促進(jìn)皮膚再生的小分子的制作方法
【專利說明】促進(jìn)皮膚再生的小分子
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請根據(jù)35U.S.C.§ 119 (e)要求2013年I月9日提交的美國序列號61/750,714的優(yōu)先權(quán)，所述專利的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0003]發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明大體涉及皮膚再生和創(chuàng)傷愈合，并且更具體地說涉及皮膚人成纖維細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)產(chǎn)生增加的小分子介導(dǎo)的誘導(dǎo)。
[0005]背景信息
[0006]皮膚是脊椎動物身體的最大器官，其由具有復(fù)雜神經(jīng)和血液供給的表皮和真皮所構(gòu)成。第三層為皮下組織，其主要由脂肪和一層疏松結(jié)締組織構(gòu)成。這三個(gè)層起到保護(hù)身體免于任何機(jī)械損傷如創(chuàng)傷的重要作用。
[0007]真皮位于表皮正下方，構(gòu)成皮膚的主體并且由膠原蛋白與一些彈性蛋白和糖胺聚糖(GAG)構(gòu)成。真皮中存在的主要細(xì)胞類型為成纖維細(xì)胞，所述成纖維細(xì)胞能夠產(chǎn)生重塑酶，如蛋白酶和膠原蛋白酶，這些酶在創(chuàng)傷愈合過程中起到重要作用。
[0008]創(chuàng)傷愈合為一個(gè)連續(xù)機(jī)制，并且其更具體而言為一種事件驅(qū)動過程，籍此來自一個(gè)細(xì)胞類型的信號在其它細(xì)胞類型中引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，所述級聯(lián)反應(yīng)推進(jìn)所述創(chuàng)傷進(jìn)入愈合階段。成人創(chuàng)傷愈合本質(zhì)上為修復(fù)過程，其通常表現(xiàn)出疤痕。組織修復(fù)一開始是受傷部位處的血纖維蛋白凝塊沉積，從而阻止受損血管出血。循環(huán)的血小板隨后聚集在受傷部位，并且釋放各種炎性介體，如H)GF、TGF-a和TGF-β、表皮生長因子(EGF)和FGF。還認(rèn)為這些分子在創(chuàng)傷修復(fù)過程的下游起重要作用。
[0009]成人組織對創(chuàng)傷的炎性反應(yīng)的特征在于早期流入嗜中性粒細(xì)胞，所述嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量穩(wěn)定增加并且在創(chuàng)傷后24 - 48小時(shí)達(dá)到最大。隨著嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量開始減少，巨噬細(xì)胞接替并再填充創(chuàng)傷部位。同時(shí)還發(fā)生上皮再形成，并且角質(zhì)細(xì)胞從真皮和傷口邊緣的基底細(xì)胞內(nèi)部深處迀移穿過肉芽組織。一旦角質(zhì)細(xì)胞重新建立皮膚的阻透性，它們就在接觸抑制時(shí)恢復(fù)基底細(xì)胞表型，并且分化成分層鱗狀角質(zhì)化表皮。
[0010]炎性反應(yīng)和上皮形成的最后階段與成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的迀移以及肉芽組織的形成重合。隨后發(fā)生血管生成和纖維增生，并且成纖維細(xì)胞變成主導(dǎo)細(xì)胞類型，產(chǎn)生膠原蛋白和ECM。使用由成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶進(jìn)行膠原蛋白的重塑。
[0011]皮膚成纖維細(xì)胞需要極高濃度的成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)以便進(jìn)行細(xì)胞復(fù)制并負(fù)責(zé)生成ECM，所述ECM將表皮的分層鱗狀上皮細(xì)胞組織成統(tǒng)一組織。此外，皮膚成纖維細(xì)胞生成結(jié)締組織的長纖維帶，所述長纖維帶將皮膚錨固至身體的筋膜。無皮膚成纖維細(xì)胞的情況下，創(chuàng)傷部位不能再生細(xì)胞外基質(zhì)，并且表皮皮膚細(xì)胞不能在創(chuàng)傷部位上增殖。因此，無皮膚成纖維細(xì)胞的情況下，皮膚不能從受傷中恰當(dāng)恢復(fù)。
[0012]對人而言，皮膚占體重的約十分之一，并且對所述主要器官的一部分的損傷(如創(chuàng)傷、疾病、燒傷或手術(shù))具有嚴(yán)重后果。將組織工程改造皮膚替代品用于防治急性和慢性皮膚創(chuàng)傷。組織工程改造旨在再生新生物材料以用于替換患病或受損的組織或器官。為了實(shí)現(xiàn)此目的，不僅需要細(xì)胞源，而且還需要可對細(xì)胞進(jìn)行支撐的人工細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。
[0013]已研宄將諸如膠原蛋白和纖連蛋白之類的天然生物聚合物用作細(xì)胞可附接的潛在生物材料來源。組織工程改造中所用的第一代可降解聚合物來自其它外科用途，并且在機(jī)械和降解性質(zhì)方面存在缺點(diǎn)。這已導(dǎo)致開發(fā)合成可降解凝膠來主要用作原位遞送細(xì)胞和/或分子的方式，即所謂智能基質(zhì)技術(shù)。組織或器官修復(fù)通常伴有導(dǎo)致產(chǎn)生疤痕的纖維化反應(yīng)。然而，某些哺乳動物組織具有完全再生而無疤痕產(chǎn)生的能力；較佳例子包括MRL/MpJ小鼠的胚胎或胎兒皮膚和耳部。這些模型系統(tǒng)的研宄表明，為了實(shí)現(xiàn)這種完全再生，需改變炎性反應(yīng)以使得纖維化和疤痕化的程度減弱。
[0014]皮膚成纖維細(xì)胞為在ECM沉積、上皮-間質(zhì)相互作用和創(chuàng)傷愈合中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞的動態(tài)群體。成纖維細(xì)胞易于在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，并且向組織工程改造皮膚替代品中摻入成纖維細(xì)胞已產(chǎn)生令人鼓舞的結(jié)果，包括癥狀性疼痛緩解、急性和慢性創(chuàng)傷的更快速愈合、更少疤痕形成以及更好的美容效果。然而，目前不存在完全復(fù)制未受傷皮膚的解剖學(xué)、生理學(xué)、生物穩(wěn)定性或美觀性質(zhì)的生物工程改造皮膚。
[0015]各種組織工程改造皮膚產(chǎn)品需要在多中心臨床試驗(yàn)中進(jìn)行比較，因?yàn)檫@將允許識別用于具體臨床應(yīng)用的特定產(chǎn)品。這可能潛在地導(dǎo)致在增加使用所述特定產(chǎn)品之后產(chǎn)品成本下降。另外，組織工程改造皮膚替代品與細(xì)胞因子和生長因子的組合未來可能用于增強(qiáng)創(chuàng)傷愈合以及提供摻入防衛(wèi)素以用于抗微生物效益的可能性。因此需要新穎的方法來生成皮膚替代物，所述方法的材料技術(shù)不僅基于智能設(shè)計(jì)，而且還基于涉及再生過程的分子。
[0016]發(fā)明概述
[0017]本發(fā)明是基于某些小分子誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和/或增加蛋白質(zhì)產(chǎn)生的重大發(fā)現(xiàn)。
[0018]本文提供一種誘導(dǎo)受試者的成纖維細(xì)胞增殖的方法。所述方法包括將有效量的誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖的小分子施用于受試者。在某些方面中，小分子為SL 327、ABT 702、非諾班(fenobam)、SX 011、毒扁豆喊半硫酸鹽(physostigimine hemisulfate)或 NBQX。
[0019]本文還提供一種增加受試者的蛋白質(zhì)分泌的方法。所述方法包括將有效量的增加蛋白質(zhì)分泌的小分子施用于受試者。
[0020]在某些方面，生長因子為EGF、FGF7/KGF、TGFI3或膠原蛋白I。在其它方面中，所述小分子為 CY 208-243、CD 439、T 0156 鹽酸鹽、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY294002鹽酸鹽、KB-R7943甲磺酸鹽、proxyfan草酸鹽、m_3M3FBS、雙嘧達(dá)莫、甲基牛扁亭檸檬酸鹽、WIN 64338、克立馬丁延胡索酸鹽或西洛他唑。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為EGF，并且小分子選自由CY208-243、CD 439、T 0156鹽酸鹽、⑶1530和PSB 06126組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為FGF7/KGF，并且小分子為前列腺素E2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為TGFI3并且小分子選自由LY294002鹽酸鹽、KB-R7943甲磺酸鹽、proxyfan草酸鹽和m_3M3FBS組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為膠原蛋白I并且小分子選自由雙嘧達(dá)莫、甲基牛扁亭檸檬酸鹽、WIN 64338、克立馬丁延胡索酸鹽和西洛他唑組成的組。
[0022]本文提供一種促進(jìn)皮膚再生的方法。所述方法包括將有效量的誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖或增加蛋白質(zhì)分泌的化合物施用于受試者。在某些方面，蛋白質(zhì)為EGF、FGF7/KGF、TGF β或膠原蛋白I。在某些方面，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖的小分子為SL 327, ABT 702、非諾班、SX011、毒扁豆堿半硫酸鹽或NBQX。在其它方面中，增加蛋白質(zhì)分泌的小分子為CY 208-243、CD 439、T 0156 鹽酸鹽、CD 1530、PSB 06126、前列腺素 E2、LY 294002 鹽酸鹽、KB-R7943 甲磺酸鹽、proxyfan草酸鹽、m_3M3FBS、雙嘧達(dá)莫、甲基牛扁亭檸檬酸鹽、WIN 64338、克立馬丁延胡索酸鹽或西洛他唑。
[0023]在某些實(shí)施方案中，受試者為人。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞處于體外細(xì)胞培養(yǎng)物中。這種細(xì)胞包括人皮膚成纖維細(xì)胞(hDF)。
[0024]附圖簡述
[0025]圖1為高通量皮膚成纖維細(xì)胞測定篩選的示意圖。
[0026]圖2為誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖的小分子隨劑量改變的圖示。
[0027]圖3為誘導(dǎo)EGF表達(dá)的小分子隨劑量改變的圖示。
[0028]圖4為誘導(dǎo)FGF7/KGF表達(dá)的小分子隨劑量改變的圖示。
[0029]圖5為誘導(dǎo)TGF β表達(dá)的小分子隨劑量改變的圖示。
[0030]圖6為誘導(dǎo)膠原蛋白I表達(dá)的小分子隨劑量改變的圖示。
[0031]圖7圖解示出誘導(dǎo)的彈性蛋白表達(dá)。
[0032]圖8為細(xì)胞毒性隨二甲基亞砜改變的圖示。
[0033]圖9為代表隨DMS0、視黃醇和小分子CGP71683改變的相對彈性蛋白表達(dá)的柱狀圖。
[0034]圖10為代表隨DMS0、視黃醇和小分子CGP71683改變的相對膠原蛋白Ia表達(dá)的柱狀圖。
[0035]發(fā)明詳述
[0036]皮膚成纖維細(xì)胞為負(fù)責(zé)產(chǎn)生膠原蛋白的皮膚細(xì)胞，其有助于形成促進(jìn)皮膚屏障完整性和創(chuàng)傷愈合的結(jié)締組織纖維和生長因子。在正常創(chuàng)傷愈合中，成纖維細(xì)胞從周圍完整組織中募集到肉芽組織中，以響應(yīng)于創(chuàng)傷流體(wound fluid)中存在的各種因子而增殖并再生新皮膚層。在正常老化期間，皮膚成纖維細(xì)胞喪失增殖能力，以及分泌正常創(chuàng)傷愈合中所涉及到的生長因子(例如EGF、FGF7/KGF、TGFf3、膠原蛋白)的能力。本文描述一種高通量篩選，其設(shè)計(jì)來識別促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和增加蛋白質(zhì)(例如EGF、FGF7/KGF、TGF β、膠原蛋白)分泌的小分子。
[0037]生長因子為能夠刺激細(xì)胞生長、增殖和細(xì)胞分化的天然存在的物質(zhì)。生長因子對調(diào)控各種細(xì)胞過程十分重要。生長因子通常充當(dāng)細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)分子。實(shí)例為細(xì)胞因子和激素，其結(jié)合至在其靶細(xì)胞的表面上的特異性受體。它們往往促進(jìn)細(xì)胞分化和成熟，這在生長因子之間有所不同。例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenic protein)刺激骨細(xì)胞分化，而成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子刺激血管分化(血管生成)。生長因子和生長因子家族的實(shí)例包括但不限于:腎上腺髓質(zhì)素(AM)、促血管生成素(Ang)、自分泌運(yùn)動因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、皮膚生長因子(EGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、生長分化因子9(GDF9)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、肝癌源性生長因子(HDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、促移行因子、肌肉生長抑制素(Myostatin)(⑶F_8)、神經(jīng)生長因子(NGF)和其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、血小板衍生生長因子(roGF)、血小板生成素(TPO)、轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、Wnt信號傳導(dǎo)通路、胎盤生長因子(PlGF)、胎牛生長激素(FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、bFGF 和 VEGF。
[0038]成纖維細(xì)胞分泌可溶性因子，所述可溶性因子擴(kuò)散至上覆表皮并以旁分泌方式影響角質(zhì)細(xì)胞，并且釋放具有自分泌和旁分泌效應(yīng)的細(xì)胞因子和生長因子。自分泌活動包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-e誘導(dǎo)的促進(jìn)膠原蛋白合成和成纖維細(xì)胞增殖的結(jié)締組織生長因子的合成和分泌。旁分泌活動影響角質(zhì)細(xì)胞生長和分化，具體而言，通過成纖維細(xì)胞分泌角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素(IL)-6和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-1O來影響。作為響應(yīng)，角質(zhì)細(xì)胞合成IL-1和甲狀旁