞家族B多肽。在一些實施方案中，P2086亞家族B多肽為B44、B02、B03、B22、B24或B09變體。在一些實施方案中，非月旨質化P2086抗原為P2086亞家族A多肽。在一些實施方案中，P2086亞家族A多肽為A05、A04、A12 或 A22 變體。在一些實施方案中，組合物包含至少兩種非脂質化P2086抗原，其中該兩種非脂質化P2086抗原為至少一種非脂質化P2086亞家族A多肽及至少一種非脂質化P2086亞家族B多肽。在一些實施方案中，非脂質化P2086亞家族A多肽為A05變體且非脂質化P2086亞家族B多肽為B44變體。在一些實施方案中，非脂質化P2086亞家族A多肽為A05變體且非脂質化P2086亞家族B多肽為B22變體。在一些實施方案中，非脂質化P2086亞家族A多肽為A05變體且非脂質化P2086亞家族B多肽為B09變體。本發(fā)明的另一方面提供一種賦予對象針對腦膜炎奈瑟球菌細菌的免疫性的方法，其中該方法包含向該對象施用包含非脂質化P2086亞家族B多肽的免疫原性組合物的步驟。在一些實施方案中，？2086亞家族8多肽為財4、802、803、822、824或洲9變體。在一些實施方案中，免疫原性組合物另外包含P2086亞家族A多肽。在一些實施方案中，P2086亞家族A多肽為A05、A04、A12或A22變體。在一些實施方案中，免疫原性組合物另外包含佐劑。在一些實施方案中，佐劑為鋁佐劑、皂苷、CpG核苷酸序列或其任何組合。在一些實施方案中，鋁佐劑為A1P04、Al (OH) 3、Al2(SO4)3或明礬。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度介于0.125 μ g/ml與0.5μ g/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度為0.25 μ g/ml。在優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度介于0.125mg/ml與0.5mg/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度為0.25mg/ml。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度介于I μ g/ml與250 μ g/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度介于10 μ g/ml與100 μ g/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度為10 μ g/ml。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的皂苷濃度為100 μ g/ml。在一些實施方案中，皂苷為QS-21或ISCOMATRIX。在一些實施方案中，在給藥方案中以多劑量向對象施用免疫原性組合物。在一些實施方案中，在給藥方案中以2個劑量向對象施用免疫原性組合物。在一些實施方案中，在給藥方案中以3個劑量向對象施用免疫原性組合物。本發(fā)明的另一方面提供一種產生非脂質化P2086變體的方法，其包含以下步驟:(a)將0RF2086變體核酸克隆至表達載體中以產生0RF2086表達載體；(b)用該0FR2086表達載體轉化細菌；(c)誘導P2086變體自該0RF2086表達載體表達；及(d)分離表達的P2086變體蛋白；其中該0RF2086表達載體不包含脂質化控制序列。在一些實施方案中，細菌為大腸桿菌(E.coli)。在一些實施方案中，通過添加IPTG來誘導表達。在一些實施方案中，編碼P2086變體的N端Cys的密碼子缺失。在一些實施方案中，編碼P2086變體的N端Cys的密碼子經突變以產生Ala、Gly或Val密碼子。在一些實施方案中，P2086變體為A05、B01或B44變體。在一些實施方案中，P2086變體為B09變體。在一些實施方案中，N端尾部經突變以添加Ser及Gly殘基來延伸緊靠N端Cys的下游的Gly/Ser莖部(stalk)。在一些實施方案中，Gly/Ser莖部中的Gly及Ser殘基的總數為至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個或至少12個。在一些實施方案中 ，P2086變體的N端尾部的密碼子通過點誘變加以優(yōu)化。在一些實施方案中，0RF2086變體的N端尾部的密碼子通過點誘變加以優(yōu)化以使編碼0RF2086變體的第5個氨基酸的密碼子與SEQ ID NO:8的核苷酸13-15100%相同且編碼0RF2086變體的第13個氨基酸的密碼子與SEQ ID N0:8的核苷酸37-39100%相同。在一些實施方案中，非脂質化0RF2086變體的N端尾部經優(yōu)化以使5’ 45個核酸與SEQ ID N0:8的核酸1-45100%相同。在一些實施方案中，非脂質化0RF2086變體的N端尾部經優(yōu)化以使5’ 42個核酸與SEQ ID N0:8的核酸4-45100%相同。在一些實施方案中，非脂質化0RF2086變體的N端尾部經優(yōu)化以使5’39個核酸與SEQ ID N0:8的核酸4-42100%相同。在一些實施方案中，相比于SEQ ID NO: 18的氨基酸1-15，非脂質化P2086變體的N端尾部包含至少一個氨基酸取代。在一些實施方案中，相比于SEQ ID NO: 18的氨基酸1-15，非脂質化P2086變體的N端尾部包含兩個氨基酸取代。在一些實施方案中，相比于SEQ ID NO: 18的氨基酸2-15，非月旨質化P2086變體的N端尾部包含至少一個氨基酸取代。在一些實施方案中，相比于SEQ IDNO: 18的氨基酸2-15，非脂質化P2086變體的N端尾部包含兩個氨基酸取代。在一些實施方案中，氨基酸取代為保守性氨基酸取代。在一實施方案中，本發(fā)明涉及呈免疫原性組合物形式的腦膜炎奈瑟球菌0RF2086亞家族B抗原的穩(wěn)定制劑。本發(fā)明亦涉及保持腦膜炎奈瑟球菌0RF2086抗原的構象的方法及測定腦膜炎奈瑟球菌rLP2086抗原的效能的方法。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括分離的非丙酮?；侵|化0RF2086多肽的組合物。在一實施方案中，組合物為免疫原性組合物。在另一實施方案中，相比于相應野生型非脂質化0RF2086多肽，該多肽包括N端Cys缺失。在一實施方案中，該多肽包括選自由以下組成的組的氨基酸序列:SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21，其中位置I處的半胱氨酸缺失。在另一實施方案中，多肽包括選自由以下組成的組的氨基酸序列:SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO: 50 及 SEQ ID NO: 55。在另一實施方案·中，多肽由可操作地連接于表達系統的核苷酸序列編碼，其中該表達系統能夠在細菌細胞中表達。在一實施方案中，表達系統為質粒表達系統。在一實施方案中，細菌細胞為大腸桿菌細胞。在另一實施方案中，核苷酸序列與控制該核苷酸序列的表達的調控序列連接。在另一方面，本發(fā)明涉及一種包括可通過如下方法獲得的非丙酮?；侵|化0RF2086多肽的組合物。該方法包括表達編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有選自由以下組成的組的氨基酸序列:SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21，其中在位置I處的半胱氨酸缺失，其中該核苷酸序列可操作地連接于能夠在細菌細胞中表達的表達系統。在一實施方案中，細菌細胞為大腸桿菌。在一方面，本發(fā)明涉及一種包括包含SEQ ID N0:49所述的氨基酸序列的分離的多肽及包含SEQ ID N0:44所述的氨基酸序列的分離的多肽的組合物。在一實施方案中，本文所述的組合物為免疫原性組合物。在另一實施方案中，本文所述的組合物另外包括來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的0RF2086亞家族A多肽。在另一實施方案中，本文所述的組合物在哺乳動物中引發(fā)針對來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的0RF2086亞家族B多肽的殺細菌免疫應答。在一方面，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID N0:49所示的氨基酸序列的分離的多肽。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID N0:46的分離的核苷酸序列。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID N0:47的分離的核苷酸序列。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID N0:48的分離的核苷酸序列。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID N0:50所示的氨基酸序列的分離的多肽。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID N0:45的分離的核苷酸序列。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID N0:44所示的氨基酸序列的分離的多肽。在一方面，本發(fā)明涉及一種包括選自由SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDN0:48及SEQ ID N0:45組成的組的核苷酸序列的質粒，其中該質粒能夠在細菌細胞中表達。在一實施方案中，細菌細胞為大腸桿菌。在一方面，本發(fā)明涉及一種在哺乳動物中引發(fā)對0RF2086亞家族B血清群B腦膜炎奈瑟球菌具有特異性的殺細菌抗體的方法。該方法包括向該哺乳動物施用有效量的分離的多肽，其包括選自由SEQ ID N0:44及SEQ ID NO:49或其組合組成的組的氨基酸序列。在一方面，本發(fā)明涉及一種產生多肽的方法。該方法包括在細菌細胞中表達包括與SEQ ID NO: 21的相同性大于90%的序列的多肽，該序列包括至少一個選自由以下組成的組的結構域:SEQ ID N0:21的氨基酸13-18、SEQ ID NO:21的氨基酸21-34及SEQ ID N0:21的氨基酸70-80或其組合，其中該序列缺乏N端半胱氨酸。該方法另外包括純化多肽。在一實施方案中，序列另外包括至少一個選自由以下組成的組的結構域:SEQ ID N0:21的氨基酸96-116、SEQ ID NO:21 的氨基酸 158_170、SEQ ID NO:21 的氨基酸 172_185、SEQ ID N0:21的氨基酸 187-199,SEQ ID N0:21 的氨基酸 213_224、SEQ ID N0:21 的氨基酸 226_237、SEQID NO:21的氨基酸239-248或其組合。在一實施方案中，細菌細胞為大腸桿菌。在一方面，本發(fā)明涉及一種通過包括本文所述的方法的方法產生的分離的多肽。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種通過包括本文所述的方法的方法產生的免疫原性組合物。在一方面，本發(fā)明涉及一種包括來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的0RF2086亞家族B多肽的免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酰化非脂質化B44。在一實施方案中，組合物另外包括來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的第二 0RF2086亞家族B多肽，其中該第二多肽為非丙酮酰化非脂質化B09。在一實施方案中，組合物包括至多3種0RF2086亞家族B多肽。在另一實施方案中，組合物包括至多兩種0RF2086亞家族B多肽。在一實施方案中，組合物還包括0RF2086亞家族A多肽。在另一實施方案中，組合物包括A05亞家族A多肽。附圖簡述

圖1:P2086變體核酸序列。圖2:P2086變體氨基酸序列。各變體的N端尾部中的Gly/Ser莖部加下劃線。圖3:0RF2086蛋白的結構。圖4:移除N端Cys導致在大腸桿菌中的表達喪失。圖5:Gly/Ser莖部長度對非脂質化0RF2086變體表達的影響。與標記為BOl的蛋白質變體相關的序列以SEQ ID NO: 35示出。與標記為B44的蛋白質變體相關的序列以SEQID N0:36示出。與標記為A05的蛋白質變體相關的序列以SEQ ID N0:37示出。與標記為A22的蛋白質變體相關的序列以SEQ ID NO: 38不出。與標記為B22的蛋白質變體相關的序列以SEQ ID N0:39示出。與標記為A19的蛋白質變體相關的序列以SEQ ID N0:40示出。圖6:盡管Gly/Ser莖部較短，但非脂質化B09的表達量較高。左側2條泳道說明在誘導的前及之后N端Cys缺失B09變體的表達。第3及第4泳道說明在誘導的前及之后N端Cys陽性B09變體的表達。最右側泳道為分子量標準。影像下方展示的氨基酸序列以SEQ ID NO: 41示出。表示N端Cys缺失A22變體(在圖中稱為“A22_001”)的核苷酸序列以SEQ ID NO: 42示出，SEQ ID NO: 42在圖中展示于SEQ ID NO: 41下方。表示N端Cys缺失B22變體(在圖中稱為“B22_001”)的核苷酸序列以SEQ ID NO: 52示出。表示N端Cys缺失B09變體(在圖中稱為“B09_004”)的核苷酸序列以SEQ ID N0:53示出。
圖7:密碼子優(yōu)化使非脂質化B22及A22變體的表達增加。左側版面說明在IPTG誘導的前(泳道I及3)及之后(泳道2及4)N端Cys缺失B22變體的表達。右側版面說明在IPTG誘導的前(泳道7)及之后(泳道8)N端Cys缺失A22變體的表達。泳道5及6為分子量標準。圖8:P2086變體核酸及氨基酸序列。
序列號SEQ ID NO:1示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A04基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID NO: 2示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A05基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID NO: 3示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A12基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID NO: 4示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A12-2基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID NO: 5示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A22基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID NO: 6示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B02基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID N0:7示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B03基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。

SEQ ID N0:8示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B09基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID NO: 9示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B22基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID NO: 10示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B24基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID NO: 11示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B44基因的DNA序列，其包括編碼N端Cys的密碼子。SEQ ID NO: 12示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A04的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID NO: 13示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A05的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID NO: 14示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A12的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID NO: 15示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A22的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID NO: 16示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B02的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID NO: 17示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B03的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID NO: 18示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B09的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID NO: 19示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B22的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。
SEQ ID NO:20示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B24的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID NO: 21示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B44的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID N0:22示出實施例2中所示的正向引物的DNA序列。SEQ ID N0:23示出實施例2中所示的反向引物的DNA序列。SEQ ID N0:24示出實施例2表I中所示的正向引物的DNA序列。SEQ ID N0:25示出實施例2表I中所示的反向引物的DNA序列。SEQ ID N0:26示出實施例2表I中所示的正向引物的DNA序列。SEQ ID N0:27示出實施例2表I中所示的反向引物的DNA序列。SEQ ID NO: 28示出實施例4中所示的Gly/Ser莖部的DNA序列。SEQ ID NO:29示出實施例4中所示的Gly/Ser莖部的氨基酸序列，其由例如SEQID NO:28 編碼。SEQ ID NO: 30示出實施例4中所示的Gly/Ser莖部的DNA序列。SEQ ID NO:31示出實施例4中所示的Gly/Ser莖部的氨基酸序列，其由例如SEQID NO:30 編碼。SEQ ID NO: 32示出實施例4中所示的Gly/Ser莖部的DNA序列。SEQ ID NO:33示出Gly/Ser莖部的氨基酸序列，其由例如SEQ ID N0:32及SEQ IDNO: 34編碼。SEQ ID NO:34示出實施例4中所示的Gly/Ser莖部的DNA序列。SEQ ID NO: 35示出圖5中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體BOl的N端的
氨基酸序列。SEQ ID NO: 36示出圖5中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B44的N端的
氨基酸序列。SEQ ID NO: 37示出圖5中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A05的N端的
氨基酸序列。SEQ ID NO: 38示出圖5中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A22的N端的
氨基酸序列。SEQ ID NO: 39示出圖5中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B22的N端的
氨基酸序列。SEQ ID NO: 40示出圖5中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A19的N端的
氨基酸序列。SEQ ID NO: 41示出圖6中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體的N端的氨基酸序列。SEQ ID NO: 42示出圖6中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A22的N端的DNA序列。SEQ ID NO: 43示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B44基因的密碼子優(yōu)化DNA序列，其中相比于SEQ ID NO: 11，編碼N端半胱氨酸的密碼子缺失。質粒pDK087包括SEQ ID NO:43。 SEQ ID N0:44示出非丙酮?；侵|化腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B44的氨基酸序列。SEQ ID N0:44與SEQ ID NO:21相同，其中在SEQ ID N0:21的位置I處的N端半胱氨酸缺失。SEQ ID44由例如SEQ ID N0:43編碼。SEQ ID NO: 45示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B09基因的密碼子優(yōu)化DNA序列，其中相比于SEQ ID N0:8，編碼N端半胱氨酸的密碼子缺失，且其中該序列包括編碼另一 Gly/Ser區(qū)域的密碼子。質粒pEB063包括SEQ ID N0:45。SEQ ID NO: 46示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B09基因的密碼子優(yōu)化DNA序列，其中相比于SEQ ID N0:8，編碼N端半胱氨酸的密碼子缺失。質粒pEB064包括SEQ IDN0:46。SEQ ID NO: 47示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B09基因的密碼子優(yōu)化DNA序列，其中相比于SEQ ID N0:8，編碼N端半胱氨酸的密碼子缺失。質粒pEB065包括SEQ IDN0:47。SEQ ID NO:48示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B09基因的DNA序列，其中相比于SEQ ID NO: 8，編碼N端半胱氨酸的密碼子缺失。質粒pLA134包括SEQ ID NO: 48。SEQ ID N0:49示出非丙酮酰化非脂質化腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B09的氨基酸序列。SEQ ID N0:49與SEQ ID NO: 18相同，其中在SEQ ID NO: 18的位置I處的N端半胱氨酸缺失。SEQ ID49由例如選自由SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:47及SEQ ID NO:48組成的組的DNA序列編碼。SEQ I D NO: 50示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B09的氨基酸序列，其中相比于SEQ ID NO: 18，編碼N端半胱氨酸的密碼子缺失且其中該序列包括編碼另一 Gly/Ser區(qū)域的密碼子。SEQ ID NO:50由例如SEQ ID N0:45編碼。SEQ ID N0:51示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B44基因的DNA序列，其中相比于SEQ ID NO: 11，編碼N端半胱氨酸的密碼子缺失。質粒pLN056包括SEQ ID NO: 51。SEQ ID NO: 52示出圖6中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B22的N端的DNA序列。SEQ ID NO: 53示出圖6中所示的腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B09的N端的DNA序列。SEQ ID NO:54示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A05基因的DNA序列，其中相比于SEQ ID NO: 2，編碼N端半胱氨酸的密碼子缺失。SEQ ID N0:55示出非丙酮?；侵|化腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體A05的氨基酸序列。SEQ ID N0:55與SEQ ID NO: 13相同，其中在SEQ ID NO: 13的位置I處的N端半胱氨酸缺失。SEQ ID NO:55由例如SEQ ID N0:54編碼。SEQ ID NO: 56示出實施例7中所示的絲氨酸-甘氨酸重復序列的氨基酸序列。SEQ ID N0:57示出非丙酮酰化非脂質化腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體BOl的氨基酸序列。SEQ ID N0:57與SEQ ID NO:58相同，其中在SEQ ID N0:58的位置I處的N端半胱氨酸缺失。SEQ ID NO: 58示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體BOl的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。SEQ ID NO: 59示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B15的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。
SEQ ID NO:60示出腦膜炎奈瑟球菌血清群B2086變體B16的氨基酸序列，其在氨基酸位置I處包括N端Cys。發(fā)明詳述除非另外定義，否則本文中使用的所有技術及科學術語皆具有與本領域普通技術人員通常理解的含義相同的含義。盡管與本文所述類似或相等的方法及材料可用于本發(fā)明的實施或測試中，但以下描述適合方法及材料。材料、方法及實施例僅具說明性，且不意欲具有限制性。本文中提及的所有出版物、專利及其它文獻皆以全文引用的方式并入本文中。應注意，在本發(fā)明中，諸如“包含”、“含有”及其類似表述的術語可具有美國專利法中所賦予其的含義；例如，其可意謂“包括”及其類似含義。這些術語是指包括一特定成分或一組成分而不排除任何其它成分。諸如“基本上由…組成”的術語具有美國專利法中所賦予其的含義，例如，其允許包括不會有損于本發(fā)明的新穎或基本特征的其它成分或步驟，亦即其排除會有損于本發(fā)明的新穎或基本特征的其它未敘述成分或步驟，且其排除現有技術(諸如在本文中引用或以引用的方式并入本文中的本領域中的文獻)的成分或步驟，尤其當此文獻的目的在于限定相比于現有技術，例如相比于本文中引用或以引用的方式并入本文中的文獻的可被授予專利(例如新穎性、非顯而易見性、創(chuàng)造性)實施方案時。此外，術語“由…組成”具有美國專利法中所賦予其的含義；亦即這些術語為封閉式術語。因此，這些術語是指包括一特定成分或一組成分且排除所有其它成分。定義

除非上下文另外明確規(guī)定，否則如本文所用，單數形式“一”及“所述”包括復數個提及物。因此，例如提及“所述方法”包括一或多種屬于本文所述類型的方法及/或步驟及/或在閱讀本發(fā)明后將變得為一般技術人員顯而易知的方法及/或步驟等。如本文所用，除非上下文另外明確規(guī)定，否則復數形式包括單數個提及物。因此，例如提及“所述方法”包括一或多種屬于本文所述類型的方法及/或步驟及/或在閱讀本發(fā)明后將變得為一般技術人員顯而易知的方法及/或步驟等。如本文所用，“約”意謂在某一值，諸如某一指定濃度范圍、時間范圍、分子量、溫度或PH值的有統計意義的范圍內。該種范圍可在某一給定值或范圍的某一數量級內，通常在20%內、更通常在10%內、且甚至更通常在5%內。由術語“約”涵蓋的容許偏差將視所研究的特定系統而定，且可易于為一般技術者所了解。無論何時在本申請內敘述某一范圍，該范圍內的每一整數皆亦涵蓋為本發(fā)明的一實施方案。術語“佐劑”是指如本文中進一步描述及例示的會增強對抗原的免疫應答的化合物或混合物?？捎糜诒景l(fā)明疫苗中的佐劑的非限制性實例包括RIBI佐劑系統(Ribi Inc.，Hamilton, Mont.)、明帆、礦物質凝膠(諸如氫氧化招凝膠)、水包油乳液、油包水乳液(例如弗氏完全及不完全佐劑)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.)>SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.) >
AMPHIGEN 佐劑、皂苷、Quil A或其它皂苷部分、單磷?；|A及阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑?！翱贵w”為一種免疫球蛋白分子，其能夠經由位于該免疫球蛋白分子的可變區(qū)中的至少一個抗原識別位點與諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等目標特異性結合。如本文所用，除非上下文另外指示，否則該術語不僅意欲涵蓋完整多克隆或單克隆抗體，而且意欲涵蓋經工程改造的抗體(例如嵌合、人源化及/或衍生化以改變效應功能、穩(wěn)定性及其它生物活性)及其片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、單鏈(ScFv)及域抗體，包括鯊魚及駱駝抗體)、及如本文所述的包含抗體部分的融合蛋白、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其展現所要生物活性即可)及抗體片段、及免疫球蛋白分子的包含抗原識別位點的任何其它經修飾構型?？贵w包括任何類別，諸如IgG、IgA或IgM(或其亞類)的抗體，且抗體無需為任何特定類別。視免疫球蛋白的重鏈的恒定結構域的抗體氨基酸序列而定，免疫球蛋白可歸為不同類別。存在5種主要免疫球蛋白類別:IgA、IgD、IgE、IgG&IgM，且這些類別中的若干類別可進一步分成亞類(同種型)，例如人類中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2。對應于不同免疫球蛋白類別的重鏈恒定結構域分別稱為α、δ、ε、Y及μ。熟知不同類別的免疫球蛋白的亞基結構及三維構型。“抗體片段”僅包含完整抗體的一部分，其中該部分優(yōu)選保留當該部分存在于完整抗體中時通常與該部分相關的至少一種、優(yōu)選大部分或所有功能。術語“抗原”通常指代含有同源抗體(cognate antibody)可選擇性結合的至少一個表位的生物分子，其通常為蛋白質、肽、多糖、脂質或綴合物；或在一些情況下，指代可在動物中刺激抗體或T細胞反應或兩者的產生的免疫原性物質,包括注射至或吸收至動物中的組合物。免疫應答可針對整個分子或針對分子的一或多個不同部分(例如表位或半抗原)產生。該術語可用于指代個別分子或均質或異質抗原性分子群?？乖煽贵w、T細胞受體或具有特定體液性免疫性及/或細胞免疫性的其它成分識別。術語“抗原”包括所有相關抗原性表位。可使用本領域中熟知的許多表位定位技術鑒別既定抗原的表位。參見例如 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第 66 卷(GlennE.Morris編，1996)Humana Press, Totowa, N.J。舉例而言,線性表位可通過例如以下方法來確定:在固體支撐物上同時合成大量肽，其中這些肽對應于蛋白質分子的各部分，且使這些肽在仍然與支撐物連接的情況下與抗體反應。這些技術在本領域中為已知的且描述于例如美國專利第 4，708,871 號；Geysen 等人(1984) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:3998-4002 ；Geysen等人(1986)Molec.1mmunol.23:709-715中，該等所有專利及文獻皆以全文引用的方式并入本文中。類似地，構形表位可通過諸如通過例如X射線結晶學及2維核磁共振確定氨基酸的空間構形加以鑒別。參見例如Epitope Mapping Protocols (同上)。此外，出于本發(fā)明的目的，“抗原”亦可用于指代包括對天然序列所作的修飾，諸如缺失、添加及取代(通常基本上為保守性的，但其可為非保守性的)的蛋白質，只要蛋白質維持引發(fā)免疫應答的能力即可。這些修飾可為人為的，如經由定點誘變或經由特定合成程序，或經由遺傳工程改造方法；或可為偶發(fā)性的，諸如經由產生抗原的宿主突變。此外，抗原可自微生物，例如細菌衍生、獲得或分離，或可為整個生物體。類似地，此定義亦包括諸如在核酸免疫應用中表達抗原的寡核苷酸或多核苷酸。亦包括合成抗原，例如聚表位、側接表位及其它重組或合成方式衍生的抗原(Bergmann 等人(1993) Eur.J.1mmunol.23:27772781 ；Bergmann 等人(1996)J.1mmunol.157:32423249 ；Suhrbier,A.(1997)Immunol, and Cell Biol.75:402408 ；Gardner 等人(1998)第 12 屆世界 AIDS 會議(12th World AIDS Conference), Geneva, Switzerland, 1998 年6 月 28 日 -7月 3 日)。術語“保守性”氨基酸取代可基于所涉及殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩性性質的類似性進行。舉例而言，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；極性/中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺；帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸及組氨酸；且?guī)ж撾姾?酸性)氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。在一些實施方案中，保守性氨基酸變化會改變0RF2086多肽的一級序列，但不改變分子的功能。當產生這些突變體時，可考慮氨基酸的親水指數。本領域中通常了解親水氨基酸指數在賦予多肽以相互作用性生物功能方面的重要性(Kyte 及 Doolittle, 1982，J.Mol.Biol.，157 (I): 105-32)。已知某些氨基酸可經取代成具有類似親水指數或計分的其它氨基酸且仍然會產生生物活性類似的多肽。各氨基酸已基于其疏水性及電荷特征而賦予親水指數。這些指數為:異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);及精氨酸(-4.5)。據信氨基 酸殘基的相對親水特性決定所得多肽的二級及三級結構，后者又限定多肽與其它分子，諸如酶、底物、受體、抗體、抗原及其類似物的相互作用。本領域中已知某一氨基酸可經具有類似親水指數的另一氨基酸取代且仍然獲得功能相等的多肽。在這些變化中，親水指數在+/_2內的氨基酸取代優(yōu)選，親水指數在+/-1內的氨基酸取代特別優(yōu)選，且親水指數在+/-0.5內的氨基酸取代更特別優(yōu)選。亦可基于親水性進行保守性氨基酸取代或插入。如美國專利第4，554，101號(其據此以引用的方式并入本文中)中所述，多肽的如受其相鄰氨基酸的親水性支配的最大局部平均親水性與該多肽的免疫原性及抗原性相關，亦即與該多肽的生物性質相關。美國專利第4，554，101號敘述以下親水性值已賦予各氨基酸殘基:精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);脯氨酸(-0.5 + 1);蘇氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。應了解，某一氨基酸可經取代成具有類似親水性值的另一氨基酸且仍然獲得生物學上等價且具體而言的免疫學上等價的多肽。在這些變化中，優(yōu)選親水性值在±2內的氨基酸取代；特別優(yōu)選親水性值在±1內的氨基酸取代；且甚至更特別優(yōu)選親水性值在±0.5內的氨基酸取代。考慮各種上述特征的例示性取代為本領域技術人員所熟知且包括(不限于):精氨酸及賴氨酸；谷氨酸及天冬氨酸；絲氨酸及蘇氨酸；谷氨酰胺及天冬酰胺；及纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸。如本文所用的術語“有效免疫原性量”是指多肽或包含多肽的組合物在脊椎動物宿主中有效引發(fā)免疫應答的量。舉例而言，本發(fā)明的rLP2086蛋白的有效免疫原性量為在脊椎動物宿主中有效引發(fā)免疫應答的量。特定“有效免疫原性劑量或量”將視宿主的年齡、重量及醫(yī)學病狀、以及施用方法而定。本領域技術人員易于確定適合劑量。如本文所用的術語“Gly/Ser莖部”是指緊靠由0RF2086編碼的蛋白質的N端Cys殘基的下游的Gly及Ser殘基系列。Gly/Ser莖部中可存在5至12個Gly及Ser殘基。因此，Gly/Ser莖部由0RF2086所編碼的蛋白質的位置2至介于7與13之間的氨基酸組成。優(yōu)選地，Gly/Ser莖部由0RF2086所編碼的蛋白質的位置2且直至介于7與13之間的氨基酸組成。本發(fā)明的P2086變體的Gly/Ser莖部由圖2中的加下劃線序列(SEQ ID NO: 12-21)表示。如本文中所示，Gly/Ser莖部的長度可影響非脂質化P2086變體的穩(wěn)定性或表達量。在一例示性實施方案中，由影響Gly/Ser莖部的長度所產生的效應是與相應野生型變體進行比較。術語“免疫原性”是指抗原或疫苗能夠引發(fā)體液性免疫應答或細胞介導的免疫應答或兩者?！懊庖咴粤俊被颉懊庖哂行Я俊被颉皠┝俊保髡咴诒疚闹锌苫Q使用，通常是指抗原或免疫原性組合物足以引發(fā)免疫應答，細胞性(T細胞)反應或體液性(B細胞或抗體)反應或兩者的量，如通過本領域技術人員已知的標準測定所量測。術語“免疫原性組合物”涉及含有抗原(例如微生物)或其組分的任何醫(yī)藥組合物，該組合物可用于在對象中引發(fā)免疫應答。本發(fā)明的免疫原性組合物可用于藉助于經由全身性經皮或經粘膜途徑施用所述免疫原性組合物來治療易受腦膜炎奈瑟球菌感染的人類。這些施用可包括經由肌肉內(1.m.)、腹膜內(1.p.)、皮內(1.d.)或皮下途徑注射；通過貼片或其它經皮傳遞裝置用藥；或對口腔/消化道、呼吸道或生殖泌尿道經粘膜施用。在一實施方案中，免疫原性組合物可用于制造疫苗或引發(fā)可用于被動保護或治療對象的多克隆或單克隆抗體。特定免疫原性組合物的組分的最佳量可通過涉及觀測對象中的適當免疫應答的標準研究確定。在初始接種之后，對象可接受適當間隔的一或數次加強免疫。術語“分離的”意謂物質自其原始環(huán)境(例如天然環(huán)境(若其為天然存在)或自其宿主生物體(若其為重組實體)，或自一種環(huán)境取至不同環(huán)境)移除。舉例而言，“分離的”蛋白質或肽基本上不含來自衍生該蛋白質的細胞或組織來源的細胞物質或其它污染性蛋白質，或基本上不含在化學合成時或另外作為化學反應的一部分存在于混合物中的化學前驅體或其它化學物質。在本發(fā)明中，蛋白質可自細菌細胞或細胞碎片分離，以使其以適用于制造免疫原性組合物的形式提供。術語“分離的”或“分離”可包括純化，包括例如如本文所述的蛋白質的純化方法。 措辭“基本上不含細胞物質”包括如下多肽或蛋白質制劑，其中該多肽或蛋白質與分離或重組產生該多肽或蛋白質的細胞的細胞組分分離。因此，基本上不含細胞物質的蛋白質或肽包括污染性蛋白質或多糖或其它細胞物質小于約30%、20%、10%、5%、2.5%或1%(以干重計)的莢膜多糖、蛋白質或肽的制劑。當重組產生多肽/蛋白質時，其亦優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，亦即培養(yǎng)基所占的蛋白質制劑體積小于約20%、10%或5%。當通過化學合成產生多肽或蛋白質時，其優(yōu)選基本上不含化學前驅體或其它化學物質，亦即其與蛋白質或多糖的合成中所涉及的化學前驅體或其它化學物質分離。因此，這些多肽或蛋白質制劑含有小于約30%、20%、10%、5%(以干重計)的除相關多肽/蛋白質或多糖片段以外的化學前體或化合物。如本文所用的術語“N端尾部”是指由0RF2086編碼的蛋白質的N端部分，其使該蛋白質連接于細胞膜。N端尾部展示在圖3中的側視結構的底部。N端尾部通常包含由0RF2086編碼的蛋白質的N端16個氨基酸。在一些實施方案中，N端尾部為SEQ ID NO: 12-21任一者的氨基酸1-16。如本文所用的術語“0RF2086”是指來自奈瑟菌屬(Neisseria)物種細菌的開放閱讀框2086。奈瑟菌屬0RF2086、由其編碼的蛋白質、彼等蛋白質的片段及包含彼等蛋白質的免疫原性組合物在本領域中為已知的且例如于W02003/063766及美國專利申請公開案第US20060257413號及第US20090202593號中描述，該等專利各據此以全文引用的方式并入本文中。術語“P2086”通常是指由0RF2086編碼的蛋白質?！?086”的前的“P”為“蛋白質”的縮寫。本發(fā)明的P2086蛋白可為脂質化或非脂質化蛋白。“1^2086”及“？2086”通常分別是指2086蛋白的脂質化及非脂質化形式。本發(fā)明的P2086蛋白可為重組蛋白?！皉LP2086”及“rP2086”通常分別是指重組2086蛋白的脂質化及非脂質化形式?！?086”由于其能夠與因子H結合而亦稱為因子H結合蛋白(fHBP)。本文所用的術語“醫(yī)藥學上可接受的載體”意欲包括與施用人類或其它脊椎動物宿主兼容的任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。通常，醫(yī)藥學上可接受的載體為聯邦管理機構、州政府管理機構或其它管理機構核準或美國藥典或其它公認藥典中所列的供動物，包括人類以及非人類哺乳動物使用的載體。術語“載體”是指與醫(yī)藥組合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。這些醫(yī)藥載體可為滅菌液體·，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源的油。水、生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液可用作液體載體，特別用于可注射溶液。適合醫(yī)藥賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。必要時，組合物亦可含有少量濕潤劑、增積劑、乳化劑或PH緩沖劑。這些組合物可采用溶液、懸浮液、乳液、持續(xù)釋放制劑及其類似形式。適合醫(yī)藥載體的實例描述于E.ff.Martin的“Remington’s PharmaceuticalSciences”中。制劑應適合施用方式。適當載體將為本領域技術人員顯而易知且大部分將視施用途徑而定。“保護性”免疫應答是指免疫原性組合物能夠引發(fā)用于保護對象免遭感染的體液性或細胞介導的免疫應答。提供的保護無需為絕對保護，亦即感染無需被完全阻止或根除，若相比于對照對象群，例如未施用疫苗或免疫原性組合物的已感染動物，在統計上顯著改良即可。保護可限于緩和感染癥狀的嚴重性或發(fā)作快速性。一般而言，“保護性免疫應答”包括在至少50%對象中誘導對特定抗原具有特異性的抗體含量增加，包括針對各抗原的可測量功能性抗體反應的一些程度的增加。在特定情況下，“保護性免疫應答”可包括在至少50%對象中誘導對特定抗原具有特異性的抗體含量增加2倍或4倍，包括對各抗原的可測量功能性抗體反應的一些程度的增加。在某些實施方案中，調理吞曬抗體(opsonisingantibody)與保護性免疫應答相關。因此，保護性免疫應答可通過在血清殺細菌活性(SBA)測定或調理吞卩遼(opsonophagocytosis)測定,例如下述測定中量測細菌計數減少百分比來測定。這些測定在本領域中亦已知。對于腦膜炎奈瑟球菌疫苗，例如SBA測定為已確立的保護作用代用物。在一些實施方案中，相比于免疫原性組合物不存在下的細菌計數，細菌計數減小至少 10%、25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95% 或 95% 以上。術語“蛋白質”、“多肽”及“肽”是指氨基酸殘基的聚合物且不限于產物的最小長度。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體等包括在該定義內。全長蛋白質與其片段兩者均由該定義涵蓋。該等術語亦包括對天然序列所作的修飾，諸如缺失、添加及取代(通常基本上為保守性的，但其可為非保守性的)，優(yōu)選使得蛋白質維持在該蛋白質所施用的動物內引發(fā)免疫應答的能力。亦包括表達后修飾，例如糖基化、乙酰化、脂質化、磷酸化等等。如本文所用的術語“重組”是指通過遺傳工程改造方法產生的任何蛋白質、多肽或表達相關基因的細胞。如關于蛋白質或多肽使用的術語“重組”意謂通過表達重組多核苷酸產生的多肽。本發(fā)明蛋白質可自天然來源分離或通過遺傳工程改造方法產生。如本文所用的“重組”另外描述如下核酸分子，其通過其來源或操作而不與其在自然界中與的相締合的全部或一部分多核苷酸相締合。如關于宿主細胞使用的術語“重組”意謂包括重組多核苷酸的宿主細胞。術語“穩(wěn)定劑”是指與抗原結合且維持該抗原的表位或免疫應答性持續(xù)一段時間的化合物。穩(wěn)定劑在本領域中為已知的。穩(wěn)定劑的實例包括多價陽離子，例如鈣或鋁。術語“對象”是指哺乳動物、鳥類、魚類、爬行動物或任何其它動物。術語“對象”亦包括人類。術語“對象”亦包括家養(yǎng)寵物。家養(yǎng)寵物的非限制性實例包括:狗、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙鼠(gerbil)、倉鼠、天竺鼠(guinea pig)、雪貂、鳥類、蛇、蜥蜴、魚類、烏龜及蛙。術語“對象”亦包括家畜動物。家畜動物的非限制性實例包括:羊駝、野牛、駱駝、牛、鹿、豬、馬、美洲馬它(llama)、驟、驢、綿羊、山羊、兔、馴鹿、牦牛、雞、鵝及火雞。如本文所用的術語“哺乳動物”是指任何哺乳動物，諸如人類、小鼠、兔、非人類靈長類動物。在一優(yōu)選實施方案中，哺乳動物為人類。可互換使用的術語“疫苗”或“疫苗組合物”是指包含至少一種在對象中誘導免疫應答的免疫原性組合物的醫(yī)藥組合物。—般性描述 本發(fā)明起因于以下新穎發(fā)現:P2086的非脂質化變體的特定制劑及給藥方案會引發(fā)比如例如于 Fletcher 等人，Infection&Immunity.第 72 卷(4): 2088-2100 (2004)中所述的P2086的先前制劑高的殺細菌抗體效價?；蛘?，本發(fā)明起因于以下新穎發(fā)現:P2086的非脂質化變體的特定制劑及給藥方案會引發(fā)比脂質化LP2086變體的市售制劑高的殺細菌抗體效價。然而，應注意，脂質化LP2086的市售制劑目前可能不可用。觀測到含有非脂質化rP2086變體的疫苗相比于脂質化rLP2086疫苗具有較高反應率(如通過SBA效價相比于基線值增加4倍或4倍以上所確定)。非脂質化P2086變體的制劑引發(fā)針對較廣泛菌株譜，包括具有類似(>92%相同性)與不同(〈92%相同性)LP2086序列兩者的菌株的殺細菌抗體。本發(fā)明亦鑒別先前未鑒別的表達非脂質化P2086變體的困難且提供克服這些困難的方法及由此獲得的新穎組合物。盡管編碼非脂質化P2086變體的質粒構建體提供非脂質化變體的強勁表達，但這些變體在N端Cys上經丙酮?；?。丙酮?；瘯恋K或降低多肽的制造相同性的可能性。本發(fā)明者另外發(fā)現非脂質化P2086變體序列缺失N端Cys會避免非脂質化P2086變體的丙酮?；?。試圖通過缺失N端Cys的密碼子來克服丙酮?；瘯磉_或導致不溶性變體表達?；蛘?，自非脂質化P2086變體移除N端Cys會使一些變體的表達減少。然而，意外地，本發(fā)明者發(fā)現盡管缺失N端Cys殘基，但至少非丙酮?；侵|化A05、B01、B09及B44變體可得以表達。一般而言，這些多肽可在相比于相應野生型序列，除Cys缺失以外無其它修飾的情況下得以表達。參見例如實施例2及4。此外，本發(fā)明者發(fā)現非丙酮?；侵|化變體意外地具有免疫原性且其出乎意料地引發(fā)殺細菌抗體。因此，本發(fā)明提供兩種克服或降低表達非脂質化變體的這些困難的可能性的方法。然而，本發(fā)明涵蓋其它方法。第一種方法為改變N端尾部中緊靠N端Cys的下游的Gly/Ser莖部的長度。第二種方法為在N端尾部內進行密碼子優(yōu)化。然而，本發(fā)明涵蓋其它密碼子的優(yōu)化。這些方法使得可溶性非脂質化P2086變體的表達增強。舉例而言，在一實施方案中，可溶性非脂質化P2086變體的表達增強是與相應野生型非脂質化變體的表達進行比較。分離的多肽本發(fā)明者意外地發(fā)現分離的非丙酮?；侵|化0RF2086多肽。本發(fā)明者另外發(fā)現該等多肽出乎意料地具有免疫原性且能夠引發(fā)殺細菌免疫應答。如本文所用，術語非丙酮酰化是指多肽不含丙酮酸。相比于相應野生型多肽，含有丙酮酸的非脂質化0RF2086多肽通常展現+70的質量變化。在一實施方案中，當通過質譜測量時，相比于相應野生型非脂質化多肽，本發(fā)明多肽不展現+70的質量變化。參見例如實施例10。在另一實施方案中，相比于相應野生型非脂質化0RF2086多肽，分離的非丙酮?；侵|化0RF2086多肽包括N端半胱氨酸殘基缺失。術語“N端半胱氨酸”是指在多肽的N端或N端尾部的半胱氨酸(Cys)。更詳細地，如本文所用的“N端半胱氨酸”是指LP2086脂蛋白經脂質化成具有三軟脂?；|尾部所處的N端半胱氨酸，如本領域中所知。舉例而言，當提及SEQ ID NO: 12-21的任一者作為參考序列時，N端半胱氨酸位于位置I處。術語“野生型非脂質化0RF2086多肽”是指氨基酸序列與在自然界中所見的相應成熟脂質化0RF2086多肽的氨基酸序列相同的0RF2086多肽。非脂質化分子與脂質化分子之間的唯一差異在于野生型非脂質化0RF2086多肽未在N端半胱氨酸處經脂質化成具有三軟脂?；|尾部。如本領域中亦已知，非脂質化2086形式是由缺乏原始前導序列的蛋白質或由經不指定宿主細胞中脂肪酸酰化位點的序列的一部分置換的前導序列產生。參見例如W02003/063766，其以全文引用的方式并入本文中。非脂質化0RF2086的實例不僅包括剛才描述的野生型非脂質化0RF2086多肽而且包括具有對應于SEQ ID NO: 12-21的任一者的氨基酸序列而其中N端Cys缺失的多肽，以及具有對應于SEQ ID NO: 12-21的任一者的氨基酸序列而其中N端Cys被取代的多肽。非脂質化 0RF2086 多肽的其它實例包括 SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO: 55,SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:62 和 SEQ ID NO:64。野生型非脂質化0RF2086多肽的實例包括具有對應于圖2中所示的SEQ IDNO: 12-21, SEQ ID NO:58, SEQ ID N0:59 及 SEQ ID NO:60 的任一者的氨基酸序列的多肽。這些示例性野生型非脂質化0RF2086多肽包括N端Cys缺失。如本文所用，例如，“非脂質化”B44多肽包括具有選自SEQ ID N0:21、其中位置I的N端Cys缺失的SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:44的氨基酸序列的多肽。“野生型非脂質化”B44多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID N0:21的多肽。“非丙酮?；侵|化”B44多肽包括具有選自其中位置I的N端Cys缺失的SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的多肽。作為另一個實例，如本文所用，“非脂質化”B09多肽包括具有選自SEQ ID NO: 18、其中位置I的N端Cys缺失的SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的多肽?！耙吧头侵|化”B09多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO: 18的多肽?！胺潜；侵|化”B44多肽包括具 有選自其中位置I的N端Cys缺失的SEQ ID NO: 18,SEQID N0:49和SEQ ID NO:50的氨基酸序列的多肽。
作為另一個實例，如本文所用，“非脂質化”A05多肽包括具有選自SEQ ID NO: 13、其中位置I的N端Cys缺失的SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO:55的氨基酸序列的多肽?！耙吧头侵|化”A05多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的多肽。“非丙酮?；侵|化”A05多肽包括具有選自其中位置I的N端Cys缺失的SEQ ID N0:13和SEQ ID NO:55的氨基酸序列的多肽。如本文所用的術語N端Cys的“缺失”包括相比于野生型非脂質化多肽序列，使N端Cys缺失的突變。例如，N端Cys的“缺失”指的是從參考序列，例如從相應的野生型序列移除氨基酸Cys，由此造成與參考序列相比的氨基酸殘基的減少。在另一實施方案中，N端Cys被不為Cys殘基的氨基酸取代。例如，在示例性實施方案中，在SEQ ID NO: 12-21的位置I處的N端Cys在位置I包括C至G的取代。見，例如，SEQ ID NO: 62 與 SEQ ID NO: 19 (B22 野生型)相比；SEQ ID NO: 64 與 SEQ ID N0:15(A22 野生型)相比。置換所述N端Cys的示例性氨基酸包括任意非Cys氨基酸，優(yōu)選極性不帶電荷氨基酸例如甘氨酸。在優(yōu)選實施方案中，用Cys的非保守殘基進行所述取代。本發(fā)明者驚奇地發(fā)現相比于相應野生型非脂質化0RF2086多肽，表達缺失N端Cys殘基的非脂質化0RF2086多肽導致當由質譜分析測量時無可檢測的丙酮?；?。非丙酮?；侵|化0RF2086多肽的實例包括具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的多肽:SEQ ID N0:12(A04)、SEQ ID NO: 13 (A05)、SEQ ID NO: 14 (A12)、SEQ ID NO: 15 (A22)、SEQID N0:16(B02)、SEQ ID NO: 17 (B03)、SEQ ID NO: 18 (B09)、SEQ ID NO: 19 (B22)、SEQ IDN0:20(B24)及SEQ ID NO:21 (B44)，其中在位置I的半胱氨酸缺失。分離的非丙酮?；侵|化0RF2086多肽的其它實例包括具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的多肽:SEQ IDNO:44,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50 及 SEQ ID NO:55。優(yōu)選地，非丙酮?；侵|化 2086多肽包括至少約250、255或260個連續(xù)氨基酸，且至多約270、269、268、267、266、265、264、263、260、259、258、257、256或255個連續(xù)氨基酸。任何最小值可與任何最大值組合以界定一范圍。優(yōu)選地，多肽具有至少254或262個連續(xù)氨基酸。在一個實施方案中，分離的非丙酮酰化非脂質化0RF2086多肽是由可操作地連接于表達系統的核苷酸序列編碼，其中該表達系統能夠在細菌細胞中表達。在一例不性實施方案中，核苷酸序列與控制該核苷酸序列表達的調控序列連接。適合的表達系統、調控序列及細菌細胞在本領域中已知。舉例而言，可使用任何質粒表達載體，例如 PET (Novogen, Madison ffis.)或 PMAL (New EnglandBiolabs，Beverly，Mass.)，只要多肽能夠在細菌細胞中表達。優(yōu)選地，PET 載體用于在大腸桿菌中克隆及表達重組蛋白。在PET 系統中，經克隆基因可在噬菌體T7啟動子控制下表達。例示性細菌細胞包括突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens),優(yōu)選為大腸桿菌。在一方面中，本發(fā)明涉及一種可通過某一方法獲得的非丙酮?；侵|化0RF2086多肽。多肽優(yōu)選是分離的。本發(fā)明另外涉及包括可通過某一方法獲得的非丙酮?；侵|化0RF2086多肽的組合物。組合物優(yōu)選為免疫原性組合物。該方法包括表達編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列:SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19、SEQ ID N0:20及SEQ ID NO:21，其中在位置I處的半胱氨酸缺失。核苷酸序列可操作地連接于能夠在細菌細胞中表達的表達系統。在一實施方案中，該方法包括表達編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列:SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ IDNO: 50及SEQ ID NO: 55。在另一實施方案中，核苷酸序列是選自由以下組成的組:SEQ IDNO:43,SEQ ID NO:5USEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:45,SEQ IDNO:54。優(yōu)選地，細菌細胞為大腸桿菌。在一方面中，本發(fā)明涉及一種組合物，其包括包含SEQ ID N0:49所述的氨基酸序列的第一分離的多肽及包含SEQ ID N0:44所述的氨基酸序列的第二分離的多肽。在一優(yōu)選實施方案中，多肽為免疫原性多肽。在另一優(yōu)選實施方案中，組合物另外包括來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的0RF2086亞家族A多肽。優(yōu)選地，0RF2086亞家族A多肽為非丙酮?；侵|化0RF2086亞家族A多肽。在一例示性實施方案中，0RF2086亞家族A多肽為A05，其實例包括例如SEQ ID NO: 13，其中在位置I處的N端半胱氨酸缺失；及SEQ ID N0:55。
在另一方面中，本發(fā)明涉及一種產生分離的多肽的方法。該方法包括在細菌細胞中表達包括與SEQ ID NO: 21的相同性大于90%的序列的多肽，該序列包括至少一個選自由以下組成的組的結構域:SEQ ID N0:21的氨基酸13-18、SEQ ID N0:21的氨基酸21-34及SEQ ID NO: 21的氨基酸70-80或其組合，其中該多肽缺乏N端半胱氨酸。該方法另外包括純化多肽。其中產生的多肽包括非丙酮?；侵|化0RF2086多肽。優(yōu)選地，多肽為免疫原性多肽。在一優(yōu)選實施方案中，細菌細胞為大腸桿菌。包括至少一個選自由SEQ ID NO:21的氨基酸13-18、SEQ ID N0:21的氨基酸21-34及SEQ ID N0:21的氨基酸70-80或其組合組成的組的結構域的多肽的實例包括SEQ ID N0:12(A04)、SEQ ID NO: 13 (A05)、SEQ ID NO: 14 (A12)、SEQ ID NO: 15 (A22)、SEQID N0:16(B02)、SEQ ID NO: 17 (B03)、SEQ ID NO: 18 (B09)、SEQ ID NO: 19 (B22)、SEQ IDN0:20(B24)及SEQ ID N0:21(B44)。優(yōu)選地，其中在位置I處的半胱氨酸缺失。其它例示性多肽包括 SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:62 和SEQ ID NO:64。在一例示性實施方案中，分離的多肽序列另外包括至少一個選自由以下組成的組的結構域:SEQ ID N0:21 的氨基酸96-116、SEQ ID NO:21 的氨基酸 158_170、SEQ ID NO:21的氨基酸 172-185、SEQ ID N0:21 的氨基酸 187_199、SEQ ID N0:21 的氨基酸 213_224、SEQID NO:21的氨基酸226-237、SEQ ID NO:21的氨基酸239-248或其組合。包括至少一個選自由 SEQ ID NO:21 的氨基酸 13-18、SEQ ID NO:21 的氨基酸 21-34 及 SEQ ID NO:21 的氨基酸70-80或其組合組成的組的結構域、及另外包括至少一個選自由SEQ ID NO:21的氨基酸 96-116、SEQ ID NO:21 的氨基酸 158-170、SEQ ID NO:21 的氨基酸 172-185、SEQID NO:21 的氨基酸 187-199、SEQ ID NO:21 的氨基酸 213-224、SEQ ID N0:21 的氨基酸226-237、SEQ ID N0:21的氨基酸239-248或其組合組成的組的結構域的多肽的實例包括SEQ ID N0:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ IDN0:20(B24)及SEQ ID NO:21 (B44)，優(yōu)選地，其中在位置I處的半胱氨酸缺失。其它例示性多肽包括 SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50 及 SEQ ID NO:55 和 SEQ ID NO:62。在一方面中，本發(fā)明涉及一種通過本文所述的方法產生的分離的多肽。在一實施方案中，分離的多肽為非丙酮?；侵|化多肽。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種通過本文所述的方法產生的免疫原性組合物。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID NO: 18 (其中在位置I處的N端Cys缺失)或SEQ ID N0:49所示的氨基酸序列的分離的多肽。編碼SEQ ID N0:49的例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:46,SEQ ID N0:47及SEQ ID N0:48。優(yōu)選地，核苷酸序列為SEQ IDNO:46ο在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID Ν0:46的分離的核苷酸序列。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID Ν0:47的分離的核苷酸序列。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID NO:48的分離的核苷酸序列。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括選自由SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47、SEQ IDΝ0:48及SEQ ID Ν0:45組成的組的核苷酸序列的質粒，其中該質粒能夠在細菌細胞中表達。適合表達系統、調控序列及細菌細胞在本領域中為已知的，如上所述。優(yōu)選地，細菌細胞為大腸桿菌。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列的分離的多肽。在一例示性實施方案中，SEQ ID NO:50由SEQ ID Ν0:45編碼。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID NO:21 (其中N端Cys缺失)或SEQID Ν0:44所述的氨基酸序列的分離的多肽。編碼SEQ ID NO:44的例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:51。優(yōu)選地，核苷酸序列為SEQ ID NO:43。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID Ν0:43的分離的核苷酸序列。免疫原性組合物在一優(yōu)選實施方案中， 本文所述的包括分離的非丙酮酰化非脂質化0RF2086多肽的組合物為免疫原性組合物。包括由來自腦膜炎奈瑟球菌0RF2086的核苷酸序列編碼的蛋白質的免疫原性組合物在本領域中為已知的。例示性免疫原性組合物包括W02003/063766及美國專利申請公開案第US20060257413號及第US20090202593號中所述的組合物，該等專利以全文引用的方式并入本文中。其中描述的這些免疫原性組合物包括鑒別為0RF2086蛋白的展現殺細菌活性的蛋白質、其免疫原性部分及/或其生物等價物。0RF2086蛋白是指由奈瑟菌屬物種的開放閱讀框2086編碼的蛋白質。蛋白質可為來自天然奈瑟菌屬物種的重組蛋白或分離的蛋白。舉例而言，奈瑟菌屬0RF2086蛋白以及該等蛋白的免疫原性部分及/或生物等價物可自細菌菌株，諸如奈瑟菌屬物種的菌株，包括腦膜炎奈瑟球菌(血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z及29E)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)及乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)的菌株分離。0RF2086蛋白包括2086亞家族A蛋白及亞家族B蛋白、其免疫原性部分及/或其生物等價物。2086亞家族A蛋白及2086亞家族B蛋白在本領域中為已知的，參見例如以上引用的Fletcher等人，2004。亦參見W02003/063766，其揭示其中SEQ ID NO: 260至278表示與2086亞家族A的蛋白質相關的氨基酸序列。此外，W02003/063766中揭示其中SEQID N0:279至299表示與2086亞家族B的蛋白質相關的氨基酸序列。W02003/063766以全文引用的方式并入本文中。0RF2086蛋白或其等價物等可經脂質化或不經脂質化。優(yōu)選地，奈瑟菌屬0RF2086蛋白為非脂質化蛋白?；蛘?，免疫原性組合物可為脂質化0RF2086蛋白與非脂質化0RF2086蛋白的組合。在一實施方案中，免疫原性組合物包括與由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的蛋白質具有至少95%氨基酸序列相同性的分離的蛋白。在一實施方案中，免疫原性組合物包括與由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的亞家族A蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分離的蛋白。優(yōu)選地，免疫原性組合物包括由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的分離的亞家族A蛋白。在一些實施方案中，0RF2086亞家族A多肽為A05、A04、A12或A22變體。在一些實施方案中，0RF2086亞家族A多肽為A05、A12或A22變體。在另一實施方案中，免疫原性組合物包括與由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的亞家族B蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分離的蛋白。優(yōu)選地，免疫原性組合物包括由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的分離的亞家族B蛋白。在一些實施方案中，0RF2086亞家族B蛋白為B44、B02、B03、B22、B24或B09變體。在一些實施方案中，0RF2086亞家族B蛋白為B44、B22或B09變體。在一優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物包括與由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的亞家族B蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分離的非丙酮酰化非脂質化多肽。舉例而言，在一些實施方案中，0RF2086亞家族B蛋白選自具有如SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的B44 ;具有如SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的B02 ;具有如SEQ ID NO: 17中所示氨基酸序列的B03 ;具有如SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的B22 ;具有如SEQ IDNO: 20中所示氨基酸序列的B24 ;或具有如SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的B09變體，其中N端Cys缺失；或其組合。更佳地，免疫原性組合物包括非丙酮?；侵|化B09多肽、非丙酮?；侵|化B44多肽或其組合。在一實施方案中，組合物包括具有如SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的非丙酮?；侵|化B09變體，其中N端Cys缺失；具有如SEQ ID NO: 21中所示氨基酸序列的非丙酮酰化非脂質化B44，其中N端Cys缺失；或其組合。在另一實施方案中，免疫原性組合物包括具有SEQ ID NO:49的非丙酮酰化非脂質化B09、具有SEQ ID N0:44的非丙酮?；侵|化B44或其組合。在一方面中，本發(fā)明涉及一種包括來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的0RF2086亞家族B多肽的免疫原性組合物， 其中該多肽為非丙酮?；侵|化B44。B44可包括如SEQ IDNO: 21 (其中N端Cys缺失)或SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列。在一實施方案中，組合物另外包括來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的第二 0RF2086亞家族B多肽，其中該第二多肽為非丙酮?；侵|化B09。B09可包括如SEQ ID NO: 18 (其中N端Cys缺失)或SEQ IDNO:49中所示的氨基酸序列。在一實施方案中，免疫原性組合物為疫苗。在另一實施方案中，組合物包括至多3種0RF2086亞家族B多肽。在另一實施方案中，組合物包括至多2種0RF2086亞家族B多肽。在一實施方案中，組合物還包括一或多種0RF2086亞家族A多肽。在優(yōu)選實施方案中，組合物包括亞家族A多肽A05。在另一實施方案中，免疫原性組合物包括與由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的亞家族A蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分離的蛋白、及與由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的亞家族B蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分離的蛋白。優(yōu)選地，免疫原性組合物包括由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的分離的亞家族A蛋白及由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的分離的亞家族B蛋白。更佳地，免疫原性組合物包括分離的非丙酮酰化非脂質化亞家族A 0RF2086多肽及分離的非丙酮?；侵|化亞家族B0RF2086多肽。在一些實施方案中，0RF2086亞家族A多肽為A05、A04、A12或A22變體。在一優(yōu)選實施方案中，0RF2086亞家族A多肽為具有如SEQ IDNO: 13中所示氨基酸序列的A05 ;具有如SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的A04 ;具有如SEQID NO: 14中所示氨基酸序列的A12 ;或具有如SEQ ID NO: 15中所示氨基酸序列的A22變體，其中N端Cys缺失；或其任何組合。在一些實施方案中，0RF2086亞家族B蛋白為B44、B02、B03、B22、B24或B09變體。在一優(yōu)選實施方案中，0RF2086亞家族B蛋白為具有如SEQID NO: 21中所示氨基酸序列的B44 ;具有如SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的B02 ;具有如SEQ ID NO: 17中所示氨基酸序列的B03 ;具有如SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的B22 ；具有如SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的B24 ;或具有如SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的B09變體，其中N端Cys缺失；或其組合。在一實施方案中，免疫原性組合物包括1:1比率的亞家族A蛋白與亞家族B蛋白。在另一方面中，本文所述的分離的多肽及組合物在哺乳動物中弓I發(fā)針對來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的0RF2086多肽的·殺細菌免疫應答。組合物在向哺乳動物施用之后能夠誘導殺細菌抗腦膜炎奈瑟球菌抗體，且在優(yōu)選實施方案中，可誘導針對各別亞家族的菌株的殺細菌抗體。以下給出關于殺細菌反應的其它信息。參見例如實施例6、11、12及13。殺細菌抗體為人類中保護作用的指示物，且臨床前研究充當代用物，且任何新穎免疫原性組合物候選物應弓I發(fā)這些功能性抗體。在一例示性實施方案中，具有SEQ ID NO: 18 (其中在位置I處的N端Cys缺失)或SEQ ID N0:49的分離的非丙酮酰化非脂質化B09多肽及其免疫原性組合物會引發(fā)針對(例如可結合)來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的亞家族A或優(yōu)選亞家族B 0RF2086多肽的殺細菌抗體。優(yōu)選地，非丙酮?；侵|化B09多肽及其免疫原性組合物會引發(fā)針對A05變體(SEQ ID NO: 13) ;B44 變體(SEQ ID NO: 21) ;B16 變體(SEQ ID NO: 60) ;B24 變體(SEQID NO:20) ;B09變體(SEQ ID NO: 18)或其組合的殺細菌抗體。在一例示性實施方案中，非丙酮?；侵|化B09多肽及其免疫原性組合物會引發(fā)針對B44變體(SEQ ID N0:21) ；B16變體(SEQ ID NO:60) ;B24 變體(SEQ ID NO: 20) ;B09 變體(SEQ ID NO: 18)或其組合的殺細菌抗體。參見例如實施例11、實施例12及實施例13。在另一例示性實施方案中，具有SEQ ID NO: 21 (其中在位置I處的N端Cys缺失)或SEQ ID N0:44的分離的非丙酮酰化非脂質化B44多肽及其免疫原性組合物會引發(fā)針對(例如可結合)來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的亞家族B 0RF2086多肽的殺細菌抗體。優(yōu)選地，非丙酮?；侵|化B44多肽及其免疫原性組合物會引發(fā)針對B44變體(SEQ IDNO: 21) ;B16 變體(SEQ ID NO: 60) ;B24 變體(SEQ ID NO: 20) ;B09 變體(SEQ ID NO: 18)或其組合的殺細菌抗體。參見例如實施例11。另外，非丙酮?；侵|化B44多肽及其免疫原性組合物亦可引發(fā)與B02變體(SEQ ID NO: 16)結合的殺細菌抗體。參見例如實施例12及實施例13。此外，非丙酮?；侵|化B44多肽及其免疫原性組合物亦可引發(fā)與B03變體(SEQ ID NO: 17)及B15變體(SEQ ID NO:59)結合的殺細菌抗體。參見例如實施例6。在另一例示性實施方案中，具有SEQ ID NO: 19 (其中在位置I處的N端Cys缺失)的分離的非丙酮?；侵|化B22多肽及其免疫原性組合物會引發(fā)針對(例如可結合)來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的亞家族B 0RF2086多肽的殺細菌抗體。優(yōu)選地，非丙酮?；侵|化B22多肽會引發(fā)針對B44變體(SEQ ID N0:21) ;B16變體(SEQ ID NO:60) ;B24變體(SEQ ID NO:20) ;B09變體(SEQ ID NO: 18)或其組合的殺細菌抗體。參見例如實施例13。在一實施方案中，具有SEQ ID NO: 13 (其中N端Cys缺失)或SEQ ID N0:55的分離的非丙酮酰化非脂質化A05多肽及其免疫原性組合物會引發(fā)針對(例如可結合)來自血清群B腦膜炎奈瑟球菌的亞家族A 0RF2086多肽的殺細菌抗體。優(yōu)選地，非丙酮?；侵|化A05及其免疫原性組合物會引發(fā)針對A05變體(SEQ ID NO: 13)、A22變體(SEQ IDN0:15)、A12變體(SEQ ID NO: 14)或其組合的殺細菌抗體。參見例如實施例6及13。在一方面中，本發(fā)明涉及一種在哺乳動物中弓丨發(fā)對血清群B腦膜炎奈瑟球菌具有特異性的殺細菌抗體的方法。在一例示性實施方案中，該方法包括引發(fā)對0RF2086亞家族B血清群B腦膜炎奈瑟球菌、0RF2086亞家族A血清群B腦膜炎奈瑟球菌或其組合具有特異性的殺細菌抗體。該方法包括向哺乳動物施用有效量的如上所述的分離的非丙酮酰化非脂質化2086多肽或其免疫原性組合物。在一優(yōu)選實施方案中，該方法包括引發(fā)對0RF2086亞家族B血清群B腦膜炎奈瑟球菌具有特異性的殺細菌抗體。分離的多肽或免疫原性組合物包括非丙酮酰化非脂質化B44多肽。在另一優(yōu)選實施方 案中，組合物另外包括非丙酮?；侵|化B09多肽，在一例示性實施方案中，分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO:49, SEQ ID N0:44或其組合。在一優(yōu)選實施方案中，分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID N0:18(其中在位置I處的N端Cys缺失)、SEQ ID NO: 21 (其中在位置I處的N端Cys缺失)或其組合。在另一優(yōu)選實施方案中，分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID N0:19，其中在位置I處的N端Cys缺失。在一優(yōu)選實施方案中，該方法包括弓I發(fā)對0RF2086亞家族A血清群B腦膜炎奈瑟球菌具有特異性的殺細菌抗體。分離的多肽或免疫原性組合物包括非丙酮?；侵|化A05多肽。在一優(yōu)選實施方案中，分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID N0:13，其中在位置I處的N端Cys缺失。在另一優(yōu)選實施方案中，組合物另外包括非丙酮?；侵|化B44多肽。在一例示性實施方案中，分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID N0:55、SEQ ID N0:44或其組合。在一優(yōu)選實施方案中，分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ IDNO: 13 (其中在位置I處的N端Cys缺失)、SEQ ID NO: 21 (其中在位置I處的N端Cys缺失)或其組合。免疫原性組合物可包括由來自奈瑟菌屬0RF2086的核苷酸序列編碼的蛋白質、其多核苷酸或等價物作為免疫原性組合物中的唯一活性免疫原?；蛘撸庖咴越M合物可另外包括活性免疫原，包括其它奈瑟菌屬免疫原性多肽、或一或多種其它微生物病原體(例如但不限于病毒、朊病毒、桿菌或真菌)的免疫活性蛋白、或莢膜多糖。組合物視所選適應癥所需可包含一或多種所要蛋白質、片段或醫(yī)藥化合物。本發(fā)明涵蓋任何多抗原或多價免疫原性組合物。舉例而言,免疫原性組合物可包括兩種或兩種以上0RF2086蛋白的組合、0RF2086蛋白與一或多種Por A蛋白的組合、0RF2086蛋白與腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、Y及W135多糖及/或多糖結合物的組合、0RF2086蛋白與腦膜炎奈瑟球菌及肺炎雙球菌(pneumococcus)組合的組合、或任何前述物的組合，呈適于所要施用(例如經粘膜傳遞)的形式。本領域技術人員將能夠容易地配制這些多抗原或多價免疫組合物。本發(fā)明亦涵蓋多免疫方案，其中適用于針對病原體的任何組合物皆可組合于其中或與本發(fā)明組合物組合。舉例而言，但不加以限制，可向患者施用本發(fā)明的免疫原性組合物及用于使對人類乳頭狀瘤病毒(papillomavirus virus) (HPV)免疫的另一免疫組合物(諸如HPV疫苗GARDASIL )作為多免疫方案的一部分。本領域技術人員將能夠容易地選擇與本發(fā)明的免疫原性組合物聯合使用的免疫原性組合物以達成開發(fā)及實施多免疫方案的目的。0RF2086多肽、片段及等價物可用作綴合物免疫原性組合物的一部分；其中一或多種蛋白質或多肽與載體綴合以產生具有針對若干血清型或更準確地血清群及/或針對若干疾病的免疫原性的組合物?；蛘?，一種0RF2086多肽可用作其它免疫原性多肽的載體蛋白。這些免疫原性組合物的配制為本領域技術人員所熟知。本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選包括醫(yī)藥學上可接受的載體。適合醫(yī)藥學上可接受的載體及/或稀釋劑包括任何及所有習知溶劑、分散介質、填充劑、固體載體、水溶液、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。適合醫(yī)藥學上可接受的載體包括例如以下一或多者:水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等以及其組
口 ο醫(yī)藥學上可接受的載體可另外包括少量會增強抗體的存放期或效用的輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。醫(yī)藥學上可接受的載體的制備及使用在本領域中為熟知的。除非任何習知介質或試劑與活性成分不兼容，否則涵蓋其在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用。

免疫原性組合物可非經腸(例如通過皮下或肌肉內注射)以及經口或經鼻內施用。肌肉內免疫的方法由 Wolff 等人 Biotechniques: 11 (4):474_85，(1991)及由 Sedegah等人PNAS第91卷，第9866-9870頁，(1994)描述。舉例而言，但不加以限制，其它施用模式采用經口制劑、經肺制劑、栓劑及經皮用藥。舉例而言，經口制劑包括通常采用的賦形劑，例如但不限于醫(yī)藥級甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。優(yōu)選地，免疫原性組合物經肌肉內施用。本發(fā)明的免疫原性組合物可另外包含一或多種其它“免疫調節(jié)劑”，其為干擾或改變免疫系統以便觀測到體液性及/或細胞介導的免疫性的上調或下調的藥劑。在一特定實施方案中，免疫系統的體液性及/或細胞介導的分支(arm)的上調優(yōu)選。某些免疫調節(jié)劑的實例包括例如佐劑或細胞激素或ISCOMATRIX(CSL Limited, Parkvilie, Australia),尤其描述于美國專利第5，254，339號中?？捎糜诒景l(fā)明疫苗中的佐劑的非限制性實例包括RIBI佐劑系統(RibiInc.，Hamilton, Mont.)、明帆、礦物質凝膠(諸如氫氧化招凝膠)、水包油乳液、油包水乳液(例如弗氏完全及不完全佐劑)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.)>SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.) >
AMPHIGEN 佐劑、皂苷、Quil A或其它皂苷部分、單磷?；|A及阿夫立定脂質-胺佐劑。適用于本發(fā)明疫苗中的水包油乳液的非限制性實例包括改進SEAM62及SEAM1/2制劑。改進SEAM62為一種水包油乳液，其含有5%(v/v)角鯊烯(squalene) (Sigma)、l%(v/v) SPAN 85 去污劑(ICI Surfactants)、0.7%(v/v) Polysorbate 80 去污劑(ICI Surfactants) >2.5%(v/v)乙醇、200yg/ml Quil A、100 μ g/ml 膽固醇及 0.5%(v/V)卵磷脂(lecithin)。改進SEAM1/2為一種水包油乳液，其包含5%(v/v)角鯊烯、1%(ν/V) SPAN 85 去污劑、0.7% (v/v)聚山梨醇酯 80 去污劑、2.5% (v/v)乙醇、100 μ g/ml QuilA及50 μ g/ml膽固醇?？砂ㄔ谝呙缰械钠渌懊庖哒{節(jié)劑”包括例如一或多種白介素、干擾素或其它已知細胞激素或趨化因子。在一實施方案中，佐劑可為環(huán)糊精衍生物或聚陰離子聚合物，諸如分別于美國專利第6，165，995號及第6，610，310號中描述的環(huán)糊精衍生物或聚陰離子聚合物。應了解，欲使用的免疫調節(jié)劑及/或佐劑將視疫苗或免疫原性組合物將施用的對象、注射途徑及欲給與的注射次數而定。在一些實施方案中，佐劑為皂苷。在一些實施方案中，皂苷濃度介于I μ g/ml與250 μ g/ml之間；介于5 μ g/ml與150 μ g/ml之間；或介于10 μ g/ml與100 μ g/ml之間。在一些實施方案中，阜苷濃度為約I μ g/ml ;約5 μ g/ml ;約10 μ g/ml ;約20 μ g/ml ;約30 μ g/ml ;約 40 μ g/ml ;約 50 μ g/ml ;約 60 μ g/ml ;約 70 μ g/ml ;約 80 μ g/ml ;約 90 μ g/ml ；約100 μ g/ml ;約 110 μ g/ml ；約 120 μ g/ml ；約 130 μ g/ml ；約 140 μ g/ml ；約 150 μ g/ml ；約160 μ g/ml ；約 170 μ g/ml ；約 180 μ g/ml ；約 190 μ g/ml ；約 200 μ g/ml ;約 210 μ g/ml ；約220 μ g/ml ;約 230 μ g/ml ；約 240 μ g/ml ；或約 250 μ g/ml。在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明蛋白質用于供經口施用的包括經粘膜佐劑的免疫原性組合物中且用于治療或預防人類宿主的腦膜炎奈瑟球菌感染。經粘膜佐劑可為霍亂毒素(cholera toxin);然而，優(yōu)選地，可根據本發(fā)明使用的不同于霍亂菌毒素的經粘膜佐劑包括霍亂全毒素(cholera holotoxin)的無毒衍生物,其中A亞基為經誘變且經化學修飾的霍亂毒素；或通過修飾霍亂毒素氨基酸序列所產生的相關蛋白質。對于可特別適用于制備本發(fā)明的免疫原性組合物的特定霍亂毒素，參見如公開的國際申請W000/18434中揭示的突變霍亂全毒素E29H，該申請據此以全文引用的方式并入本文中。這些佐劑可添加至本發(fā)明多肽中或與本發(fā)明多肽結合。相同技術可應用于具有經粘膜佐劑或傳遞性質的其它分子，諸如大腸桿菌不耐熱毒素(LT)?？墒褂镁哂薪浾?膜佐劑或傳遞活性的其它化合物，諸如膽汁；聚陽離子，諸如DEAE-葡聚糖及聚鳥氨酸；去污劑，諸如十二烷基苯硫酸鈉；脂質綴合物質；抗生素，諸如鏈霉素(streptomycin);維生素A ;及會改變粘膜表面的結構或功能完整性的其它化合物。其它具經粘膜活性的化合物包括微生物結構的衍生物(諸如MDP);吖啶及西咪替丁(cimetidine)。亦可使用如上所述的 SHMUL0N QS-21、MPL 及 IL-12。本發(fā)明的免疫原性組合物可以ISCOMS (免疫刺激復合物)形式傳遞，ISCOMS含有CTB、脂質體或囊封于諸如丙烯酸酯或聚(DL-丙交酯-共-糖苷)的化合物中以形成具有適于吸收的尺寸的微球。本發(fā)明蛋白質亦可并入油性乳液中。向患者施用的免疫原性組合物的量(亦即劑量)可根據一般技術者已知的標準技術確定，考慮諸如以下因素:特定抗原；佐劑(若存在)；特定患者的年齡、性別、重量、物種、狀況；及施用途徑。舉例而言,用于青少年人類患者的劑量可包括至少0.1 μ g、l μ g>10y g或50 μ g奈瑟菌屬0RF2086蛋白，且至多80 μ g、100 μ g、150 μ g或200 μ g奈瑟菌屬0RF2086蛋白。任何最小值與任何最大值可組合以界定某一適合范圍。佐劑
在某些實施方案中，如本文所述的免疫原性組合物亦包含一或多種佐劑。佐劑為一種當與免疫原或抗原一起施用時會增強免疫應答的物質。許多細胞激素或淋巴激素已顯示具有免疫調節(jié)活性，且因此適用作佐劑，包括(但不限于)白介素1-α、1_β、2、4、5、6、7、8、10、12(參見例如美國專利第5，723，127號)、13、14、15、16、17及18(及其突變形式)；干擾素_α、β及Υ ;顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(參見例如美國專利第5，078，996號及ATCC寄存編號39900);巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF);顆粒球集落刺激因子(G-CSF);及腫瘤壞死因子α及β。適合與本文所述的免疫原性組合物一起使用的其它佐劑包括趨化因子，包括但不限于MCP-l、MIP-la ,MIP-1 β及RANTES ;粘著分子，諸如選擇素(selectin)，例如L-選擇素、P-選擇素及E-選擇素；粘蛋白(mucin)樣分子，例如CD34、GlyCAM-1及MadCAM-1 ;整合素(integrin)家族成員，諸如LFA-l、VLA-l、Mac_l及pl50.95 ;免疫球蛋白超家族成員，諸如 PECAM、ICAM (例如 ICAM-1、ICAM-2 及 ICAM-3)、CD2 及 LFA-3 ;共刺激分子，諸如 B7-1、B7-2、⑶40及⑶40L ;生長因子，包括血管生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、PDGF、BL_1及血管內皮生長因子；受體分子，包括Fas、TNF受:體、Flt、Apo_l、p55、WSL-U DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2 及DR6 ;及卡斯蛋白酶(Caspase) (ICE)。其它例示性佐劑包括(但不限于)氫氧化鋁；磷酸鋁；SHMUL0NtmQS-21 (AquilaBiopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.) ；MPL (3-0-去酸化單憐酸基脂質A ；Corixa, Hamilton, Mont.) >529 (一種氨基燒基葡糖胺磷酸酯化合物，Corixa,Hamilton, Mont)> IL-12 (Genetics Institute,Cambridge, Mass.)；GM-CSFdmmunex Corp.，Seattle, Wash.) ；N-乙?；?胞壁酰基_L_蘇氨?；?D-異氨酰胺(thr-MDP) ；N-乙?；?去甲基-胞壁酰基-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺(CGP11637，稱為去甲基MDP) ；N-乙?；邗；?L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2- (Γ -2’ - 二軟脂?；?sn-甘油-3-羥基磷?；趸?乙胺)(CGP19835A，稱為MTP-PE);及霍亂毒素。在某些優(yōu)選實施方案中，佐劑為QS-21。其它例示性佐劑包括霍亂毒素(包括其A亞基)的無毒衍生物、及/或腦膜炎奈瑟球菌多肽與霍亂毒素或其B亞基(“CTB”)的結合物或遺傳工程改造融合物、霍亂前原類毒素(procholeragenoid)、真菌多糖(包括裂裥菌素(schizophyllan))、胞壁酰二肽、胞壁酰二肽(“MDP”)衍生物、佛波醇(phorbol)酯、大腸桿菌的不耐熱毒素、嵌段聚合物或皂苷。磷酸鋁已用作I期臨床試驗中的佐劑，濃度為每劑0.125mg，遠低于美國聯邦法規(guī)(US Code of Federal Regulations) [610.15 (a)]所指定的每劑 0.85mg 的限度。含招佐劑廣泛用于人類以在肌肉內或皮下施用時增強抗原的免疫應答。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度介于0.125 μ g/ml與0.5 μ g/ml之間；介于0.20 μ g/ml與0.40 μ g/ml之間；或介于0.20 μ g/ml與0.30 μ g/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度為約 0.125 μ g/ml ;約 0.15 μ g/ml ;約 0.175 μ g/ml ;約 0.20 μ g/ml ;約 0.225 μ g/ml ；約 0.25 μ g/ml ；約 0. 275 μ g/ml ；約 0.30 μ g/ml ；約 0.325 μ g/ml ；約 0.35 μ g/ml ；約 0.375 μ g/ml ；約 0.40 μ g/ml ；約 0.425 μ g/ml ；約 0.45 μ g/ml ；約 0.475 μ g/ml ；或約0.50 μ g/ml。
在優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度介于0.125mg/ml與0.5mg/ml之間；介于0.20mg/ml與0.40mg/ml之間；或介于0.20mg/ml與0.30mg/ml之間。在一些實施方案中，免疫原性組合物中的鋁濃度為約0.125mg/ml ;約0.15mg/ml ;約0.175mg/ml ;約0.20mg/ml ;約 0.225mg/ml ;約 0.25mg/ml ;約 0.275mg/ml ;約 0.30mg/ml ;約 0.325mg/ml ；約 0.35mg/ml ;約 0.375mg/ml ;約 0.40mg/ml ;約 0.425mg/ml ;約 0.45mg/ml ;約 0.475mg/ml ;或約 0.50mg/ml。適用于增強免疫應答的佐劑另外包括但不限于MPL (3-0-去?；瘑瘟柞；|A，Corixa, Hamilton, MT)，其描述于美國專利第4，912，094號中?？勺訡orixa (Hamilton, MT)獲得且描述于美國專利第6，113,918號中的合成脂質A類似物或氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)或其衍生物或類似物亦適用作佐劑。一種此類AGP為2-[(R) -3-十四?；趸孽；被鵠乙基2-脫氧-4-0-膦?；?3-0-[ (R) -3-十四?；趸孽；鵠-2-[(R)-3-十四?；趸孽；?氨基]-b-D-葡萄吡喃糖苷，其亦稱為529 (先前稱為RC529)。此529佐劑配制成水性形式(AF)或穩(wěn)定乳液(SE)。其它佐劑包括胞壁酰肽，諸如N-乙?；?胞壁?；?L-蘇胺酰基-D-異麩酰氨酸(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲基胞壁?；?L-丙氨酸-2- (Γ -2’ 二軟脂酰基_sn-甘油-3-羥基磷?；?氧基)-乙胺(MTP-PE);水包油乳液，諸如MF59 (美國專利第6，299，884號)(含有5%角鯊烯、0.5%聚山梨醇酯80及0.5%Span85 (視情況含有不同量的MTP-PE)，使用微流化器(諸如IlOY型微流化器(Microfluidics, Newton, MA))配制成亞微顆粒)、及SAF(含有10%角鯊烯、0.4%聚山梨醇酯80、5%普洛尼克(pluronic)嵌段聚合物L121及thr-MDP，微流化成次微乳液或渦旋以產生粒徑較大的乳液)；不完全弗氏佐劑(IFA);鋁鹽(明礬)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁；愛菲金(Amphigen);阿夫立定；L121/角鯊烯；D_丙交酯-聚丙交酯/糖苷；普洛尼克多元醇；經殺死的博德特氏菌(Bordetella);皂苷，諸如描述于美國專利第 5，057, 540 號中的 Stimulon QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.)、描述于美國專利第 5, 254, 339 號中的 ISCOMATRIX(CSL Limited, Parkville, Australia)、及免疫刺激復合物(ISCOMATRIX);結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis);細菌脂多糖；合成多核苷酸，諸如含有CpG基元 的寡核苷酸(例如美國專利第6，207，646號)；IC_31 (IntercellAG，Vienna, Austria)，描述于歐洲專利第1，296，713號及第1，326，634號中；百日咳毒素(pertussis toxin) (PT)或其突變體、霍亂毒素或其突變體(例如美國專利第7，285，281號、第7, 332, 174號、第7, 361, 355號及第7, 384, 640號);或大腸桿菌不耐熱毒素(LT)或其突變體，具體而言LT-K63、LT-R72(例如美國專利第6，149，919號、第7，115，730號及第7，291，588 號)。產生非脂質化P2086抗原的方法在一方面中，本發(fā)明涉及一種產生非丙酮?；侵|化0RF2086多肽的方法。該方法包括表達編碼0RF2086多肽的核苷酸序列，其中與相應野生型序列比較，N端半胱氨酸缺失，且其中該核苷酸序列可操作地連接于能夠在細菌細胞中表達的表達系統。舉例而言，優(yōu)選地，多肽具有 SEQ ID NO: 12 ；SEQ ID NO: 13 ；SEQ ID NO: 14 ；SEQ ID NO: 15 ；SEQ IDNO: 16 ；SEQ ID NO: 17 ；SEQ ID NO: 18 ；SEQ ID NO: 19 ；SEQ ID NO:20 ；SEQ ID NO:21 所述的氨基酸序列，其中與相應野生型序列比較，在位置I處的半胱氨酸缺失。其它示例性多肽包括具有選自 SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID N0:62和SEQ ID N0:64的氨基酸序列的多肽。該方法還包括純化所述多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種產生可溶性非脂質化P2086抗原的方法，其包含以下步驟:將0RF2086變體核酸序列克隆至無脂質化控制序列的大腸桿菌表達載體中，用0RF2086表達載體轉化大腸桿菌細菌，誘導表達及分離表達的P2086蛋白。在一些實施方案中，用IPTG誘導表達。在一些實施方案中，0RF2086變體的N端Cys的密碼子缺失。這些密碼子的實例包括TGC。在一些實施方案中，0RF2086變體的N端Cys的密碼子通過點誘變加以突變以產生Ala、Gly或Val密碼子。在一些實施方案中，添加Ser及Gly密碼子至0RF2086變體的N端尾部以延伸緊靠N端Cys的下游的Gly/Ser莖部。在一些實施方案中，Gly/Ser莖部內的Gly及Ser殘基的總數為至少7、8、9、10、11或12。在一些實施方案中，N端Cys的密碼子缺失。在一些實施方案中，N端7、8、9、10、11或12個殘基為Gly或Ser。在一些實施方案中，非脂質化0RF2086變體的N端尾部的密碼子通過點誘變加以優(yōu)化。在一些實施方案中，非脂質化0RF2086變體的N端尾部經優(yōu)化以匹配B09變體的N端尾部。在一些實施方案中，0RF2086變體的N端尾部的密碼子通過點誘變加以優(yōu)化以使編碼0RF2086變體的第5個氨基酸的密碼子與SEQ ID NO:8的核苷酸13-15100%相同且編碼0RF2086變體的第13個氨基酸的密碼子與SEQ ID NO: 8的核苷酸37-39100%相同。在一些實施方案中，非脂質化0RF2086變體的N端尾部經優(yōu)化以使5’ 45個核酸與SEQ ID NO: 8的核酸1-45100%相同。在一些實施方案中，非脂質化0RF2086變體的N端尾部經優(yōu)化以使5’42個核酸與SEQ ID N0:8的核酸4-45100%相同。在一些實施方案中，非脂質化0RF2086變體的N端尾部經優(yōu)化以使5’39個核酸與SEQ ID N0:8的核酸4-42100%相同。在一些實施方案中，相比于SEQ ID NO: 18的氨 基酸1-15，非脂質化P2086變體的N端尾部包含至少一個氨基酸取代。在一些實施方案中，相比于SEQ ID NO: 18的氨基酸1-15，非脂質化P2086變體的N端尾部包含兩個氨基酸取代。在一些實施方案中，相比于SEQ ID N0:18的氨基酸2-15，非脂質化P2086變體的N端尾部包含至少一個氨基酸取代。在一些實施方案中，相比于SEQ ID NO: 18的氨基酸2-15，非脂質化P2086變體的N端尾部包含兩個氨基酸取代。在一些實施方案中，氨基酸取代為保守性氨基酸取代。在一些實施方案中，非脂質化變體的密碼子已出于表達增加的目的而優(yōu)化。密碼子優(yōu)化在本領域中為已知的。參見例如Sastalla等人，Applied and EnvironmentalMicrobiology,第 75 卷(7):2099-2110 (2009)及 Coleman 等人,Science,第 320卷:1784(2008)。在一些實施方案中，密碼子優(yōu)化包括使氨基酸序列的密碼子利用與所選宿主生物體的密碼子頻率匹配，同時包括及/或排除特定DNA序列。在一些實施方案中，密碼子優(yōu)化另外包括使相應二級mRNA結構最小以降低轉譯障礙。在一些實施方案中，N端尾部已經密碼子優(yōu)化以包含SEQ ID N0:28、30、32及34的任一者。在一些實施方案中，Gly/Ser莖部已經密碼子優(yōu)化以包含SEQ ID NO:28、30、32及34的任一者。為了更佳理解本發(fā)明，闡述以下實例。實例僅出于說明的目的且不應解釋為限制本發(fā)明范疇。免疫原性組合物制劑在某些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物另外包含佐劑、緩沖劑、低溫保護齊U、鹽、二價陽離子、非離子去污劑、自由基氧化抑制劑、稀釋劑或載體的至少一種。
除多種腦膜炎奈瑟球菌蛋白抗原及莢膜多糖-蛋白質綴合物之外，本發(fā)明的免疫原性組合物亦可另外包含一或多種防腐劑。FDA要求多次劑量小瓶中的生物產品含有防腐劑，僅有少數情況例外。含有防腐劑的疫苗產品包括含有芐索氯銨(炭疽(anthrax))、2-苯氧乙酉享(DTaP、HepA、Lyme、脊髓灰質炎(Polio)(非經腸))、苯酌.(肺炎(Pneumo)、傷寒(Typhoid)(非經腸)、牛痘)及硫柳汞(DTaP、DT、Td、H印B、Hib、流行性感冒、JE、腦膜炎(Mening)、肺炎、狂犬病(Rabies))的疫苗。核準用于可注射藥物的防腐劑包括例如氯丁醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、芐索氯銨、氯化苯甲烴銨、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。本發(fā)明制劑可另外包含以下一或多種:緩沖劑、鹽、二價陽離子、非離子去污劑、低溫保護劑(諸如糖)及抗氧化劑(諸如自由基清除劑或螯合劑)或其任何多重組合。任一組分(例如螯合劑)的選擇可決定另一組分(例如清除劑)是否合乎需要。經配制以供施用的最終組合物應無菌及/或無熱原質。本領域技術人員可憑經驗確定這些及其它組分的哪些組合將最佳包括在含防腐劑的本發(fā)明免疫原性組合物中，此視多種因素而定，諸如所需的特定儲存及施用條件。在某些實施方案中，可與非經腸施用相容的本發(fā)明制劑包含一或多種生理學上可接受的緩沖劑，其選自(但不限于)Tris (氨基丁三醇)、磷酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸及丁二酸鹽。在某些實施方案中，制劑經緩沖至約6.0至約9.0、優(yōu)選約6.4至約7.4的pH值范圍內。在某些實施方案中， 可能需要調整本發(fā)明的免疫原性組合物或制劑的pH值。可使用本領域中的標準技術調整本發(fā)明制劑的PH值。制劑的pH值可調整至介于3.0與8.0之間。在某些實施方案中，制劑的pH值可介于或可調整至介于3.0與6.0,4.0與6.0、或5.0與8.0之間。在其它實施方案中，制劑的pH值可為或可調整為約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約5.8、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5或約8.0。在某些實施方案中，pH值可為或可調整為以下范圍:4.5至7.5、或4.5至6.5,5.0至5.4,5.4至5.5,5.5至5.6,5.6至 5.7,5.7 至 5.8,5.8 至 5.9,5.9 至 6.0,6.0 至 6.1,6.1 至 6.2,6.2 至 6.3,6.3 至 6.5、6.5至7.0,7.0至7.5、或7.5至8.0。在一特定實施方案中，制劑的pH值為約5.8。在某些實施方案中，可與非經腸施用相容的本發(fā)明制劑包含濃度在約0.1mM至約IOmM的范圍內，其中優(yōu)選至多約5mM的一或多種二價陽離子，包括(但不限于)MgCl2XaCl2及 MnCl2。在某些實施方案中，可與非經腸施用相容的本發(fā)明制劑包含一或多種鹽，包括(但不限于)氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉及硫酸鉀，其以在非經腸施用后對對象而言為生理學上可接受的離子強度存在且以產生所選離子強度或同滲濃度的最終濃度包括在最終制劑中。制劑的最終離子強度或重量摩爾滲透濃度將由多種組分，例如來自緩沖化合物及其它非緩沖鹽的離子決定。一種優(yōu)選鹽NaCl是以至多約250mM的范圍存在，其中鹽濃度經選擇以補充其它組分(例如糖)以使得制劑的最終總同滲濃度可與非經腸施用(例如肌肉內或皮下注射)兼容且將促進免疫原性組合物制劑的免疫原性組分在不同溫度范圍的長期穩(wěn)定性。無鹽制劑將容許增加范圍的一或多種所選低溫保護劑以維持所要最終同滲濃度程度。在某些實施方案中，可與非經腸施用相容的本發(fā)明制劑包含一或多種低溫保護齊U，其選自(但不限于)二糖(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖)及多羥基烴(例如半乳糖醇、甘油、甘露糖醇及山梨糖醇)。在某些實施方案中，制劑的同滲濃度在約200m0s/L至約800m0s/L的范圍內，其中優(yōu)選范圍為約250m0s/L至約500m0s/L、或約300m0s/L至約400m0s/L。無鹽制劑可含有例如約5%至約25%蔗糖、且優(yōu)選約7%至約15%、或約10%至約12%蔗糖?；蛘?，無鹽制劑可含有例如約3%至約12%山梨糖醇、且優(yōu)選約4%至7%、或約5%至約6%山梨糖醇。若添加諸如氯化鈉的鹽，則鹿糖或山梨糖醇的有效范圍相對減小。這些及其它此類同滲質量摩爾濃度及同滲濃度考慮事項完全在本領域的技能內。在某些實施方案中，可與非經腸施用相容的本發(fā)明制劑包含一或多種自由基氧化抑制劑及/或螯合劑。多種自由基清除劑及螯合劑在本領域中為已知的且適用于本文所述的制劑及使用方法。實例包括(但不限于)乙醇、EDTA、EDTA/乙醇組合、三乙醇胺、甘露糖醇、組氨酸、甘油、檸檬酸鈉、六磷酸肌醇酯、三聚磷酸鹽、抗壞血酸/抗壞血酸鹽、丁二酸/丁二酸鹽、蘋果酸/順丁烯二酸鹽、甲碘酸去鐵銨(desferal)、EDDHA及DTPA、及以上兩者或兩者以上的各種組合。在某些實施方案中，至少一種非還原性自由基清除劑可以有效增強制劑的長期穩(wěn)定性的濃度添加。一或多種自由基氧化抑制劑/螯合劑亦可以各種組合，諸如清除劑與二價陽離子組合添加。螯合劑的選擇將決定是否需要添加清除劑。在某些實施方案中，可與非經腸施用相容的本發(fā)明制劑包含一或多種非離子表面活性劑，包括(但不限于)聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯_80(吐溫80 (TWeen80))、聚山梨醇酯-60 (吐溫60)、聚山梨醇酯_40 (吐溫40)及聚山梨醇酯_20 (吐溫20)、聚氧乙烯烷基醚(包括(但不限于)81^_58、81^_35)、以及其它非離子表面活性劑，諸如曲通X-100 (Triton X-100)、曲通X-114、NP40、司盤85 (Span85)及普洛尼克系列的非離子表面活性劑(例如普洛尼克121)，其中優(yōu)選組分為約0.001%至約2%(其中優(yōu)選至多約0.25%)的濃度的聚山梨醇酯-80或約0.001%至1% (其中優(yōu)選至多約0.5%)的濃度的聚山梨醇酯-40。 在某些實施方案中，本發(fā)明制劑包含適于非經腸施用的一或多種其它穩(wěn)定劑，例如包含至少一個硫醇基(-SH)的還原劑(例如半胱氨酸、N-乙?；腚装彼?、還原型谷胱甘肽、硫代乙醇酸鈉、硫代硫酸鹽、單硫代甘油或其混合物)?；蛘呋蛞暻闆r，本發(fā)明的含防腐劑的免疫原性組合物制劑可進一步通過自儲存容器移除氧氣、使制劑避光(例如通過使用琥珀色玻璃容器)來加以穩(wěn)定。本發(fā)明的含防腐劑的免疫原性組合物制劑可包含一或多種醫(yī)藥學上可接受的載體或賦形劑，其包括自身不會誘導免疫應答的任何賦形劑。適合賦形劑包括(但不限于)大分子(諸如蛋白質、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物)、蔗糖(Paoletti等人，2001，Vaccine, 19:2118)、海藻糖、乳糖及脂質聚集體(諸如油滴或脂質粒)。這些載體為本領域技術人員所熟知。醫(yī)藥學上可接受的賦形劑例如于Gennaro, 2000，RemingtoniTheScience and Practice of Pharmacy,第 20 版，ISBN:0683306472 中論述。本發(fā)明組合物可凍干或呈水性形式，亦即溶液或懸浮液。液體制劑宜直接自其包裝形式施用且因此對于注射而言為理想的而無需如另外為本發(fā)明的凍干組合物所需的于水性介質中重建。可通過非經腸施用(肌肉內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內、或向組織間隙施用)；或通過經直腸、經口、經陰道、經表面、經皮、經鼻內、經眼、經耳、經肺或其它經粘膜施用來向對象直接傳遞本發(fā)明的免疫原性組合物。在一優(yōu)選實施方案中，非經腸施用是通過肌肉內注射，例如對對象的大腿或上臂進行肌肉內注射來達成。注射可經由針(例如皮下注射針)達成，但或者可使用無針注射。典型肌肉內劑量為0.5mL。本發(fā)明組合物可制備成各種形式，例如對于注射而言制備成液體溶液或懸浮液。在某些實施方案中，組合物可制備成供經肺施用(例如于吸入器中)的散劑或噴霧劑。在其它實施方案中，組合物可制備成栓劑或子宮托，或對于經鼻、經耳或經眼施用而言，例如制備成噴霧劑、滴劑、凝膠或散劑。特定免疫原性組合物的組分的最佳量可通過涉及觀測對象的適當免疫應答的標準研究來確定。在初始接種之后，對象可接受適當間隔的一或數次加強免疫。包裝及劑型本發(fā)明的免疫原性組合物可以單位劑量或多劑量形式(例如2個劑量、4個劑量、或4個以上劑量)包裝。對于多劑量形式，小瓶通常但并非必定優(yōu)于預填充注射器。適合多劑量形式包括(但不限于):每個容器2至10個劑量，每劑量0.1至2mL。在某些實施方案中，劑量為0.5mL劑量。參見例如國際專利申請案W02007/127668，其以引用的方式并入本文中。組合物可提供于小瓶或其它適合儲存容器中，或可提供于預填充傳遞裝置中，例如單一或多組分注射器，其可能連同·或不連同針一起提供。注射器通常但無需必定含有單一劑量的本發(fā)明的含防腐劑的免疫原性組合物，但亦設想多次劑量預填充注射器。同樣，小瓶可包括單一劑量但或者可包括多次劑量。有效劑量體積可按常規(guī)確立，但注射用組合物的典型劑量具有0.5mL的體積。在某些實施方案中，劑量經配制以用于向人類對象施用。在某些實施方案中，劑量經配制以用于向成人、少年、青少年、嬰兒或幼兒(亦即不超過I歲)人類對象施用且在優(yōu)選實施方案中可通過注射施用。本發(fā)明的液體免疫原性組合物亦適于重建以凍干形式提供的其它免疫原性組合物。當免疫原性組合物欲用于此臨用時重建時，本發(fā)明提供一種具有兩個或兩個以上小瓶、兩個或兩個以上備用填充注射器、或一或多個小瓶及備用填充注射器的試劑盒，其中注射器的內含物用于在注射的前重建小瓶的內含物，或反的亦然?；蛘?，本發(fā)明的免疫原性組合物可凍干及重建，例如使用本領域中熟知的用于冷凍干燥的眾多方法的一以形成干燥、形狀規(guī)則(例如球狀)的粒子，諸如微?；蛭⑶?，其具有可通過改變用于制備該等粒子的精確方法加以選擇并控制的粒子特征，諸如平均直徑尺寸。免疫原性組合物可另外包含可視情況與各別干燥、形狀規(guī)則(例如球狀)的粒子(諸如微?；蛭⑶?一起制備或含于該等粒子中的佐劑。在這些實施方案中，本發(fā)明另外提供一種免疫原性組合物試劑盒，其包含包括穩(wěn)定干燥免疫原性組合物，視情況另外包含一或多種本發(fā)明防腐劑的第一組分；及包含用于重建該第一組分的無菌水溶液的第二組分。在某些實施方案中，水溶液包含一或多種防腐劑，且可視情況包含至少一種佐劑(參見例如W02009/109550(以引用的方式并入本文中))。在另一實施方案中，多劑量形式的容器是選自由(但不限于)以下組成的組的一或多者:一般實驗室玻璃器皿、燒瓶、燒杯、量筒、發(fā)酵器、生物反應器、配管(tubing)、導管(pipe)、袋、瓶、小瓶、小瓶扣合物(例如橡膠塞、螺旋帽蓋)、安瓿、注射器、雙腔室或多腔室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡膠扣合物、塑料扣合物、玻璃扣合物、藥筒及拋棄式筆及其類似物。本發(fā)明的容器不受制造材料限制且包括各種材料，諸如玻璃、金屬(例如鋼、不銹鋼、鋁等)及聚合物(例如熱塑性塑料、彈性體、熱塑性彈性體)。在一特定實施方案中，該形式的容器為具有丁基塞的5mL Schottl型玻璃小瓶。本領域技術人員將了解，上述形式決不為窮舉性，而僅充當對技術人員關于可用于本發(fā)明的諸多形式的導則。預期可用于本發(fā)明中的其它形式可見于實驗室設備供貨商及制造商，諸如United States Plastic Corp.(Lima, OH)，VffR的公開目錄中。
實施例實施例1:實驗程序血清殺細菌測定食蟹稱猴(Cynomolgusmacaques) (n=5 只 / 組)用吸附于 AlPO4 的 rLP2086 或rP2086 (A+B)蛋白肌肉內免疫。在第0、4及24周對動物接種，且在第0、4、6及26周測定0RF2086特異性IgG及功能性抗體效價。針對rLP2086A及rLP2086B測定血清0RF2086特異性IgG效價。通過血清殺細菌測定(SBA)檢查功能性抗體針對表達序列與疫苗中所含序列同源或異源的LP2086的腦膜炎奈瑟球菌菌株的效價。使用利用人類補體進行的SBA測定經0RF2086疫苗免疫的獼猴或兔中的血清殺細菌抗體。兔免疫血清或獼猴免疫血清經熱滅活以移除固有補體活性，隨后在96孔微量滴定板中于含Ca2+及Mg2+的杜爾貝科氏(Dulbecco’s)PBS(D-PBS)中1:2連續(xù)稀釋以測試針對腦膜炎奈瑟球菌菌株的血清殺細菌活性。測定中使用的細菌在補充有凱洛格氏(Kellogg’s)補充劑的GC培養(yǎng)基(GCK)中生長且通過650nm下的光學密度監(jiān)測。在0.50-0.55的最終OD65tl下收集細菌以用于測定中，于D-PBS中稀釋，且添加1000-3000個CFU至含20%人類補體的測 定混合物中。無可檢測殺細菌活性的人類血清用作外源性補體源。測試補體源針對各個別測試菌株的適合性。只有當未添加免疫血清的對照中存活的細菌數目>75%時才使用補體源。需要10個獨特補體源來進行此研究中描述的SBA。在37°C及5%C02下孵育30分鐘之后，添加D-PBS至反應混合物中且等分試樣轉移至填充有50%GCK培養(yǎng)基的微過濾板中。微過濾板經過濾，在37°C及5%C02下孵育過夜，且染色并定量微群落。血清殺細菌效價定義為相比于無免疫血清的對照孔中的CFU，使CFU降低50%的血清稀釋度的內插倒數。SBA效價定義為在37°C下孵育30分鐘之后使細菌計數減少50%的測試血清的內插稀釋度的倒數。若相比于相應免疫前血清，0RF2086免疫血清的SBA效價上升4倍或4倍以上，則確立對0RF2086免疫血清的殺傷作用敏感。對在起始稀釋度下針對測定菌株為陰性的血清賦予為測定檢測限(亦即4)的一半的效價。實施例2:克隆及表達非脂質化0RF2086變體對應于來自腦膜炎奈瑟球菌菌株M98250771 (A05)的殘基27_286的成熟P2086氨基酸序列最初由自基因組DNA進行PCR擴增而產生。正向引物，序列為TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG (SEQ ID NO: 22)，粘接至5’序列且含有NdeI克隆位點。反向引物，序列為 CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC(SEQ ID NO:23)，粘接至基因的 3’ 端且含有終止密碼子TAG，繼的以限制位點BamHI。799bp擴增片段首先克隆至中間載體PCR2.1 (Invitrogen, Carlesbac, CA)中。此質粒用NdeI及BamHI裂解，且連接至已用NdeI及BamHI裂解的表達載體pET9a(Novagen, Madison, WI)中。所得載體pLAlOO (其包括SEQ ID N0:54)表達來自菌株M98250771的無將存在于脂質化蛋白質中的N端半胱氨酸的成熟亞家族A05P2086(參見SEQ ID NO: 13 (其中在位置I處的N端Cys缺失)或 SEQ ID N0:55)。使用 BLR(DE3)大腸桿菌宿主菌株[F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcmΔ (srl-recA)306:: TnlO (TetR) (DE3) ] (Novagen)來獲得 fHBP 的表達。使用相同克隆步驟來制備B02、B03、B09、B22、B24、B44、A04、A12 及 A22N 端 Cys 缺失的變體。亦通過此相同方法，使用亦包括Cys密碼子(例如SEQ ID N0:1_11的第一密碼子)的正向引物制備含有N端Cys的變體。基于本文提供的序列，本領域技術人員將能夠設計這些變體的各自的正向引物及反向引物。舉例而言，使用以下引物來擴增B44非脂質化變體，隨后使用NdeI及BlpI克隆至pET9a中。表I
權利要求
1.一種組合物，其包含分離的非丙酮?；侵|化0RF2086多肽。
2.權利要求1的組合物，其中所述組合物為免疫原性組合物。
3.權利要求1的組合物，其中相比于相應野生型非脂質化0RF2086多肽，所述多肽包含N端Cys缺失。
4.權利要求1的組合物，其中所述多肽包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:20 及 SEQ ID NO:21，其中在位置 I 處的半胱氨酸缺失。
5.權利要求4的組合物，其中所述多肽包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:SEQID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO: 50 及 SEQ ID NO: 55。
6.權利要求1的組合物，其中所述多肽由可操作地連接于表達系統的核苷酸序列編碼，其中所述表達系統能夠在細菌細胞中表達。
7.權利要求6的組合物，其中所述表達系統為質粒表達系統。
8.權利要求6的組合物，其中所述細菌細胞為大腸桿菌細胞。
9.權利要求6的組合物，其中所述核苷酸序列與控制所述核苷酸序列表達的調控序列連接。
10.權利要求1的組合物，其 中相比于相應野生型非脂質化0RF2086多肽，所述多肽包含N端Cys取代。
11.一種組合物，其包含可通過如下方法獲得的非丙酮?；侵|化ORF2086多肽，所述方法包括表達核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ IDNO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21，其中在位置 I 處的半胱氨酸缺失，其中所述核苷酸序列可操作地連接于能夠在細菌細胞中表達的表達系統。
12.權利要求O的組合物，其中所述細菌細胞為大腸桿菌(E.coli)。
13.一種組合物，其包含包括SEQ ID N0:49所示的氨基酸序列的分離的多肽，及包括SEQ ID N0:44所示的氨基酸序列的分離的多肽。
14.權利要求1至13中任一項的組合物，其中所述組合物為免疫原性組合物。
15.權利要求13的組合物，其還包含血清群B腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)的 0RF2086 亞家族 A 多肽。
16.權利要求1至13中任一項的組合物，其中所述組合物在哺乳動物中引發(fā)針對血清群B腦膜炎奈瑟球菌的0RF2086亞家族B多肽的殺細菌免疫應答。
17.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
18.一種分離的核苷酸序列，其包含SEQ ID N0:46。
19.一種分離的核苷酸序列，其包含SEQ ID N0:47。
20.一種分離的核苷酸序列，其包含SEQ ID N0:48。
21.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
22.一種分離的核苷酸序列，其包含SEQ ID N0:45。
23.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
24.一種質粒，其包含選自由 SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48 及 SEQ IDN0:45組成的組的核苷酸序列，其中所述質粒能夠在細菌細胞中表達。
25.權利要求24的質粒，其中所述細菌細胞為大腸桿菌。
26.一種在哺乳動物中引發(fā)對血清群B腦膜炎奈瑟球菌的0RF2086亞家族B具有特異性的殺細菌抗體的方法，包括給所述哺乳動物施用有效量的分離的多肽，所述分離的多肽包含選自由SEQ ID N0:44及SEQ ID NO:49或其組合組成的組的氨基酸序列。
27.一種產生多肽的方法，其包含在細菌細胞中表達多肽，所述多肽包含與SEQ IDN0:21具有90%以上相同性的序列，所述序列包含至少一個選自由SEQ ID NO:21的氨基酸13-18,SEQ ID NO:21的氨基酸21-34及SEQ ID NO:21的氨基酸70-80或其組合組成的組的結構域，其中所述序列缺乏N端半胱氨酸；及純化所述多肽。
28.權利要求27的方法，其中所述序列還包含至少一個選自由以下組成的組的結構域:SEQ ID NO: 21 的氨基酸 96-116、SEQ ID NO: 21 的氨基酸 158-170、SEQ ID NO: 21 的氨基酸 172-185、SEQ ID NO:21 的氨基酸 187-199、SEQ ID NO:21 的氨基酸 213-224、SEQ IDNO: 21的氨基酸226-237、SEQ ID NO: 21的氨基酸239-248或其組合。
29.權利要求27的方法，其中所述細菌細胞為大腸桿菌。
30.一種分離的多肽，其由包含如權利要求27的方法的方法產生。
31.一種免疫原性組合物，其由包含如權利要求27的方法的方法產生。
32.一種免疫原性組合物，其包含血清群B腦膜炎奈瑟球菌的0RF2086亞家族B多肽，其中所述多肽為非丙酮?；侵|化B44。
33.權利要求32的組合物，其另外包含血清群B腦膜炎奈瑟球菌的第二0RF2086亞家族B多肽，其中所述第二多肽為非丙酮?；侵|化B09。
34.權利要求32的組合物，其中所述組合物包括至多3種0RF2086亞家族B多肽。
35.權利要求32的組合物，其中所述組合物包括至多兩種0RF2086亞家族B多肽。
36.權利要求32的組合物，其中所述組合物還包括一或多種0RF2086亞家族A多肽。
37.權利要求36的組合物，其中所述組合物包括亞家族A多肽A05。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括分離的非丙酮酰化非脂質化ORF2086多肽的組合物及其方法。在一例示性實施方案中，本文所述的組合物為免疫原性組合物。本發(fā)明另外關于在哺乳動物中引發(fā)針對血清群B腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的ORF2086亞家族B多肽的殺細菌免疫應答的組合物及與其相關的方法。
文檔編號A61K39/095GK103096920SQ201180043326
公開日2013年5月8日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權日2010年9月10日
發(fā)明者A·S·安德森, S·K·霍伊塞思, K·U·揚森, J·K·莫蘭, M·E·魯彭 申請人:惠氏有限責任公司