專利名稱：含有gkn1的抗癌用組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有GKNl (Gastrokinel,胃動蛋白I)的抗癌用組合物，尤其涉及能夠抑制胃癌的產(chǎn)生、抑制癌細胞轉移的活性優(yōu)秀的GKNl基因的新用途。
背景技術：
胃癌(Stomach cancer)作為在全世界范圍內(nèi)在韓國、日本等地多發(fā)的癌癥，雖然在美國、歐洲等西方癌癥的發(fā)病率較低，但是在韓國，癌癥發(fā)病率排在第一位的為胃癌，死亡率緊隨肺癌排在第二位。察看胃癌的分類，整個胃癌的95%為在胃壁黏膜的腺細胞中產(chǎn)生的腺癌，之外還有在淋巴系統(tǒng)產(chǎn)生的淋巴瘤、在間質(zhì)組織中產(chǎn)生的胃腸道間質(zhì)瘤。在引起胃癌的多種發(fā)病原因中，尤其食物成了最重要的發(fā)病原因，在加工的肉類中大量含有的硝酸鹽、亞硝酸鹽被認為是最有力的致癌物質(zhì)，燒焦的食物、又辣又咸的食物被認為會成為導致胃癌的原因。除此之外，最近備受矚目的幽門螺旋桿菌作為胃炎和胃潰瘍的病原菌，被查明與胃癌的產(chǎn)生有相關性。并且，察看癌癥發(fā)病的原因，由于誘發(fā)癌癥的致癌基因的不正常的活性化，導致細胞增殖或與之相反地抑制細胞的不正常增殖，或者啟動細胞凋亡程序來殺死特定細胞，從而在阻斷癌細胞生成的癌癥抑制基因出現(xiàn)異常而產(chǎn)生癌癥，即使是具有被不正?；钚曰陌┗虻募毎?，只要癌癥抑制基因表現(xiàn)出正常的活性，則該細胞就不能形成癌癥而凋亡。因而，為了成為癌細胞則不僅要有致癌基因的活性化，而且在一個細胞中應同時出現(xiàn)癌癥抑制基因的非活性化。對此，最近在全世界范圍內(nèi)正就通過對與癌癥的生成及治療相關的基因的功能進行研究來發(fā)掘治療用靶，并將這些用于診斷及治療劑的開發(fā)而展開著激烈的競爭。隨著與基因組研究的活躍相伴，對人類基因DNA芯片或蛋白質(zhì)組學分析研究活躍，并大量發(fā)掘與癌癥相關的基因，從而構 建了很多基因的目錄和相關數(shù)據(jù)庫，但是對于這些基因的在細胞內(nèi)的具體生物學功能及癌癥相關性大部分還沒有被研究或不確定，因而與實際與癌癥的相關性或診斷及作為靶基因來使用一同，進而在發(fā)掘能夠有效治療癌癥的基因方面存在相當大的困難。因此，實際情況是，除了到目前為止被查明的與癌癥相關的基因之外，還需要發(fā)掘新的基因。另一方面，在目前治療癌癥的方法中3種主要的治療方法為外科治療方法、藥物療法、放射療法，其中藥物療法在治療過程中伴隨的痛苦較少，比起外科治療或放射治療，在治療后癌癥的復發(fā)相對較少，因而受到期待。因此，開發(fā)了很多能夠滿足這種期待的抗癌劑并被使用，其中大部分的抗癌劑主要針對癌癥的異常增殖，通過使分裂活躍的細胞選擇性地凋亡來表現(xiàn)出抗癌效果。這種抗癌劑伴有會一同殺死作為通常在人體內(nèi)分裂活躍的細胞的免疫細胞、毛根細胞等的正常細胞的嚴重的副作用，因而具有不能長時間使用的問題。并且，作為用于治療胃癌的方法，使用淋巴結切除術、內(nèi)鏡下黏膜切除術、腹腔鏡下胃切除術等的方法，內(nèi)鏡下黏膜切除術作為對黏膜內(nèi)的早期胃癌，在存在癌癥病變的胃黏膜周圍注入生理鹽水來使得病變部位鼓起后切除存在病變的黏膜的方法，雖然具有能夠通過簡單的內(nèi)鏡下手術來避免胃切除手術的痛苦的優(yōu)點，但在局限于黏膜的早期胃癌中淋巴結轉移可能性低的情況下使用時會受到限制。因而，實際情況是，需要發(fā)掘用于與癌癥的發(fā)病相關聯(lián)來起到主要功能并能夠利用該功能在癌癥的早期進行預防和治療的新的抗癌劑的開發(fā)的靶基因。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題為此，本發(fā)明者鑒于GKNl基因在正常的胃黏膜細胞上表達而在胃癌組織中其表達下降的問題，對上述基因的功能進行研究的結果，最先查明了 GKNl基因具有能夠抑制胃癌細胞的增殖及活性，并阻礙癌癥轉移的功能，確認了能夠將上述基因用作癌癥治療劑的事實，進而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于，提供包含GKNI蛋白質(zhì)或對GKNl蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸的抗癌用組合物。本發(fā)明的再一目的在于，提供一種抗癌劑篩選方法，該抗癌劑篩選方法包括如下步驟:培養(yǎng)GKNl蛋白質(zhì)或表達上述蛋白質(zhì)的重組細胞和候選物質(zhì)(candidate substance)的步驟；以及測定GKNl蛋白質(zhì)的活性或對細胞內(nèi)表達水平的增加所產(chǎn)生的效果的步驟。解決問題的手段為了實現(xiàn)如上所述的本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供包含GKNl蛋白質(zhì)或對GKNl蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸的抗癌用組合物。在本發(fā)明的一實施例中，上述GKNl蛋白質(zhì)可以包含序列第I位的氨基酸序列。在本發(fā)明的一實施例中，對上述GK`Nl蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸可以是包含序列第2位的堿基序列多核苷酸。在本發(fā)明的一實施例中，上述多核苷酸可以是包含于表達載體內(nèi)的多核苷酸。在本發(fā)明的一實施例中，上述表達載體可以是具有圖12的酶切圖(cleavagemap)的 pcDNA3.1-GKNl0在本發(fā)明的一實施例中，上述癌癥可以是胃癌。并且，本發(fā)明提供一種抗癌劑篩選方法，其特征在于，包括如下步驟:培養(yǎng)GKNl蛋白質(zhì)或表達上述蛋白質(zhì)的重組細胞和候選物質(zhì)的步驟；以及測定GKNl蛋白質(zhì)的活性或對細胞內(nèi)表達水平的增加所產(chǎn)生的效果的步驟。在本發(fā)明的一實施例中，還可包括如下步驟:在上述候選物質(zhì)增加GKNl蛋白質(zhì)的活性或在細胞中增加GKNl基因的表達水平的情況下，將上述候選物質(zhì)判斷為具有抗癌活性的抗癌劑的步驟。在本發(fā)明的一實施例中，上述GKNl蛋白質(zhì)的活性或細胞內(nèi)表達水平可以通過選自由免疫共沉淀法(coimmunoprecipitation)、放射免疫分析法(RIA, Radioimmunoassay) >酶聯(lián)免疫分析法(ELISA, enzyme-linked immuno sorbent assay)、免疫組織化學、蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)以及突光激活細胞分揀術(FACS, fluorescence-activatedcell sorting)組成的組中的某一種方法來執(zhí)行。在本發(fā)明的一實施例中，上述抗癌劑能夠預防或治療胃癌。發(fā)明的效果
由于本發(fā)明的GKNl蛋白質(zhì)具有不僅抑制癌細胞產(chǎn)生的活性優(yōu)秀，而且在過度表達時抑制癌細胞轉移的活性也優(yōu)秀的特征，因而具有能夠有效用作抗癌治療用組合物的效
果O


圖1表示胃癌組織的GKNl蛋白質(zhì)免疫染色結果，圖1的(A)部分表示在陷窩細胞和淺表性胃上皮細胞中的免疫活性，圖1的(B)部分表示在胃腺瘤中的免疫陽性，圖1的(C)表示在管狀腺瘤中的陰性免疫染色結果，圖1的(D)部分表示在胃癌中的免疫陽性，圖1的(E)部分和(F)部分表示在腸型胃癌和擴散型胃癌中的陰性免疫染色結果。圖2表示GKNl蛋白質(zhì)的甲基化狀態(tài)，圖2的⑷部分表示在胃癌組織⑴和正常的胃黏膜(N)中對GKNl基因甲基化的DNA(M)和非甲基化的DNA⑶，圖2的⑶表示在胃癌細胞株中對GKNl蛋白質(zhì)基因甲基化的(M)DNA和非甲基化的(U)DNA。圖3為表示在胃癌中與對照組相比較的(A)GKNl蛋白質(zhì)DNA復制數(shù)量和⑶GKNl蛋白質(zhì)mRNA表達的倍數(shù)變化的圖表。圖4分別表示在腸型⑴、擴散型⑶及混合型(M)胃癌組織⑴和正常胃黏膜(N)中的GKNl蛋白質(zhì)的表達。圖5的(A)部分表示利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)分析法，在轉染GKNl蛋白質(zhì)的胃癌細胞中隨著時間經(jīng)過而發(fā)生的細胞的生存能力，圖5的(B)部分為表示利用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)分析法，在轉染GKNl蛋白質(zhì)的胃癌細胞中隨著時間經(jīng)過而發(fā)生的細胞增殖的圖表。圖6表示通過 膜聯(lián)蛋白V結合分析法來測定的在轉染GKNl蛋白質(zhì)后隨著時間而發(fā)生的細胞凋亡。圖7表示通過膜聯(lián)蛋白V結合分析法來測定的在轉染GKNl蛋白質(zhì)24小時后經(jīng)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3 (caspase-3)抑制劑(Z_DEVD-fmk)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)抑制劑(Z_IETD-fmk)處理的細胞凋亡。圖8的(A)部分表示通過執(zhí)行蛋白印跡分析的與轉染GKNl蛋白質(zhì)24小時后的凋亡相關的蛋白質(zhì)的活性，圖8的(B)部分經(jīng)過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抑制劑(Z-DEVD-fmk)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8抑制劑(Ζ-1ETD-fmk)的處理，由此通過執(zhí)行蛋白印跡分析來表示對于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性抑制的結果。圖9表示通過傷口 -治愈方法的GKNl蛋白質(zhì)對細胞移動的效果,虛線表示缺損缺陷的界限。圖10表示GKNl蛋白質(zhì)在胃癌細胞株AGS中對transwell移動的效果，圖10的(A)部分表示用Diff-Quik染色法對薄膜進行染色的結果，圖10的(B)為在光學顯微鏡(lightmicroscopy)下計算細胞數(shù)量來表示的圖表。圖11為通過執(zhí)行基質(zhì)膠(matrigel)分析法來表示GKNl蛋白質(zhì)對細胞擴散的效果，圖11的(A)部分為拍攝轉染24小時后通過基質(zhì)被浸潤的細胞的結果，圖11的(B)部分為計算細胞數(shù)量來表示的圖表。圖12表示插入本發(fā)明的GKNl基因來制備的重組載體pcDNA3.1-GKNl載體的酶切圖。
具體實施例方式本發(fā)明的特征在于，提供一種將GKNl蛋白質(zhì)作為有效成分來含有的抗癌用組合物，更為具體地，本發(fā)明的特征在于，提供包含GKNl蛋白質(zhì)或對GKNl蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸的抗癌用組合物。本發(fā)明者在為了開發(fā)能夠抑制癌癥產(chǎn)生的新的癌癥治療劑而進行研究的過程中，關注到作為最近從哺乳動物的胃黏膜細胞中分離的新的蛋白質(zhì)的GKNl蛋白質(zhì)。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，GKNl蛋白質(zhì)又被稱為胃竇黏膜蛋白-18 (AMP-18，antrum mucosalprotein-18)或胃癌相關分泌蛋白(CAll)，在胃竇進行表達，具有通過使受損后的恢復和增殖變得容易來促進治愈的活性(Toback.F.G.et al.,Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol, 285:G344-353, 2003)。但到目前為止，對于GKNl蛋白質(zhì)所具有的其他功能幾乎無從得知。為此，本發(fā)明者通過確認與正常細胞不同，在癌細胞中GKNl基因的表達被減少的事實，推測GKNl基因參與癌癥的發(fā)病機理，并最初實質(zhì)性地查明GKNl蛋白質(zhì)具有抗癌活性的事實。首先，通過本發(fā)明的一實施例，確認了 GKNl基因的表達在癌細胞中減少或消失的事實，即，根據(jù)本發(fā)明的一實施例，通過免疫組織化學方法來調(diào)查了在胃癌組織中GKNl蛋白質(zhì)的表達，在固定胃癌組織來制作切片之后，利用GKNl蛋白質(zhì)抗體、生物素標記的羊抗小鼠(biotinylated goat ant1-mouse)抗體來進行了檢測，并與連接有過氧化物酶的親和素-生物素復合體進行培養(yǎng)后，將二氨基聯(lián)苯胺用作色原體，載玻片利用邁耶蘇木精溶液進行對比染色來分析表達的結果，在胃竇(antrum)和胃體(corpus)的正常胃黏膜細胞細胞質(zhì)中表現(xiàn)出免疫陽性，并觀察到在胃腺瘤(adenomas)和癌(carcinomas)組織中GKNl蛋白質(zhì)的表達減少或消失(參照圖1及表I)。并且，根據(jù)本發(fā)明的 再一實施例，對從冰凍胃癌試樣提取的GKNl基因組DNA和mRNA定量化,并在Stratagene Mx 3000P突光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(QPCR, QuantitativePCR Detecting System)中執(zhí)行了 real time SYBR Green QPCR 的結果，GKNl 蛋白質(zhì)的復制數(shù)量與正常胃黏膜組織DNA相比，在胃癌DNA中減少了 50 %以上，GKNl蛋白質(zhì)mRNA表達數(shù)值在正常胃黏膜組織中表達GKNl基因轉錄體，相反，在所有的胃癌組織，表達減少或消失(參照圖3)。基于這種結果，本發(fā)明者在本發(fā)明的GKNl基因可具有抗癌活性的推測下，在癌細胞中對GKNl基因進行過度表達的情況下，調(diào)查了對癌細胞的細胞增殖和細胞凋亡產(chǎn)生的影響，即，根據(jù)本發(fā)明的一實施例，隨著時間的經(jīng)過對轉染到癌細胞株AGS的GKNl蛋白質(zhì)執(zhí)行3-(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(MTT)分析和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)結合分析的結果，在轉染的細胞中，細胞的生存能力和細胞增殖明顯被抑制(參照圖5),對異硫氰酸突光素(FITC, Fluorescein Isothiocyanate)-標記的膜聯(lián)蛋白(annexin)V細胞進行染色的結果，在轉染GKNl蛋白質(zhì)的細胞中，凋亡細胞隨著時間的經(jīng)過而增加(參照圖6)。因此，本發(fā)明的GKNl蛋白質(zhì)具有抑制癌細胞的增殖、誘發(fā)癌細胞凋亡的特征。并且，根據(jù)本發(fā)明的再一實施例，在試管中(in vitro)執(zhí)行傷口-治愈、transwell趨化性試驗(chemotaxis)、浸潤檢測的結果,與轉染GKNl蛋白質(zhì)的表達載體的AGS細胞相比，沒有插入GKNl基因的對照組表達載體和轉染到GKNl蛋白質(zhì)siRNA的細胞在轉染后明顯向傷口部位移動(參照圖9)，轉染GKNl蛋白質(zhì)的AGS細胞的移動減少(參照圖10)，在GKNl蛋白質(zhì)被過度表達的AGS細胞中，浸潤明顯被抑制(參照圖11)。因此，通過上述結果，本發(fā)明者能夠得知GKNl蛋白質(zhì)通過阻止癌細胞的移動來抑制上皮細胞轉換為間質(zhì)細胞，在過度表達時，也能夠在胃癌細胞株中抑制浸潤的事實。因而，本發(fā)明能夠提供包含GKNl蛋白質(zhì)或對GKNl蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸的抗癌用組合物。優(yōu)選地，上述GKNl蛋白質(zhì)可以是具有以序列第I位記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，對上述GKNl蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸可以是具有以序列第2位記載的堿基序列的多核苷酸。并且，優(yōu)選地，本發(fā)明的上述GKNl蛋白質(zhì)可以是對于具有序列第I位的氨基酸序列的多肽的功能性對等物。所謂上述“功能性對等物”是指，附加、取代或缺失氨基酸的結果，具有與以序列第I位來表示的氨 基酸序列至少60%的序列相同性，優(yōu)選地具有70%的序列相同性，更為優(yōu)選地具有80%以上的序列相同性，并實質(zhì)上表現(xiàn)出與本發(fā)明的GKNl蛋白質(zhì)同種類活性的多肽。在這里，“實質(zhì)上同種類的活性”意味著上述中所記載的GKNl蛋白質(zhì)的活性。上述功能性對等物，例如可包括，在本發(fā)明的GKNl蛋白質(zhì)的氨基酸序列的氨基酸中，一部分被置換或缺失，或者添加的氨基酸序列變形體。優(yōu)選地，氨基酸的置換可以是保存性置換，自然中存在的氨基酸的保存性置換的例如下:脂肪族氨基酸(甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro)、疏水氨基酸(異亮氨酸lie、亮氨酸Leu、纈氨酸Val)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸Phe、酪氨酸Tyr、色氨酸Trp)、酸性氨基酸(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)、堿性氨基酸(組氨酸His、賴氨酸Lys、精氨酸Arg、谷氨酰胺Gin、天冬酰胺Asn)以及含硫氨基酸(胱氨酸Cys、蛋氨酸Met)。優(yōu)選地，氨基酸的缺失可位于不直接干預本發(fā)明的GKNl蛋白質(zhì)的活性的部分。并且，上述功能性對等物的范圍里還可包括在維持GKNl蛋白質(zhì)的基本骨架及其生理活性的同時，多肽的一部分化學結構變形的多肽衍生物。例如，可包括在維持用于改變本發(fā)明的多肽的穩(wěn)定性、儲存性、揮發(fā)性或溶解度等的結構變形及生理活性的同時，通過與其他蛋白質(zhì)融合來制成的融合蛋白質(zhì)等。并且，可通過公知的方法向質(zhì)?；虿《据d體等的表達載體內(nèi)導入對上述GKNl蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸后，以本領域公知的多種方法，通過轉導(transduction)或轉染(transfection)以表達型向祀細胞導入上述表達載體。質(zhì)粒表達載體為能夠用于人體的得到食品和藥物管理局(FDA)的認可的基因傳遞方法，并且作為直接向人體細胞傳遞質(zhì)粒DNA的方法(諾貝爾，如等人，科學，249:1285-1288,1990, Nabel, E.G.et al.，Science, 249:1285-1288，1990)，質(zhì)粒 DNA 與病毒載體不同，具有能夠被均勻純化的優(yōu)點。作為能夠在本發(fā)明中使用的質(zhì)粒表達載體可以使用在本領域公知的哺乳動物表達質(zhì)粒，在本發(fā)明的一實施例中，通過使用pcDNA3.1(美國英杰生命技術有限公司=Invitrogen)質(zhì)粒來制備了作為插入有GKNl基因的具有如圖12的酶切圖的重組表達載體的pcDNA3.1-GKNl蛋白質(zhì)。雖然并不限定于此,但能夠通過本領域公知的方法,例如，瞬時轉染(transienttransfection)、微量注射、轉導(transduction)、細胞融合、磷酸|丐沉淀法、脂質(zhì)體介導轉染(liposome-mediated transfection)、DEAE 葡聚糖介導轉染(DEAE Dextran-mediatedtransfection)、聚凝胺介導轉染(polybrene-mediated transfection)、電穿孔法(electropora tion)、基因槍(gene gun)以及用于使DNA向細胞內(nèi)流入的其他公知的方法來向腫瘤細胞內(nèi)導入包含本發(fā)明的核酸的質(zhì)粒表達載體(plasmid expression vector)(ffu.et al.，J.Bi0.Chem.，267:963-967,1992 ；ffu.et al.，Bi0.Chem.，263: 14621-14624，1988)。優(yōu)選地，能夠使用瞬時轉染方法。并且，能夠表達上述GKNl蛋白質(zhì)的載體可通過公知的方法來向細胞、組織或體內(nèi)給藥，例如，局部性地，通過非口服、口服、鼻腔、靜脈、肌肉內(nèi)、皮下內(nèi)或其他適當?shù)姆椒▉斫o藥。尤其，上述載體能夠以用于治療靶組織的腫瘤細胞的有效量來直接向癌或腫瘤細胞內(nèi)注射。尤其，對于存在于眼睛、胃腸管、泌尿生殖器官、肺以及支氣管系統(tǒng)等的體腔(bodycavity)內(nèi)的癌或腫瘤，能夠利用針、導管(catheter)或其他種類的輸送管能夠向受癌或腫瘤的影響的中空器官(hollow organ)直接注射本發(fā)明的藥學組合物。另一方面，由于本發(fā)明的GKNl蛋白質(zhì)具有抑制癌細胞的增殖、促進細胞凋亡的同時抑制癌細胞的轉移及浸潤的活性，因而本發(fā)明能夠提供利用上述基因的抗癌劑篩選方法。即，本發(fā) 明的抗癌劑篩選方法可包括如下步驟:步驟(a)，培養(yǎng)GKNl蛋白質(zhì)或表達上述蛋白質(zhì)的重組細胞和候選物質(zhì)；以及步驟(b)，測定GKNl蛋白質(zhì)的活性或對細胞內(nèi)表達水平的增加所產(chǎn)生的效果。在上述中，GKNl蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)水平增加意味著通過GKNl基因的表達增加或GKNl蛋白質(zhì)的分解被抑制，從而使得GKNl蛋白質(zhì)的濃度增加。上述GKNl基因表達包括GKNl基因的轉錄及向蛋白質(zhì)的翻譯過程。因此，當上述候選物質(zhì)在細胞內(nèi)使GKNl基因的表達及蛋白質(zhì)的水平增加時，可將上述候選物質(zhì)判斷為具有抗癌活性的物質(zhì)。并且，測定GKNl蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)活性及細胞內(nèi)的水平的方法可使用在本領域公知的多種方法，例如，雖然并不限定于此，但可包括免疫共沉淀法(coimmunoprecipitation)、酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbentassay)、放射免疫分析法(RIA)、免疫組織化學、蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)以及熒光激活細胞分揀術(FACS)。并且，以本發(fā)明的GKNl作為靶的篩選方法可以適用高通量篩選方法(highthroughput screening ;HTS)。高通量篩選方法是通過同時對多個候選物質(zhì)進行試驗來對多個候選物質(zhì)的生物學活性同時或幾乎同時進行篩選的方法。作為特定實施方式，在96-孔微滴定板或192-孔微滴定板中培養(yǎng)細胞株，并從中處理多個候選物質(zhì)之后能夠通過免疫化學方法來測定GKNl的表達程度。上述孔典型地需要達到50 μ I至500 μ I的檢測容積，除了微滴定板之外，為了使96孔的形式符合廣泛的均相及非均相檢測，從商業(yè)上可利用多個儀器、器具、移液器、機器人、平皿清潔器以及平皿閱讀器。并且，本發(fā)明的抗癌組合物可用作能夠預防及治療癌癥的藥學組合物，上述藥學組合物還可包含在藥學上接受的擔體。在上述中“藥學上接受”是指在生理學上接受的，并在給藥到人體時，通常不會引起胃腸障礙、眩暈等的過敏反應或與此類似的反應的組合物。作為藥學上接受的載體，例如有乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等的口服給藥用擔體以及水、適當?shù)挠汀⑸睇}水、水溶性葡萄糖及乙二醇等的非口服給藥用擔體等，還可包含穩(wěn)定劑及保存劑。適當?shù)姆€(wěn)定劑有亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸等的抗氧化齊U。適當?shù)谋４鎰┯斜皆蠕@、甲基-或羥苯丙酯以及氯丁醇。除此之外的作為在藥學上接受的載體，可參考以下文獻(Remington, s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., MackPublishing Company,Easton,PA, 1995)。本發(fā)明的藥學組合物能夠與如上所述的在藥學上接受的擔體一同根據(jù)本領域公知的方法來以適當?shù)男螒B(tài)進行劑型化。即，本發(fā)明的藥學組合物能夠根掘公知的方法來制備成多種非口服或口服給藥用形態(tài)，具有代表性的非口服給藥用劑型是注射用劑型，優(yōu)選為等滲性水溶液或懸浮液。注射用劑型可通過使用適當?shù)姆稚┗驖櫇駝┮约皯腋⒏鶕?jù)本領域公知的技術制備而成。例如，將各成分溶解于生理鹽水或緩沖液來劑型化為注射用劑型。并且，口服給藥用劑型雖然不限定于此，但有粉末、顆粒、片劑、丸藥以及膠囊等。用如上所述的方法來劑型化的藥學組合物能夠以有效量通過包括口服、經(jīng)皮膚、皮下、靜脈或肌肉等的多種途徑來給藥。上述中的“有效量”為，向患者給藥時能夠表現(xiàn)出預防或治療效果的量。本發(fā)明的藥學組合物的給藥量可根據(jù)給藥路徑、給藥對象、年齡、性別、體重、個體差異及病態(tài)來適當選擇。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥學組合物可根據(jù)疾病的程度來使有效成分的含量不同，優(yōu)選地，以I 10000 μ g/體重kg/day的有效量、更為優(yōu)選地，以10 IOOOmg/體重kg/day的有效量一天多次反復給藥。并且,本發(fā)明的抗癌用組合物也能夠與具有預防、改善或治療癌癥的效果的公知的化合物一同進行給藥。以下，通過實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明。這些實施例僅僅用于更具體地說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不受限于這些實施例，這對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說是顯而易見的。實施例1插入有GKNl的重組載體的制備及向胃癌細胞的轉化為了向作為胃癌細胞株的AGS轉染GKNl，首先將胃癌細胞株AGS與被熱惰性化的10%的胎牛血清一同在37°C下，在5%的CO2的RPM1-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，由此進行準備。隨后，利用聚合酶鏈式反應(PCR,Polymerase Chain Reaction)對GKNl的cDNA進行擴增，并利用限制酶位點(使用EcoR I和BamH `I)來制備在pcDNA3.1 (英杰公司，卡爾斯巴德，力口利福尼亞州，美國:Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)具有圖12的酶切圖的pcDNA3.1-GKNl重組載體后，在大腸桿菌(Escherchia coli)DH5a水溶性細胞(competent cell)進行了轉化。轉化的細胞在包含有氨芐西林的LB瓊脂(LB agar)固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，從細胞群中制作要培養(yǎng)的種子(culture seed)進行大量培養(yǎng)，并且從培養(yǎng)液中收集細胞來純化DNA，并制備了 pcDNA3.1-GKNl載體。而且，在直徑為60mm的培養(yǎng)皿中利用脂質(zhì)體加轉染試劑(Lipofectamine Plus Transfection Reagent,英杰公司，Invitrogen)來將表達載體(共5 μ g的DNA)轉染到所培養(yǎng)的AGS細胞。實施例2通過免疫組織化學的GKNl的表達模式分析為了進行免疫組織化學性分析，用甲醛水溶液進行固定后，以含有經(jīng)石蠟處理的169個胃癌組織試樣的方式設計了組織微陣列受體塊。從各癌中以直徑為2mm取3個組織核，利用市場上銷售的微陣列儀器(Beecher Instruments公司，微陣列技術,銀泉,馬里蘭州，美國，Beecher Instruments, Micro-Array Technologies, Silver Spring, MD, USA)向新的受體石蠟塊移動，也將一個位于各腫瘤附近的正常胃黏膜的腔體移動至受體塊。所有試樣均在使用前一天切割為2 μ m的切片，并按照標準實驗方案來進行保管。并且為了將免疫組織化學信號最大化，均使用了在檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復的方法和利用生物素標記的酪胺(biotinylated tyramide)來擴增信號的方法,具體地，由熱誘發(fā)的表位(epitope)修復方法為，在裝滿lOmmol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)的玻片染色缸(Coplin)容器中浸泡載玻片，在700W微波的壓力鍋(北歐潔具，明尼阿波利斯，明尼蘇達州，美國，NordicWare, MinneapoI is, MN, USA)中煮沸30分鐘緩沖液后，經(jīng)20分鐘使玻片染色缸變涼。而且，使用了含有鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase)和生物素標記的酪胺(biotinylated tyramide)的 Renaissance TSA 間接試劑盒(Indirect Kit)(新生命科學，波士頓，美國，NEN Life Science, Boston, A, USA)，首先用磷酸鹽緩沖液(PBS,phosphate-buffered saline)沖洗載玻片之后，為了去除內(nèi)源性過氧化物酶(endogenousperoxidase)活性，浸泡于用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的I %的H2O2并在常溫下進行15分鐘處理。之后，用三硝基甲苯(TNT,Trinitrotoluene)緩沖液(0.lmol/L的三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽(Tris-HCl)、pH 為 7.4、0.15mol/L 的氯化鈉(NaCl)、0.05% 的吐溫 20 (Tween20))清洗20分鐘載玻片后,進行了三硝基苯(TNB, Trinitrobenzene)緩沖液(0.lmol/L的三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽、pH為7.4、0.15mol/L的氯化鈉、0.5%的阻斷劑(blocking reagent))處理。之后將切片與GKNl抗體(1/100;西格瑪奧德里奇有限公司，圣路易斯，密蘇里州，美國，Sigma-Aldrich Co，St.Louis, MO, USA) 一同在4°C下整夜進行培養(yǎng)，并利用生物素標記的羊抗小鼠(biotinylated goat ant1-mouse)抗體(Sigma公司，圣路易斯,密蘇里州，美國，Sigma, St.Louis, MO, USA)進行檢測后，與連接有過氧化物酶的親和素-生物素復合體一同進行培養(yǎng)。將二氨基聯(lián)苯用作色原體，用邁耶蘇木精對載玻片進行對比染色。抗原染色結果分析中，將細胞質(zhì)的30%以上染色為陽性時視作陽性，并由兩名病理學家獨立完成了檢查。將用非免疫血清代替一級抗體的作為陰性對照組。表I
權利要求
1.一種抗癌用組合物，其特征在于，包含GKNl蛋白質(zhì)或對GKNl蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗癌用組合物，其特征在于，上述GKNl蛋白質(zhì)包含序列第I位的氨基酸序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗癌用組合物，其特征在于，對上述GKNl蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸包含序列第2位的堿基序列。
4.根據(jù)權利要求1所述的抗癌用組合物，其特征在于，上述多核苷酸包含于表達載體內(nèi)。
5.根據(jù)權利要求4所述的抗癌用組合物，其特征在于，上述表達載體為具有圖12的酶切圖的 pcDNA3.1-GKNl。
6.根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的抗癌用組合物，其特征在于，上述癌為胃癌。
7.一種抗癌劑篩選方法，其特征在于，包括如下步驟: 培養(yǎng)GKNl蛋白質(zhì)或表達上述GKNl蛋白質(zhì)的重組細胞和候選物質(zhì)的步驟；以及 測定GKNl蛋白質(zhì)的活性或對細胞內(nèi)表達水平的增加所產(chǎn)生的效果的步驟。
8.根據(jù)權利要求7所述的抗癌劑篩選方法，其特征在于，還包括如下步驟:在上述候選物質(zhì)增加GKNl蛋白質(zhì)的活性或在細胞中增加GKNl基因的表達水平的情況下，將優(yōu)選物質(zhì)判斷為具有抗癌活性的抗癌劑的步驟。
9.根據(jù)權利要求8所 述的抗癌劑篩選方法，其特征在于，上述GKNl蛋白質(zhì)的活性或細胞內(nèi)表達水平通過選自由免疫共沉淀法、放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、免疫組織化學、蛋白質(zhì)印跡法以及熒光激活細胞分揀法組成的組中的某一種方法來執(zhí)行。
10.根據(jù)權利要求7至9中任一項所述的抗癌劑篩選方法，其特征在于，上述抗癌劑能夠預防或治療胃癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及將GKN1作為有效成分來含有的抗癌用組合物，更為具體地涉及包含抗癌活性優(yōu)秀的GKN1基因的表達載體或將GKN1蛋白質(zhì)作為有效成分來含有的抗癌用組合物。由于本發(fā)明的GKN1具有不僅抑制癌細胞產(chǎn)生的活性優(yōu)秀，而且在過度表達時抑制癌細胞轉移的活性也優(yōu)秀的特征，因而具有能夠有效用作抗癌治療用組合物的效果。
文檔編號A61K38/16GK103209702SQ201180054619
公開日2013年7月17日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權日2010年11月12日
發(fā)明者樸元相, 尹晶桓 申請人:加圖立大學校產(chǎn)學協(xié)力團