專利名稱：突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及在治療內(nèi)分泌疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，尤其涉及突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其制備方法，本發(fā)明還涉及該突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在制備治療內(nèi)分泌疾病藥物中的用途， 屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病是繼心腦血管疾病和腫瘤之后的人類第三大殺手。隨著生活模式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，全世界糖尿病患病率呈急劇上升的趨勢(shì)。預(yù)計(jì)到2030年世界糖尿病患病人數(shù)將增至3. 66億人，糖尿病將成為世界各個(gè)國(guó)家一個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)。對(duì)于2型糖尿病，絕大多數(shù)的患者不可避免的要用藥物來(lái)治療。其中，口服藥物有三大類第一類為黃脲類。如優(yōu)降糖，糖適平，達(dá)美康，美吡達(dá)等。黃脲類藥能夠刺激胰島分泌胰島素，但胰島素分泌多了以后，可以引起低血糖，這對(duì)低血糖患者而言是一個(gè)不可忽視的危險(xiǎn)因素，而且部分藥物具有較大副作用，如可引起肝功能損傷。第二類藥是雙胍類藥。如降糖靈和二甲雙胍；雙胍類藥并不刺激胰島素分泌，它刺激機(jī)體在細(xì)胞水平上提高胰島素的利用，但對(duì)于胰島素分泌不足的糖尿病患者而言，其發(fā)揮的作用就很有限，而且還有乳酸性酸中毒等不良反應(yīng)。第三類藥是a糖苷酶抑制劑，如拜糖平等；這類藥的作用是減少人體對(duì)飲食中糖的吸收，因?yàn)槲諟p少，血糖升高也比較緩慢。但該藥的主要副作用就是胃腸反應(yīng)，服用后如發(fā)生低血糖反應(yīng)，還要口服或靜脈注射葡萄糖。目前注射藥物主要是胰島素，注射用的胰島素在糖尿病的治療中發(fā)揮著重要的作用。但也有其不足，主要為用藥后心慌、表情異常、流汗等，重者產(chǎn)生胰島素休克或低血糖性驚厥；注射胰島素的患者，經(jīng)一度停藥再用藥時(shí)，對(duì)胰島素的需用量愈來(lái)愈大，使患者必須每天必須多次注射胰島素，給患者帶來(lái)很大痛苦，而且大劑量用藥也加大了集體產(chǎn)生副作用的機(jī)制，其原因可能是機(jī)體產(chǎn)生了胰島素抗體，抗體與胰島素結(jié)合而減弱其作用。近年來(lái)，隨著人基因組序列的破譯，一批具有獨(dú)立調(diào)節(jié)血糖，有望成為新型治療糖尿病藥物的蛋白被相繼發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21 (FGF-21)就是其中之一。已有大量實(shí)驗(yàn)證明FGF-21是除胰島素外，生物體內(nèi)又一個(gè)能夠獨(dú)立調(diào)節(jié)代謝水平的蛋白因子。在已完成的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-21能夠獨(dú)立促進(jìn)小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝取(不論胰島素存在與否)，并以劑量依賴性的方式降低ob / ob和db / db小鼠以及ZDF大鼠餐后及空腹時(shí)血中的葡萄糖、甘油三酯及糖原水平。更重要的是，在發(fā)揮作用的同時(shí)，F(xiàn)GF-21沒有引起低血糖等其它糖尿病治療藥物常見的副作用。FGF-21的發(fā)現(xiàn)為糖尿病患者尤其是糖尿病晚期胰島素抵抗嚴(yán)重的患者帶來(lái)了新的希望。但是FGF-21在人體內(nèi)代謝時(shí)間較短，同胰島素一樣需要多次注射才能穩(wěn)定患者血糖。因此，將FGF-21進(jìn)行適當(dāng)改造，在不改變其原有活性的基礎(chǔ)上增加其穩(wěn)定性及活性，這對(duì)于將FGF-21應(yīng)用于臨床具有非常重要的意義。在以往生物藥物研究中，多采用隨機(jī)突變的方法進(jìn)行蛋白改造，由于突變的隨機(jī)性及蛋白功能的復(fù)雜性，隨機(jī)突變結(jié)果往往適得其反，浪費(fèi)了大量人力和物力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21 (FGF-21)及其編碼基因；
本發(fā)明的目的之二是提供一種設(shè)計(jì)該突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21 (FGF-21)的理論基礎(chǔ)；
本發(fā)明目的之三是提供含有突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21 (FGF-21)基因的表達(dá)載體或質(zhì)粒以及含有該表達(dá)載體和宿主細(xì)胞；
本發(fā)明目的之四是將該突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21 (FGF-21)應(yīng)用于制備成治療糖尿病的藥物或藥物組合物。本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
一種突變的FGF-21，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 2所示；編碼該突變的FGF-21的核苷酸序列為SEQ ID NO: I所示。主要利用Arg的強(qiáng)堿性以及它在生理?xiàng)l件下帶正電荷，不僅上調(diào)FGF-21的等電點(diǎn)，改善了 FGF-21的穩(wěn)定性，還幫助FGF-21結(jié)合到細(xì)胞膜表面，賦予了 FGF-21在降低血糖水平方面起效快、藥效好等優(yōu)點(diǎn)。并且，本發(fā)明目的明確，保留了很高的同源性，節(jié)省了大量后續(xù)工作。有利于加快該蛋白的藥用開發(fā)。本發(fā)明所述突變的FGF-21的方法，包括如下步驟以從正常人肝臟中提取的RNA 為模版，并以此為模板逆轉(zhuǎn)錄獲得編碼FGF-21的基因，以此為模板，通過下游引物引入突變，PCR后獲得突變體，將所獲得的突變基因連接到構(gòu)建好的表達(dá)載體中；將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，活性檢測(cè)。含有該突變的FGF-21核苷酸序列的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也當(dāng)然的包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選的，可以將突變的FGF-21核苷酸序列與分子伴侶相連接，再將其克隆到表達(dá)載體中。其中，所述的分子伴侶優(yōu)選為小分子泛素樣修飾蛋白 (SUMO)；
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)突變FGF-21的方法，包括將突變的FGF-21核苷酸序列與分子伴侶相連接，再將其克隆到表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體；將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中；誘導(dǎo)表達(dá)FGF-21，分離純化FGF-21，利用蛋白酶切除與其融合表達(dá)的分子伴侶部分，純化，即得。優(yōu)選的,所述的表達(dá)載體可以是pET_30a ( + ),所述的宿主細(xì)胞可以是Ti-aflsetta (DE3);所述的分子伴侶優(yōu)選為小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO)；
其中，所述的純化包括將酶切后的蛋白進(jìn)行樹脂親和層析，依次經(jīng)洗滌、洗脫、脫鹽。動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明突變的FGF-21相比于野生型FGF-21，能夠更加有效降低動(dòng)物體內(nèi)的血糖水平，此外，本發(fā)明突變的FGF-21在降低血糖水平方面還具有起效快、藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明突變的FGF-21可作為藥物治療糖尿病，代謝綜合癥或脂代謝紊亂等內(nèi)分泌疾病。下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
說(shuō)明本發(fā)明中涉及的基因的設(shè)計(jì)、合成和克隆，表達(dá)載體的構(gòu)建，核酸提取及序列分析及鑒定，以及表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化等操作步驟，可按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行(參見 ⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLE⑶LAR BIOLOGY)。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實(shí)施例I FGF-21基因的克隆根據(jù)FGF-21基因去除信號(hào)肽的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，通過互補(bǔ)延伸的方法獲得去除信號(hào)肽的FGF-21基因。利用在線軟件Primer5. 0設(shè)計(jì)FGF-21突變體引物。以提取的人肝臟總RNA為模板，Oligo (dT) 15為引物，參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶M-MLVRT 說(shuō)明書進(jìn)行cDNA第一條鏈合成，反應(yīng)體系和具體操作分別如下
aigo(dT)i5 1.0 ui 模板5.0 111
IXPC-H0 7.0 pi
70°C水浴5min，冰上放置5min，依次加入
SXasia1.0 d
5X M-MLVRT buffer5 M
dN'm5.0 ul
M-MLYRT1.0 gl
37 °C水浴2 h，70 °C水浴15 min，取2耵用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增FGF-21突變體成熟多肽cDNA，PCR反應(yīng)(50 W體系)如下
IOX PCR buffer dOTs5.0 SUl
Pl :5’ GGTCTCTAGGT CACCCCATCCCTGACTCCAGT 3’
P2 :5’ CGCGGATCCTTACCGCCGGGACGCATAGCTGGGGCTTCGG 3’
混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性5 min, 940C I min, 56°C I min,72°C
Imin的順序，25個(gè)循環(huán)后，72 °C再延伸10 min。最終得到全長(zhǎng)的FGF-21突變體基因。
實(shí)施例2 突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的制備及活性檢測(cè)
I、突變FGF-21基因表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例I回收后的FGF-21突變體目的片段與原核表達(dá)載體pET30a ( + )連接， 連接反應(yīng)體系(10 W)如下
權(quán)利要求
1.一種突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID N0:2所示。
2.編碼權(quán)利要求I所述的突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO: I所示。
3.含有權(quán)利要求2所述突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21基因的表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
5.一種制備權(quán)利要求I所述的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的方法，包括將編碼該突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21核苷酸序列與分子伴侶相融合，得到融合基因；將融合基因可操作的與表達(dá)載體相連接，得到重組表達(dá)載體；將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中；誘導(dǎo)表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21，分離純化成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21，利用蛋白酶切除與其融合表達(dá)的分子伴侶部分，純化，即得。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的分子伴侶為小分子泛素樣修飾蛋白。
7.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的純化包括將酶切后的蛋白進(jìn)行樹脂親和層析，依次經(jīng)過洗滌、洗脫、脫鹽。
8.一種治療內(nèi)分泌疾病的藥物組合物，包括治療上有效量的權(quán)利要求I所述的突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21和藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
9.權(quán)利要求I所述的突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21在制備治療內(nèi)分泌疾病藥物中的用途。
10.按照權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述的內(nèi)分泌疾病包括糖尿病，代謝綜合癥或脂代謝紊亂。
全文摘要
本發(fā)明公開了突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-21)及其在治療內(nèi)分泌疾病中的用途。本發(fā)明突變的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的氨基酸序列為SEQIDNO:2所示，其編碼基因序列為SEQIDNO:1所示。本發(fā)明以野生型FGF-21為模板，通過下游引物引入兩個(gè)精氨酸(Arg)，PCR后獲得突變體，主要利用Arg的強(qiáng)堿性以及它在生理?xiàng)l件下帶正電荷，不僅上調(diào)FGF-21的等電點(diǎn)，還幫助FGF-21結(jié)合到細(xì)胞膜表面。動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明突變的FGF-21能夠更加有效降低動(dòng)物體內(nèi)的血糖水平，此外，本發(fā)明突變體在降低血糖水平方面還具有起效快、藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明突變的FGF-21可作為藥物治療糖尿病，代謝綜合癥或脂代謝紊亂等內(nèi)分泌疾病。
文檔編號(hào)A61K38/18GK102603886SQ201210031800
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者任桂萍, 何坤, 劉銘瑤, 吳云舟, 李德山, 王文飛 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)