b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種佐劑吸附b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備方法及凍干b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備方法，產(chǎn)品效果良好。本發(fā)明的制備方法，包括以下步驟：1)將b型流感嗜血桿菌多糖降解；2)對(duì)降解后的b型流感嗜血桿菌多糖進(jìn)行活化；3)將活化的b型流感嗜血桿菌多糖和破傷風(fēng)類毒素用化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)合；4)對(duì)結(jié)合后的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物進(jìn)行純化。
【專利說(shuō)明】b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種制備b型流感嗜血桿菌多糖-蛋 白結(jié)合物的結(jié)合技術(shù)，基于此結(jié)合技術(shù)，制備出了具有較高免疫原性的b型流感嗜血桿菌 結(jié)合疫苗。

【背景技術(shù)】：
[0002] b型流感嗜血桿菌（Haemophilus Influenzae Type b，簡(jiǎn)稱Hib)，是全世界兒童發(fā) 病和死亡的主要原因之一，b型流感嗜血桿菌感染性疾病主要發(fā)生在5歲以下兒童，一旦被 Hib感染，嬰幼兒很有可能受到肺炎和腦膜炎等可怕疾病的侵襲，還可能并發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系 統(tǒng)后遺癥，包括耳聾、語(yǔ)言障礙或延遲、視力障礙、智力低下和運(yùn)動(dòng)功能異常等。目前研究發(fā) 現(xiàn)，人類是Hib的唯一宿主，病菌的傳播主要通過(guò)空氣飛沫及與病菌攜帶者親密接觸。
[0003] Hib的莢膜多糖主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸鹽（Polyribose ribitol phosphate，PRP)，是Hib的主要毒力因子之一，由此制備成的多糖疫苗具有一定的免疫預(yù) 防效果，但由于多糖屬于T細(xì)胞非依賴性抗原，因此抗體的產(chǎn)生與年齡具有相關(guān)性。成人接 種后可產(chǎn)生免疫應(yīng)答且抗體長(zhǎng)期存在；2歲以上兒童接種疫苗后可產(chǎn)生抗體，但維持時(shí)間 較短，并且重復(fù)接種也無(wú)加強(qiáng)反應(yīng)；在免疫系統(tǒng)機(jī)能發(fā)育尚不完善的2歲以下嬰幼兒中，不 能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。
[0004] Hib結(jié)合疫苗是將PRP以共價(jià)鍵的方式結(jié)合到具有免疫原性的蛋白載體上制備 的。與多糖疫苗相比，Hib結(jié)合疫苗不僅能刺激嬰幼兒機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的免疫反應(yīng)，而且再次接 種也能加強(qiáng)反應(yīng)，從而提高疫苗的保護(hù)性能。
[0005] 多糖和蛋白質(zhì)主要是通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行偶聯(lián)的，目前普遍運(yùn)用的多糖蛋白結(jié)合物 制備方法是：用CNBr活化Hib多糖并與己二酰肼連接制備衍生物，然后在碳二亞胺的作用 下多糖衍生物通過(guò)己二酰肼的橋連作用與載體蛋白結(jié)合，最后經(jīng)凝膠過(guò)濾層析純化獲得高 分子多糖蛋白結(jié)合物。然而這種多糖蛋白結(jié)合物制備技術(shù)存在著以下不足：（1)工藝復(fù)雜， 反應(yīng)周期長(zhǎng)；（2)EDAC在介導(dǎo)多糖ADH衍生物與載體蛋白結(jié)合的同時(shí)，容易引起載體蛋白的 自身交聯(lián)，形成載體蛋白的聚合物，從而降低多糖-蛋白的結(jié)合效率；（3) Hib莢膜多糖的分 子大小分布不均，每個(gè)批次的分子大小分布存在較大差異，導(dǎo)致每批多糖蛋白結(jié)合疫苗的 理化指標(biāo)各異，影響生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性、成品疫苗的批間穩(wěn)定性和成品疫苗質(zhì)量的一致性。
[0006] 本發(fā)明提供了一種新的多糖蛋白結(jié)合方法，采用化學(xué)方法將Hib多糖降解成分子 量均一的小分子多糖，減小多糖分子大小批間差異，生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量一致性 顯著提高。用CDAP活化多糖后直接與載體蛋白結(jié)合，不添加 EDAC可避免載體蛋白的自身 交聯(lián)，縮短了生產(chǎn)周期，提高了結(jié)合物收率。
[0007] 本發(fā)明還提供一種佐劑吸附b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備方法及凍干b型流 感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備方法，產(chǎn)品效果良好。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0008] 本發(fā)明提供了一種新的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物制備方法。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供用本發(fā)明的方法制備的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素 結(jié)合疫苗及其制劑。
[0010] 本發(fā)明所述的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物的制備方法，包括以 下步驟：
[0011] 1)將b型流感嗜血桿菌多糖降解；
[0012] 2)對(duì)降解后的b型流感嗜血桿菌多糖進(jìn)行活化；
[0013] 3)將活化的b型流感嗜血桿菌多糖和破傷風(fēng)類毒素用化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)合；
[0014] 4)對(duì)結(jié)合后的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物進(jìn)行純化。
[0015] 其中，步驟1)所述將b型流感嗜血桿菌多糖降解，方法為：
[0016] b型流感嗜血桿菌多糖用0· 02mol/L?0· 04mol/L乙酸鈉溶液溶解（4?5mg/ ml)，加入終濃度為0. 5%?3%的過(guò)氧化氫，于50?60°C反應(yīng)20?40分鐘。用注射用水 或2mol/L氯化鈉溶液作為緩沖液，超濾或透析去除小分子物質(zhì)，得到降解后的b型流感嗜 血桿菌多糖。
[0017] 其中，步驟2)所述對(duì)降解后的b型流感嗜血桿菌多糖進(jìn)行活化，方法為
[0018] 取降解后的多糖溶液，濃度控制在4-20mg/ml，加入CDAP，多糖投入量與CDAP比例 為1:0. 25?1:2,維持反應(yīng)20?300秒。加入過(guò)量的三乙胺溶液，反應(yīng)溶液pH值控制在 8. 5?10. 5之間，冰浴或室溫反應(yīng)5?8分鐘后，調(diào)pH值至8. 3?8. 9之間。
[0019] 其中，步驟3)所述將活化的b型流感嗜血桿菌多糖和破傷風(fēng)類毒素用化學(xué)方法進(jìn) 行結(jié)合，
[0020] 方法為：
[0021] 根據(jù)多糖投入量，按1:0. 5?1:3的比例加入純化破傷風(fēng)類毒素原液（以蛋白含 量計(jì)算），混勻后維持pH在8. 3?8. 9之間反應(yīng)1?2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后調(diào)pH值至4. 8? 5. 2之間，加入過(guò)量的甘氨酸溶液，30?60分鐘后終止反應(yīng)，用0. 02?0. 2mol/L氯化鈉溶 液作為緩沖液，超濾或透析去除小分子物質(zhì)。
[0022] 其中，步驟4)所述對(duì)結(jié)合后的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物進(jìn)行 純化，方法為：
[0023] 用0· 02?0· 2mol/L氯化鈉溶液作為流動(dòng)相，多糖-蛋白結(jié)合物經(jīng)Sephacryl S-400HR層析純化，上樣量不能超過(guò)柱體積的10%，收集K d < 0. 4的洗脫液段，適當(dāng)稀釋后 經(jīng)0. 2 μ m無(wú)菌濾器除菌過(guò)濾后即得b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物。
[0024] 本發(fā)明所述的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物的制備方法，優(yōu)選的
[0025] 步驟1)所述多糖降解，其中所述乙酸鈉溶液濃度為0· Olmol/L?0· 10m〇l/L，最佳 為0. 02mol/L?0. 04mol/L ;所述多糖溶解濃度為1?10mg/ml，最佳為4?5mg/ml ;所述 加入的過(guò)氧化氫濃度為0. 1?5%，最佳為0. 5?3%,
[0026] 步驟2)所述多糖活化，其中所述多糖投入量與CDAP比例為1:0. 25?1:2 (g/g)， 維持反應(yīng)20-300秒；訴述加入三乙胺濃度為0. 2mol/L，反應(yīng)時(shí)間5?8分鐘，維持pH值 8. 5?10. 5之間，后將溶液的pH值調(diào)至8. 3?8. 9之間，
[0027] 步驟3)所述多糖蛋白結(jié)合，其中所述多糖與蛋白質(zhì)加入的質(zhì)量混合比例為 1:0. 5?1:3,更佳為1:0. 8?1:1. 5,最佳為I : 1 ;所述維持pH值在8. 0?9. 0之間，更佳為 8. 3?8. 9范圍；所述反應(yīng)時(shí)間為0. 5?4小時(shí)，更佳為1?2小時(shí)；所述調(diào)整pH值4. 5? 6. 0之間，更佳為4. 8?5. 2之間；所述過(guò)量甘氨酸溶液為Ig多糖加入50?120g的Imol/ L甘氨酸溶液；所述氯化鈉溶液濃度為0. 02?0. 2mol/L，
[0028] 步驟4)所述多糖蛋白結(jié)合物純化，其中所述氯化鈉溶液濃度為0. 02?0. 2mol/L ; 所述層析介質(zhì)為Sephacryl S-400HR凝膠；所述收集洗脫液為Kd < 0. 4的洗脫液段。
[0029] 本發(fā)明進(jìn)一步包括，將上述純化步驟所得的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒 素結(jié)合物作為疫苗制劑的活性成分，根據(jù)制劑學(xué)的要求制備成疫苗制劑。
[0030] 本發(fā)明優(yōu)選的疫苗制劑為凍干劑型，其組分包括b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng) 類毒素結(jié)合物、乳糖，氯化鈉，其中，各組分的濃度為：
[0031] b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物（以多糖含量計(jì)） 17?30 μ g/ ml
[0032] 乳糖 0· 6 ?I. 4mg/ml
[0033] 其制備方法包括如下步驟：
[0034] a)取檢定合格的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物原液。
[0035] b)向b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物原液內(nèi)加入賦形劑乳糖溶液， 用注射用水稀釋定容。
[0036] c)分裝后置入凍干機(jī)中進(jìn)行凍干得到b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗。
[0037] 本發(fā)明的疫苗制劑也可以為液體劑型，組分包括b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng) 類毒素結(jié)合物、氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑，氯化鈉，其中，各組分的濃度為：
[0038] b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物（以多糖含量計(jì)）17?30 μ g/ ml
[0039] 鋁離子 0· 2 ?0· 8mg/ml
[0040] 氯化鈉 7. 0 ?10. Omg/ml
[0041] 其制備方法包括如下步驟：
[0042] a)取檢定合格的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物原液。
[0043] b)制備氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑，檢測(cè)佐劑鋁離子含量及氯化鈉濃度。
[0044] c)向b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物原液內(nèi)加入佐劑、氯化鈉溶液， 用注射用水稀釋定容。
[0045] d) 2_8°C吸附過(guò)夜，分裝，得到b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗。
[0046] 以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
[0047] 傳統(tǒng)b型流感嗜血桿菌-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物原液的制備方法主要有兩種：一種 是傳統(tǒng)的CNBr方法，即用CNBr活化Hib多糖并與己二酰肼連接制備衍生物，然后在碳二亞 胺的作用下多糖衍生物通過(guò)己二酰肼的橋連作用與載體蛋白結(jié)合；另一種是傳統(tǒng)的CDAP 活化方法，與溴化氰方法相比，只是采用了較溫和的活化劑CDAP。
[0048] 本發(fā)明采用雙氧水降解Hib多糖，采用CDAP活化降解多糖后直接與載體蛋白結(jié) 合的方法與傳統(tǒng)結(jié)合技術(shù)相比具有周期短、收率高，免疫原性好的特點(diǎn)，效果對(duì)比如表1所 示：
[0049] 表1傳統(tǒng)結(jié)合技術(shù)與本發(fā)明技術(shù)效果對(duì)比結(jié)果
[0050]

【權(quán)利要求】
1. b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物的制備方法，包括以下步驟： 1) 將b型流感嗜血桿菌多糖降解； 2) 對(duì)降解后的b型流感嗜血桿菌多糖進(jìn)行活化； 3) 將活化的b型流感嗜血桿菌多糖和破傷風(fēng)類毒素用化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)合； 4) 對(duì)結(jié)合后的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物進(jìn)行純化。
2. 如權(quán)利要求1中所述的制備方法，其特征在于，其中，步驟1)所述將b型流感嗜血桿 菌多糖降解，方法為： b型流感嗜血桿菌多糖用0. 02mol/L?0. 04mol/L乙酸鈉溶液溶解（4?5mg/ml)，力口 入終濃度為〇. 5%?3%的過(guò)氧化氫，于50?60°C反應(yīng)20?40分鐘，用注射用水或2mol/ L氯化鈉溶液作為緩沖液，超濾或透析去除小分子物質(zhì)，得到降解后的b型流感嗜血桿菌多 糖。
3. 如權(quán)利要求1中所述的制備方法，其特征在于，其中，步驟2)所述對(duì)降解后的b型流 感嗜血桿菌多糖進(jìn)行活化，方法為 取降解后的多糖溶液，濃度控制在4-20mg/ml，加入CDAP，多糖投入量與CDAP比例為 1:0. 25?1:2,維持反應(yīng)20?300秒，加入過(guò)量的三乙胺溶液，反應(yīng)溶液pH值控制在8. 5? 10. 5之間，冰浴或室溫反應(yīng)5?8分鐘后，調(diào)pH值至8. 3?8. 9之間。
4. 如權(quán)利要求1中所述的制備方法，其特征在于，其中，步驟3)所述將活化的b型流感 嗜血桿菌多糖和破傷風(fēng)類毒素用化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)合，方法為： 根據(jù)多糖投入量，按1:0. 5?1:3的比例加入純化破傷風(fēng)類毒素原液（以蛋白含量計(jì) 算），混勻后維持pH在8. 3?8. 9之間反應(yīng)1?2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)pH值至4. 8?5. 2 之間，加入過(guò)量的甘氨酸溶液，30?60分鐘后終止反應(yīng)，用0. 02?0. 2mol/L氯化鈉溶液作 為緩沖液，超濾或透析去除小分子物質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求1中所述的制備方法，其特征在于，其中，步驟4)所述對(duì)結(jié)合后的b型流 感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物進(jìn)行純化，方法為： 用0. 02?0. 2mol/L氯化鈉溶液作為流動(dòng)相，多糖-蛋白結(jié)合物經(jīng)S印hacryl S-400HR 層析純化，上樣量不能超過(guò)柱體積的10 %，收集KD < 0. 4的洗脫液段，適當(dāng)稀釋后經(jīng)0. 2 μ m 無(wú)菌濾器除菌過(guò)濾后即得b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物。
6. 如權(quán)利要求1中所述的制備方法，其特征在于， 其中，步驟1)所述多糖降解，其中所述乙酸鈉溶液濃度為0. Olmol/L?0. 10m〇l/L，最 佳為0. 02mol/L?0. 04mol/L ;所述多糖溶解濃度為1?10mg/ml，最佳為4?5mg/ml ;所 述加入的過(guò)氧化氫濃度為〇. 1?5%，最佳為0. 5?3%， 其中，步驟2)所述多糖活化，其中所述多糖投入量與CDAP比例為1:0. 25?1:2 (g/g)， 維持反應(yīng)20-300秒；訴述加入三乙胺濃度為0. 2mol/L，反應(yīng)時(shí)間5?8分鐘，維持pH值 8. 5?10. 5之間，后將溶液的pH值調(diào)至8. 3?8. 9之間， 其中，步驟3)所述多糖蛋白結(jié)合，其中所述多糖與蛋白質(zhì)加入的質(zhì)量混合比例為 1:0. 5?1:3,更佳為1:0. 8?1:1. 5,最佳為1 :1 ;所述維持pH值在8. 0?9. 0之間，更佳為 8. 3?8. 9范圍；所述反應(yīng)時(shí)間為0. 5?4小時(shí)，更佳為1?2小時(shí)；所述調(diào)整pH值4. 5? 6. 0之間，更佳為4. 8?5. 2之間；所述過(guò)量甘氨酸溶液為lg多糖加入50?120g的lmol/ L甘氨酸溶液；所述氯化鈉溶液濃度為0. 02?0. 2mol/L， 其中，步驟4)所述多糖蛋白結(jié)合物純化，其中所述氯化鈉溶液濃度為0. 02?0. 2mol/ L ;所述層析介質(zhì)為Sephacryl S-400HR凝膠；所述收集洗脫液為KD彡0. 4的洗脫液段。
7. 用權(quán)利要求1-6任何一項(xiàng)制備方法制備的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié) 合物。
8. 以權(quán)利要求7所述的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物作為活性成分制 備的疫苗制劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗制劑，其特征在于，為凍干制劑，組分包括b型流感嗜血 桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物、乳糖，其中，各組分的濃度為： b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物（以多糖含量計(jì)）17?30 μ g/ml 乳糖 0· 6 ?1. 4mg/ml 其制備方法，包括如下步驟： 1) 取檢定合格的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物原液， 2) 向b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物原液內(nèi)加入乳糖溶液，用注射用水 稀釋定容， 3) 分裝后置入凍干機(jī)中進(jìn)行凍干：先-40?-50°C預(yù)凍2?6小時(shí)，預(yù)凍完成后開始 抽真空處理，將真空狀態(tài)的凍干機(jī)溫度調(diào)至-30?_35°C，并保持4小時(shí)以上，擱板以3? 5°C /小時(shí)的速度升溫至30?32°C，并維持在30?32°C的溫度8?12小時(shí)，制品壓塞出 箱，即獲得成品。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗制劑，其特征在于，為液體制劑，組分包括b型流感嗜血 桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物、氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑，氯化鈉，其中，各組分的濃 度為： b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物（以多糖含量計(jì)）17?30 μ g/ml 鋁離子 0· 2?0· 8mg/ml 氯化鈉 7. 0?10. Omg/ml 其制備方法，包括如下步驟： 1) 取檢定合格的b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物原液， 2) 制備氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑，檢測(cè)佐劑鋁離子含量及氯化鈉濃度， 3) 向b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物原液內(nèi)加入佐劑、氯化鈉溶液，用注 射用水稀釋定容， 4) 2-8°C吸附過(guò)夜，分裝得到b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK104225588SQ201410413100
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】蘇曉葉, 石獻(xiàn)華, 康鴻宇, 孟文茜, 潘勇, 劉剛, 黃穎, 杜琳 申請(qǐng)人:北京智飛綠竹生物制藥有限公司