經(jīng)修飾fgf-21多肽和其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供經(jīng)修飾FGF-21多肽和其用途以及產(chǎn)生方法，所述經(jīng)修飾人類FGF-21多肽包含SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6或SEQ?ID?NO：7的多肽序列，且在SEQ?ID?NO：1的108位置處或SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6或SEQ?ID?NO：7的相應(yīng)位置處以一個(gè)非天然編碼氨基酸進(jìn)行取代。
【專利說(shuō)明】經(jīng)修飾FGF-21多肽和其用途
[0001]分案說(shuō)明
[0002]本申請(qǐng)案是申請(qǐng)日為2008年3月19日，申請(qǐng)?zhí)枮?00880009653.9 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2008/057563)，發(fā)明名稱為經(jīng)修飾FGF-21多肽和其用途的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0003]相關(guān)申請(qǐng)案的交叉參考
[0004]本申請(qǐng)案主張2007年3月30日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第60/921，297號(hào)和2007年11月14日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第60/988，060號(hào)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)利，所述申請(qǐng)案的說(shuō)明書和揭示內(nèi)容以全文并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及視情況經(jīng)至少一個(gè)非天然編碼氨基酸修飾的FGF-21多肽。

【背景技術(shù)】
[0006]成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是廣泛表達(dá)于發(fā)育和成熟組織中的大的多肽(Baird等人，Cancer Cells, 3:239-243, 1991)，并且在包括血管生成、有絲分裂發(fā)生、模式形成、細(xì)胞分化、代謝調(diào)節(jié)和組織損傷修復(fù)的多種生理學(xué)功能中起關(guān)鍵作用(McKeehan等人,Prog.Nucleic Acid Res.Mol.B1l.59:135-176, 1998 ；Burgess, ff.H.等人,Annu.Rev.B1chem.58:575-606 (1989))。原型成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF) FGF-1 和 FGF-2 最初是從作為成纖維細(xì)胞有絲分裂原的大腦和垂體中分離。FGF-3經(jīng)鑒別為由小鼠乳腺腫瘤病毒活化的常用標(biāo)靶(Dickson 等人，Ann.N.Y.Acad.Sc1.638:18-26 (1991)) ;FGF_4到 FGF-6 經(jīng)鑒別為致癌基因產(chǎn)物(Yoshida 等人，Ann.NY Acad.Sc1.638:27—37 (1991)；Goldfarb 等人，Ann.NY Acad.Sci 638:38-52(1991) ；Coulier 等人，Ann.NY Acad.Sc1.638:53-61 (1991))。FGF-10是通過(guò)基于同源性的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從大鼠肺中鑒別(Yamasaki 等人，J.B1l.Chem.271:15918-15921 (1996))。FGF-1l 到 FGF-14(FGF 同源因子(FHF)I到4)是通過(guò)隨機(jī)cDNA測(cè)序、數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和基于同源性的PCR的組合從人類視網(wǎng)膜中鑒別(Smallwood 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 93:9850-9857 (1996))。FGF-15經(jīng)鑒別為嵌合體同源結(jié)構(gòu)域癌蛋白的下游標(biāo)祀(Mcffhirter等人，Developmentl24:3221-3232(1997)) ο FGF-16、FGF-17和FGF-18分別是通過(guò)基于同源性的PCR從大鼠心臟和胚胎中鑒別(Miyake 等人,B1chem.B1phys.Res.Commun.243:148-152 (1998)；Hoshikawa 等人,B1chem.B1phys.Res.Commun.244:187-191 (1998) ；0hbayashi 等人,J.B1l.Chem.273:18161-18164(1998))。FGF-19是通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索從人類胎兒大腦中鑒別(Nishimura 等人,B1chim.B1phys.Actal444:148-151 (1999))。其具有氨基酸一致性為約30%到60%的約120個(gè)保守氨基酸殘基的核。
[0007]天然存在突變的動(dòng)物模型、過(guò)度表達(dá)和分析使成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和其受體牽涉于多種疾病中(例如 Wilkie 等人，Current B1logy, (1995) 5:500-507 ；Pugh-Humphreys等人,The Cytokine Handbook, A.Thomson 編，第 2 版,Academic Press, HarcourtBrace&c0.出版社，London,第525-566頁(yè))，表明活性調(diào)節(jié)可用于治療。舉例來(lái)說(shuō)，化合物蘇拉明(Suramin)對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子_2的抑制作用會(huì)預(yù)防小鼠的新血管形成和腫瘤生長(zhǎng)(Pesenti 等人，British Journal of Cancer, 66:367-372)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在血管生成(Lyons, Μ.K.,等人，Brain Res.(1991) 558:315-320)、傷口愈合(Uhl, E.,等人，Br.J.Surg.(1993)80:977-980, 1993)、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生(astrogl1sis)、膠質(zhì)細(xì)胞增生和分化(Biagini, G.等人，Neurochem.1nt.(1994) 25:17-24)、腦血管舒張(Tanaka, R.等人，Stroke (1995) 26:2154-2159)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)/神經(jīng)調(diào)節(jié)過(guò)程中也起作用。
[0008]成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子也具有多種積極作用，包括改善血流和防止鈣毒性以改善腦缺血的后果(Mattson, Μ.P.等人，Semin.Neurosc1.(1993) 5:295-307 ；Doetroc j.ff.D.等人，J.Neurotrauma(1996) 13:309-316)?；A(chǔ)FGF治療促進(jìn)缺血心肌中的新血管生成(Schumacher 等人,Circulat1n (1998) 97:645-650)。基礎(chǔ) FGF 增強(qiáng)功能恢復(fù)，并促進(jìn)局灶性腦梗塞后的神經(jīng)元萌生(Kawamata等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.(1997) 94 (15):8179-84)。根據(jù)公開文獻(xiàn)，F(xiàn)GF家族由至少22個(gè)成員組成(Reuss等人，CellTissue Res.313:139-157(2003))。
[0009]已報(bào)導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF_21)優(yōu)先表達(dá)于肝臟中(Nishimura等人，B1chimica et B1physica Acta, 1492:203-206 (2000) ；W0 01/36640 ；和 WO01/18172，其以引用的方式并入本文中)，并且將其描述為缺血性血管疾病、傷口愈合和與肺、支氣管或肺泡細(xì)胞或功能損失相關(guān)的疾病以及眾多其它病癥的治療方法。FGF-21主要表達(dá)于肝臟、腎臟和肌肉組織中(參看美國(guó)專利公開案第20040259780號(hào)的實(shí)例2，所述專利以全文引用的方式并入本文中)。FGF-21基因由3個(gè)外顯子構(gòu)成并且位于染色體19上。與其它FGF不同，F(xiàn)GF-21不具有增殖和致瘤作用(Genome B1l.2001 ;2 (3):REVIEWS3005)。
[0010]美國(guó)專利公開案第20010012628號(hào)(其以全文引用的方式并入本文中)描述人類FGF-21的核苷酸和蛋白質(zhì)序列(分別參看美國(guó)專利公開案第20010012628號(hào)的SEQ IDNO:1和SEQ ID NO: 2)。上述公開案中的SEQ ID NO: 2 (稱作sbgFGF_19)為209個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并且在N末端含有28個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列。本文中呈現(xiàn)為SEQ ID NO: 3的人類FGF-21序列是與美國(guó)專利公開案第20010012628號(hào)的SEQ ID N0:2相同的序列。這個(gè)序列具有關(guān)于位置174的脯氨酸(P)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),下文中稱作“FGF-21的209個(gè)氨基酸P形式”。
[0011]美國(guó)專利第6，716，626號(hào)(其以全文引用的方式并入本文中)論述人類FGF-21和其它哺乳動(dòng)物(尤其小鼠和大鼠)中的同源蛋白。以美國(guó)專利第6，716，626號(hào)的SEQ IDNO:1表示的小鼠FGF高度表達(dá)于肝臟中并且表達(dá)于睪丸和胸腺中，并且表明人類FGF-21可能在肝病和/或睪丸功能或源自胸腺的細(xì)胞的功能的病癥發(fā)展和恢復(fù)中起作用。美國(guó)專利第6，716，626號(hào)的SEQ ID NO: 4為209個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并且在N末端含有28個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列。本文中呈現(xiàn)為SEQ ID NO: 6的人類FGF-21序列是與美國(guó)專利第6，716，626號(hào)的SEQID N0:4相同的序列。這個(gè)序列具有關(guān)于位置174的亮氨酸(L)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，下文中稱作“FGF-21的209個(gè)氨基酸L形式”。
[0012]美國(guó)專利公開案第20040259780號(hào)(其以全文引用的方式并入本文中)論述人類FGF-21，并且呈現(xiàn)208個(gè)氨基酸長(zhǎng)(美國(guó)專利公開案第20040259780號(hào)的SEQ ID NO: 2)并且在N末端含有27個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列的序列。本文中呈現(xiàn)為SEQ ID NO: 7的人類FGF-21序列是與美國(guó)專利公開案第20040259780號(hào)的SEQ ID N0:2相同的序列。這個(gè)序列具有關(guān)于位置173的亮氨酸(L)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，下文中稱作“FGF-21的208個(gè)氨基酸L形式”。
[0013]已顯示FGF-21在胰島素存在和不存在下刺激小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝取，并且以劑量依賴性方式降低ob/ob和db/db小鼠以及8周齡ZDF大鼠的餐后和空腹血糖、甘油三酯和胰高血糖素水平，因此，為使用FGF-21作為治療糖尿病和肥胖癥的療法提供了基礎(chǔ)(以引用的方式并入本文中的WO 03/011213，和Kharitonenkov等人，J ClinInvest.2005 年 6 月；115 (6): 1627-35)。Kharitonenkov 等人，T Clin Invest.2005 年 6月；115(6):1627-35也顯示表達(dá)人類FGF-21的轉(zhuǎn)基因小鼠血糖過(guò)低，對(duì)胰島素敏感并抵抗飲食誘發(fā)的肥胖癥。Kharitonenkov等人，Endocrinology (待出版)也顯示FGF-21降低糖尿病稱猴(Rhesus monkey)的葡萄糖、甘油三酯、胰島素和胰高血糖素。
[0014]另外，已顯示FGF-21可有效降低危重患者的死亡率和發(fā)病率(W0 03/059270，其以引用的方式并入本文中)。美國(guó)專利申請(qǐng)案20050176631(其以引用的方式并入本文中)中已描述FGF-21，其影響總體代謝狀況，并且可對(duì)抗在身體對(duì)敗血癥以及由非感染性病理原因引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)的應(yīng)激反應(yīng)期間可能出現(xiàn)的消極副作用。因此，可使用FGF-21來(lái)降低危重患者中出現(xiàn)的死亡率和發(fā)病率。危重患者包括需要連續(xù)、協(xié)同的醫(yī)師、看護(hù)和呼吸護(hù)理的生理不穩(wěn)定患者。這類護(hù)理尤其需要詳加注意以提供持續(xù)監(jiān)控和療法滴定。危重患者包括處于生理代償失調(diào)風(fēng)險(xiǎn)中的患者，并因此需要持續(xù)監(jiān)控以使得加強(qiáng)護(hù)理團(tuán)隊(duì)可提供立即干預(yù)以防止不利情況發(fā)生。危重患者特別需要須由可提供連續(xù)滴定護(hù)理的團(tuán)隊(duì)提供的監(jiān)控和生命支持。
[0015]聚乙二醇化FGF-21多肽描述于以引用的方式并入本文中的WO 2005/091944中。WO 2005/091944中描述的 FGF-21多肽是181個(gè)氨基酸的多肽。以WO 2005/091944的SEQID NO:1表示的成熟、野生型或天然人類FGF-21序列缺乏前導(dǎo)序列。這個(gè)人類FGF-21與小鼠FGF-21 (約79%氨基酸一致性)和大鼠FGF-21 (約80%氨基酸一致性)高度一致。本文中呈現(xiàn)為SEQ ID N0:5的人類FGF-21序列是與WO 05/091944的SEQ ID N0:1相同的序列。這個(gè)序列具有關(guān)于位置146的亮氨酸(L)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地使用替代性哺乳動(dòng)物FGF-21多肽序列或類似物、突變蛋白或與人類FGF-21序列具有足夠同源性的衍生物來(lái)達(dá)成本文所述的用途。
[0016]本文中呈現(xiàn)為SEQ ID NO:1的人類FGF-21序列具有關(guān)于位置146的脯氨酸⑵的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。SEQ ID NO:1的N末端His標(biāo)簽型式在本文中展示為SEQ ID N0:2。
[0017]WO 2005/091944描述一個(gè)或一個(gè)以上PEG分子與FGF-21化合物的特定殘基的共價(jià)連接。與天然FGF-21相比，所得化合物是消除半衰期延長(zhǎng)并且清除率降低的具有生物活性的聚乙二醇化FGF-21化合物。PEG分子是與半胱氨酸或賴氨酸殘基共價(jià)連接。在半胱氨酸的多個(gè)位置處進(jìn)行取代以允許連接至少一個(gè)PEG分子。描述一個(gè)或一個(gè)以上賴氨酸殘基(56、59、69和122)處的聚乙二醇化。
[0018]聚乙二醇化FGF-21化合物可適用于治療具有包括(但不限于)以下病癥的個(gè)體:2型糖尿病、肥胖癥、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖耐受不良、高血糖癥和代謝綜合癥。服用可通過(guò)達(dá)成較長(zhǎng)循環(huán)半衰期而增大功效并且將需要較少劑量的聚乙二醇化FGF-21化合物將為尤其有利的，其增加需要此療法的個(gè)體的方便性與個(gè)體順應(yīng)給藥要求的可能性。代謝綜合癥可定義為以下征候中至少三種的群集:腹部肥胖，在大多數(shù)男性中，腰圍為40英寸或更大；高血糖，空腹后為至少110毫克/分升(mg/dL);高甘油三酯，血流中為至少150mg/dL ;低HDL，小于40mg/dL ；以及血壓為130/85或更高。
[0019]與親水性聚合物聚乙二醇(縮寫為PEG)共價(jià)連接是對(duì)許多生物活性分子(包括蛋白質(zhì)、肽和尤其疏水性分子)增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治療半衰期，調(diào)節(jié)免疫原性，調(diào)節(jié)生物活性或延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間的方法。PEG已廣泛用于藥物、人工植入物，以及生物相容性、無(wú)毒性和無(wú)免疫原性具有重要性的其它應(yīng)用中。為最大化PEG的所需性質(zhì)，連接到生物活性分子上的一種或一種以上PEG聚合物的總分子量和水合狀態(tài)必須足夠高以賦予通常與PEG聚合物連接相關(guān)的有利特征(例如增加的水溶性和循環(huán)半衰期)，而不會(huì)不利地影響母體分子的生物活性。
[0020]PEG衍生物通常通過(guò)例如賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基、N末端以及碳水化合物部分等反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)與生物活性分子連接。已存在關(guān)于形成治療性FGF-21化合物的研究，但因多種原因而存在問(wèn)題，其中一個(gè)原因是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和其它分子通常具有有限數(shù)目的可用于聚合物連接的反應(yīng)性位點(diǎn)。通常，最適于通過(guò)聚合物連接來(lái)修飾的位點(diǎn)在受體結(jié)合中起重要作用，并且對(duì)于分子的生物活性保持來(lái)說(shuō)是必需的。因此，聚合物鏈與生物活性分子上的這些反應(yīng)性位點(diǎn)的雜亂連接通常導(dǎo)致聚合物修飾的分子的生物活性顯著降低或甚至完全喪失。R.Clark等人，(1996).T.B1l.Chem., 271:21969-21977。為形成具有足夠聚合物分子量以賦予標(biāo)靶分子以所需優(yōu)點(diǎn)的接合物，先前技術(shù)方法通常涉及多個(gè)聚合物臂與分子的隨機(jī)連接，從而增大母體分子的生物活性降低或甚至完全喪失的風(fēng)險(xiǎn)。
[0021]形成PEG衍生物與蛋白質(zhì)的連接點(diǎn)的反應(yīng)性位點(diǎn)由蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)指示。蛋白質(zhì)(包括酶)由多個(gè)α氨基酸序列構(gòu)成，所述序列具有一般結(jié)構(gòu)H2N-CHR-C00H。一個(gè)氨基酸的α氨基部分(H2N-)與相鄰氨基酸的羧基部分(-C00H)連接形成酰胺鍵聯(lián)，其可表示為-(NH-CHR-CO)n-, 其中下標(biāo)“η”可等于數(shù)百或數(shù)千。由R表示的片段可含有關(guān)于蛋白質(zhì)生物活性和用于連接PEG衍生物的反應(yīng)性位點(diǎn)。
[0022]舉例來(lái)說(shuō)，在氨基酸賴氨酸的情況下，在ε位以及α位存在-NH2部分。ε-NH2在堿性pH值條件下不反應(yīng)。用PEG進(jìn)行蛋白質(zhì)衍生領(lǐng)域中的許多技術(shù)是針對(duì)開發(fā)用于連接蛋白質(zhì)中存在的賴氨酸殘基的ε-NH2部分的PEG衍生物。"PolyethyleneGlycol and Derivatives for Advanced PEGylat1n^j Nektar Molecular EngineeringCatalog, 2003,第1_17頁(yè)。然而，這些PEG衍生物都具有常見限制:其不能在蛋白質(zhì)表面上存在的通常眾多賴氨酸殘基之間進(jìn)行選擇性安裝。在賴氨酸殘基對(duì)于蛋白質(zhì)活性較為重要(例如存在于酶活性位點(diǎn)中)的情況下或在賴氨酸殘基在介導(dǎo)蛋白質(zhì)與其它生物分子的相互作用中起作用(如在受體結(jié)合位點(diǎn)的情況下)的情況下，這可能是一個(gè)重要限制。
[0023]蛋白質(zhì)聚乙二醇化的現(xiàn)有方法的又一個(gè)同樣重要的復(fù)雜情況在于PEG衍生物可能經(jīng)歷與除所需殘基以外的殘基發(fā)生的不需要的副反應(yīng)。組氨酸含有反應(yīng)性亞氨基部分(其結(jié)構(gòu)表示為-N(H)-)，但許多與ε-NH2反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)也可與-N(H)-反應(yīng)。類似地，氨基酸半胱氨酸的側(cè)鏈帶有自由巰基，其結(jié)構(gòu)表示為-SH。在一些情況下，針對(duì)賴氨酸的ε_(tái)ΝΗ2基團(tuán)的PEG衍生物也與半胱氨酸、組氨酸或其它殘基反應(yīng)。這可以產(chǎn)生PEG衍生的生物活性分子的復(fù)雜的異質(zhì)混合物，并且存在破壞所靶向生物活性分子的活性的風(fēng)險(xiǎn)。將需要開發(fā)出允許在蛋白質(zhì)內(nèi)的單一位點(diǎn)處引入化學(xué)官能團(tuán)的PEG衍生物，其隨后將使得一種或一種以上PEG聚合物能夠與蛋白質(zhì)表面上確定以及可預(yù)測(cè)的特定位點(diǎn)處的生物活性分子選擇性偶合。
[0024]除賴氨酸殘基之外，所屬領(lǐng)域中也已作出相當(dāng)大的努力來(lái)開發(fā)靶向其它氨基酸側(cè)鏈(包括半胱氨酸、組氨酸和N末端)的活化PEG試劑。例如，參看以引用的方式并入本文中的美國(guó)專利第6，610，281 號(hào)，以及〃Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylat1n^, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003,第 1-17 頁(yè)?？墒褂枚c(diǎn)誘變和所屬領(lǐng)域中已知的其它技術(shù)將半胱氨酸殘基位點(diǎn)選擇性地引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，并且所得自由巰基部分可與帶有硫醇反應(yīng)性官能團(tuán)的PEG衍生物反應(yīng)。然而，這種方法的復(fù)雜之處在于引入自由巰基可能使所得蛋白質(zhì)的表達(dá)、折疊和穩(wěn)定性變得復(fù)雜。因此，將需要獲得一種將化學(xué)官能團(tuán)引入FGF-21中的方法，其使得一種或一種以上PEG聚合物能夠與蛋白質(zhì)選擇性偶合，同時(shí)可與巰基和蛋白質(zhì)中通?？梢姷钠渌瘜W(xué)官能團(tuán)相容(即，不會(huì)發(fā)生不需要的副反應(yīng))。
[0025]從所屬領(lǐng)域中的取樣來(lái)看，在已開發(fā)的用于連接蛋白質(zhì)側(cè)鏈(具體來(lái)說(shuō)，賴氨酸氨基酸側(cè)鏈上的-NH2部分和半胱氨酸側(cè)鏈上的-SH部分)的這些衍生物中，已證實(shí)許多衍生物的合成和使用存在問(wèn)題。一些衍生物與蛋白質(zhì)形成不穩(wěn)定鍵聯(lián)，其經(jīng)歷水解并因此分解、降解或以其它方式在水性環(huán)境中(例如在血流中)不穩(wěn)定。一些衍生物形成較穩(wěn)定的鍵聯(lián)，但在形成所述鍵聯(lián)之前經(jīng)歷水解，這表示PEG衍生物上的反應(yīng)性基團(tuán)可能在可連接蛋白質(zhì)之前已失活。一些衍生物稍有毒性并且因此不太適于活體內(nèi)使用。一些衍生物因反應(yīng)過(guò)慢而不能實(shí)際使用。一些衍生物因與負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)活性的位點(diǎn)連接而導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性喪失。一些衍生物在其將連接的位點(diǎn)中不具特異性，這也可能導(dǎo)致所需活性喪失并缺乏結(jié)果的再現(xiàn)性。為克服與用聚乙二醇部分修飾蛋白質(zhì)相關(guān)的挑戰(zhàn)，已開發(fā)出更穩(wěn)定(例如，美國(guó)專利6，602，498，其以引用的方式并入本文中)或與分子和表面上的硫醇部分選擇性反應(yīng)(例如，美國(guó)專利6，610，281，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。所屬領(lǐng)域中無(wú)疑需要在要求選擇性反應(yīng)形成穩(wěn)定化學(xué)鍵之前在生理環(huán)境中呈化學(xué)惰性的PEG衍生物。
[0026]近年來(lái)，已報(bào)導(dǎo)蛋白質(zhì)科學(xué)中的全新技術(shù)，其有希望克服眾多與蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性修飾相關(guān)的限制。具體來(lái)說(shuō)，已將新的組分添加到原核生物大腸桿菌(Escherichia coli ；E.coli)(例如，L.Wang 等人,(2001), Science292:498-500)以及真核生物釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae ；S.cerevisiae)(例如，J.Chin 等A,Science301:964-7 (2003))的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)制中，其使得能夠在活體內(nèi)將非遺傳編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中。使用此方法，已回應(yīng)琥珀密碼子TAG而將具有新穎化學(xué)、物理或生物性質(zhì)的許多新穎氨基酸(包括光親和性標(biāo)記和可光致異構(gòu)化氨基酸、光交聯(lián)氨基酸(例如參看 Chin, J.ff.等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.99:11020-11024 ;和 Chin, J.W.等人，(2002) T.Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮某氡某酸、含重原子氡某酸和糖某化氨基酸)有效且高保真地并入大腸桿菌以及酵母中的蛋白質(zhì)中。例如，參看J.W.Chin等人,(2002), Tournal of the American Chemical Society 124:9026-9027 ；J.ff.Chin和 P.G.Schultz, (2002).ChemB1Chem3(ll):1135-1137: T.ff.Chin 等人，(2002).PNASUnited States of America99:11020-11024 ；以及 L.Wang 和 P.G.Schultz, (2002), Chem.Comm.,1:1-11。所有參考文獻(xiàn)都是以全文引用的方式并入本文中。這些研究已證實(shí)有可能選擇性地并且常規(guī)地引入蛋白質(zhì)中不存在的化學(xué)官能團(tuán)(例如酮基、炔基和疊氮部分)，所述官能團(tuán)對(duì)20種常見的遺傳編碼氨基酸中存在的所有官能團(tuán)都呈化學(xué)惰性并且可用于有效并選擇性地反應(yīng)形成穩(wěn)定共價(jià)鍵聯(lián)。
[0027]在蛋白質(zhì)中并入非遺傳編碼氨基酸的能力允許引入可能提供天然存在的官能團(tuán)(例如賴氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基等)的有價(jià)值替代的化學(xué)官能團(tuán)。已知某些化學(xué)官能團(tuán)對(duì)20種常見的遺傳編碼氨基酸中存在的官能團(tuán)呈惰性，但完全并有效地反應(yīng)形成穩(wěn)定鍵聯(lián)。舉例來(lái)說(shuō)，所屬領(lǐng)域中已知疊氮基和乙炔基在催化量的銅存在下在水性條件下經(jīng)歷休斯根(Huisgen) [3+2]環(huán)加成反應(yīng)。例如，參看Tornoe等人，(2002) Τ.0rg.Chem.67:3057-3064 ；和 Rostovtsev 等人，(2002) Angew.Chem.1nt.Ed.41:2596-25990舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中引入疊氮部分，能夠并入對(duì)蛋白質(zhì)中存在的胺、巰基、羧酸、羥基呈化學(xué)惰性，但也與乙炔部分平穩(wěn)并有效地反應(yīng)形成環(huán)加成產(chǎn)物的官能團(tuán)。重要的是，在不存在乙炔部分的情況下，疊氮化物在其它蛋白質(zhì)側(cè)鏈存在下在生理?xiàng)l件下仍保持化學(xué)惰性并且不反應(yīng)。
[0028]本發(fā)明尤其涉及與FGF-21多肽的活性和制備相關(guān)的問(wèn)題，并且也涉及具有改良的生物或藥理學(xué)性質(zhì)(例如改良的治療半衰期)的FGF-21多肽的制備。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0029]本發(fā)明提供包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的FGF-21多肽。
[0030]在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上翻譯后修飾。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽是與連接子、聚合物或生物活性分子連接。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽是與雙官能聚合物、 雙官能連接子或至少一個(gè)其它FGF-21多肽連接。
[0031]在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸是與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸是利用連接子與水溶性聚合物連接或與水溶性聚合物鍵結(jié)。在一些實(shí)施例中，聚乙二醇分子是雙官能聚合物。在一些實(shí)施例中，雙官能聚合物是與第二多肽連接。在一些實(shí)施例中，第二多肽是FGF-21多肽。
[0032]在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含至少兩個(gè)與包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物連接的氨基酸。在一些實(shí)施例中，至少一個(gè)氨基酸是非天然編碼氨基酸。
[0033]在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置中:位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、
111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、
130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白質(zhì)的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2_7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入SEQ ID N0:34-36中從位置1(8卩，在N末端)之前到C末端的一個(gè)或一個(gè)以上位置中。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置中:10、52、117、126、131、162、87、77、83、72、69、79、91、96、108和110 (SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2-7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置中:10、52、77、117、126、131、162(SEQ ID NO:1 或在 SEQ ID NO:2-7 中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置中:87、77、83、72(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2_7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置中:69、79、91、96、108 和 110(SEQ ID NO:1 或在 SEQ ID NO: 2-7 中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸并入SEQ ID NO:3、4、6、7或其它FGF-21序列的前導(dǎo)序列或信號(hào)序列中。在一些實(shí)施例中，前導(dǎo)序列可能選自SEQ ID N0:39、40、41、42、43或44。在一些實(shí)施例中，將FGF-21分泌構(gòu)筑體克隆到具有選自SEQ ID NO: 39、40、41、42、43、44的前導(dǎo)序列的pVK7ara (Nde/Eco)中。
[0034]在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置處的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接，包括(但不限于)以下位置:位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111 、112、113、114、115、116，117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白質(zhì)的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2_7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，將SEQ ID N0:34-36中從位置I (B卩，在N末端)之前到C末端的一個(gè)或一個(gè)以上位置處的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置處的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接，包括(但不限于)以下位置:10、52、117、126、131、162、87、77、83、72、69、79、91、96、108 和 110(SEQ ID NO:1 或在 SEQ ID N0:2_7 中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置處的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接，包括(但不限于)以下位置:10、52、77、117、126、131、162(SEQ ID N0:1或在SEQ ID NO:2-7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置處的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接:87、77、83、72(SEQ ID N0:1或在SEQ ID N0:2_7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置處的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接:69、79、91、96、108和110(SEQ ID N0:1或在SEQ ID N0:2_7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，將SEQ ID N0:3、4、6、7、39、40、41、42、43、44的前導(dǎo)序列或信號(hào)序列或者其它FGF-21序列中的一個(gè)或一個(gè)以上非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施例中，將SEQ ID N0:3、4、6、7的前導(dǎo)序列或信號(hào)序列或者其它FGF-21序列中的一個(gè)或一個(gè)以上非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接。
[0035]在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含調(diào)節(jié)FGF-21多肽對(duì)FGF-21多肽受體或結(jié)合搭配物(包括(但不限于)蛋白質(zhì)、多肽、小分子或核酸)的親和性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21的穩(wěn)定性相比增加FGF-21多肽的穩(wěn)定性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21的免疫原性相比調(diào)節(jié)FGF-21多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間相比調(diào)節(jié)FGF-21多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的取代、添加或缺失。
[0036]在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21的水溶性相比增加FGF-21多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21的溶解性相比增加宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的FGF-21多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21的表達(dá)或合成相比增加FGF-21多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)或增加活體外合成的取代、添加或缺失。包含這種取代的FGF-21多肽保持激動(dòng)劑活性并且保持或提高在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21的蛋白酶抗性相比增加FGF-21多肽的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。美國(guó)專利第6，716，626號(hào)指出可經(jīng)取代以改變蛋白酶裂解的潛在位點(diǎn)包括(但不限于)脯氨酸的2個(gè)殘基內(nèi)的單堿位點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與在與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21多肽相互作用后受體的活性相比調(diào)節(jié)FGF-21受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21多肽的結(jié)合相比調(diào)節(jié)其與另一分子(例如受體)的結(jié)合的取代、添加或缺失。
[0037]在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽包含與不具有取代、添加或缺失的相應(yīng)FGF-21的相容性相比增加FGF-21多肽與醫(yī)藥防腐劑(例如，間甲酚、苯酚、芐醇)的相容性的取代、添加或缺失。這一增加的相容性將使得能夠制備在存儲(chǔ)期間保持蛋白質(zhì)的生理化學(xué)性質(zhì)和生物活性的防腐醫(yī)藥調(diào)配物。以全文引用的方式并入本文中的WO 2005/091944論述具有增強(qiáng)的醫(yī)藥穩(wěn)定性的FGF-21突變蛋白的以下實(shí)例:用帶電和/或極性但不帶電的氨基酸取代一個(gè)以下氨基酸:WO 05/091944的SEQ ID NO:1的甘氨酸42、谷氨酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸
131、亮氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷氨酰胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170或絲氨酸172。本發(fā)明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相應(yīng)位置處的一個(gè)或一個(gè)以上所述取代，且/或可包括一個(gè)或一個(gè)以上其它取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸在以下位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置處進(jìn)行取代:甘氨酸42、谷氨酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、脯氨酸/亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷氨酰胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170、絲氨酸172 (SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2_7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸在以下位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置處進(jìn)行取代:谷氨酸91、精氨酸131、谷氨酰胺108、精氨酸77、精氨酸72、組氨酸87、亮氨酸86、精氨酸126、谷氨酸110、酪氨酸83、脯氨酸146、精氨酸135、精氨酸96、精氨酸36(SEQ ID N0:1或在SEQ ID N0:2_7中的相應(yīng)氨基酸)。
[0038] WO 05/091944描述具有增強(qiáng)的醫(yī)藥穩(wěn)定性的其它FGF-21突變蛋白。這些突變蛋白包括用半胱氨酸取代FGF-21中兩個(gè)或兩個(gè)以上的以下氨基酸(參看WO 05/091944的SEQ ID NO:1):精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷氨酰胺27、谷氨酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷氨酰胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷氨酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬酰胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139。本發(fā)明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相應(yīng)位置處的一個(gè)或一個(gè)以上所述取代，且/或可包括一個(gè)或一個(gè)以上其它取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸在以下位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置處進(jìn)行取代:精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸
25、丙氨酸26、谷氨酰胺27、谷氨酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷氨酰胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷氨酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬酰胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139 (SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO: 2-7中的相應(yīng)氨基酸)。
[0039]WO 05/091944進(jìn)一步描述除在Cys75_Cys93處天然存在的二硫鍵之外還具有工程改造過(guò)的二硫鍵的特定FGF-21突變蛋白(經(jīng)半胱氨酸取代的氨基酸)，如下:Gln76Cys-Serl09Cys, Cys75_Ser85Cys、 Cys75_Ala92Cys、 Phe73Cys_Cys93、Serl23Cys-Hisl25Cys、AspI 02Cys-TyrI 04Cys、AspI 27Cys-GIyI 32Cys、Ser94Cys_GlullOCys、 Proll5Cys_Hisll7Cys、 Asnl21Cys_Aspl27Cys、Leu100Cys_Aspl02Cys、Phe95Cys_Tyrl07Cys、Argl9CysProl38Cys、Tyr20Cys_Leul39Cys、Tyr22Cys_Leul37Cys、Arg77Cys_Asp79Cys、Pro90Cys_Ala92Cys、Glu50Cys_Lys69Cys、Thr23Cys-Asp25Cys、Ala31Cys_Gly43Cys、Gln28Cys_Gly43Cys、Thr23Cys_Gln28Cys、Val41Cys-Leu82Cys、 Leu58Cys_Val62Cys、 Gln54Cys_Leu66Cys、 Ile35Cys_Gly67Cys、Gly67Cys_Arg72Cys、Ile35Cys_Gly84Cys、Arg72Cys-Gly84Cys 或 Arg77Cys_Ala81Cys，其中編號(hào)是根據(jù)WO 05/091944的SEQ ID N0:1。其它具有工程改造過(guò)的二硫鍵的突變蛋白為 Tyr22Cys_Leul39Cys ；Asp24Cys-Argl35Cys ；Leull8Cys-Glyl32Cys ；Hisll7Cys-Prol30Cys ； HisI I 7Cys-AI a I 29Cys ； Leu82Cys-Pro 11 9Cys ；Gly80Cys-Alal29Cys ；Gly43Cys-Prol24Cys ；Gly42Cys-Argl26Cys ；Gly42Cys-Prol24Cys ；Gln28Cys-Prol24Cys ； GI n27Cys-SerI 23Cys ； AIa26Cys-LysI 22Cys ；或Asp25Cys-Lysl22Cys，其中編號(hào)是根據(jù) WO 05/091944 的 SEQ ID NO:1。其它具有工程改造過(guò)的二硫鍵的突變蛋白為L(zhǎng)eull8Cys_Alal34Cys ；Leu21Cys-Leu33Cys ；Ala26Cys-Lysl22Cys ；Leu21Cys-Leu33Cys/Leull8Cys-Alal34Cys,其中編號(hào)是根據(jù) WO05/091944的SEQ ID NO:1。本發(fā)明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相應(yīng)位置處的一個(gè)或一個(gè)以上所述取代，且/或可包括一個(gè)或一個(gè)以上其它取代、添加或缺失。本發(fā)明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相應(yīng)位置處的一個(gè)或一個(gè)以上所述取代(SEQ ID ΝΟ:1或在SEQID NO: 2-7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的FGF-21多肽可包括在SEQ IDNO: 34-36中從位置I ( 即，在N末端)之前到C末端的相應(yīng)位置處的一個(gè)或一個(gè)以上所述取代。
[0040]WO 05/091944描述聚乙二醇化的其它FGF-21突變蛋白。這些突變蛋白具有一種以下取代:D25C、D38C、L58C、K59C、P60C、K69C、D79C、H87C、E91C、E101C、D102C、L114C、L116C、K122C、R126C、P130C、P133C、P140C。本發(fā)明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相應(yīng)位置處的一個(gè)或一個(gè)以上所述取代，且/或可包括一個(gè)或一個(gè)以上其它取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸在以下位置中的一個(gè)或一個(gè)以上位置處進(jìn)行取代:25、38、58、59、60、69、79、87、91、101、102、114、116、122、126、130、133、140(SEQ IDN0:1或在SEQ ID NO:2-7中的相應(yīng)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的FGF-21多肽可包括在SEQ ID NO: 34-36中從位置I (B卩，在N末端)之前到C末端的相應(yīng)位置處的一個(gè)或一個(gè)以上所述取代。
[0041]WO 05/091944描述在以下位置處的半胱氨酸取代:19、21、26、28、29、30、36、39、42、50、56、61、64、65、68、70、71、77、81、85、86、90、92、94、98、107、108、112、113、123 和 124。WO 05/091944說(shuō)明在以下位置處的半胱氨酸取代:24、27、37、40、44、46、49、57、88、89、106、110、111、115、120和139? WO 05/091944也描述在以下位置處的半胱氨酸取代:18、45、47、48、78、83、99、103、125、128、131、132 和 138。WO 05/091944 也描述在以下位置處的半胱氨酸取代:25、38、58、59、60、69、79、87、91、101、102、114、116、122、126、130、133 和 140。
[0042]在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上工程改造過(guò)的鍵是由一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸產(chǎn)生。分子內(nèi)的鍵可以多種方式產(chǎn)生，包括(但不限于)蛋白質(zhì)中兩個(gè)氨基酸(一個(gè)或兩個(gè)氨基酸可能為非天然氨基酸)在合適條件下的反應(yīng)；兩個(gè)氨基酸(其各自可能為天然編碼或非天然編碼)與連接子、聚合物或其它分子在合適條件下的反應(yīng)等。
[0043]在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽中的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸可經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽中的氨基酸可經(jīng)天然存在或非天然存在氨基酸取代，條件是至少一個(gè)經(jīng)非天然編碼氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)GF-21多肽中的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸可經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一個(gè)經(jīng)非天然編碼氨基酸取代。
[0044]在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基服基、置氣基或炔基。
[0045]在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu):
[0046]

【權(quán)利要求】
1.一種經(jīng)修飾人類 FGF-21 多肽，其包含 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6 或 SEQ ID NO:7 的多肽序列，且在 SEQ ID NO:1 的 108位置處或 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 或 SEQ IDNO:7的相應(yīng)位置處以一個(gè)非天然編碼氨基酸進(jìn)行取代，其中所述非天然編碼氨基酸與一個(gè)聚合物連接，所述聚合物包含聚乙二醇；所述經(jīng)修飾人類FGF-21多肽具有至少一種FGF-21的生物活性，且所述非天然編碼氨基酸選自對(duì)位取代的苯丙氨酸、鄰位取代的苯丙氨酸和間位取代的苯丙氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氣氧基、餅基、酸餅基、氣基服基、置氣基、炔基或?qū)χ脷饣奖麣馑帷?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含對(duì)乙酰基苯丙氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中所述聚乙二醇具有介于0.1kDa與10kDa之間的平均分子量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中所述聚乙二醇具有30kDa的平均分子量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中所述聚乙二醇是分枝或多臂的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中所述經(jīng)修飾人類FGF-21多肽所具有的活體內(nèi)半衰期，較未包含有所述非天然編碼氨基酸以及所述聚合物的相應(yīng)人類FGF-21多肽為高。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中所述經(jīng)修飾人類FGF-21多肽所具有的血清半衰期，為未包含有所述非天然編碼氨基酸以及所述聚合物的相應(yīng)人類FGF-21多肽的血清半衰期的至少五倍。
9.一種經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其包含SEQ ID NO:1的多肽序列，且在SEQ ID NO:1的108位置處以一個(gè)非天然編碼氨基酸進(jìn)行取代，其中所述非天然編碼氨基酸與一個(gè)聚合物連接，所述聚合物包含聚乙二醇；所述經(jīng)修飾人類FGF-21多肽具有至少一種FGF-21的生物活性，所述非天然編碼氨基酸包含對(duì)乙?；奖彼?，且所述聚乙二醇具有30kDa的平均分子量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中所述聚合物與所述多肽是以肟鍵連接，所述肟鍵是由所述對(duì)乙?；奖彼崤c一個(gè)和所述聚合物相連接的氨氧基經(jīng)反應(yīng)而形成。
11.一種組合物，其包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑和根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述的組合物更包含第二藥劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述的第二藥劑是選自于由下列所組成之群組:雙胍類、噻唑烷二酮、磺酰脲類、苯甲酸衍生物、葡糖苷酶抑制劑和前述物質(zhì)的混合物。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求11所述組合物的用途，用于制造供用于治療經(jīng)投與FGF-21可加以治療或預(yù)防的病狀的治療方案中的藥劑，其中所述藥劑包含所述組合物的預(yù)防或治療有效量。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述治療方案包括投與所述組合物以及投與包含附加藥物的第二藥劑，其中所述投與可同時(shí)或分別進(jìn)行，可依照任一次序投與。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其中所述附加藥物是選自于由下列所組成之群組:雙胍類、噻唑烷二酮、磺酰脲類、苯甲酸衍生物、葡糖苷酶抑制劑和前述物質(zhì)的混合物。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求11所述組合物的用途，用于制造供用于經(jīng)由增加脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取而增加葡萄糖利用或治療、預(yù)防或緩解以下病狀的治療方案中的藥劑:2型糖尿病、肥胖癥、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、代謝綜合癥或前述病癥的組合；其中所述藥劑包含所述組合物的預(yù)防或治療有效量。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中所述治療方案包括投與所述組合物以及投與包含附加藥物的第二藥劑，其中所述投與可同時(shí)或分別進(jìn)行，可依照任一次序投與。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中所述附加藥物是選自于由下列所組成之群組:雙胍類、噻唑烷二酮、磺酰脲類、苯甲酸衍生物、葡糖苷酶抑制劑和前述物質(zhì)的混合物。
20.一種核酸，其包含編碼SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的多肽的序列，且所述核酸包含一個(gè)選擇密碼子，所述選擇密碼子編碼在下列位置處進(jìn)行取代的一個(gè)非天然編碼氨基酸:所述SEQ ID NO:1的108 位置處或所述 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6 或SEQ ID NO: 7的相應(yīng)位置處；其中所述核酸在當(dāng)存在有正交RNA的情況下進(jìn)行表達(dá)時(shí)，允許可產(chǎn)生包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7的多肽序列的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中在所述SEQ ID NO:1的108 位置處或所述 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6 或SEQ ID NO:7的相應(yīng)位置處是以選自對(duì)位取代的苯丙氨酸、鄰位取代的苯丙氨酸和間位取代的苯丙氨酸的非天然編碼氨基酸進(jìn)行取代。
21.—種分離細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求20所述的核酸，其中所述細(xì)胞包含正交tRNA合成酶。
22.—種產(chǎn)生經(jīng)修飾人類FGF-21多肽的方法，所述方法包括:于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)包含根據(jù)權(quán)利要求20所述核酸的分離細(xì)胞，所述細(xì)胞更包含有正交RNA合成酶和正交tRNA;其中當(dāng)所述核酸在所述細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，即可產(chǎn)生包含SEQ ID NO: K SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7 的多肽序列的經(jīng)修飾人類FGF-21多肽，其中在SEQ ID NO:1的108位置處或SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的相應(yīng)位置處以一個(gè)非天然編碼氨基酸進(jìn)行取代，且所述非天然編碼氨基酸選自對(duì)位取代的苯丙氨酸、鄰位取代的苯丙氨酸和間位取代的苯丙氨酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，所述方法更包括:使所述經(jīng)修飾人類FGF-21多肽和具有可與所述非天然編碼氨基酸反應(yīng)的聚乙二醇的聚合物接觸反應(yīng)，藉以將所述經(jīng)修飾人類FGF-21多肽連接至所述具有聚乙二醇的聚合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含對(duì)乙?；奖彼?。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述聚合物與所述多肽是以肟鍵連接，所述肟鍵是由所述對(duì)乙?；奖彼崤c一個(gè)和所述聚合物相連接的氨氧基經(jīng)反應(yīng)而形成。
26.一種經(jīng)修飾人類 FGF-21 多肽，其包含 SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6或SEQ ID NO:7的多肽序列，且在以下殘基位置處以一個(gè)非天然編碼氨基酸進(jìn)行取代:SEQ ID勵(lì):1的72、77、86、87、91、104、108、110、126、.131、146 位置處或 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6 或SEQ ID N0:7的相應(yīng)位置處，且 i)其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu):
其中R為并非存在于20種常見氨基酸或吡咯賴氨酸或硒代半胱氨酸中的側(cè)鏈的取代基，且其中所述非天然編碼氨基酸是在選自由以下殘基組成的群組的位置處經(jīng)取代:SEQID NO:1 的 72、77、86、87、91、104、108、110、126、131、146 位置處或另一人類 FGF-21 多肽中的相應(yīng)氨基酸位置； ?)其中所述非天然編碼氨基酸為苯丙氨酸衍生物；或 iii)其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu):
其中R為并非存在于20種常見氨基酸或吡咯賴氨酸或硒代半胱氨酸中的側(cè)鏈的取代基，其中所述多肽包括有與 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID N0:6 或 SEQ ID N0:7 具有 95 致性的序列。
【文檔編號(hào)】C07K14/50GK104163864SQ201410360138
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2008年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2007年3月30日
【發(fā)明者】湯姆士·P.·庫(kù)杰克, 羅伯托·馬利安, 安娜瑪莉亞·A.·海斯·蒲楠, 威廉·M.·基夫, 尼克·克努森, 何莉蓮, 杰森·品克史塔夫, 瓦迪姆·克賴諾夫 申請(qǐng)人:Ambrx公司