專利名稱：一種免疫類毒素的制備方法
技術領域：
[O本發(fā)明涉及一種藥品原料的制備方法，尤其是ー種免疫類毒素的制備方法。
背景技術：
一種致病性細菌所產(chǎn)生的特異性毒性物質(zhì)ー細菌毒素經(jīng)脫毒處理而保留免疫原性稱之為類毒素。類毒素是ー種自動免疫制劑，用于細菌毒素性疾病的預防及治療?，F(xiàn)常用生產(chǎn)類毒素的方法是選擇培養(yǎng)基和菌種，菌種經(jīng)人工培養(yǎng)后產(chǎn)生毒素，毒素脫毒后形成類毒素。目前，非常成熟的類毒素有破傷風類毒素、白喉類毒素、霍亂類毒素
寸ア ΡΠ οCN101869704A公開了單劑免疫破傷風類毒素陽離子葡聚糖微球及其制備方法，其特特征是由破傷風類毒素通過靜電作用后栽在陽離子甲基丙烯酸羥こ酯葡聚糖微球上制·得。ZL87104279公開了類毒素制備新方法，包括用一定量氧化劑處理至少部分分離的毒素，以對所說毒素進行化學滅活，但同時保留其免疫性，此后從中獲得滅活的毒素。CN1798548公開了基于含吸附類毒素和含多糖抗原微粒體的免疫原性組合物，該發(fā)明是將類毒素抗原或含多糖的抗原吸附在微粒體上形成免疫原性組合物。蟾蜍是ー種兩棲動物，生存環(huán)境是陰濕、細菌病毒滋生的區(qū)域，蟾蜍生命力極強，抗性應答產(chǎn)生大量的毒素以抵抗外界細菌、病毒的侵蝕。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)有的類毒素生產(chǎn)采用菌種和培養(yǎng)基為主要生產(chǎn)原料，菌種經(jīng)人工培養(yǎng)后產(chǎn)生毒素，毒素脫菌后形成類毒素，因此菌種及培養(yǎng)基篩選的局限性，培養(yǎng)過程的長周期性都影響類毒素的產(chǎn)量和質(zhì)量。針對現(xiàn)有類毒素培養(yǎng)方法存在的問題，本發(fā)明提供ー種以中藥材蟾蜍或蟾蜍干皮為原料的免疫類毒素的制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的(1)以蟾蜍的鮮品或干品為原料，破碎或粉碎；
(2)然后加入純凈水攪拌均勻，固液比為lkg:2 30L，加入O.I IOOg胰蛋白酶，在25 50°C酶解4 48h ；
(3)用分離機以3000 15000r/min分離上述酶解物，收集的液體用緩沖液調(diào)pH=7. O 9. 0，控制溫度為25 45°C，加I IOOg戊ニ醛或甲醛脫毒處理30 60d，成為免疫脫毒液粗品；
(4)將Ikg免疫脫毒液粗品加入氨水調(diào)pH=8 10，再加入100 300g硫酸銨及10 500g活性白土，常溫條件下生成沉淀并放置I 24h ;
(5)上述物料用膜孔徑O.2 10 μ m微孔過濾機過濾并且用膜孔徑8 120nm超濾機超濾處理，收集超濾液；(6)收集的超濾液注入到分離柱中，在壓カO.2 5Mpa、流速10 500mL/min條件下分離純化得免疫類毒素；
(7)分離純化的免疫類毒素用氫氧化招溶液或磷酸 丐溶液吸附，常溫條件吸附時間12 24h，成為穩(wěn)定性免疫類毒素。本發(fā)明的免疫類毒素是以中藥材蟾蜍或蟾蜍干皮為原料制備的ー種類毒素，采用蟾蜍為基本原料生產(chǎn)類毒素，解決了菌種及培養(yǎng)基篩選的局限性問題而且沒有培養(yǎng)過程，由于各種蟾蜍的毒素成分清楚，其エ藝簡單實用，成本低，因此本發(fā)明脫毒過程易于控制能保證類毒素的生物活性。為中藥材蟾蜍的應用提供了更加廣泛的途徑。


圖I為膨脹溶劑體系提取裝置的結(jié)構示意圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式按照下述方法制備免疫類毒素1、以中華大蟾蜍或黑眶大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍的鮮品或干品為原料經(jīng)破碎或粉碎；2、用化學緩沖溶液在一定溫度、時間、壓カ條件下提?。?、分離機固液分離；4、酸沉法或有機溶劑法或變溫法去蛋白；5、化學法或物理法滅活；6、微濾過濾及超濾法濃縮；7、凝膠色譜層析分離并用超聲駐波液相制備色譜純化；8、穩(wěn)定化處理；9、將免疫類毒素作為活性成分并與適宜的賦形劑相結(jié)合制備成藥品用于調(diào)節(jié)人體機能免疫功能。具體方法如下
(1)選用中華大蟾蜍或黑眶大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍的干品用粉碎機粉碎至過100 150目篩，收集粉末；
(2)將IOOOg粉末放入微波爐中以功率1000 2500W，加熱I 20min殺菌處理，然后自然冷卻至室溫；
(3)上述冷卻至室溫的粉狀物加入2 20L純凈水混合均勻后，加入O.I 50g胰蛋白酶，保持溫度25 50°C，酶解4 48h ;
(4)用分離機以3000 15000r/min分離上述酶解物，收集的液體用O.2mol/L磷酸氫ニ鈉與O. lmol/L檸檬酸組成的緩沖液調(diào)pH=7. O 9. 0，控制溫度為35 45°C，加I IOOg戊ニ醛脫毒處理30 60d，成為免疫脫毒液粗品；
(5)將Ikg免疫脫毒液粗品加入氨水調(diào)pH=8 10，再加入100 300g硫酸銨及10 200g活性白土，常溫條件下生成沉淀并放置I 24h ;
(6)上述物料用膜孔徑O.2 10 μ m微孔過濾機過濾并且用膜孔徑8 120nm超濾機超濾處理，收集超濾液；
(7)收集的超濾液注入到SephadexG75或SephadexGlOO分離柱中，在壓カ2 5Mpa、流速10 500mL/min條件下分離純化得免疫類毒素；
(8)分離純化的免疫類毒素用I 15mg/mL氫氧化招溶液或I 10mg/mL磷酸|丐溶液吸附，常溫條件吸附時間12 24h，成為穩(wěn)定性免疫類毒素。(9)將免疫類毒素作為活性成分，并與適宜的賦形劑相結(jié)合制備成藥品用于調(diào)節(jié)人體機能免疫功能。
具體實施方式
ニ 本實施方式按照下述方法制備免疫類毒素(1)選用2 4齡中華大蟾蜍或黑框大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍，在溫度-10 _30°C冷凍，用絞肉機絞碎再用磨漿機磨成漿；
(2)在膨脹溶劑體系提取裝置中，Ikg漿體加入2 20kg甲醇或こ醇或こ酸こ酷，充入10 50kg ニ氧化碳,加壓至O. 2 IOMpa,常溫條件下保持時間30 120min,然后降壓至
常壓；
(3)用分離機以3000 15000r/min分離上述物料,收集固形物；
(4)lkg固形物加入10 30L純凈水攪拌均勻，加入I IOOg胰蛋白酶，在25 50°C酶解5 48h ;
(5)用分離機以3000 15000r/min分離上述酶解物，收集漿液， 用O.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液調(diào)整pH=7. O 7. 6，控制溫度25 45°C，加10 IOOg甲醛脫毒30 60天,成為免疫類毒素粗品；
(6)將Ikg免疫類毒素粗品加入氨水調(diào)整pH=8 9，再加入200 300g硫酸銨及10 500g活性白土，常溫條件下沉淀并放6 24h ;
(7)上述物料用膜孔徑O.2 10 μ m微濾機過濾并且用膜孔徑8 120nm超濾機超濾處理；
(8)將超濾液注入到SephadexG75或SephadexG150分離柱中，在壓カO.2 I. OMpa>流速100 500mL/min條件下分離純化成免疫類毒素；
(9)將純化免疫類毒素用I 10g/L氫氧化招溶液或I 50g/L磷酸韓溶液吸附,常溫條件下吸附12 24h成穩(wěn)定性免疫類毒素。如圖I所示，本實施方式中所述膨脹溶劑體系提取裝置由球形膨脹溶劑體系提取器I、原料罐2、固液分離器3、氣固分離器4、成品罐5、外源ニ氧化碳瓶6、ニ氧化碳儲罐7、ニ氧化碳循環(huán)壓カ泵8和溶劑罐9組成，球形膨脹溶劑體系提取器I通過管線分別與原料罐2、固液分離器3、ニ氧化碳循環(huán)壓カ泵8及溶劑罐9相連接，固液分離器3與氣固分離器4相連接，氣固分離器4通過管線分別與成品罐5及ニ氧化碳儲罐7相連接，ニ氧化碳儲罐7通過管線分別與外源ニ氧化碳瓶6及ニ氧化碳循環(huán)壓カ泵8連接。免疫調(diào)節(jié)作用實驗
(I)選用BALB/C近親系小鼠，6 8周齡，18 22g,雌性小鼠40只，雄性小鼠40只，經(jīng)ロ服15 30天。其中O組為對照組，不喂免疫類毒素，I組每日服用O. 2g，II組每日服用O. 6g, III組姆日服用I. 2g。(2)細胞免疫功能檢測 ①淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗
MTT法原理MTT是四氮唑鹽的一種可以接受氫原子的染料，當T淋巴細胞受伴刀豆蛋白刺激后發(fā)生母細胞轉(zhuǎn)化，活細胞特別是増殖細胞線粒體中的水解酶在細胞體內(nèi)可以將MTT分解為藍紫色的結(jié)晶而顯色，其光密度值能夠反映細胞的増殖情況。死亡細胞則無此功倉^:。用加伴刀豆蛋白孔的光密度值減去不加伴刀豆蛋白孔的光密度值代表淋巴細胞的増殖能力。受試物組的光密度值的測定結(jié)果均低于對照組的光密度值。 實驗結(jié)果表明，三組實驗小鼠服用免疫類毒素后T淋巴細胞均有不同的増殖反應(表 1)。表權利要求
1.ー種免疫類毒素的制備方法，其特征在于所述方法如下 (1)以蟾蜍的鮮品或干品為原料，破碎或粉碎； (2)然后加入純凈水攪拌均勻，固液比為Ikg2 30L，加入O. I IOOg胰蛋白酶，在25 50°C酶解4 48h ; (3)用分離機以3000 15000r/min分離上述酶解物，收集的液體用緩沖液調(diào)pH=7. O 9. 0，控制溫度為25 45°C，加I IOOg戊ニ醛或甲醛脫毒處理30 60d，成為免疫脫毒液粗品； (4)將Ikg免疫脫毒液粗品加入氨水調(diào)pH=8 10，再加入100 300g硫酸銨及10 500g活性白土，常溫條件下生成沉淀并放置I 24h ; (5)上述物料用膜孔徑O.2 10 μ m微孔過濾機過濾并且用膜孔徑8 120nm超濾機超濾處理，收集超濾液； (6)收集的超濾液注入到分離柱中，在壓カO.2 5Mpa、流速10 500mL/min條件下分離純化得免疫類毒素； (7)分離純化的免疫類毒素用氫氧化招溶液或磷酸 丐溶液吸附，常溫條件吸附時間12 24h，成為穩(wěn)定性免疫類毒素。
2.根據(jù)權利要求I所述的免疫類毒素的制備方法，其特征在于所述蟾蜍為中華大蟾蜍、黑眶大蟾蜍、花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的免疫類毒素的制備方法，其特征在于所述蟾蜍為2 4齡。
4.根據(jù)權利要求I所述的免疫類毒素的制備方法，其特征在于所述緩沖液由O.2mol/L磷酸氫ニ鈉與O. lmol/L檸檬酸組成。
5.根據(jù)權利要求I所述的免疫類毒素的制備方法，其特征在于所述緩沖液由O.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4 組成。
6.根據(jù)權利要求I所述的免疫類毒素的制備方法，其特征在于所述分離柱為SephadexG75、SephadexGlOO 或 SephadexG150。
7.根據(jù)權利要求I所述的免疫類毒素的制備方法，其特征在于所述制備方法具體步驟如下 (1)選用中華大蟾蜍或黑眶大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍的干品用粉碎機粉碎至過100 150目篩，收集粉末； (2)將IOOOg粉末放入微波爐中以功率1000 2500W，加熱I 20min殺菌處理，然后自然冷卻至室溫； (3)上述冷卻至室溫的粉狀物加入2 20L純凈水混合均勻后，加入O.I 50g胰蛋白酶，保持溫度25 50°C，酶解4 48h ; (4)用分離機以3000 15000r/min分離上述酶解物，收集的液體用O.2mol/L磷酸氫ニ鈉與O. lmol/L檸檬酸組成的緩沖液調(diào)pH=7. O 9. 0，控制溫度為35 45°C，加I IOOg戊ニ醛脫毒處理30 60d，成為免疫脫毒液粗品； (5)將Ikg免疫脫毒液粗品加入氨水調(diào)pH=8 10，再加入100 300g硫酸銨及10 200g活性白土，常溫條件下生成沉淀并放置I 24h ; (6)上述物料用膜孔徑O.2 10 μ m微孔過濾機過濾并且用膜孔徑8 120nm超濾機超濾處理，收集超濾液； (7)收集的超濾液注入到SephadexG75或SephadexGlOO分離柱中，在壓カ2 5Mpa、流速10 500mL/min條件下分離純化得免疫類毒素； (8)分離純化的免疫類毒素用I 15mg/mL氫氧化招溶液或I 10mg/mL磷酸|丐溶液吸附，常溫條件吸附時間12 24h，成為穩(wěn)定性免疫類毒素。
8.根據(jù)權利要求I所述的免疫類毒素的制備方法，其特征在于所述方法具體步驟如下 Cl)選用2 4齡中華大蟾蜍或黑框大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍，在溫度-10 _30°C冷凍，用絞肉機絞碎再用磨漿機磨成漿； (2)在膨脹溶劑體系提取裝置中，Ikg漿體加入2 20kg甲醇或こ醇或こ酸こ酷，充入10 50kg ニ氧化碳,加壓至O. 2 IOMpa,常溫條件下保持時間30 .120min,然后降壓至常壓； (3)用分離機以3000 15000r/min分離上述物料,收集固形物； (4)lkg固形物加入10 30L純凈水攪拌均勻，加入I IOOg胰蛋白酶，在25 50°C酶解5 48h ; (5)用分離機以3000 15000r/min分離上述酶解物，收集漿液，用O.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液調(diào)整pH=7. O 7. 6，控制溫度25 45°C，加10 IOOg甲醛脫毒30 60天,成為免疫類毒素粗品； (6)將Ikg免疫類毒素粗品加入氨水調(diào)整pH=8 9，再加入200 300g硫酸銨及10 500g活性白土，常溫條件下沉淀并放6 24h ; (7)上述物料用膜孔徑O.2 10 μ m微濾機過濾并且用膜孔徑8 120nm超濾機超濾處理； (8)將超濾液注入到SephadexG75或SephadexG150分離柱中，在壓カO.2 I. OMpa>流速100 500mL/min條件下分離純化成免疫類毒素； (9)將純化免疫類毒素用I 10g/L氫氧化招溶液或I 50g/L磷酸韓溶液吸附,常溫條件下吸附12 24h成穩(wěn)定性免疫類毒素。
全文摘要
一種免疫類毒素的制備方法，涉及一種藥品原料的制備方法。本發(fā)明按照下述方法制備(1)以蟾蜍的鮮品或干品為原料，破碎或粉碎；(2)酶解；(3)脫毒；(4)加入硫酸銨及活性白土，沉淀；(5)微濾和超濾；(6)純化；(7)穩(wěn)定性化處理。本發(fā)明的免疫類毒素是以中藥材蟾蜍或蟾蜍干皮為原料制備的一種類毒素，其工藝簡單實用，成本低，為中藥材蟾蜍的應用提供了更加廣泛的途徑。
文檔編號A61K35/56GK102657683SQ20121017901
公開日2012年9月12日 申請日期2012年6月2日 優(yōu)先權日2012年6月2日
發(fā)明者徐華民, 徐萌, 趙艷琨, 趙榮華 申請人:哈爾濱工業(yè)大學