專利名稱：無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽ah90和cw49的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49在促進(jìn)皮膚修復(fù)、減少疤痕以及治療相關(guān)皮膚性疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皮膚作為機(jī)體天然的保護(hù)屏障，有機(jī)械阻擋病原體的作用。一旦皮膚的天然屏障作用被損壞，機(jī)體就會立即自動(dòng)開啟生理開關(guān)進(jìn)行皮膚的損傷修復(fù)。人體皮膚損傷后的愈合，同時(shí)存在上述的組織補(bǔ)充和疤痕愈合兩個(gè)過程。上皮細(xì)胞由正常皮膚邊緣向心性爬行生長，或由皮膚附屬器汗腺、毛囊的上皮向外擴(kuò)展生長，最后完成創(chuàng)面上皮覆蓋。真皮組織對損傷的反應(yīng)，是形成肉芽組織，肉芽組織實(shí)際上是ー種炎癥組織，從細(xì)胞學(xué)角度來看，肉 芽組織包括新生的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，由局部原始的中胚層細(xì)胞分化來的纖維母細(xì)胞及其合成物，如膠原纖維、粘多糖等。疤痕是由肉芽組織發(fā)育形成，生長到一定階段后自行停止并逐漸吸收消退。一般的創(chuàng)面愈合后半年至一年內(nèi)瘢痕仍在增生，其后逐漸吸收平復(fù)。但此過程可延續(xù)幾年、十幾年尚不能完成。無指盤臭蛙為蛙科蛙屬的兩棲動(dòng)物，是中國的特有物種。分布于四川、貴州、云南等地，常生活于中小山溪內(nèi)植物茂盛以及陰暗潮濕處。其生存的海抜范圍為720至3200米。無指盤臭蛙適應(yīng)其自生存的自然環(huán)境以及避免受傷等機(jī)體損傷，在長期的進(jìn)化過程中，無指盤臭蛙的皮膚發(fā)展成為具有多種功能的器官，如分泌大量抗菌肽抵御微生物侵襲；分泌神經(jīng)毒素對抗各類天故；分泌生長因子促進(jìn)傷ロ愈合等。本發(fā)明研究的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49對皮膚修復(fù)功能，目前為止尚未有這兩種多肽能修復(fù)皮膚的公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49在制備治療體表創(chuàng)傷、燒傷、皮膚潰瘍、減少疤痕產(chǎn)生、加快疤痕修復(fù)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的所用的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49采用常規(guī)的化學(xué)合成的方法獲得；其中I.無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90的分子量為2657. 18 Da，等電點(diǎn)為10. 26，其全序列ー級結(jié)構(gòu)為 ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG。2、無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49的分子量為1210. 43 Da，等電點(diǎn)為8. 29，全序列ー級結(jié)構(gòu)為APFRMGICTTN。本發(fā)明的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49在制備治療體表創(chuàng)傷、燒傷、皮膚潰瘍、減少疤痕產(chǎn)生、加快疤痕修復(fù)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的內(nèi)容在小鼠的動(dòng)物模型上試驗(yàn)，其試驗(yàn)方案為常規(guī)方法，具體如下I.無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49對傷ロ的愈合作用小鼠用2%戊巴比妥鈉麻酔后，背部兩側(cè)皮膚用剃毛器除毛，酒精消毒后，在其后背開兩個(gè)直徑7mm的創(chuàng)ロ，樣品溶解于PBS中(AH的濃度O. 05mg/ml，Cff濃度為lmg/ml )，每天給藥兩次，每次30ul。樣品加在右側(cè)創(chuàng)面，左側(cè)創(chuàng)面加相應(yīng)體積的PBS作陰性對照。每隔兩天用相機(jī)拍下創(chuàng)面變化，即DAYO，DAY2，DAY4，DAY6，DAY8直到加藥創(chuàng)面完全脫痂愈合為止。拍照時(shí)用量尺比照創(chuàng)ロ作標(biāo)尺。最后用作圖軟件計(jì)算創(chuàng)面大小變化，采用histologicalscore的評分系統(tǒng)評分。II.無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49對真皮、表皮的增生作用。A:石蠟切片I.取材將小鼠處死后剪取創(chuàng)面皮膚組織
2.固定將切好的肝組織用生理鹽水組織洗ー下，立即投入中性福爾馬林固定液中3.洗滌材料經(jīng)固定后，流水沖洗，數(shù)小時(shí)或過夜。4.脫水材料依次經(jīng)70%、80%、90%各級こ醇溶液脫水，各30min，再放入95%、100%各2次，姆次20min。5.透明純酒精、ニ甲苯等量混合液15min, ニ甲苯I 15min、II 15min (至透明為止)。6.透蠟放入ニ甲苯和石臘各半的混合液15min,再放入石臘I、石臘II透臘各50_60分鐘。7.包埋用鑷子夾取石蠟?zāi)Ｗ?金屬質(zhì)地)在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟?zāi)Ｖ校帕姓R。再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。8.切片①將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺上。②將切片刀固定在刀夾上，刀ロ向上。③搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀ロ貼近，但不可超過刀ロ。④調(diào)整石蠟塊與刀ロ之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。⑤調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為4-10微米。⑥一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時(shí)右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將臘帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40-50r/min。⑦切成的蠟帶到20-30cm長時(shí)，右手用另ー支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。⑧用單面刀片切取蠟片ー小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。⑨切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機(jī)擦拭干凈保存。
9.展片、貼片打開水浴鍋，使水溫維持在40_45°C，另準(zhǔn)備30%こ醇溶液。①切片時(shí)，將ー碗30%こ醇溶液放于切片機(jī)旁的桌面上。②用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在こ醇溶液的水面上，使切片展開。③小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用ー個(gè)載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。④另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片1/3處，另一端(磨邊，粗糙的一端)磨面上標(biāo)記或貼上標(biāo)簽，放于切片架上。10.脫蠟復(fù)水
將水浴鍋溫度調(diào)至60°C，待水溫控制在60°C時(shí)，將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內(nèi)，放入水浴鍋中，蓋上蓋子(可密封)，30min至蠟熔化。之后，石蠟切片經(jīng)ニ甲苯I、II脫蠟各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各3_5min，再放入蒸餾水中 3min。B: HE 染色I(xiàn).切片放入蘇木精中染色約10_30min。染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長。冬季室溫低時(shí)放入恒溫箱中染色。2.水洗用自來水流水沖洗15min。使切片顏色變藍(lán)(或放入堿性水中)，但要注意流水不能過大，以防切片脫落。3.分化將切片放入1%鹽酸こ醇液中褪色，2秒至數(shù)十秒鐘，見切片變紅，顏色較淺。4.漂洗切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。5.脫水 I切片入50%こ醇一70%こ醇一80%こ醇中各3_5min。6、復(fù)染用O. 5%伊紅こ醇液對比染色l_3min。7.脫水II將切片放入95%こ醇中洗去多余的紅色，然后放入無水こ醇中3_5min。最后用吸水紙吸干多余的こ醇。8.透明切片放入ニ甲苯I、II中各3_5min。9.封藏中性樹膠封存C:表皮厚度計(jì)算。將染色后的切片拍照，最后用軟件ImageJ計(jì)算表皮厚度，采用histologicalscore的評分系統(tǒng)評分。本發(fā)明的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49能促進(jìn)皮膚的修復(fù)，同時(shí)能減少皮膚修復(fù)過程中表皮的增生厚度，能夠用于制備治療體表創(chuàng)傷、燒傷、皮膚潰瘍的藥物。


圖1-A、圖1-B、圖1-C、圖1_D、圖1_E分別顯示O天、2天、4天、6天、8天無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90對小鼠皮膚損傷模型的對照及治療作用。圖2-A、圖2-B、圖2-C、圖2-D、圖2-E分別顯示O天、2天、4天、6天、8天無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49對小鼠皮膚損傷模型的對照及治療作用。圖3-A、圖3-B、圖3_C、圖3-D、圖3_E、圖3_F分別為無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90對小鼠皮膚的對照及治療作用切片圖。
圖4-A、圖4-B、圖4-C、圖4-D、圖4-E、圖4-F分別為無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49對小鼠皮膚的對照及治療作用作用切片圖。圖5-A、圖5-B分別為無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49對皮膚愈合的評分。圖6-A、圖6-B分別為無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49對表皮増殖作用。
圖7-A、圖7-B分別為無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49對表皮增殖評分。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的所用的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49采用常規(guī)的化學(xué)合成的方法獲得；其中I.無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90的分子量為2657. 18 Da，等電點(diǎn)為10. 26，其全序列ー級結(jié)構(gòu)為 ATAWDFGPHGLLP IRPIRIRPLCG。2、無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49的分子量為1210. 43 Da，等電點(diǎn)為8. 29，全序列ー級結(jié)構(gòu)為APFRMGICTTN。本發(fā)明的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49在制備治療體表創(chuàng)傷、燒傷、皮膚潰瘍藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的內(nèi)容在小鼠的動(dòng)物模型上試驗(yàn)，其試驗(yàn)方案為常規(guī)方法，具體步驟同發(fā)明內(nèi)容部分的描述。實(shí)施例I :無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90對小鼠皮膚損傷模型的修復(fù)作用。取O. 05mg/ml無指盤臭娃促皮膚修復(fù)多肽AH90進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果為能迅速促進(jìn)皮膚的修復(fù)功能(圖1-A、圖1-B、圖1-C、圖1-D、圖1-E)，第二天的修復(fù)效果比較明顯，第四天結(jié)痂，第六天基本上完全恢復(fù)，并且和對照小鼠的皮膚修復(fù)有明顯的差異。實(shí)施例2 無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49對小鼠皮膚損傷模型的修復(fù)作用。取lmg/ml無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果為能迅速促進(jìn)皮膚的修復(fù)功能(圖1-A、圖1-B、圖1-C、圖1-D、圖1-E)，第二天的修復(fù)效果比較明顯，第四天結(jié)痂，第八天基本上完全恢復(fù)，并且和對照小鼠的皮膚修復(fù)有明顯的差異。實(shí)施例3 無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90對小鼠皮膚修復(fù)作用切片圖。小鼠皮膚在恢復(fù)的過程中，將每天恢復(fù)效果做成切片，觀察皮膚表皮生長情況。圖3-A、圖3-B、圖3-C、圖3-D、圖3-E、圖3-F顯示加入AH90治療后的第三天肉芽組織形成，第五天表皮組織基本上完全恢復(fù)，第九天治療組的表皮組織厚度與對照組相比明顯減少。實(shí)施例4
無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49對小鼠皮膚修復(fù)作用切片圖。切片結(jié)果表明(圖4-A、圖4-B、圖4-C、圖4-D、圖4-E、圖4-F)，無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49治療后第三天形成較厚的增生表皮組織，第五天增生的表皮組織厚度減少，第九天表皮厚度恢復(fù)正常且有腺體產(chǎn)生。實(shí)施例5 無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49對肉芽組織愈合的評分。小鼠皮膚的創(chuàng)傷后涂抹無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49，對每天小鼠傷ロ的愈合情況拍照，采用histological score的評分系統(tǒng)對肉芽組織愈合進(jìn)行評分。結(jié)果表明(圖5-A、圖5-B)，使用無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49后，肉芽組織愈合的程度和對照有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P〈0. 01)。 實(shí)施例6 無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49對表皮増殖作用。如圖6-A、圖6-B所示，小鼠皮膚損傷恢復(fù)的過程中表皮的厚度明顯增加，涂抹無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49后表皮的厚度増加明顯小于對照組并且和對照組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P〈0. 01)，AH90和CW49具有預(yù)防疤痕產(chǎn)生的作用。實(shí)施例7 無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49對真皮和表皮增殖評分。將小鼠皮膚恢復(fù)的部位做成切片，然后拍照觀察表皮的増殖厚度，采用histological score的評分系統(tǒng)對皮膚修復(fù)進(jìn)行評分。結(jié)果表明(圖7-A、圖7-B),使用指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49表皮和真皮評分和對照組有顯著性的差異。
權(quán)利要求
1.分子量為2657.18 Da,等電點(diǎn)為10. 26，其全序列一級結(jié)構(gòu)為ATAffDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90在制備治療體表創(chuàng)傷、燒傷、皮膚潰瘍、減少疤痕產(chǎn)生、加快疤痕修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
2.分子量為1210.43 Da，等電點(diǎn)為8. 29，全序列一級結(jié)構(gòu)為APFRMGICTTN的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49在制備治療體表創(chuàng)傷、燒傷、皮膚潰瘍、減少疤痕產(chǎn)生、加快疤痕修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49的應(yīng)用。本發(fā)明的分子量為2657.18 Da，等電點(diǎn)為10.26，其全序列一級結(jié)構(gòu)為ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90作為藥物在治療體表創(chuàng)傷、燒傷、皮膚潰瘍、減少疤痕產(chǎn)生、加快疤痕修復(fù)方面的應(yīng)用。本發(fā)明的分子量為1210.43 Da，等電點(diǎn)為8.29，全序列一級結(jié)構(gòu)為APFRMGICTTN的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽CW49作為藥物在治療體表創(chuàng)傷、燒傷、皮膚潰瘍、減少疤痕產(chǎn)生、加快疤痕修復(fù)方面的應(yīng)用。本發(fā)明的無指盤臭蛙促皮膚修復(fù)多肽AH90和CW49能促進(jìn)皮膚的修復(fù)，同時(shí)能減少皮膚修復(fù)過程中表皮的增生厚度，能夠用于制備治療體表創(chuàng)傷、燒傷、皮膚潰瘍、減少疤痕產(chǎn)生、加快疤痕修復(fù)的藥物。
文檔編號A61K38/17GK102657845SQ20121017427
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者劉涵, 容明強(qiáng), 賴仞 申請人:中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所