專利名稱：抗nkg2a 的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對NK細(xì)胞表面受體NKG2A的單克隆抗體及其片段，以及生產(chǎn)和評價(jià)這樣的抗體的方法。單克隆抗體及其片段在治療免疫疾病，尤其是自身免疫性疾病以及其他要求調(diào)控NK細(xì)胞功能的疾病中是有用的?？傮w而言，本發(fā)明方法涉及使用抗體及其片段，以防止導(dǎo)致促成待治療疾病病理的表達(dá)HLA-E或Qalb的細(xì)胞如樹突細(xì)胞或活化T細(xì)胞的溶解的NK細(xì)胞上NKG2A受體的刺激。
背景技術(shù)：
保持有效的免疫監(jiān)視而不引起自身免疫反應(yīng)需要效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)的準(zhǔn)確滴定。當(dāng)免疫系統(tǒng)針對自身抗原發(fā)起免疫反應(yīng)時(shí)便出現(xiàn)自身免疫性疾病(參見，例如，Ludewig etal. (1999) Immunol Rev. 169 :45-54)。盡管在引發(fā)和維持自身免疫性反應(yīng)中涉及的機(jī)制還不清楚，但是可能涉及在次級淋巴器官中以前在免疫方面被忽視的抗原的出現(xiàn)。樹突細(xì)胞是骨髓來源的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，其在免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用(參見,例如，0’ Neill et al. (2004)Bloodl04 :2235-2246)。DC通過吞噬、胞吞和胞飲作用將細(xì)菌、病毒、瀕死細(xì)胞和各種復(fù)合分子加以內(nèi)化。并入的蛋白被分解為肽，它們接著與MHCI和II類分子一起被呈遞到DC細(xì)胞表面上。加載到MHC I類上的抗原通常來源于內(nèi)源性蛋白并且由CD8+T細(xì)胞識別，而MHC II類加載的抗原通常來源于外源蛋白并且由CD4+T細(xì)胞識別。在抗原捕獲之后，未成熟的DC細(xì)胞變成熟而形成了成熟的DC，它們表現(xiàn)出減少的吞噬作用，移動到淋巴組織并且具有增強(qiáng)的T細(xì)胞刺激能力。在淋巴組織中，DC起動原初(naive ) T細(xì)胞，刺激它們的克隆擴(kuò)增和分化，并且也可以與B細(xì)胞和本身免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(包括NK細(xì)胞)相互作用?；罨腘K細(xì)胞可以殺傷不成熟的DC細(xì)胞，而不是成熟的DC細(xì)胞。由于T淋巴細(xì)胞的抗原運(yùn)送和初始敏化主要是通過抗原呈遞樹突細(xì)胞介導(dǎo)的，所以有可能通過樹突細(xì)胞自身抗原的不合適的呈遞至少部分地促進(jìn)自身免疫性障礙。自然殺傷(NK)細(xì)胞是包括在非傳統(tǒng)免疫中涉及的淋巴細(xì)胞的亞種群。NK細(xì)胞提供一種有效的免疫監(jiān)督機(jī)制，由此可消除不希望的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞。NK細(xì)胞活性是通過包含兩種活化和抑制信號的復(fù)雜機(jī)制進(jìn)行調(diào)控的(參見，例如，Morettaet al. (2001)Annu Rev TmmunoI 19 :197-223 ；Moretta et al. (2003)EMBO J EPub Dec18 ；Ravetch et al. (2000)Science 290 :84-89 ;Zambello et al. (2003)Blood 102 1797-805 ；Moretta et al. (1997)Curr Opin Immunol 9 :694-701 ;將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。已證實(shí)多種不同的NK特異性受體在NK細(xì)胞介導(dǎo)的對HLA I類缺陷型靶細(xì)胞的識別和殺傷中起重要作用。這些受體(稱為NKp30、NKp46和NKp44)是Ig超家族的成員。它們的交聯(lián)(通過特異性mAb誘導(dǎo))導(dǎo)致強(qiáng)烈的NK細(xì)胞激活，致使細(xì)胞內(nèi)Ca++水平升高，觸發(fā)細(xì)胞毒性和淋巴因子釋放。重要的是，mAb介導(dǎo)的NKp30、NKp46和/或NKp44的活化導(dǎo)致對于多種靶細(xì)胞的NK細(xì)胞毒性的激活。這些發(fā)現(xiàn)為這些受體在天然細(xì)胞毒性中的一種中心性作用提供了證據(jù)。NK細(xì)胞由主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類-特異性抑制性受體進(jìn)行負(fù)調(diào)控(Karre et al. (1986)Nature 319 :675-8 ；0hlen et al, (1989) Science 246 :666-8)。這些特異性受體與主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子或HLA的多態(tài)決定子相結(jié)合，并抑制自然殺傷(NK)細(xì)胞溶解。在人體內(nèi)，稱為殺傷Ig-樣受體(KIR)的受體家族的某些成員識別HLA I 類等位基因的組(參見，例如 Yawata et al. (2002)Crit Rev TmmunoI 22:463-82;Martin et al. (2000)Immunogenetics. 51 :268-80 ；Lanier (1998)Annu Rev Immunol. 16 359-93 ;將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。NK細(xì)胞上的另一重要的抑制性受體是⑶94-NKG2A，其與非典型的MHC I類分子HLA-E相互作用(參見，例如Braud et al. (1998)Nature 391 :795-799 ；Lee et al. (1998) PNAS 95 :5199-5204 ；Vance et al. (2002)PNAS 99 :868-873 ；Brooks et al. (1999)J Immunoll62 :305-313 ;Miller et al. J Immunol(2003) 171 :1369-75 ;Brooks etal. (1997) J Exp Med 185 :795-800 ；Van Beneden et al. (2001)4302-4311 ;美國專利申請第20030095965號；將每一篇的內(nèi)容都通過引證方式合并入本文中)。這些受體中的一些具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞抗原受體-依賴性T細(xì)胞活化的閾值的能力。在罕見的抑制性受體缺乏的情況下，這些活化同工型(isoform)可能擴(kuò)大T細(xì)胞效應(yīng)器的功能并且促成自身免疫病理。NKG2A的氨基酸序列在哺乳動物(包括靈長類動物)中發(fā)生變化。例如，NKG2A蛋白的人類和獼猴形式共享少于90%的一致性，包括在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的大約86%。對于用于調(diào)節(jié)NKG2A的療法的努力(主要用于防止炎癥)已集中在對非典型MHCI類分子、用于人類受體的HLA-E和用于小鼠受體的Qa-Ib的研究上。對于細(xì)胞表面表達(dá)，這些MHC分子優(yōu)選與來源于其他MHC I類分子的信號肽的肽結(jié)合。其他I類MHC分子的表達(dá)可以調(diào)控HLA-E的表達(dá)，因此，允許NK細(xì)胞在潛在的靶細(xì)胞中監(jiān)控MHC I類依賴性抗原呈遞途徑的狀態(tài)。細(xì)胞表面HLA-E的水平對于針對腫瘤和病毒感染細(xì)胞的NK細(xì)胞毒性是至關(guān)重要的。用于調(diào)節(jié)HLA-E表達(dá)或功能的治療方案通常集中在利用HLA-I或HSP60肽來誘導(dǎo)用于防止發(fā)炎的保護(hù)狀態(tài)，致使NK細(xì)胞不被活化。美國專利公開第20030095965號披露了一種抗體3S9，其與NKG2A、NKG2C和NKG2E結(jié)合。據(jù)稱3S9引起這些受體的交聯(lián)并且伴隨著NK細(xì)胞介導(dǎo)的溶解的抑制。共同擁有的PCT專利公開W02005/105849披露了一種抗體的應(yīng)用，其中該抗體與NK受體(包括NKG2A)特異結(jié)合，以治療患有粒狀淋巴細(xì)胞(NK-LDGL)的NK型淋巴細(xì)胞增殖性疾病的患者。這樣的抗體抑制NK細(xì)胞活性。已證明單克隆抗體對于各種疾病的診斷和治療是非常有用的。治療用單克隆抗體可以通過不同的機(jī)制起作用。一些抗體如利妥昔(Rituxan)識別在病態(tài)細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)表面上存在的抗原(在利妥昔的情形下的CD20)，并且通過指導(dǎo)免疫細(xì)胞破壞所識別的細(xì)胞而起作用。其他抗體如將托西莫(Bexxar)、Oncolym或澤娃靈(Zevalin)連接于放射性同位素、化學(xué)治療劑或毒素，導(dǎo)致與該抗體結(jié)合的細(xì)胞的直接殺傷。還有其他的抗體如巴利昔單抗(Basiliximab)和達(dá)利珠單抗(Daclizumab)(它們封閉IL_2)、IgE封閉的奧馬佐單抗(Omalizumab)和efaluzimab起作用以封閉特異性蛋白的活性?；诳贵w的療法在本領(lǐng)域是眾所周知的并且被綜述在例如Gatto (2004) Curr Med Chem Anti-Canc Agents4(5) :411-4, Casadevall et al. (2004)Nat Rev Microbiol. 2(9) :695-703, Hinoda etal. (2004)Cancer Sci.95(8) :621-5, Olszewski et al. (2004)Sci STKE. Jul06(241)pe30, Coiffier(2004)Hematol J. Suppl 3 :S154_8，Roque et al. (2004)BiotechnolProg. 20(3) :639-54中，將其每一篇的全部內(nèi)容都通過引用結(jié)合在此。在抗體可被用于人類的治療應(yīng)用、或進(jìn)入臨床試驗(yàn)之前，它們必須在非人類動物中經(jīng)過臨床前研究以評價(jià)各種參數(shù)如它們的毒性、體內(nèi)有效性、生物利用度、半衰期以及各種其他的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)參數(shù)。這樣的化驗(yàn)分析通常是在哺乳動物中進(jìn)行的，并優(yōu)選地，在它們具有生物活性，即在mAb與物種內(nèi)的同系物分子起反應(yīng)的部位進(jìn)行，因此人們可以期望其與人類最大程度的生理相似性。然而，如果針對人類蛋白的抗體不與靶蛋白的非人類動物同系物相結(jié)合，則在非人靈長類動物中的研究可能被阻止。相反，當(dāng)存在交叉反應(yīng)性時(shí)，在該動物體內(nèi)不僅可以檢測該抗體的體內(nèi)有效性，而對其他問題如副作用、毒性或與抗體結(jié)合于靶蛋白有關(guān)的動力學(xué)性質(zhì)也可以進(jìn)行研究。易于獲得的靈長類動物的實(shí)例 包括新世界猴(New World monkey)和舊世界猴(Old World monkey),如短尾猴(Macacamulatta)、稱猴(Macacus mulatta)、非洲綠猴(Chlorocebus aethiops)、滅猴(Callithrixjacchus)、松鼠猴(Saimiri sciureus)都可以從“Centre de Primatologie”(CDP :ULP,Fort Foch,67207Niederhausbergen, France)獲得，并且狒狒(Papio hamadryas)可以從“Station de Primatologie du CNRS”, CD56,13790Rousset/Arc, France 獲得。黑猩猩和猿通常也可以用于檢測候選藥物，盡管這樣的情形很少，并且只有當(dāng)沒有其他用于檢測的替代物存在或已被用盡時(shí)。由于抗體與它們的目標(biāo)的特異性三維特征相結(jié)合，所以在靶蛋白的氨基酸序列上的微小變化可使其無法結(jié)合在一起，使得很難預(yù)測針對來自一個(gè)物種的蛋白的所給抗體是否會結(jié)合于享有一部分但不是全部序列一致性的同源蛋白。已經(jīng)描述了許多情形，其中例如針對人類蛋白的抗體對于即使緊密相關(guān)的物種中的同系物也不結(jié)合。例如，抗人類CD4蛋白的一些抗體不結(jié)合猴同系物，即使人類和獼猴CD4蛋白具有接近94%的一致性(參見，例如，Genbank IDs GI 116013and 20981680 ；Sharma et al. (2000) JPET 293 :33-41,2000，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。其他的實(shí)例包括抗人類CD3(對于抗體開發(fā)的而被廣泛研究的藥物靶點(diǎn))的一些抗體，本來具有適于開發(fā)的特性的一些抗體，如UCHT2，不與猴CD3蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)。鑒于許多自身免疫性疾病的突出性和嚴(yán)重性，以及成熟樹突細(xì)胞在協(xié)調(diào)針對自身抗原的免疫反應(yīng)中的作用，本領(lǐng)域很需要新的且有效的療法，調(diào)節(jié)潛在的這些疾病的樹突細(xì)胞的活性或水平。此外，也需要針對以可以屏蔽自身不被免疫系統(tǒng)破壞的異常細(xì)胞(例如，以某些癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞)為特征的疾病的療法。最后，還需要找到對于針對NKG2A的單克隆抗體在人體內(nèi)的治療潛力的有效體內(nèi)檢測系統(tǒng)。本發(fā)明致力于解決這種和其他的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了針對NKG2A受體的單克隆抗體及其片段。本發(fā)明的單克隆抗體及其片段可以抑制NK細(xì)胞溶解正常地易感染靶細(xì)胞的能力(“NK細(xì)胞抑制性抗體”)，或重建NK細(xì)胞溶解另外受保護(hù)的靶細(xì)胞的能力(“NK細(xì)胞活化抗體”)。本發(fā)明的單克隆抗體及其片段的功能依賴于它們結(jié)合Fe受體的能力。Fe受體如Fe Y受體被表達(dá)在白細(xì)胞的表面上。這些受體與免疫球蛋白(Ig)的Fe部分結(jié)合，例如，F(xiàn)e y受體與IgG的Fe部分結(jié)合。這種結(jié)合通過將由抗體對抗原的識別與基于細(xì)胞的效應(yīng)子機(jī)制相關(guān)聯(lián)而有助于促進(jìn)免疫功能。不同的免疫球蛋白種類通過免疫球蛋白Fe區(qū)域與免疫細(xì)胞上的特異性Fe受體(FcR)的差異相互作用而觸發(fā)不同的效應(yīng)器機(jī)制。活化 Fe Y 受體包括 Fe Y RI、Fe YR IIA, FcyR II C 和 FcyRIIIA。FcyRII B被認(rèn)為是一種抑制性的Fe Y受體。(對于綜述，參見，例如，Woof et al. (2004)NatRev Tmmun01. 4(2) :89-99 ;Baumann et al. (2003)Arch TmmunoI Ther Exp (Warsz)51(6)399-406 ；Pan et al. (2003)Chin Med J (Engl)116(4) :487-94 ;Takai et al. (1994)Cell76 :519-529 ；Ravetch et al. (2001)Annu Rev Immunol 19 :275_290，將其每一篇的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。
不受理論的限制，本發(fā)明的發(fā)明人相信，在本發(fā)明的抗體和片段中存在的Fe受體結(jié)合區(qū)域在帶有Fe受體的細(xì)胞存在下引起NK細(xì)胞溶解的抑制。缺乏Fe受體結(jié)合區(qū)域的那些抗體和片段可以在它們的細(xì)胞表面上重建帶有HLA-E或Qalb的靶細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解。這樣的靶細(xì)胞通常通過HLA-E或Qalb與NKG2A受體的相互作用來保護(hù)其不發(fā)生NK細(xì)胞溶解。本發(fā)明還提供了一種包括本發(fā)明的抗體和片段的組合物，以及利用這樣的組合物來治療不同疾病和障礙的治療方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用非人靈長類動物來評價(jià)和表征針對人類NKG2A的抗體或其片段的活性、毒性和合適劑量方案。所以，一方面，本發(fā)明提供了一種活化抗體，它是單克隆抗體或其片段，其特征在于a)特異性結(jié)合NKG2A ；b)非特異性結(jié)合Fe受體；和c)當(dāng)結(jié)合于人類NK細(xì)胞上的NKG2A時(shí)，引起所述NK細(xì)胞溶解在靶細(xì)胞表面上帶有HLA-E或Qalb的靶人類細(xì)胞(當(dāng)所述靶細(xì)胞與所述NK細(xì)胞接觸時(shí))。優(yōu)選地，該單克隆抗體或片段不與其他的人類NKG2受體結(jié)合，特別是活化受體NKG2C或NKG2E。更優(yōu)選的是本發(fā)明的抗體或片段與選自Z199或Z270的抗-NKG2的單克隆體完全競爭。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該單克隆抗體或其片段能夠與非人靈長類動物的NKG2A結(jié)合。更優(yōu)選地，當(dāng)結(jié)合在非人靈長類動物NK細(xì)胞上的NKG2A時(shí)，該單克隆抗體或其片段具有在靶細(xì)胞表面上重建帶有HLA-E的靶非人靈長類動物細(xì)胞的溶解(當(dāng)所述靶細(xì)胞與所述NK細(xì)胞接觸時(shí))。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該單克隆抗體或其片段包括Z270的可變重鏈區(qū)或Z270的可變輕鏈區(qū)的氨基酸序列。在可替換的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，該單克隆抗體或其片段包括Z199的可變重鏈區(qū)或Z199的可變輕鏈區(qū)的氨基酸序列。在又一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該單克隆抗體或其片段包括小鼠或人類IgGl恒定區(qū)，該恒定區(qū)已被修飾以防止與Fe受體或人類IgG4恒定區(qū)結(jié)合。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該抗體或片段是嵌合或人源化的。更優(yōu)選的是包括ch270VK或ch270VH的抗體或其片段。在另一具體實(shí)施方式
中，該抗體或其片段被衍生化以增強(qiáng)其體內(nèi)的生物可利用度或穩(wěn)定性。在另一具體實(shí)施方式
中，該抗體是用PEG進(jìn)行衍生化。本發(fā)明的活化抗體和片段對于重建某些在正常情況下抵抗NK細(xì)胞介導(dǎo)的溶解的靶細(xì)胞溶解很有用。因此，在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種在包括NK細(xì)胞和所述靶細(xì)胞的種群中重建NK細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞溶解的方法，其中所述NK細(xì)胞的特征在于其表面上的NKG2A，并且所述靶細(xì)胞的特征在于其表面上存在HLA-E或Qalb,所述方法包括將所述NK細(xì)胞與上述單克隆抗體或片段進(jìn)行接觸的步驟。優(yōu)選地，該靶細(xì)胞是人類細(xì)胞。更優(yōu)選地，該靶細(xì)胞是樹突細(xì)胞(“DC”)、癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞。最優(yōu)選地，該靶細(xì)胞是成熟的樹突細(xì)胞(“mDC”)?；罨目贵w或其片段可以被配制到另外包含藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的組合物中。進(jìn)行這樣的組合可以被形成制劑以適于藥學(xué)上給藥。該藥物組合物可以可選包括對于被治療的特定疾病或癥狀有用的第二治療劑。所有這樣的組合物也是本發(fā)明的一部 分。本發(fā)明的活化抗體組合物可用于治療或預(yù)防患者體內(nèi)的自身免疫或炎性障礙、或免疫反應(yīng)；或治療患者體內(nèi)以在其表面上存在表達(dá)HLA-E或Qalb的癌細(xì)胞為特征的癌癥，或以在其表面上存在表達(dá)HLA-E或Qalb的病毒感染細(xì)胞為特征的病毒性疾病。這些方法可以另外包括給予患者對于待治療的特定疾病或癥狀有用的第二治療劑的步驟。該第二治療劑可以作為一個(gè)單獨(dú)的劑型或作為所述組合物的一部分給予。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，在包含本發(fā)明的活性抗體或片段的組合物和利用本發(fā)明的活性抗體或片段的方法中的第二治療劑是激動活化的NK細(xì)胞受體如NKp30、NKp44和NKp46的化合物。在另一具體實(shí)施方式
中，該第二治療劑是抑制性NK細(xì)胞受體如抑制性KIR受體的拮抗劑。在另一具體實(shí)施方式
中，第二治療劑是TGF-Pl的拮抗劑。在另一具體實(shí)施方式
中，第二治療劑選自由細(xì)胞因子抑制劑、造血生長因子、止痛藥、胰島素、抗炎劑和免疫抑制劑組成的組。在另一具體實(shí)施方式
中，該第二治療劑是抗癌化合物或止吐劑。在另一具體實(shí)施方式
中，該第二治療劑是抗病毒化合物。在另一具體實(shí)施方式
中，待預(yù)防或治療的自身免疫性或炎性障礙選自由以下組成的組自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、韋格納肉芽腫(Wegener ' s granulomatosis)、阿耳茨海默氏病、自身免疫性肝炎、白塞氏病(Beh^efs disease)、克隆氏病(Crohn' s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬皮病、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合癥(Sj6gren’S syndrome)、I型糖尿病、葡萄膜炎、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、甲狀腺炎、I型糖尿病、心肌炎、風(fēng)濕熱、硬皮病、強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、重癥肌無力、多肌炎、格林巴利綜合癥(GuiIIain-Barresyndrome)、多發(fā)性硬化、斑秀、天皰瘡/類天皰瘡、牛皮癬和白癜風(fēng)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制性單克隆抗體或其抑制性片段，其特征在于a)特異性結(jié)合NKG2A ；b)特異性結(jié)合Fe受體；c)不結(jié)合NKG2C或NKG2E ；d)與Z270或Z199完全競爭；e)能夠抑制一個(gè)NK細(xì)胞敏感的靶細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解，其中所述交聯(lián)的單克隆抗體不是Z199。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該抑制性抗體進(jìn)一步的特征在于結(jié)合非人靈長類動物NKG2A。在一更優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，抑制性抗體或其片段包括Z270的可變輕鏈區(qū)的氨基酸序列，或Z270的可變重鏈區(qū)的氨基酸序列。在最優(yōu)選的具體實(shí)施方式
之一中，該抗體是Z270。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該抑制性抗體或片段是嵌合的或人源化的。更優(yōu)選的是包括ch270VK或ch270VH的抑制性抗體或其抑制性片段。在另一個(gè)最優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該抗體是chZ270或Z270。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包括一種有效量的上述抑制性抗體或其抑制性片段、或Z199 ;以及一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這些抑制性抗體組合物優(yōu)選進(jìn)行配制以用于藥學(xué)上的應(yīng)用。本發(fā)明的抑制性抗體組合物可選包括對治療特征在于不希望的其他細(xì)胞的NK細(xì)胞介導(dǎo)的溶解、過度活化的NK細(xì)胞活性或不需要的NK細(xì)胞增生的疾病或癥狀有用的第二治療劑。這樣的第二治療劑可以選自例如細(xì)胞因子、抗癌化合物(如化學(xué)治療用化合物、抗血管形成化合物、促進(jìn)凋亡的化合物、激素劑、干擾DNA復(fù)制、有絲分裂和/或染色體分離的化合物、或破壞多核苷酸前體的合成和保真度的試劑)、輔助性化合物、能夠刺激抑制性NK細(xì)胞受體的化合物(如能夠刺激⑶94/NKG2A受體或抑制性KIR受體如KIR2DL1、KIR2DL2、 KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2的活性的天然配體、抗體或小分子)、或活化的NK細(xì)胞受體(如 NKp30、NKp44 或 NKp46)的抑制劑。本發(fā)明的抑制性抗體和片段可以在減少NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的方法中使用?？商鎿Q地，本發(fā)明的抑制性抗體和片段可以在減少細(xì)胞種群中的NK細(xì)胞數(shù)量的方法中使用。這兩種方法都包括將所述NK細(xì)胞與抑制性單克隆抗體或片段進(jìn)行接觸的步驟。本發(fā)明的包括抑制性抗體的藥學(xué)上適合的組合物可用于治療或預(yù)防患有以不希望的NK細(xì)胞介導(dǎo)的其他細(xì)胞溶解、過度活化的NK細(xì)胞活性、或不需要的NK細(xì)胞增生為特征的疾病或癥狀的患者的方法中，所述方法包括給予患者所述組合物的步驟。一種這樣的癥狀是NK-LDGL。NK-LDGL(粒狀淋巴細(xì)胞的NK-型淋巴細(xì)胞增生性疾??；另外稱之為NK-LGL)是指由NK細(xì)胞或NK樣細(xì)胞，即表現(xiàn)出表面抗原表達(dá)的特性組合(例如，⑶3_、CD56+、CD16+等等；參見，例如Loughran (1993) Blood 82 1)的大粒狀淋巴細(xì)胞的克隆擴(kuò)增引起的一類增生性障礙。在一可替換的具體實(shí)施方式
中，利用本發(fā)明的抑制性抗體的任何方法可以包括給予所述患者第二治療劑的附加步驟。第二治療劑是正常情況下用于治療以不希望的NK細(xì)胞介導(dǎo)的其他細(xì)胞溶解、過度活化的NK細(xì)胞活性或不需要的NK細(xì)胞增生為特征的疾病或癥狀的藥劑。這樣的藥劑的實(shí)例在上文中已陳述。該第二治療劑可以作為單獨(dú)的劑型或作為所述抑制性抗體或片段組合物的一個(gè)成分給予。另一方面，本發(fā)明提供一種包括本文中描述的抗體或其片段的任何一個(gè)或多個(gè)的試劑盒。通常，該試劑盒還包括一根據(jù)本發(fā)明方法使用該抗體的說明書。在相關(guān)的具體實(shí)施方式
中，該試劑盒在一個(gè)單獨(dú)的容器中另外包括一個(gè)第二治療劑，如上面描述的用于在治療或預(yù)防各種疾病或癥狀中與活化或抑制性抗體或片段聯(lián)用的那些中的任一種。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種評價(jià)針對人類NKG2A的抗體的方法，包括以下步驟a)將所述抗體與其表面上具有以NKG2A為特征的非人靈長類動物細(xì)胞、或非人靈長類動物NKG2A多肽進(jìn)行接觸jPb)評估所述抗體與所述細(xì)胞或多肽結(jié)合或影響所述細(xì)胞或多肽結(jié)合的活性的能力。在一個(gè)相關(guān)的具體實(shí)施方式
中，該方法用于評價(jià)活化的抗體；將所述抗體與包含非人靈長類動物NK細(xì)胞和靶細(xì)胞的細(xì)胞種群進(jìn)行接觸，其中所述NK細(xì)胞的特征在于在其表面上的NKG2A，并且所述靶細(xì)胞的特征在于在其表面存在HLA-E ;并且所述評估步驟是確定所述靶細(xì)胞是否被溶解。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)適用于人類的疾病治療的抗體的方法，所述方法包括a)用包括人類NKG2A的組合物使非人類哺乳動物免疫；b)選擇結(jié)合NKG2A、但不結(jié)合NKG2C或NKG2E的單克隆抗體；c)使所述抗體適合于人類使用；d)將所述抗體給予非人靈長類動物；以及e)評估所述抗體在所述靈長類動物體體內(nèi)與NKG2A的結(jié)合能力和所述靈長類動物對所述抗體的耐受性。如果該抗體與之結(jié)合并且被所述非人靈長類動物所耐受，則表明所述抗體適用于人類的疾病治療。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該方法包括在步驟d之前修飾所述抗體使之不結(jié)合于Fe受體的附加步驟。本發(fā)明還提供了通過這種方法生產(chǎn)的一種抗體。在又一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種對于針對人類NKG2A的一種治療抗體的合適的給藥方案進(jìn)行鑒別的方法，所述方法包括a)利用其中所述抗體的劑量和頻率 被改變的一系列給藥方案將所述抗體給予一個(gè)非人靈長類動物jPb)確定表達(dá)NKG2A的細(xì)胞在所述非人靈長類動物體內(nèi)的活性和所述靈長類動物對于每一種所述給藥方案的耐受性。一旦確定一種方案被所述靈長類動物耐受并且導(dǎo)致可以檢測到的對在所述表達(dá)NKG2A的細(xì)胞的活性中的調(diào)節(jié)，則該給藥方案被認(rèn)為適用于人類。根據(jù)一可替換的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明提供了一種結(jié)合物，包括a) —種抑制性或活性抗體，和b) —種細(xì)胞毒性試劑。所得到的結(jié)合物用于殺死NK細(xì)胞。因此，活性抗體與細(xì)胞毒性試劑的結(jié)合將產(chǎn)生一種殺死NK細(xì)胞的分子，與單獨(dú)通過活性抗體所實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞活化相反。本發(fā)明的細(xì)胞毒素/抗體結(jié)合物能夠以一種類似于本發(fā)明的抑制性抗體的方式配制到組合物中并用于各種方法。


圖I示出重建用抗-NKG2A mAb的溶解，具體地為克隆體Z270 (mlgGl)。其示出了三種不同濃度的Z270對處于不同的NK細(xì)胞與PHA胚細(xì)胞比率的表達(dá)HLA-E的PHA胚細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解的影響。圖2示出重建用抗-NKG2A mAb的溶解，具體地為克隆體Z199 (mlgG2b)。其示出了三種不同濃度的Z199對處于不同的NK細(xì)胞與PHA胚細(xì)胞比率的表達(dá)HLA-E的PHA胚細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解的影響。圖3示出重建用抗-NKG2A mAb的溶解，具體地為第13天的NK主體/PHA胚細(xì)胞，其中E/T比率=I. 50ii g/ml mAb。其示出了 Z270的F (ab' ) 2片段對表達(dá)HLA-E的PHA胚細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解的影響。圖4示出第16天的抗-NKG2A mAb、克隆體Z270與短尾猴NK主體的結(jié)合(300u/ml)。其示出了結(jié)合于短尾猴NK細(xì)胞的抗體Z270以及IgGl和抗-⑶16，證實(shí)了 Z270結(jié)合于短尾猴NK細(xì)胞。還對獼猴和狒狒顯示出了結(jié)合。
具體實(shí)施例方式引言本發(fā)明提供針對NKG2A的新的抗體，這些抗體活化NK細(xì)胞介導(dǎo)的以在其細(xì)胞表面上存在表達(dá)HLA-E或Qalb的細(xì)胞為特征的靶細(xì)胞溶解；提供用于生產(chǎn)、評價(jià)和表征用于治療用途的這些抗體的方法；以及提供包括用于治療自身免疫或炎性障礙和其他的以其細(xì)胞表面上存在表達(dá)HLA-E或Qalb的細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)為特征的癥狀的那些抗體的組合物和使用這樣的抗體用于治療自身免疫或炎性障礙和其他的以其細(xì)胞表面上存在表達(dá)HLA-E或Qalb的細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)為特征的癥狀的方法。本發(fā)明部分地基于令人意外的發(fā)現(xiàn)，即NKG2A對于通過許多NK細(xì)胞抑制成熟樹突細(xì)胞的溶解中負(fù)有主要責(zé)任。成熟樹突細(xì)胞表達(dá)顯著水平的HLA-E，其通過NK細(xì)胞上存在的NKG2A受體發(fā)揮作用以抑制樹突細(xì)胞的靶向作用。因此，不受限于下面的理論，所相信的情況是阻止NKG2A介導(dǎo)的NK細(xì)胞抑制導(dǎo)致了由NK細(xì)胞靶向的樹突細(xì)胞的增多，從而提供對于自身免疫性障礙或炎性障礙或?qū)嶋H上對于任何可通過減少樹突細(xì)胞、尤其是成熟樹突細(xì)胞的活性來減輕或治愈的癥狀的有效治療。因此，更一般而言，本發(fā)明還提供了在哺乳動物中抑制或減少樹突細(xì)胞、優(yōu)選成熟樹突細(xì)胞的數(shù)量，以及通常減少免疫反應(yīng)、優(yōu)選自身反應(yīng)性免疫反應(yīng)的方法。相反地，本發(fā)明還提供針對NKG2A的新抗體，其抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞溶解；提供生產(chǎn)、評價(jià)和表征用于治療用途的那些抗體的方法；以及提供包括用于治療自身免疫疾病或移植排斥的那些抗體的組合物和使用這些抗體的方法。 定義如本文所使用，除非另外說明，下面的術(shù)語具有賦予它們的含義。如本文中所使用，“NK”細(xì)胞是指在非傳統(tǒng)免疫中涉及的淋巴細(xì)胞的亞群。NK細(xì)胞可以借助于某些特性和生物學(xué)性質(zhì)加以鑒別，如特異性表面抗原包括⑶16、⑶56和/或⑶57的表達(dá)、在細(xì)胞表面上缺少a/0或y/S TCR復(fù)合體、通過活化特異性細(xì)胞溶解酶而結(jié)合和殺死不能表達(dá)“自身”MHC/HLA抗原的細(xì)胞的能力、殺死腫瘤細(xì)胞或其他的表達(dá)用于NK活化受體的配體的疾病細(xì)胞的能力、以及釋放刺激或抑制免疫反應(yīng)的稱為細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)分子的能力。任何這些特性或活性可以利用本領(lǐng)域熟知的方法用來鑒別NK細(xì)胞。樹突細(xì)胞是骨髓中產(chǎn)生的免疫細(xì)胞的異源種群(參見，例如，0’Neill etal. (2004)Blood 104 :2235-2246, Mohamadzadeh et al. (2004)J Immune Based TherVaccines. 2004 ；2 :1 ;將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。如本文中提到的，DC可包括DC前體、不成熟DC和成熟DC。DC前體和不成熟DC是種系負(fù)性(CD3-CD14-CD19-CD56-)HLA-DR+單核細(xì)胞。這些細(xì)胞可以被進(jìn)一步分成兩個(gè)種群髓樣DC和漿細(xì)胞樣DC。髓樣DC是⑶I Ic+和⑶123低，并具有單核細(xì)胞樣外觀，而漿細(xì)胞樣DC是⑶IIc-和⑶123高，且具有類似于漿細(xì)胞的形態(tài)特征。在抗原捕獲后，DC經(jīng)歷一個(gè)成熟的過程，其中捕獲的抗原被處理為肽并加載到MHC I類或II類上用于在細(xì)胞表面上呈遞。成熟DC細(xì)胞表現(xiàn)出較低的吞噬攝取，具有稱為菌幕的胞質(zhì)擴(kuò)展，移動到淋巴組織，并表達(dá)特征標(biāo)記物如⑶83和DC-LAMP。TLR還在DC中被表達(dá)，其中不同DC型表達(dá)不同的TLR標(biāo)記(參見，例如，O’Neill et al. (2004))。NKG2A(0MIM 161555，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)是轉(zhuǎn)錄物的NKG2群的一員(Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173 :1017-1020)。NKG2A 被跨接 25kb 的 7 個(gè)外顯子編碼，表現(xiàn)出一些差異性剪接。NKG2A是一種在NK細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的抑制性受體。與抑制性KIR受體相似，在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中具有ITIM。如本文中用到的，“NKG2A”是指NKG2A基因或編碼的蛋白的任何變異體、衍生物或同工型。還包括在內(nèi)的是與野生型(全長NKG2A)共有一種或多種生物學(xué)性質(zhì)或功能的任何核酸或蛋白質(zhì)序列，并且具有至少70%、80%、90%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的核苷酸或氨基酸一致性。NKG2A在本文通篇中也被稱為“NKG2A受體”。NKG2C (0MIM 602891，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)和NKG2E (0MM 602892，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)是轉(zhuǎn)錄物的NKG2群的另外的兩個(gè)成員(Gilenke，etal. (1998) Immunogenetics 48:163-173)。NKG2C 和 NKG2E 是在 NK 細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的活化受體。如本文中用到的，“NKG2C”和“NKG2E ”分別是指NKG2C或NKG2E基因或編碼的蛋白的任何變異體、衍生物或同工型。還包括的是與野生型(全長NKG2C或NKG2E)共有一種或多種生物性質(zhì)或功能的任何核酸或蛋白質(zhì)序列，并且與披露的基因或編碼的蛋白質(zhì)具有至少70 %、80 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或更高的核苷酸或氨基酸一致性。CD94(0MM 602894，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。CD94是一種優(yōu)先在NK細(xì)胞上表達(dá)的抗原(Chang et al. (1995)Europ. J. Immun. 25 :2433-2437)。CD94 在 NK 細(xì)胞系中被表達(dá)為0. 8、I. 8和3. 5kb的3個(gè)主要轉(zhuǎn)錄物和5. 5kb的一個(gè)次要轉(zhuǎn)錄物，并對具有147個(gè)氨基酸胞外結(jié)構(gòu)域和C-型凝集素的多個(gè)基序特征的一種蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。CD94的氨 基酸序列與那些NKG2家族成員NKG2A、NKG2C、NKG2D和NKG2E具有27% 32%的一致性。由于實(shí)際缺乏胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所以CD94要求與其他受體聯(lián)合，與NKG2A、NKG2C和NKG2E形成二硫鍵合的雜二聚體(Lazetic et al. (1996) J. Immun. 157 :4741-4745)。如本文中所所使用，“CD94”是指CD94基因或編碼的蛋白的任何變異體、衍生物或同工型。還包括在內(nèi)的是與野生型(全長CD94)共有一種或多種生物性質(zhì)或功能的任何核酸或蛋白質(zhì)序列，并且具有至少70 %、80 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或更高的核苷酸或氨基酸一致性。HLA-E(0MIM 143010，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)是一個(gè)非典型MHC分子，其被表達(dá)在細(xì)胞表面上并且通過結(jié)合由其他的MHC I類分子的信號序列衍生的肽進(jìn)行調(diào)控。HLA-E結(jié)合自然殺傷(NK)細(xì)胞和一些T細(xì)胞，特異性地與⑶94/NKG2A、⑶94/NKG2B和⑶94/NKG2C結(jié)合，并且不與抑制性KIR受體結(jié)合(參見，例如，OMM 604936，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)(參見，例如，Braud et al. (1998)Nature 391 :795_799，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。HLA-E的表面表達(dá)足以保護(hù)靶細(xì)胞不受CD94/NKG2A+NK細(xì)胞克隆體的溶解。如本文所所使用，“HLA-E”是指HLA-E基因或編碼的蛋白的任何變異體、衍生物或同工型。還包括的是與野生型(全長HLA-E)共有一種或多種生物學(xué)性質(zhì)或功能的任何核酸或蛋白質(zhì)序列，并且具有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸或氨基酸一致性。Qalb是小鼠細(xì)胞表面抗原，其是NKG2A的生理學(xué)配體。如本文所使用的，“Qalb”是指Qalb基因或編碼的蛋白的任何變異體、衍生物或同工型。還包括在內(nèi)的是與野生型(全長Qalb)共有一種或多種生物學(xué)性質(zhì)或功能的任何核酸或蛋白質(zhì)序列，并且具有至少70%、80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的核苷酸或氨基酸一致性?！白陨砻庖咝浴闭系K包括源于對辨別自身與非自身或其他細(xì)胞的能力的破壞而導(dǎo)致的其中免疫系統(tǒng)發(fā)動針對自身細(xì)胞或組織的任何障礙、癥狀或疾病。自身免疫性障礙的實(shí)例包括橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto ' s thyroiditis)、惡性貧血、阿狄森氏病(Addison; s disease)、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、干燥綜合癥、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、賴特氏綜合癥、格雷夫氏病、多發(fā)性肌炎、格林巴利綜合癥、韋格納肉芽腫、結(jié)節(jié)性多動脈炎、風(fēng)濕性多肌痛、顳動脈炎、白塞氏病、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(Churg-Strauss syndrome)、高安氏動脈炎和其他障礙?！把仔哉系K”包括以不需要的免疫反應(yīng)為特征的任何障礙。自身免疫和炎性障礙可涉及免疫系統(tǒng)的任何部分，并且可以在體內(nèi)靶向任何細(xì)胞或組織型。關(guān)于NKG2A活性的術(shù)語“抑制”、“減少”、“阻斷”、“下行調(diào)節(jié)”和“減量調(diào)節(jié)”是指可以減慢、減少、逆轉(zhuǎn)或以任何方式負(fù)面性地影響細(xì)胞(優(yōu)選NK細(xì)胞)上的NKG2A受體的刺激或表達(dá)的任何過程、方法或化合物。這些術(shù)語可以指這樣的化合物，它們通過配體抑制對NKG2A的刺激、它們在缺少配體的情況下拮抗性地發(fā)揮作用以降低該受體的活性、它們降低受體的表達(dá)水平、它們阻斷NKG2A觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或基因表達(dá)、或者它們阻斷任何由NKG2A活化導(dǎo)致的該細(xì)胞的其他活性。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該抑制性化合物或方法阻止受體通過一個(gè)配體例如HLA-E的結(jié)合。NKG2A受體分子的數(shù)量或任何在此描述的活性可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)途徑(例如在本申請其他地方披露的)進(jìn)行檢測。如本文所使用的，術(shù)語“抗體”是指多克隆抗體和單克隆抗體。取決于重鏈中恒定結(jié)構(gòu)域的類型，抗體被分為五大類之一 IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它們的一些進(jìn)一步被分為亞類或同種型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等等。一個(gè)示例性免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單 位包括一個(gè)四聚體。每一個(gè)四聚體是由兩個(gè)相同的多肽鏈對組成，每一對具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的N-端定義為約100 110或更多個(gè)氨基酸的一個(gè)可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原識別。術(shù)語“可變輕鏈(\)”和“可變重鏈(Vh) ”分別是指這些輕鏈和重鏈。對應(yīng)于不同種類免疫球蛋白的這些重鏈恒定結(jié)構(gòu)域被分別稱為“ a ”、“ 6 ”、“ e ”、“ y ”和“ ii ”。不同種類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是熟知的。本發(fā)明中優(yōu)選使用的抗體種類為IgG和/或IgM，其中尤其優(yōu)選為IgG，因?yàn)樗鼈兪巧頎顩r下最普通的抗體并且因?yàn)樗鼈冏钊菀自趯?shí)驗(yàn)室條件下制備。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。尤其優(yōu)選是人源化的、嵌合的、人類或其他適合人類的抗體。術(shù)語“抗體”也包括任何本文描述的抗體的片段或衍生物，除非在本發(fā)明披露內(nèi)容的上下文中這樣的包括變得重復(fù)多余(例如，特定參照“一種抗體或其片段”)。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該抗體是非-耗盡性抗體，意思是指它們與NK細(xì)胞結(jié)合并且抑制NKG2A刺激(該刺激導(dǎo)致在它們細(xì)胞表面上帶有HLA-E或Qalb的細(xì)胞溶解)，但不導(dǎo)致殺死NKG2A表達(dá)細(xì)胞。非-耗盡性抗體或抗體片段是那些不被Fe受體識別或僅僅被很弱地識別的抗體或抗體片段，如IgG4抗體、缺乏Fe部分的抗體片段、或其Fe尾部被修飾以減少或消除由Fe受體結(jié)合的任何其他抗體(參見，例如W003101485，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，抗體或抗體片段與Fe受體結(jié)合。這樣的抗體和片段引起NKG2A分子的交聯(lián)，導(dǎo)致抑制NK細(xì)胞活性，并且在一些情況下，導(dǎo)致NK細(xì)胞死亡。術(shù)語“特異性結(jié)合”是指當(dāng)利用重組形式的蛋白、其中的表位、或在分離的NK或其他細(xì)胞表面上存在的天然蛋白進(jìn)行評價(jià)時(shí)，抗體(優(yōu)選在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中)可以結(jié)合至結(jié)合伴侶例如NKG2A。競爭性結(jié)合試驗(yàn)和其他用于確定特異性結(jié)合的方法在下文中進(jìn)一步描述并且在本領(lǐng)域是熟知的。“人類適合的”抗體是指任何可以安全地用于人類例如用于本文描述的治療方法的抗體、衍生的抗體或抗體片段。人類適合的抗體包括所有形式的人源化、嵌合或完全的人類抗體，或其中抗體的至少一部分衍生自人類或其他方式修飾的任何抗體，以避免在使用天然非人類抗體時(shí)通常會引起的免疫反應(yīng)。為了本發(fā)明的目的，一個(gè)“人源化”抗體是指一種抗體，其中一個(gè)或多個(gè)人類免疫球蛋白的恒定和可變框架結(jié)構(gòu)區(qū)與動物免疫球蛋白的結(jié)合區(qū)(如CDR)融合。設(shè)計(jì)這樣的人源化抗體以保持非人類抗體(結(jié)合區(qū)域由其衍生而來)的結(jié)合特異性，而避免對非人類抗體的免疫反應(yīng)。一個(gè)“嵌合抗體”是一種抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其一個(gè)部分被改變、取代或交換以使抗原結(jié)合點(diǎn)(可變區(qū))被連接至不同或改變種類的恒定區(qū)、效應(yīng)器功能和/或物種，或一種賦予嵌合抗體新特性的完全不同的分子例如酶、毒素、激素、生長因子、藥劑等等；或(b)可變區(qū)或其一個(gè)部分被具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、取代或交換?！獋€(gè)“人類”抗體是從轉(zhuǎn)基因小鼠或其他動物(其被“基因工程化”以在抗原激發(fā)響應(yīng)中產(chǎn)生特異性人類抗體。(參見，例如，Green et al. (1994)Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature368 :856 ；Taylor et al. (1994) Int Immun 6 :579,將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。一個(gè)完全的人類抗體也可以通過遺傳或染色體轉(zhuǎn)染的方法和噬菌體顯示技術(shù)(這些都是本領(lǐng)域已知的)加以構(gòu)建(參見，例如，McCafferty et al. (1990)Nature 348:552-553)。人類抗體也可以通過體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生(參見，例如，美國專利第5，567，610號和5，229，275號，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。在本發(fā)明的背景中，“活性”或“活化”的NK細(xì)胞是指生物學(xué)活性NK細(xì)胞，更具體地，是具有溶解靶細(xì)胞能力的NK細(xì)胞。例如，“活性”NK細(xì)胞是能夠殺傷表達(dá)NK活化受體-配體但不能表達(dá)“自身"MHC/HLA抗原的細(xì)胞(KIR不相容細(xì)胞)。這樣的細(xì)胞在本文中也被稱為“NK細(xì)胞敏感的祀細(xì)胞”。適用于重導(dǎo)向殺傷實(shí)驗(yàn)(redirected killing assay)的這樣的靶細(xì)胞的實(shí)例是P815和K562細(xì)胞。然而，多個(gè)細(xì)胞種類的任何一種均可使用并且在本領(lǐng)域是熟知的(參見，例如，Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186 :1129-1136 ;Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187 :2065-2072 ；Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188 953-960 ；Neri et al. (2001)Clin. Diag. Lab. Immun. 8 :1131-1135)?！盎钚?，，或“活化，，的細(xì)胞也可以通過與NK活性相關(guān)領(lǐng)域已知的任何其他性質(zhì)或活性來進(jìn)行鑒定，如在游離胞內(nèi)鈣水平下細(xì)胞因子(例如IFN-Y和TNF-a)生產(chǎn)的提高。為了本發(fā)明的目的，活化的NK細(xì)胞理想地是指這樣的NK細(xì)胞，其中NKG2A受體沒有被刺激，并且其中一個(gè)NCR (優(yōu)選NKp30)被刺激，從而導(dǎo)致產(chǎn)生針對成熟樹突細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如在本文中使用的術(shù)語“NKG2A刺激”是指當(dāng)NKG2A結(jié)合其天然配體(例如，HLA-E或Qalb)或其一個(gè)功能性片段時(shí)在一個(gè)帶有NKG2A的細(xì)胞(例如，NK細(xì)胞)中發(fā)生的過程。因?yàn)镹KG2A是一個(gè)抑制性受體，所以這樣的結(jié)合可以導(dǎo)致NK細(xì)胞活性的抑制。因此，“NKG2A刺激的抑制”是指這樣的過程，通過其NKG2A與其天然配體或其功能性片段的結(jié)合在結(jié)合發(fā)生處被減少或抑制，但不引起NK細(xì)胞活性的抑制。因此，如在本文提及針對NKG2A的抗體中所使用的術(shù)語“活化抗體”是用來指這樣的一個(gè)抗體，其通過結(jié)合到NK細(xì)胞上的NKG2A而阻止NKG2A與其靶細(xì)胞上天然的配體(例如，HLA-E或Qalb)結(jié)合，或阻止通常通過HLA-E陽性靶介導(dǎo)的NKG2A依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，由此逆轉(zhuǎn)由NKG2A與配體結(jié)合引起的通過NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的溶解的抑制。因此，一個(gè)活化抗體引起對NKG2A刺激的抑制。
如本文對于針對NKG2A的抗體所使用的術(shù)語“抑制性抗體”是用來指這樣的一個(gè)抗體，其通過結(jié)合到NK細(xì)胞上的NKG2A而引起NK細(xì)胞對在其他情況下應(yīng)當(dāng)被溶解的細(xì)胞進(jìn)行溶解的能力的抑制。本發(fā)明的抑制性抗體通常在NK細(xì)胞內(nèi)引起NKG2A分子的交聯(lián)，這導(dǎo)致NK細(xì)胞的抑制和有時(shí)導(dǎo)致死亡。應(yīng)該注意，本發(fā)明的針對NKG2A的抑制性抗體可以阻止NKG2A與其天然配體或其活性片段的結(jié)合，但不會導(dǎo)致帶有該天然配體的細(xì)胞溶解，因?yàn)镹K細(xì)胞溶解細(xì)胞的能力已經(jīng)被該抗體抑制。術(shù)語“分離出的” “純化的”或“生物純的”是指大致或基本上沒有以其天然狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的通常伴隨的成分的物質(zhì)。純度和同質(zhì)性通常是用分析化學(xué)技術(shù)如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜來確定。在一種制備物中以主要物種存在的一種蛋白質(zhì)是基本上被純化的。如本文中使用的術(shù)語“生物樣品”包括但不限于生物液體(例如血清、淋巴、血液)、細(xì)胞樣品或組織樣品(例如骨髓)。在本文中可互換使用的術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”是指氨基酸殘基的聚合物。 這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。當(dāng)參照例如細(xì)胞或核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)使用的術(shù)語“重組”是指該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過引入異源核酸或蛋白或天然核酸或蛋白變異而被修飾，或該細(xì)胞來源于被如此修飾的一個(gè)細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的天然(非重組)形式中沒有的基因，或表達(dá)其他方面異常表達(dá)、低表達(dá)或完全不表達(dá)的天然基因。當(dāng)參照一個(gè)特定的單克隆抗體(例如Z199或Z270)時(shí)，術(shù)語“競爭”是指在利用重組NKG2A分子或表面表達(dá)的NKG2A分子的一個(gè)結(jié)合試驗(yàn)中，被檢測的抗體或其片段減少該參照單克隆抗體(例如Z199或Z270)與NKG2A的結(jié)合(與包含該參照單克隆抗體和NKG2A但缺乏該試驗(yàn)抗體的一個(gè)對照相比較)。例如，在一個(gè)結(jié)合試驗(yàn)中，如果一個(gè)抗體減少Z270與人類NKG2A分子的結(jié)合，則該抗體與Z270 “競爭”結(jié)合到人類NKG2A上。如本文中所使用的術(shù)語“完全競爭”是指該試驗(yàn)抗體大致或基本上結(jié)合到與參照單克隆抗體相同的表位上。如本文中所使用的“有效量”是指任何要達(dá)到或促進(jìn)一個(gè)所期望結(jié)果的必要或充分的量。在一些情形下，一個(gè)有效量是一個(gè)治療有效量。一個(gè)治療有效量是在受治療者體內(nèi)用于促進(jìn)或達(dá)到一個(gè)所期望的生物學(xué)反應(yīng)必要或充分的任何量。對于任何特定應(yīng)用的有效量可根據(jù)以下因素變化被治療的疾病或癥狀、所給予的特定藥劑、受治者的大小、或疾病或癥狀的嚴(yán)重性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以憑經(jīng)驗(yàn)判斷一個(gè)特定藥劑的有效量而無需進(jìn)行過度試驗(yàn)。術(shù)語非人靈長類動物包括屬于靈長目的任何哺乳動物，其包括猿，新世界猴，舊世界猴，原猴，婆羅洲猩猩Oorneo orangutan),蘇門達(dá)臘猩猩(Sumatran orangutan),大猩猩(western lowland gorilla),倭黑猩猩(bonobo),黑猩猩(chimpanzee),白臉黑猩猩(chimpanzee),褐狐猴(brown lemur),白須檉柳猴(white-lipped tamarin),紅腹檉柳猴(red-bellied tamarin),巴拉圭滅(Paraguayan titi),松鼠猴(squirrel monkey),黑掌蜘蛛猴(black-handed spider monkey),絨毛猴(woolly monkey),紅面猴(stumptaiImacaque)，食蟹稱猴(crab-eating macaque),日本稱猴(japanese macaque),稱猴(rhesusmonkey)，豚尾猴(pigtailed macaque)，黑冠稱猴(Celebes ape)，赤猴(patas monkey)，狒狒，狨，卷尾猴，短尾猴，吼猴，蜘蛛猴，西非大狒狒，長尾猴，赤猴，疣猴，長臂猿，狐猴，指猴，蜂猴，嬰猴，和跗猴。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明中利用的非人靈長類動物不是猿猴，例如，是除了黑猩猩、大猩猩、猩猩或長臂猿的非人靈長類動物。為了本發(fā)明的目的，用非人靈長類動物實(shí)施的試驗(yàn)包括體內(nèi)試驗(yàn)(其中將抗體給予該靈長類動物)、體外試驗(yàn)(其中例如將取自靈長類動物的細(xì)胞用抗體處理并且返回到該靈長類動物)以及涉及取自靈長類動物的細(xì)胞、蛋白質(zhì)或組織的體外試驗(yàn)。如果說諸如非人靈長類動物的一個(gè)哺乳動物“耐受” 一個(gè)抗-NKG2A抗體的給藥方案，則意味著該給藥在動物中不是致命的并且沒有嚴(yán)重的副作用，盡管副作用依然可能存在，但只要它們不嚴(yán)重，并且通常它們被通過給藥提供的治療益處所超過。獲得與NKG2A特異性結(jié)合的化合物本發(fā)明涉及與在免疫細(xì)胞上，優(yōu)選在NK細(xì)胞上的NKG2A結(jié)合的活化和抑制性抗 體，以及它們的鑒定、生產(chǎn)、評價(jià)和應(yīng)用。鑒定這樣的抗體的一種方法是找出能夠與NKG2A結(jié)合的那些抗體。一旦鑒定了特異性結(jié)合的抗體，就可以檢測它們抑制或活化例如在NK細(xì)胞上的NKG2A的能力。然而，應(yīng)當(dāng)理解，進(jìn)行這樣的結(jié)合試驗(yàn)對于本發(fā)明的實(shí)踐來說不是必需的。多種試驗(yàn)中的任何一種均可以用于評價(jià)抗體與NKG2A的結(jié)合。除其他之外，基于ELISA、放射免疫試驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡、BIAC0RE和其他競爭試驗(yàn)等的方案都適合利用并且是本領(lǐng)域熟知的。例如，可以使用簡單的結(jié)合試驗(yàn)，其中在靶蛋白或表位(例如，NKG2A或其部分)存在的情況下孵育試驗(yàn)抗體，未結(jié)合的抗體被洗掉，存在的結(jié)合抗體用以下方法評價(jià)，例如，放射性標(biāo)記、物理方法如質(zhì)譜、或者利用例如細(xì)胞熒光測定法分析(例如FACScan)檢測的直接或間接熒光標(biāo)記檢測。這樣的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。高于用一個(gè)對照的非特異性抗體所觀察的量的任何結(jié)合的量即表明該抗體特異性地結(jié)合到該靶標(biāo)上。在這樣的試驗(yàn)中，試驗(yàn)抗體結(jié)合靶細(xì)胞或人類NKG2A的能力可以與(陰性)對照蛋白例如針對結(jié)構(gòu)不相關(guān)的抗原或非-Ig肽或蛋白產(chǎn)生的抗體結(jié)合相同靶標(biāo)的能力進(jìn)行比較。相對于對照蛋白，使用任何合適的試驗(yàn)，以25 %、50 %、100 %、200 %、1000 %或更高增加的親和力結(jié)合靶蛋白或NKG2A的抗體或片段被稱為與靶標(biāo)“特異性結(jié)合”或與靶標(biāo)“特異地相互作用”，并且它們在下面描述的治療方法中優(yōu)選被使用。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，評價(jià)了一個(gè)試驗(yàn)抗體影響的一個(gè)(陽性)對照抗體(例如3S9，20d5，Z270或Z199，或它們的衍生物)針對NKG2A的結(jié)合能力。在另一個(gè)實(shí)施方式中，測試了一個(gè)試驗(yàn)抗體影響一個(gè)自然配位體對于NKG2A，例如HLA-E，的結(jié)合能力。美國專利公開20030095965種說明了 3S9，該公開通過引用結(jié)合在此。3S9與NKG2C和NKG2E以及 NKG2A 向結(jié)合。20d5 是一種可商購的抗體(BD Biosciences Pharmingen, CatalogNo. 550518，USA)。20d5與小鼠的NKG2A, NKG2E和NKG2C相結(jié)合。Z199是一種可商購的抗體(Beckman Coulter, Inc. ,Product No.頂2750,USA)。Z270 在此充分說明。Z270 特別與人類NKG2A結(jié)合，但不結(jié)合人類NKG2C或NKG2E。此外，可采用簡單的競爭測試，其中一個(gè)對照抗體(例如3S9，Z270或Z199)與一個(gè)試驗(yàn)抗體被混合在一起(或預(yù)先吸附)并施用到一個(gè)含NKG2A的樣品上。在某些實(shí)施方式中，可在施用到含NKG2A的樣品上之前的一段時(shí)間將多種對照抗體與不同量的試驗(yàn)抗體預(yù)先混合(例如，I 10或I : 100)。在其他實(shí)施方式中，該對照與不同量的試驗(yàn)抗體在暴露于抗原/靶樣品期間可以被簡單地混合。只要可以區(qū)分結(jié)合抗體和游離抗體(例如，通過使用分離或洗滌技術(shù)來除去未結(jié)合的抗體)以及區(qū)分對照抗體和試驗(yàn)抗體(例如，通過使用物種-或同種型-特異性的二級抗體，通過用可檢測標(biāo)記特異性地標(biāo)記對照抗體，或通過使用物理方法例如質(zhì)譜來區(qū)分不同的化合物)，就能夠確定試驗(yàn)抗體是否減少對照抗體與抗原的結(jié)合，表明試驗(yàn)抗體大致識別與對照相同的表位。在上面描述的競爭性試驗(yàn)中，在完全不相關(guān)抗體存在的情況下，(標(biāo)記的)對照抗體的結(jié)合是對照高值。對照低值通過孵育標(biāo)記的(陽性)對照抗體(例如3S9、Z270或Z199)和完全相同類型的未標(biāo)記抗體(例如3S9、Z270或Z199)而得到，其中可以產(chǎn)生競爭并且減少標(biāo)記抗體的結(jié)合。在試驗(yàn)分析中，在試驗(yàn)抗體存在的情況下，經(jīng)標(biāo)記的抗體反應(yīng)性的顯著降低表明 試驗(yàn)抗體識別相同的表位，也就是與經(jīng)標(biāo)記的對照抗體“交叉反應(yīng)”的抗體。以對照試驗(yàn)抗體或化合物在約I : 10至約I : 100之間的比例，減少經(jīng)標(biāo)記的對照與抗原/靶標(biāo)的結(jié)合的至少50%或更優(yōu)選70%的任何試驗(yàn)抗體或化合物被認(rèn)為是基本上結(jié)合與對照一樣的表位或決定子的抗體或化合物。優(yōu)選地，這樣的試驗(yàn)抗體或化合物將減少對照與抗原/靶標(biāo)的結(jié)合的至少90%。盡管如此，將一個(gè)對照抗體或化合物的結(jié)合減少到任何可以檢測程度的任何化合物或抗體都可以用于本發(fā)明。與所討論的單克隆抗體大致結(jié)合到相同的表位的一種或多種抗體的鑒定可以容易地通過利用免疫篩選試驗(yàn)的任何一種來確定，其中可以評估抗體競爭。這樣的試驗(yàn)在本領(lǐng)域是常規(guī)性的(參見，例如，美國專利第5，660，827號，將其通過引用結(jié)合在此)。應(yīng)當(dāng)理解，為了鑒定一個(gè)抗體結(jié)合到與所討論的單克隆抗體相同或基本上相同的表位上并不要求實(shí)際確定該抗體所結(jié)合的表位。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可以通過流式細(xì)胞儀試驗(yàn)來評價(jià)競爭。例如，帶有NKG2A/CD94受體的細(xì)胞先用已知與該受體特異性結(jié)合的對照抗體(例如，3S9、Z270或Z199)孵育，然后用已用例如熒光色素或生物素標(biāo)記的試驗(yàn)抗體孵育。如果通過用飽和量的對照抗體預(yù)孵育所獲得的結(jié)合是沒有用對照預(yù)孵育的抗體所獲得的結(jié)合(熒光均值)的80%、優(yōu)選50^^40%或更少，則稱試驗(yàn)抗體與該對照競爭。可替換地，如果通過利用在細(xì)胞上的標(biāo)記對照(用熒光色素或生物素)與飽和量的試驗(yàn)抗體預(yù)孵育獲得的結(jié)合是沒有與該抗體預(yù)孵育獲得的結(jié)合的80%、優(yōu)選50%、40%或更少，則稱該試驗(yàn)抗體與對照競爭。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以采用簡單的競爭試驗(yàn)，其中試驗(yàn)抗體被預(yù)吸附并以飽和濃度施加到一個(gè)表面上，其上固定有用于抗體結(jié)合的底物，例如NKG2A/CD94受體或含其表位的部分，該部分已知與例如3S9結(jié)合。該表面優(yōu)選是一個(gè)BIAC0RE芯片。然后，將對照抗體(例如3S9、Z270或Z199)在一個(gè)飽和底物濃度下與該表面進(jìn)行接觸并且測量對照抗體的底物表面結(jié)合。將對照抗體的這種結(jié)合與沒有試驗(yàn)抗體的情況下對照抗體與包含底物的表面的結(jié)合相比較。在一個(gè)試驗(yàn)測定中，在一個(gè)試驗(yàn)抗體存在下該對照抗體與包含底物的表面的結(jié)合的顯著減少表明試驗(yàn)抗體識別相同的表位，即是與該對照抗體“交叉反應(yīng)”的抗體。任何將該對照抗體與包含抗原的底物的結(jié)合減少至少30%或更優(yōu)選40%的試驗(yàn)抗體都被認(rèn)為是與對照抗體基本上相同的表位或決定子相結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，這樣的試驗(yàn)抗體將使該對照抗體與該底物的結(jié)合減少至少50%?？梢岳斫?，對照和試驗(yàn)抗體的順序可以反轉(zhuǎn)，也就是對照抗體首先結(jié)合到表面而試驗(yàn)抗體其后與該表面接觸。優(yōu)選地，對底物抗原具有更高親和力的抗體首先與包含底物的表面結(jié)合，因?yàn)閷A(yù)期對于該第二抗體(假設(shè)這些抗體是交叉反應(yīng)的)所看到的結(jié)合減少的幅度會更大。在Saunal et al. (1995)J. Immunol. Meth 183 :33-41中提供了此類試驗(yàn)的其他實(shí)例，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的識別NKG2A的單克隆抗體與在具有自身免疫性或炎性障礙的患者體內(nèi)的相當(dāng)大百分比的NK細(xì)胞上存在的表位發(fā)生反應(yīng)，但不會與其他細(xì)胞(即不表達(dá)NKG2A的免疫或非免疫細(xì)胞)發(fā)生顯著反應(yīng)。因此，一旦鑒定了特異性識別在細(xì)胞例如NK、優(yōu)選人類NK細(xì)胞上的NKG2A的抗體，就可以檢測其結(jié)合從具有自身免疫或炎性障礙的患者提取的NK細(xì)胞的能力。同樣地，可以理解，本方法可以用多種抗體來實(shí)行，例如針對NKG2A的不同表位Gpitopes)或同工型，其方式被設(shè)計(jì)為最大程度地抑制NKG2A的刺激。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，在給予抗體或化合物之前，從患者提取NK細(xì)胞和樹突細(xì)胞，并評 價(jià)試驗(yàn)抗體克服NKG2A介導(dǎo)的對樹突細(xì)胞溶解的抑制的能力。在本發(fā)明的那些具體實(shí)施方式
中，當(dāng)對其他抗原(例如，來源于其他物種的NKG2A、NKG2C、NKG2E、Fc受體)的特異性結(jié)合或缺乏特異性結(jié)合必須進(jìn)行測量時(shí)，可以使用與上述那些相似的試驗(yàn)，替代用于NKG2A的合適抗原并使用對該抗原(正在對其進(jìn)行結(jié)合測試)特異性的對照抗體。這樣的抗原或?qū)φ湛贵w在本領(lǐng)域是熟知的并且許多可以商購。評價(jià)抗體抑制NKG2A刺激的能力能夠抑制由HLA-E或Qalb對NKG2A/⑶94刺激的本發(fā)明的活化抗體的鑒定通常涉及基于細(xì)胞的試驗(yàn)，以此在試驗(yàn)抗體存在的情況下評估NKG2A的活性。在一些具體實(shí)施方式
中，如上描述的，候選抗體首先根據(jù)它們結(jié)合NKG2A的能力進(jìn)行鑒定。在其他的具體實(shí)施方式
中，實(shí)施基于細(xì)胞的篩選以直接鑒定能夠抑制NKG2A刺激的抗體，而不管它們的結(jié)合親和力。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，利用在美國專利申請第20030171280號，Braud etal. (1998)Nature 391 :795-799 ；Lee et al. (1998)PNAS 95 :5199-5204 ；Vance etal. (2002)PNAS 99 :868-873 ；Brooks et al. (1999)J Immunol 162 :305-313 ；Miller etal. J Immunol(2003) 171:1369-75 ;Brooks et al. (1997) J Exp Med 185 :795-800 ;VanBeneden et al. (2001)4302-4311 ;美國專利申請第20030095965號中描述的方法或試驗(yàn)來鑒定NKG2A的調(diào)節(jié)子，將其全部內(nèi)容并入本文作為參考。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，評估本發(fā)明的活化抗體抑制由配體對NKG2A受體的刺激的能力?？梢允褂么罅吭囼?yàn)中的任何一個(gè)，其為基于分子、細(xì)胞和基于動物的模型。在一些典型的具體實(shí)施方式
中，使用以細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗(yàn)，其中將細(xì)胞例如表達(dá)NKG2A的NK細(xì)胞暴露于NKG2A配體(或表達(dá)該配體的細(xì)胞)，優(yōu)選HLA-E，并且評估抗體破壞該受體的刺激的能力?？梢岳么罅恳约?xì)胞為基礎(chǔ)的試驗(yàn)中的任何一種來評估NKG2A活性，包括基于基因表達(dá)的活性、基于細(xì)胞毒性的試驗(yàn)和增生試驗(yàn)。在某些具體實(shí)施方式
中，體外試驗(yàn)使用從具有自身免疫性或炎性障礙的患者中取得的細(xì)胞，例如NK細(xì)胞，但通?？梢允褂萌魏伪磉_(dá)NKG2A的細(xì)胞，包括NK細(xì)胞系如YTS或NK-92 (可由ATCC獲得)。例如，細(xì)胞系可以用編碼NKG2A的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染并在本試驗(yàn)中使用，只要表達(dá)的受體的刺激以可檢測到的方式(例如，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、影響增殖、或改變細(xì)胞的細(xì)胞毒性)改變該細(xì)胞的活性或性質(zhì)。可以理解，對于這樣的試驗(yàn)，NKG2A、⑶94或HLA-E任何的同工型(參見，例如OMMrefs. 161555、602894和143010，將其全部披露的內(nèi)容引入本文以供參考)可以在這樣的試驗(yàn)(或任何其他的涉及本文中描述的NKG2A的試驗(yàn)或方法)中使用。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，使用細(xì)胞測定，其中將表達(dá)NKG2A的細(xì)胞例如NK細(xì)胞與NKG2A配體如HLA-E或表達(dá)NKG2A配體的細(xì)胞優(yōu)選樹突細(xì)胞加以孵育，并且評估試驗(yàn)化合物阻斷NK細(xì)胞的抑制的能力。在這樣的試驗(yàn)中，可以測量樹突細(xì)胞的溶解本身作為NK細(xì)胞活性的反映。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可以使用取自具有自身免疫或炎性障礙的患者的NK細(xì)胞來構(gòu)建細(xì)胞系。在大量的具體實(shí)施方式
中，使用的各個(gè)試驗(yàn)中利用了包含適當(dāng)配體(例如，在小鼠的情況下，Qa-I)的非人類細(xì)胞或非人類NKG2A/⑶94，例如表達(dá)NKG2A/⑶94的非 人靈長類動物細(xì)胞，或表達(dá)小鼠或人類NKG2A/CD94的小鼠細(xì)胞。NKG2A與合適配體的結(jié)合引起帶有NKG2A的細(xì)胞中的多種生理變化。這些包括在基因表達(dá)、細(xì)胞生長、細(xì)胞繁殖、pH、細(xì)胞內(nèi)第二信使例如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP，細(xì)胞因子生產(chǎn)、或諸如細(xì)胞毒活性的活性的變化。這樣的變化在本文中被稱為“NKG2A活性”。在NKG2A配體存在的情況下，這樣的變化的任何反轉(zhuǎn)可以用于評估試驗(yàn)抗體的效用。這樣的反轉(zhuǎn)在本文中被稱為“NKG2A活性的抑制”。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，NKG2A活性是通過檢測NKG2A-應(yīng)答基因或蛋白，例如SHP-I或SHP-2或它們的靶的表達(dá)或活性來評估的(參見，例如，Le Drean et al. (1998)Eur J TmmunoI 28 :264-276, Augugliaro et al. (2003)Eur JImmunol 33 =1235-141 ;將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。在任何本文描述的試驗(yàn)中，這些細(xì)胞中NKG2A活性以任何可檢出的測定中的減少5%U0%,20%,優(yōu)選 30%、40%、50%，最優(yōu)選 60%、70%、80%、90%、95%或更大的減少表明該試驗(yàn)抗體是適合在本方法中使用的候選物。除了結(jié)合之外，可以評估抗體或化合物引起NK細(xì)胞以抑制帶有NKG2A配體的靶細(xì)胞例如樹突細(xì)胞、某些癌細(xì)胞或某些病毒感染的細(xì)胞的增生或活化，或優(yōu)選殺傷這些革巴細(xì)胞的能力。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，表達(dá)NKG2A受體的人類NK細(xì)胞隨著帶有NKG2A配體的靶細(xì)胞被引入孔板中，例如96孔板，并暴露于各種量的試驗(yàn)抗體。通過加入一種活體染料(即被完整細(xì)胞攝取的染料)如 AlamarBlue (BioSource International, Camarillo CA),并洗滌以除去多余的染料，存活細(xì)胞的數(shù)目可以借助于光密度值進(jìn)行測量(抗體殺死的細(xì)胞越多，光密度值越低)。(參見，例如，Connolly et al. (2001) J Pharm Exp Ther 298 25-33，將其全部內(nèi)容通過弓I用結(jié)合在此)。最優(yōu)選地，本發(fā)明的活化抗體不顯示與Fe受體的實(shí)質(zhì)性的特異結(jié)合。這樣的抗體可以包括已知不與Fe受體結(jié)合的各種重鏈的恒定區(qū)。一個(gè)這樣的實(shí)例是IgG4恒定區(qū)?？商鎿Q地，可以使用不包含恒定區(qū)的抗體片段，如Fab或F(ab’)2片段，以避免Fe受體結(jié)合。Fe受體結(jié)合可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行評估，包括例如在BIAC0RE試驗(yàn)中檢測抗體與Fe受體蛋白的結(jié)合。同樣，可以使用任何其他的抗體種類，其中Fe部分被修飾以最小化或消除與Fe受體的結(jié)合(參見，例如，W003101485，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。用來評估Fe受體結(jié)合的試驗(yàn)，例如基于細(xì)胞的試驗(yàn)在本領(lǐng)域是熟知的，并被描述在例如W003101485中。優(yōu)選地，本發(fā)明活化單克隆抗體包括一個(gè)Fe區(qū)域，優(yōu)選為IgG4或IgG2亞型的Fe區(qū)域，或IgGl或IgG3亞型的Fe區(qū)域，其已被修飾以減少與Fe受體的結(jié)合。最優(yōu)選地，該IgG4或IgG2的Fe區(qū)域被修飾以進(jìn)一步最小化或完全消除與Fe受體的結(jié)合(參見，例如Molecular Immunology 30 :105-108,將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。IgG4同種型不是完全沒有Fe結(jié)合活性，表現(xiàn)出與Fe y (“Fcg”)受體的一些結(jié)合(Newman et al. (2001) Clin. Immunol. (98(2) :164-174)。一種未修飾的 IgG4 單克隆抗體可以引起體內(nèi)細(xì)胞的耗盡(Isaacs et al, (1996)Clin. Exp. Immunol. 106,427) 所報(bào)道的主要負(fù)責(zé)與Fcg受體結(jié)合的序列被定義為LLGGPS(Burton et al, (1992)Adv. Immunol. 51 I)。這個(gè)序列(位于重鏈CH2區(qū)域的N末端(EU編號234-239))被保留在人類IgGl、IgG3和鼠IgG2a同種型中，它們?nèi)颗cFcg受體強(qiáng)烈結(jié)合。用于IgG4同種型的野生型序列包 含在位置234處的苯丙氨酸，形成基序FLGGPS。鼠IgG2b同種型(也是Fcg受體的較差結(jié)合物)包含該序列LEGGPS。Newman等(2001)將與鼠IgG2b相關(guān)的谷氨酸殘基合并入人類野生型IgG4CH2結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生序列FEGGPS，這甚至進(jìn)一步減少了⑶C和ADCC活性，并且事實(shí)上消除了在體外與FcgRI和FcgRII的結(jié)合。除了引入谷氨酸之外，由脯氨酸取代絲氨酸228導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)比野生型IgG4更穩(wěn)定的分子。IgG4分子趨向于在鉸鏈區(qū)顯示低效的鏈間二硫鍵的形成。引入一個(gè)脯氨酸被稱為給鉸接提供了剛性并且促進(jìn)了更有效的鏈間成鍵，并且在228位存在的絲氨酸可能通過鄰接半胱氨酸分子而優(yōu)先促進(jìn)鏈內(nèi)鍵接而不是鏈間的二硫鍵。對本發(fā)明的抗體可以容易地進(jìn)行任何這樣的修飾和其他修飾。在許多情況下，本發(fā)明的抑制性抗體可以轉(zhuǎn)變?yōu)楸景l(fā)明的活化抗體，這是通過消除前者與Fe受體結(jié)合的大部分或全部能力。價(jià)針對NKG2A的抗體抑制NK細(xì)胞活件的能力能夠結(jié)合NKG2A并抑制NK細(xì)胞活性(尤其是細(xì)胞的NK細(xì)胞溶解)的本發(fā)明的抑制性抗體的鑒定是利用基于細(xì)胞的試驗(yàn)進(jìn)行分析的。通常，在不同量的試驗(yàn)抗體存在的情況下，將帶有NKG2A的細(xì)胞如NK細(xì)胞與NK敏感的細(xì)胞如RMA、RMA的TAP-2衍生物、P815和K562進(jìn)行接觸。將在試驗(yàn)抗體存在的情況下殺死的NK敏感細(xì)胞的百分比與抗體不存在情況下的殺傷進(jìn)行比較。在用于本發(fā)明的抑制性抗體的另一個(gè)試驗(yàn)中，將NK細(xì)胞在不同量的試驗(yàn)抗體存在下進(jìn)行孵育，與抗體不存在時(shí)的NK細(xì)胞死亡相比較，從而確定該抗體對NK細(xì)胞的直接殺傷影響。NK細(xì)胞殺傷也可以在包含存在NK敏感細(xì)胞的試驗(yàn)中加以確定。在任何本文描述的試驗(yàn)中，NK敏感細(xì)胞殺傷減少5%、10%、20%，優(yōu)選30%、40%、50%，最優(yōu)選60%、70%、80%、90%、95%和/或爾細(xì)胞死亡增加5%、10%、20%，優(yōu)選30%、40%、50%，最優(yōu)選60%、70%、80%、90%、95%表明該試驗(yàn)抗體是本發(fā)明的一種抑制性抗體。靈長類動物物種間NKG2A的交叉反應(yīng)性已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在人類和非人靈長類動物的NKG2A之間存在交叉反應(yīng)性。因此，可以利用來源于任何靈長類動物的NKG2A多肽來實(shí)施用于評價(jià)抗-NKG2A抗體對受體活性的影響的試驗(yàn)。例如，可以在體外使用非人靈長類動物NK細(xì)胞來實(shí)施這樣的試驗(yàn)，或可以將抗體給予非人靈長類動物并且檢測它們調(diào)節(jié)NKG2A活性(例如，如在NK細(xì)胞活性的變化中反映)的能力。牛產(chǎn)杭體本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)中的任何一種來生產(chǎn)。通常，利用在細(xì)胞如T細(xì)胞或NK細(xì)胞或樹突細(xì)胞表面上包括NKG2A(或者，對于本文中描述的所有具體實(shí)施方式
，對于CD94或HLA-E)受體的一個(gè)免疫原將非人類動物優(yōu)選小鼠免疫化而生產(chǎn)。該受體可以包含完整細(xì)胞或細(xì)胞膜，NKG2A (或CD94、等)的全長序列或任何NKG2A的片段或衍生物(通常為免疫原片段)，即，包含暴露在表達(dá)該受體的細(xì)胞表面上的表位的多肽的一部分?？梢允褂肗KG2A的任何同工型或剪接片段(參見，例如OMM 161555 ;將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。這樣的片段通常包含成熟多肽序列的至少7個(gè)連續(xù)氨基酸，甚至更優(yōu)選其至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。它們基本上來源于該受體的胞外結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，用于產(chǎn)生抗體的NKG2A受體是一種人類受體。在某些具體實(shí)施方式
中，以異質(zhì)二聚體形式例如與CD94聯(lián)合存在的NKG2A可以用于產(chǎn)生抗體。
在一個(gè)最優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該免疫原包括在類脂膜中(通常在細(xì)胞的表面上)的一個(gè)野生型人類NKG2A受體多肽。在特定的具體實(shí)施方式
中，該免疫原包括完整NK細(xì)胞，尤其是完整人類NK細(xì)胞，可選被處理或被溶解。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該免疫原是取自具有自身免疫障礙或炎性障礙的患者的一個(gè)NK細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，這些抗體來源于一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的識別NKG2A的單克隆抗體，例如 Z199(Della Chiesa et al, (2003)Eur. J. Immunol. 33 :1657-1666)、Z270、3S9(參見，例如，美國專利申請第 0030095965 號)或 20D5 (Vance et al, (1990) J. Exp.Med. 190(12) :1801-1812),將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。對于某些應(yīng)用，這樣的抗體可以直接或間接地加以標(biāo)記(即使用一種標(biāo)記的第二抗體)，以用作診斷抗體來確定在現(xiàn)有細(xì)胞，優(yōu)選來自具有自身免疫或炎性障礙的患者的NK細(xì)胞上存在的NKG2A。另外，可以將這些抗體制成適于如本文描述的人類給藥，以用于本發(fā)明治療方法中。本發(fā)明的抗體可以是全長抗體或抗體片段或衍生物?？贵w片段實(shí)例包括Fab、Fab丨、Fab丨_SH、F (ab丨)2和Fv片段；雙抗體；單鏈Fv (scFv)分子；在沒有相關(guān)的重鏈部分的情況下，只包含一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽，或其包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR的片段；在沒有相關(guān)的輕鏈部分的情況下，只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)的單鏈多肽，或其包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR的片段；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。這樣的片段和衍生物以及制備它們的方法在本領(lǐng)域是熟知的。例如，胃蛋白酶可用于在鉸鏈區(qū)的二硫鍵之下消化抗體，以產(chǎn)生F (ab)' 2 (其是本身通過二硫鍵結(jié)合到Vh-ChJ^ Fab的二聚物)。在溫和的條件下斷裂鉸鏈區(qū)中的二硫鍵可以減少F (ab)' 2，從而將F(ab)' 2 二聚物轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab'單體。Fab'單體實(shí)質(zhì)上是帶有部分絞鏈區(qū)的Fab (見Fundamental Immunology (Pauled.，3ded. 1993))。盡管各種抗體片段都是根據(jù)完整抗體的消化定義的，但是技術(shù)人員可以理解，這樣的片段可以化學(xué)地或通過使用重組DNA方法從頭合成。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該活化抗體是非-耗盡性抗體，意思是指它們與NK細(xì)胞結(jié)合并且抑制NKG2A的刺激，但不導(dǎo)致殺傷表達(dá)NKG2A的細(xì)胞。殺傷表達(dá)NKG2A細(xì)胞的能力可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行評估，包括體外試驗(yàn)以確?？贵w不是細(xì)胞毒性的、直接殺傷結(jié)合的細(xì)胞、以及體內(nèi)試驗(yàn)(其中給予抗體并評估表達(dá)NKG2A細(xì)胞的水平和活性。在一個(gè)特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，如上所述的，使用不被Fe受體識別(或僅很弱識別)的抗體。因此，優(yōu)選的抗體包括IgG4、諸如Fab或F(ab’ )2的片段、或其Fe部分被修飾以減少或消除與Fe受體的結(jié)合的任何其他的IgG、IgE、IgM等等(參見，例如W003101485，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。單克隆或多克隆抗體的制備在本領(lǐng)域是熟知的，并且大量可利用的技術(shù)的任何一種都可以使用(參見，例如 Kohler & Milstein, Nature 256:495-497(1975) ；Kozbor etal. , Immunology Today 4:72(1983) ；Cole et al., pp. 77_96in Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy (1985))。用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利第4，946，778號)可以適合于生產(chǎn)針對期望的多肽(例如，NKG2A)的抗體。而且，轉(zhuǎn)基因小鼠或其他有機(jī)體如其他的哺乳動物，可以用于表達(dá)人源化、嵌合或類似修飾的抗體。可替換地，噬菌體顯示技術(shù)可以用于鑒定與所選抗原特異型結(jié)合的抗體和異源Fab片段(參見,例如，McCaffertyet al. ,Nature 348:552-554(1990) ；Marks et al. ,Biotechnology 10:779-783(1992))。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，該方法包括從文庫或表達(dá)譜(repertoire)中選擇與NKG2A受體多肽交叉反應(yīng)的單克隆抗體或其片段或衍生物。例如，該表達(dá)譜可以是抗體或其片段的任 何(重組)表達(dá)譜，可選地通過任何合適的結(jié)構(gòu)(例如，噬菌體、細(xì)菌、合成復(fù)合體)加以顯
/Jn o用一種抗原來免疫非人類哺乳動物的步驟可以以本領(lǐng)域熟知的方式進(jìn)行(參見，例如，E. Harlow and D. Lane, Antibodies A Laboratory Manual. , Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor,NY(1988))。通常,將免疫原懸浮或溶解在緩沖液中，可選地利用佐劑如完全Freund’ s佐劑。用于確定免疫原的量、緩沖液的類型和佐劑的量的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的并且不以任何方式限制本發(fā)明。類似地，足以刺激抗體產(chǎn)生的免疫化的部位和頻率在本領(lǐng)域也是熟知的。在一個(gè)典型的免疫化方案中，在第I天和約I周后再次給非人類動物腹膜內(nèi)注射抗原。然后大約在第20天時(shí),跟隨抗原的回憶(recall)注射,可選地利用佐劑如不完全的Freund’s佐劑?；貞涀⑸涫窃陟o脈內(nèi)實(shí)施的并且可連續(xù)多天重復(fù)進(jìn)行。隨后在第40天跟隨一次靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)強(qiáng)化(booster)注射，通常沒有佐劑。這個(gè)方案導(dǎo)致在大約40天后產(chǎn)生抗原特異性抗體的B細(xì)胞的形成。其他方案也可以使用，只要它們導(dǎo)致產(chǎn)生表達(dá)針對免疫化中使用的抗原的抗體的B細(xì)胞產(chǎn)生。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，分離出來自未免疫的非-人類哺乳動物的淋巴細(xì)胞，在體外生長，然后在細(xì)胞培養(yǎng)中暴露于免疫原。然后收獲淋巴細(xì)胞并且實(shí)施下面描述的融合步驟。對于優(yōu)選用于本發(fā)明目的的單克隆抗體，接下來的步驟是從免疫的非人類哺乳動物分離細(xì)胞，例如，淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞或B細(xì)胞，并且接下來將這些脾細(xì)胞、或B細(xì)胞、或淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞融合以形成產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞。因此，如本文中所使用的，術(shù)語“從免疫動物制備抗體”包括從免疫動物獲得B細(xì)胞/脾細(xì)胞/淋巴細(xì)胞，并利用這些細(xì)胞來產(chǎn)生表達(dá)抗體的雜交瘤細(xì)胞，以及直接從免疫化動物血清中得到抗體。例如從非-人類哺乳動物中分離脾細(xì)胞在本領(lǐng)域是熟知的，并且例如包括從麻醉的非人類哺乳動物提取脾，將其切成小塊并且將來自脾被膜中的脾細(xì)胞通過細(xì)胞尼龍濾網(wǎng)壓入合適的緩沖液，以便產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。將這些細(xì)胞洗滌，離心并重懸在溶解任何血紅細(xì)胞的緩沖液中。將該溶液再一次離心并且最后將小球中余下的淋巴細(xì)胞重懸在新鮮的緩沖液中。一旦被分離出并存在于單細(xì)胞懸液中，將這些產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個(gè)永生細(xì)胞系融合。這通常是一個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，盡管許多其他對于形成雜交瘤細(xì)胞的永生細(xì)胞系在本領(lǐng)域是已知的。優(yōu)選的鼠骨髓瘤細(xì)胞系包括，但不限于，那些來源于M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤(可從 the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.U.S.A.獲得)、X63 Ag8653 和 SP-2 細(xì)胞(可從 the American Type Culture Collection,Rockville, Maryland U.S.A.獲得)。利用聚乙二醇等來實(shí)現(xiàn)融合。然后將得到的雜交瘤細(xì)胞在包含一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細(xì)胞的生長或存活的底物的選擇性培養(yǎng)基中生長。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于該雜交瘤的培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長。雜交瘤細(xì)胞可以在一個(gè)巨噬細(xì)胞的滋養(yǎng)層上生長。這些巨噬細(xì)胞優(yōu)選來自用于分離脾細(xì)胞的非人類哺乳動物的同胞仔，并且通常在培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞之前，用不完全Freund’s佐劑等刺激多天。融合的方法描述在,例如(Goding, “Monoclonal Antibodies Principles and Practice, ”pp. 59-103 (Academic Press, 1986)),將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。讓這些細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生長足夠的時(shí)間，以形成集落和產(chǎn)生抗體。這通常為7到14天。然后對雜交瘤集落產(chǎn)生特異性識別的期望底物例如NKG2A的抗體進(jìn)行測定試驗(yàn)。盡管可以采用任何可以適合于雜交瘤細(xì)胞所生長的孔中的試驗(yàn)，該試驗(yàn)通常是比色ELISA型試驗(yàn)。其他的試驗(yàn)包括免疫沉淀和放射性免疫測定。對于期望抗體產(chǎn)生是陽性的孔進(jìn)行考察，以確定是否存在一個(gè)或多個(gè)不同集落。如果存在多于一個(gè)的集落，則該細(xì)胞可以再次克隆和生長，以確保只有單個(gè)細(xì)胞形成產(chǎn)生所期望抗體的集落。具有顯染是單個(gè)集落的陽性孔通常被再次克隆和再次測定，以確保被檢測和生產(chǎn)的只有一個(gè)單克隆抗體。然后將確定為生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基如DMEM或RPMI-1640中以更大量進(jìn)行生長?？商鎿Q地，這些雜交瘤細(xì)胞可以在動物體內(nèi)作為腹水瘤生長。在充分生長以產(chǎn)生想要的單克隆抗體后，將包含單克隆抗體的生長培養(yǎng)基(或腹水)與細(xì)胞分離并且純化在其中存在的單克隆抗體。純化通常是通過凝膠電泳、透析、利用蛋白A或蛋白G瓊脂糖的色譜、或連接到固體載體如瓊脂糖或瓊脂糖珠的抗小鼠Ig(所有描述例如在 the Antibody Purification Handbook,Amersham Biosciences,publicationNo. 18-1037-46，Edition AC中，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)來實(shí)現(xiàn)的。結(jié)合的抗體通常利用低PH緩沖液(pH 3.0或更低的甘氨酸或醋酸鹽緩沖液)從蛋白A/蛋白G柱洗脫，并對包含抗體的片段立即中和。將這些片段根據(jù)需要集中、透析并濃縮。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，對結(jié)合在NKG2A免疫原上存在的決定子(抗原決定基)的抗體進(jìn)行編碼的DNA被從雜交瘤細(xì)胞分離出來并且放入合適的表達(dá)載體中用于轉(zhuǎn)染入合適的宿主中。然后將該宿主用于抗體、其變異體、其活性片段、或包含該抗體的抗原識別部分的人源化或嵌合抗體的生產(chǎn)。優(yōu)選地，在這個(gè)實(shí)施方式中使用的DNA編碼識別在NK細(xì)胞(例如，取自具有自身免疫或炎性疾病的患者的NK細(xì)胞)的NKG2A受體上存在的決定子的抗體。
對本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行編碼的DNA可以使用傳統(tǒng)過程(例如，通過使用能夠特異結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)而容易地被分離和測序。一旦分離，則可將該DNA放入表達(dá)載體，然后其被轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞(它們不另外產(chǎn)生免疫球蛋白)，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。在編碼該抗體的DNA的細(xì)菌中的重組表達(dá)在本領(lǐng)域是熟知的(參見，例如 Skerra et al. (1993)Curr. Op. Immunol. 5 :256 ；and Pluckthun(1992) Immunol. Revs. 130 :151)?？贵w也可以通過選擇組合的免疫球蛋白文庫而生產(chǎn),例如在Ward et al. (1989)Nature 341 :544 中披露的。
在一個(gè)特定的具體實(shí)施方式
中，該抗體實(shí)質(zhì)上結(jié)合到與單克隆抗體Z199或Z270 之一相同的表位或決定子。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該單克隆抗體包括Z270的Fab 或F(ab' )2部分。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，該單克隆抗體包括Z270的可變重鏈區(qū)的三個(gè)CDR(CDR1 = SEQ ID NO 2的氨基酸31至35 ;CDR2 = SEQ ID NO 2的氨基酸 50至66 ;CDR3 = SEQ ID NO 2的氨基酸99-108)。更優(yōu)選的是包括Z270的可變重鏈區(qū) (Z270VH ；SEQ ID NO 2)的單克隆抗體。更加優(yōu)選的是包括Z270的可變重鏈區(qū)并且是由包括chZ270VH(SEQ ID NO :3)的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的單克隆抗體。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，單克隆抗體包括Z270的可變輕鏈區(qū)的三個(gè)CDR (⑶Rl = SEQ ID NO :6的氨基酸 24 至 34 ; CDR2 = SEQ ID NO 6 的氨基酸 50 至 56 ;CDR3 = SEQ ID NO 6 的氨基酸 89-95)。 更優(yōu)選的是包括Z270的可變輕鏈區(qū)(SEQ ID NO 6)的單克隆抗體。甚至更優(yōu)選的是包括 Z270可變輕鏈區(qū)并且是由包括chZ270VK(SEQ ID NO :7)的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的單克隆抗體。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中該抗體是Z270。Z270是于2005年12月22日在法國巴黎25，Rue du Docteur Roux，F(xiàn)-75725的巴士德研究院的國家微生物培養(yǎng)物保藏中心 (the Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institute Pasteur,25, Rue du Docteur Roux, F_75725Paris, France)保藏的，登記號為 1-3549。
將針對NKG2A的活化和抑制性單克隆抗體通常加以修飾，以使它們適用于人類治療應(yīng)用。例如，它們可以是人源化的、嵌合的或用本領(lǐng)域熟知的方法從人類抗體文庫選取。 這樣的適合人類的抗體可以直接應(yīng)用于本發(fā)明治療方法中，或可以進(jìn)一步衍化為細(xì)胞毒性抗體(如后文描述的)以用于本發(fā)明方法中。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，產(chǎn)生本發(fā)明的抗體(例如，結(jié)合到與Z199或Z270 基本上相同的表位)的雜交瘤細(xì)胞的DNA可以在插入表達(dá)載體之前被修飾，例如，通過用人類重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列取代同源性非人類序列(例如，Morrison et al. (1984) PNAS 81 :6851)，或通過共價(jià)結(jié)合到免疫球蛋白編碼序列、或非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列。以這種方式，所制備的“嵌合”或“雜合”的抗體具有原始抗體的結(jié)合特異性。通常，這樣的非免疫球蛋白多肽用本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域取代。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該抗體包括融合到人類重鏈恒定區(qū)的Z270的可變重鏈區(qū)(SEQ ID NO 2) 0在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，人類重鏈恒定區(qū)是IgG4 恒定區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，人類重鏈恒定區(qū)是IgGl恒定區(qū)，優(yōu)選人類 IgGlm(-1, -2，-3)恒定區(qū)。優(yōu)選地，這樣的包含一個(gè)人類重鏈恒定區(qū)的抗體是由包括 chZ270VH(SEQ ID NO 3)的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的。
在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該抗體包括融合到人類輕鏈恒定區(qū)的Z270的可變輕鏈區(qū)的(SEQ ID NO:并6)。更優(yōu)選的是包括融合到人類K (k3)輕鏈恒定區(qū)的Z270 的可變輕鏈區(qū)的抗體。優(yōu)選地，這樣的包括人類輕鏈恒定區(qū)的抗體是由包括chZ270VK(SEQ ID N07)的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的。
更優(yōu)選的是包括融合到人類輕鏈恒定區(qū)的270VK和融合到人類重鏈恒定區(qū)的 270VK的一種抗體。優(yōu)選地，該輕鏈恒定區(qū)是K (k3)恒定區(qū)，并且該重鏈恒定區(qū)是選自 IgG4或IgGlm(-l，-2，-3)。并且，優(yōu)選地，抗體的每一個(gè)重鏈和輕鏈分別是由包括包含 chZ270VH(SEQ ID NO 3)的核苷酸序列和包括包含chZ270VK (SEQ ID NO 7)的核苷酸的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的。
在一個(gè)特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的抗體是人源化的。根據(jù)本發(fā)明的抗體的“人源化”形式是特異性嵌合的免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈或片段(例如Fv、Fab、 Fab'、F(ab' )2、或抗體的其他抗原結(jié)合序列)，其包括最小量的來源于鼠或其他非人類免疫球蛋白的序列。對于大多數(shù)部分，人源化抗體是人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來自原始抗體(供者抗體)的CDR的殘基取代，同時(shí)保持原始抗體期望的特異性、親和力和能力。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv框架結(jié)構(gòu)殘基可以被相應(yīng)的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可以包括既沒有在受者抗體也沒有在引入的CDR或框架結(jié)構(gòu)序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。形成這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化抗體性能。通常，人源化抗體可以包括大致至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中的全部，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)域?qū)?yīng)于原始抗體的那些區(qū)域，并且所有或基本上所有的FR區(qū)域是人免疫球蛋白共有序列的那些區(qū)域。對于進(jìn)一步的詳細(xì)情況，參見Jones et al. (1986) Nature321 :522 ;Reichmann et al. (1988)Nature 332 323 ；Verhoeyen et al. (1988) Science 239 :1534(1988) ；Presta(1992)Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593 ;將其每一個(gè)通過引用結(jié)合在此。
用于制備人源化抗體的人類可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈和重鏈)的選擇對于減少免疫原性是非常重要的。根據(jù)所謂的“最佳擬合”方法，本發(fā)明抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列是在整個(gè)已知的人類可變-結(jié)構(gòu)域序列的文庫中篩選的。然后，將最接近小鼠的人類序列接受為用于人源化抗體的人類框架結(jié)構(gòu)(FR) (Sims et al. (1993) J. Tmmun. , 151 :2296 ；Chothia and Lesk(1987) J.Mol. Biol. 196 :901)。另一個(gè)方法使用來自輕鏈或重鏈特定亞群的所有人類抗體的共有序列的特定框架。相同的框架結(jié)構(gòu)可以用于多種不同的人源化抗體(Carter et al. (1992)PNAS 89 :4285 ；Presta et al. (1993)J. Immunol. 51 :1993))。
更重要的是，抗體被人源化同時(shí)保持它們對NKG2A，優(yōu)選人類和非人靈長類動物 NKG2A的高親和力以及其他有利的生物學(xué)性質(zhì)。為了達(dá)到這個(gè)目的，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的方法， 通過使用親本和人源化序列的三維模型來分析親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的過程來制備人源化抗體。這些三維免疫球蛋白模型通?？衫貌⑶覍τ诒绢I(lǐng)域的技術(shù)人員是熟悉的。由計(jì)算機(jī)程序可供使用，其圖解和展示被選擇的候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對這些顯示的檢查允許對殘基在候選免疫球蛋白序列功能化中的可能作用進(jìn)行分析，即，分析殘基影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力。以這種方式，F(xiàn)R殘基可以從有共識的和引入序列中加以選取和組合以便獲得期望的抗體特性如對于靶抗原增加的親和力。總之，該DCR殘基是直接和極其實(shí)質(zhì)性地參與了影響抗原結(jié)合。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了具有至少5、6、8、9、10、15或20天的半衰期的人類或人源化活化抗-NKG2A抗體，其基本上不結(jié)合人類Fe YRIIIa(CD16)。更優(yōu)選地，該活化抗-NKG2A抗體是人源化抗體并且對于結(jié)合人類NKG2A與Z199或Z270抗體完全競爭。為了用根據(jù)本文的方法適于使用的優(yōu)選抗體進(jìn)行說明的目的，可以使用Z199或Z270抗體來制備人源化抗體。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的人源化抗體包括人類框架結(jié)構(gòu)、至少一個(gè)來源于非人類抗體的CDR，并且其中存在的任何恒定區(qū)基本上等同于人類免疫球蛋白恒定區(qū)，例如，至少約60-90%，優(yōu)選至少95%等同。因此，人源化抗體的所有部分(除了可能的⑶R)都基本上等同于一個(gè)或多個(gè)天然人類抗體序列的相應(yīng)部分。在一些情況下，除了來自于非人類抗體的CDR，人源化的抗體在人類框架結(jié)構(gòu)區(qū)包括另外的非人類殘基。
人源化抗體的設(shè)計(jì)可以如下進(jìn)行。當(dāng)氨基酸歸入以下種類時(shí)，使用的人類抗體 (受者抗體)的框架結(jié)構(gòu)氨基酸被來自提供CDR的非人類抗體(供者抗體)的框架氨基酸替代(a)在受體抗體的人類框架結(jié)構(gòu)區(qū)中的氨基酸在那個(gè)位置對于人類抗體是不尋常的， 而在供者抗體中的相應(yīng)氨基酸在那個(gè)位置對人類抗體是典型的；(b)該氨基酸的位置緊鄰著一個(gè)CDR ;或(c)該氨基酸能夠與在三維結(jié)構(gòu)抗體模型中的CDR相互作用(參見，C. Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,10029 (1989), and Co et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,2869(1991)，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。
對于人源化抗體生產(chǎn)的進(jìn)一步詳細(xì)描述,參見Queen et al. , op. cit. and Co et al，op. cit.和美國專利第 5，585，089,5, 693，762,5, 693，761 和 5，530，101 號，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。通常，人源化抗體的CDR區(qū)域大致相同，并且更通常地，與衍生其的小鼠抗體中相應(yīng)的CDR區(qū)域相同。盡管不是通常期望的，但是有時(shí)有可能在沒有顯著影響所得到的人源化抗體的結(jié)合親和力的情況下，形成CDR殘基的一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代。偶爾地，CDR區(qū)域的的取代能夠增強(qiáng)結(jié)合親和力。除了上面討論的特定氨基酸取代外，人源化抗體的框架結(jié)構(gòu)區(qū)通?；旧弦恢拢Ｒ姷?，與衍生其的人類抗體的框架結(jié)構(gòu)區(qū)一致。當(dāng)然，框架結(jié)構(gòu)區(qū)的許多氨基酸對于抗體的特異性或親和力具有很少的或沒有直接貢獻(xiàn)。因此，在沒有顯著改變所得到的人源化抗體特異性或親和力的情況下，框架結(jié)構(gòu)殘基的許多個(gè)體保守取代可以被容忍。人源化抗體的抗原結(jié)合區(qū)域(非人類部分)可以來源于具有對NKG2A的特異性的非人類起源的抗體(稱為供者抗體)。例如，合適的抗原結(jié)合區(qū)域可以來源于Z199或Z270單克隆抗體。其他來源包括從非人類來源如嚙齒動物(例如，小鼠和大鼠)、兔、豬、山羊或非人靈長類(例如，猴)或駱駝科動物(例如，駱駝或美洲駝)得到的NKG2A特異性(阻斷)抗體。另外，可以形成其他的多克隆或單克隆抗體，如結(jié)合到與Z199或Z270抗體相同或相似的表位的抗體(參見，Kohler et al.，Nature, 256 495-497(1975) ；Harlow et al. ,1988, Antibodies ALaboratory Manual, (Cold Spring Harbor, N. Y.) ；and Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer ' 94), Ausubel et al. , Eds. (John Wiley & Sons New York, N. Y. ), Chapter 11(1991))。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，具有對人類和非人靈長類動物NKG2A的結(jié)合特異性的人源化抗體包含至少一個(gè)非人類起源的⑶R。例如，具有對人類和非人靈長類動物NKG2A 的結(jié)合親和力的人源化抗體包含一條重鏈和一條輕鏈。該輕鏈可以包括來源于非人類來源的抗體(結(jié)合NKG2A)的CDR和來源于人類起源的輕鏈的FR。例如，該輕鏈可以包括CDR1、 ⑶R2和/或⑶R3，其具有與Z199或Z270抗體的任何一個(gè)的各自⑶R相似或基本上相同的氨基酸序列，使得該抗體與人類和非人靈長類動物NKG2A特異性結(jié)合。該重鏈可以包括來源于非人類起源的抗體(結(jié)合NKG2A)的CDR和來源于人類起源的重鏈的FR。例如，該重鏈可以包括⑶R1、⑶R2和⑶R3，其具有下面提出的氨基酸序列或與Z199或Z270抗體各自的CDR相似或基本上相同的氨基酸，使得該抗體特異地結(jié)合到人類或非人靈長類動物的 NKG2A。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
是與人類和非人靈長類動物NKG2A特異性結(jié)合并且包括人源化輕鏈的人源化抗體，該人源化輕鏈包括來自Z199或Z270抗體的三個(gè)輕鏈CDR 和來自人類抗體輕鏈的輕鏈可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)序列。本發(fā)明進(jìn)一步包括人源化重鏈，其包括來自Z199或Z270抗體的三個(gè)重鏈⑶R和來自人類抗體重鏈的重鏈可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)序列。
人類起源的人源化抗體或抗體鏈的部分(人類部分)可以來源于任何合適的人類抗體或抗體鏈。例如，人類恒定區(qū)或其部分(如果存在)可以來源于人類抗體(包括等位基因變異體)的K或λ輕鏈、和/或Y (例如，Y I、Y 2> Y 3> Y 4) > μ、α (例如， α I、α 2)、δ或ε重鏈。可以選擇一個(gè)特定恒定區(qū)如IgG2b或IgG4、其變異體或部分，以修飾效應(yīng)子功能。因此，尤其優(yōu)選后者的恒定區(qū)或部分，因?yàn)樗鼈兓旧喜唤Y(jié)合 NK細(xì)胞上的Fe Y IIIa受體(⑶16)，并且因此基本上不誘導(dǎo)ADCC介導(dǎo)的本發(fā)明的抗-NKG2A抗體結(jié)合至其的NK效應(yīng)子的溶解。例如，突變的恒定區(qū)(也被稱為“變異體”)可以并入融合蛋白，以最小化與Fe受體的結(jié)合和/或固定補(bǔ)體的能力(參見,例如，Winter et al.,美國專利第 5，648，260 號；Morrison et al.，WO 89/07142 ；Morgan et al.，W094/29351)。另外，與天然的Fe區(qū)域相比，可以形成突變的IgG2Fc結(jié)構(gòu)域以減少有絲分裂反應(yīng)(參見，例如，Tso et al.，美國專利第5，834，597號，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。如果存在， 則人類FR優(yōu)選來源于具有與抗原結(jié)合區(qū)域供體的相似或等同區(qū)域的序列相似性的人類抗體可變區(qū)域。用于人源化抗體的人類起源的部分的FR的其他來源包括人類可變共有序列 (參見，Kettleborough, C. A. et al. , Protein Engineering 4 :773-783(1991) ；Queen et al.，美國Pat. Nos :5,585, 089, 5，693，762 and 5，693，761，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。例如，用于獲得非人類部分的抗體或可變區(qū)域的序列可以與人類序列(如在Kabat， E. A. , et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,美國 Department of Health and Human Services,美國 Government Printing Office (1991) 中描述的)進(jìn)行比較。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，一個(gè)人源化抗體鏈的FR來源于與非人類供體(例如，Z199或Z270抗體)的可變區(qū)具有至少約60%總體序列一致性，優(yōu)選至少約80%總體序列一致性的人類可變區(qū)。
在兩個(gè)核酸或多肽(例如，編碼人源化抗體或人源化抗體的氨基酸序列的DNA)的背景下，如利用以下序列比對方法和/或視覺檢查，當(dāng)對最大對應(yīng)性進(jìn)行比較和排齊時(shí)，術(shù)語“基本上相同”是指兩個(gè)或多個(gè)具有至少約80%，最優(yōu)選的90-95%或更高的核苷酸或氨基酸殘基一致性的序列或順序。這樣的“基本上相同”的序列通常認(rèn)為是同源的。優(yōu)選地，“基本上相同”存在于一個(gè)序列的區(qū)域內(nèi)，其長度為至少約50個(gè)殘基，更優(yōu)選是在至少約 100個(gè)殘基的區(qū)域內(nèi)，并且最優(yōu)選是在至少約150個(gè)殘基內(nèi)、或在比較的兩個(gè)序列的全長范圍內(nèi)基本上相同的序列。如下面描述的，任何兩個(gè)抗體序列通過使用在Kabat中的編序方案只能以一種方式排齊。因此，對于抗體，一致性百分率具有唯一和明確定義的含義。
來自抗體的成熟重鏈和輕鏈的可變區(qū)的氨基酸分別被命名為Hx和Lx，其中X是根據(jù) Kabat 的方案，(Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda,Md. , 1987and 1991))指定氛基酸位置的編號。Kabat 對每個(gè)亞群列出了用于抗體的許多氨基酸序列，并且列出了在該亞群中每個(gè)氨基酸位置最通常存在的氨基酸。Kabat使用了一種方法，其在列出的序列中將殘基編號分配給每一個(gè)氨基酸，并且這種用于分配殘基編號的方法在本領(lǐng)域已經(jīng)成為標(biāo)準(zhǔn)。Kabat方案可以擴(kuò)展到不包括在他的綱要中的其他抗體，其通過將討論的抗體與Kabat中的共有序列之一進(jìn)行排齊。 應(yīng)用Kabat編號系統(tǒng)容易鑒定在不同抗體中的等價(jià)位置處的氨基酸。例如，在人類抗體的 L50位置處的氨基酸占據(jù)與小鼠抗體的L50位置處的氨基酸等價(jià)的位置。從N末端到C末端，輕鏈和重鏈可變區(qū)均包含交替的框架結(jié)構(gòu)和(CDR) " FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和 FR4。每個(gè)區(qū)域氨基酸的分配是根據(jù)Kabat (1987)和(1991)的定義，supra and/or Chothia & Lesk，J.Mol· Biol. 196 :901-917(1987) ；Chothia et al. ,Nature 342:878-883(1989)。
也可以在用于鑒定和/或分離具有必需特異性的人源化抗體(例如，來自文庫) 步驟是使用結(jié)合和/或粘附試驗(yàn)或其他合適的方法(例如競爭試驗(yàn))。
用于本發(fā)明的非人類和人類起源的抗體部分包括輕鏈、重鏈以及輕鏈和重鏈的部分。這些抗體部分可以從抗體獲得或衍生(例如，通過一部分的新合成)，或可制備和表達(dá)編碼具有期望性質(zhì)(例如，結(jié)合NKG2A，序列相似性，例如與Z199或Z270抗體的序列相似性)的抗體或其鏈的核酸。包含期望的人類和非人類起源的部分(例如，抗原結(jié)合區(qū)域、 CDR、FR、C區(qū)域)的人源化抗體可以利用合成和/或重組核酸(以制備編碼期望的人源化鏈的基因(例如，cDNA))來生產(chǎn)。為了制備鏈的一部分，將一個(gè)或多個(gè)終止密碼子在期望位置引入。例如，編碼新設(shè)計(jì)的人源化可變區(qū)的核酸序列可以利用PCR突變方法以改變現(xiàn)有的 DNA 序列進(jìn)行構(gòu)建(參見例如，Kamman, M. , et al. , Nucl. Acids Res. 17 :5404 (1989))。編碼新的CDR的PCR引物可以與前面的人源化可變區(qū)(其基于相同的，或非常相似的人類可變區(qū))的 DNA 模板雜交(Sato, K. , et al. , Cancer Research53 :851-856 (1993))。如果不能得到相似DNA序列用作模板，包含編碼可變區(qū)序列的序列的核酸可以由合成的寡核苷酸進(jìn)行構(gòu)建(參見，例如，Kolbinger,F. ,Protein Engineering 8 :971-980 (1993))。編碼信號肽的一個(gè)序列也可以并入該核酸(例如，通過合成，通過插入載體)。如果不能得到天然信號肽序列，則可以使用來自另一個(gè)抗體的信號肽序列(參見，例如，Kettleborough, C. A., Protein Engineering 4 :773-783 (1991))。使用這些方法(本文中描述的方法或其他合適的方法)，可以容易地生產(chǎn)變異體。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，克隆的可變區(qū)可以被誘變， 并且可以選擇(例如，從噬菌體文庫；參見例如Krebber et al.，美國Pat. No. 5，514，548 ； Hoogengoom et al.，WO 93/06213, published Apr. 1,1993))編碼具有期望特異性的變異體的序列。
本發(fā)明還涉及分離和/或重組(包括，例如，基本上純的)的包含編碼本發(fā)明的人源化抗體或人源化抗體的輕鏈和重鏈的序列的核酸。
人類抗體也可以根據(jù)各種其他技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，如為了免疫化通過使用已被改造為表達(dá)人類抗體表達(dá)譜的其他轉(zhuǎn)基因動物。在這種技術(shù)中，人類重鏈和輕鏈基因座的成分利用內(nèi)源性重鏈和輕鏈基因座的靶向破壞引入小鼠和其他動物(參見，例如，Jakobovitz et al. (1993)Nature 362 255 ；Green et al. (1994)Nature Genet. 7 13 ；Lonberg et al. (1994)Nature 368 856 ；Taylor et al. (1994) Int. Immun. 6 :579，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)?？商鎿Q地，人類抗體可以通過基因或染色體轉(zhuǎn)染的方法、或通過使用噬菌體顯示方法來選擇抗體所有組分進(jìn)行構(gòu)建。在該技術(shù)中，抗體可變結(jié)構(gòu)域基因符合框架結(jié)構(gòu)地被克隆入絲狀噬菌體的大或小殼體蛋白基因，并且在噬菌體顆粒表面上顯示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體的功能性質(zhì)的選擇也導(dǎo)致選擇編碼顯示那些性質(zhì)的抗體的基因。以這種方式，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些性質(zhì)(參見，例如，Johnson et al. (1993)Curr Op Struct Biol 3:5564-571 ；McCafferty et al. (1990)Nature 348 :552_553，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。人類抗體也可以通過在體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生(參見，例如，美國專利第5，567，610和5，229，275號，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，“人源化”單克隆抗體是使用動物如用于免疫化的 XenoMouse (Abgenix, Fremont, CA)制備的。一個(gè) XenoMouse 是一個(gè)鼠類宿主，其免疫球蛋白基因已被功能性的人類免疫球蛋白基因取代。因此，由這種小鼠產(chǎn)生的抗體或在由這種小鼠的B細(xì)胞制成的雜交瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體已經(jīng)是人源化的。該XenoMouse描述在美國專利第6，162，963號中，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。一個(gè)類似的方法可以使用 HuMAb-Mouse (Medarex)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的抗體也可以衍生成“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與原始抗體中相應(yīng)的序列等同或類似，而鏈的其余部分與來源于其他物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類中的相應(yīng)序列等同或類似，以及這樣的抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(參見，例如，Morrison et al. (1984)PNAS81 :6851 ;美國Pat. No. 4，816，567)。
在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了結(jié)合至細(xì)胞毒性劑的上文描述的(無論活化或抑制性的)任何抗體或其片段。如本文中使用的術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”是能夠殺傷在其細(xì)胞表面上帶有NKG2A受體的分子。本文中使用的術(shù)語“結(jié)合”是指兩種試劑通過共價(jià)和 /或非共價(jià)鍵互相結(jié)合；或直接或通過連接部分拴住或其他方式連接于另一個(gè)。
大量毒性部分或方法中的任何一個(gè)都可以用于生產(chǎn)這樣的細(xì)胞毒性抗體結(jié)合物。 在一些優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，抗體可以直接用放射性同位素或其他毒性化合物衍生。在這樣的情況下，可以將標(biāo)記的單一特異性抗-NKG2A抗體注入患者體內(nèi)，在那里它可以結(jié)合到并且殺傷表達(dá)靶抗原的細(xì)胞，尤其是NK細(xì)胞，其中未結(jié)合的抗體簡單地在體內(nèi)清除。 也可以使用間接方案，例如“親和力增強(qiáng)系統(tǒng)(Affinity Enhancement System) ” (AES)(參見，例如，美國專利第 5，256，395 號；Barbet et al. (1999) Cancer Biother Radiopharml4 153-166 ;將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。這種特殊的途徑包括使用放射性標(biāo)記的半抗原和識別NK細(xì)胞受體與放射活性半抗原的抗體。在這種情況下，首先將抗體注入患者并允許結(jié)合到靶細(xì)胞，然后，一旦允許從血流中清除未結(jié)合的抗體，則給予放射性標(biāo)記的半抗原。該半抗原結(jié)合到在過度增殖的LGL(例如，NK或T)細(xì)胞上的抗體-抗原復(fù)合體，從而殺傷它們，其中未結(jié)合的半抗原從體內(nèi)清除。
任何形式的具有細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性作用的部分均可結(jié)合到本發(fā)明抗體上， 以形成本發(fā)明的細(xì)胞毒性結(jié)合物并抑制或殺傷特異性NK受體表達(dá)的細(xì)胞，包括發(fā)射性同位素、毒性蛋白、毒性小分子，例如藥劑、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、酶抑制劑、治療放射性核素、血管形成抑制劑、化學(xué)治療劑、長春堿、氨茴環(huán)霉素、表葉毒素(epidophyllotoxin)、紫杉烷、抗代謝物、烷化劑、抗生素、C0X-2抑制劑、SN-38、抗有絲分裂物、抗血管形成和凋亡劑、尤其是阿霉素、氨甲蝶呤、紅豆杉醇、CPT-11、喜樹堿 (camptothecans)、氮芥、吉西他濱、燒基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、喃唳類似物、嘌呤類似物、鉬配位化合物、假單胞外毒素、蓖麻毒、相思豆毒蛋白、5-氟尿嘧啶核苷、 核糖核酸酶(RNase)、脫氧核糖核酸酶I (DNase I)、葡萄球菌腸毒素_A，美洲商陸抗病毒蛋白、白樹素、白喉毒素、假單胞菌外毒素、和假單胞菌內(nèi)毒素以及其他物質(zhì)(參見，例如， Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995) ；Goodman and Gilman’ s The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw Hill,2001)； Pastan et al. (1986)Cell 47 :641 ;Goldenberg(1994)Cancer Journal for Clinicians 44 :43;美國專利第6，077，499號；將其全部內(nèi)容引入本文以供參考)?？梢岳斫?，毒素可以是動物、植物、真菌或微生物來源的，或可以通過化學(xué)合成在體外新生成。
毒素或其他的化合物可以使用大量可獲得的方法中的任何一種直接或間接連接到抗體。例如，試劑可以通過使用交聯(lián)劑例如N-琥珀?；?-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(STOP)形成二硫鍵，或通過在抗體的Fe區(qū)的糖部分連接到減少抗體成分的鉸鏈區(qū)(參見，例如，Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56 244 ；ffong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking(CRC Press 1991) ；Upeslacis et al. ," Modification of Antibodies by Chemical Methods, " in Monoclonal antibodies !principles and applications, Birch et al. (eds. ) , pagesl87_230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)； Price, " Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, " in Monoclonal antibodies Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds. ), pages 60-84(Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989)Chemistry today 7 :51-58, Delprino et al. (1993)J. Pharm. Sci 82 :699-704 ；Arpicco et al. (1997)Bioconjugate Chemistry 8 :3 ；Reisfeld et al. (1989)Antihody, Tmmunicon. Radiopharrn. 2 217 ;將其每一個(gè)全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。
在一個(gè)(優(yōu)選)具體實(shí)施方式
中，抗體可用放射活性同位素如1-131進(jìn)行衍生?？梢允褂么罅亢线m的放射活性同位素中的任何一種，包括但不限于銦-111、镥-171、鉍-212、 鉍-213、砹-211、銅-62、銅-64、銅-67、釔-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、鈧-47、 銀-111、鎵-67、鐠-142、釤-153、鋱-161、鏑-166、欽-166、錸-186、錸-188、錸-189、 鉛-212、鐳-223、錒-225、鐵-59、硒-75、砷-77、鍶-89、鑰-99、銠-105、鈀-109、鐠-143、 钷-149、鉺-169、銥-194、金-198、金-199和鉛-211。通常，放射性核素優(yōu)選具有在20到 6，OOOkeV的范圍內(nèi)的衰變能量，優(yōu)選地，對于俄歇(Auger)放射體在60至200keV的范圍內(nèi)、對于β放射體在100-2，500keV內(nèi)、對于α放射體在4，000-6，OOOkeV內(nèi)。也優(yōu)選的是大致隨α粒子產(chǎn)生而衰變的放射性核素。
在本發(fā)明的細(xì)胞毒性組合物中選擇結(jié)合到抗-NKG2A抗體的細(xì)胞毒性部分，期望確保該部分在體內(nèi)不產(chǎn)生針對延續(xù)生命的正常組織嚴(yán)重的負(fù)作用，如選自心臟、腎、大腦、 肝、骨髓、結(jié)腸、乳房、前列腺、甲狀腺、膽囊、肺、腎上腺、肌肉、神經(jīng)纖維、胰腺、皮膚、或其他的在人類體內(nèi)的保持生命的器官或組織中的一種或多種。如本文中所使用的，術(shù)語“嚴(yán)重的副作用”是指抗體、配體或抗體結(jié)合物，當(dāng)在體內(nèi)給予時(shí)，其會僅僅產(chǎn)生可忽略或臨床上可處理的負(fù)作用，例如在化學(xué)治療過程中通常遇到的那些。
在一些相關(guān)的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明也提供結(jié)合到可檢測標(biāo)記物的本發(fā)明的抗體。本文中所使用的術(shù)語“可檢測標(biāo)記物”是指任何可以定量或定性觀察或測量的分子。可用于本發(fā)明的結(jié)合抗體的可檢測標(biāo)記物的實(shí)例是放射性同位素、熒光色素或互補(bǔ)結(jié)合對中的一員，例如以下中的任何一員抗原/抗體(不是針對NKG2A的抗體)、凝集素/碳水化合物；親和素/生物素；受體/配體；或分子印跡聚合物/印跡分子系統(tǒng)。
結(jié)合本發(fā)明抗體的可檢測標(biāo)記可以用于檢測體外或體內(nèi)該在抗體與NKG2A的結(jié)合。這樣的結(jié)合物也可以用來在競爭型實(shí)驗(yàn)中檢測另一個(gè)分子與NKG2A的結(jié)合。在一個(gè)體內(nèi)環(huán)境下，本發(fā)明的可檢測標(biāo)記物-抗體結(jié)合物可以用于監(jiān)測用本發(fā)明的NKG2A抗體組合物治療患者的效力，其中通過可檢測標(biāo)記物體表外檢測(例如，通過這樣的全身掃描)或通過檢測在從患者獲得的生物材料(例如，血液、活體組織、其他體液、皮膚碎屑等)。將在各種生物材料中標(biāo)記物的檢測與在所述材料中的治療性抗體的存在關(guān)聯(lián)起來。
在一個(gè)相關(guān)的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其在獨(dú)立的容器中包括可檢測標(biāo)記-抗-NKG2A抗體結(jié)合物；和包含NKG2A的材料。包含NKG2A的材料可以是分離的NKG2A，包含本發(fā)明的抗-NKG2A抗體結(jié)合的表位的NKG2A片段，或表達(dá)在其細(xì)胞表面上的NKG2A的細(xì)胞。
在非人靈長類動物體內(nèi)評價(jià)抗人類NKG2A抗體
在優(yōu)選的一系列具體實(shí)施方式
中，在非人靈長類動物體內(nèi)評價(jià)本發(fā)明的抗-NKG2A 抗體的活性。這樣的具體實(shí)施方式
可以為了各種理由中的任何一個(gè)而實(shí)施?？紤]到在人類NKG2A和來自非人靈長類動物的NKG2A之間的交叉反應(yīng)性，并且考慮到在靈長類動物之間的生理相似性，給予非人靈長類動物的識別人類NKG2A的抗體允許在體內(nèi)評價(jià)許多方面，包括但不限于其調(diào)節(jié)表達(dá)NKG2A(例如，NK細(xì)胞)的細(xì)胞的活性、產(chǎn)生的副作用、毒性、藥效學(xué)、藥代動力學(xué)、生物利用度、半衰期、給藥的最佳劑量或頻率、最佳劑型(包括與其他治療物質(zhì)的組合物)、或可以測量以確定該抗體的效率、安全性或最佳給藥方式的任何其他性質(zhì)。在體內(nèi)評價(jià)候選治療化合物的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并描述在例如The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,17th edition,Remington' s Pharmaceutical Sciences, 20th edition,將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。
任何非人靈長類動物可以用于本文描述的方法，包括猿、猴子和原猴類。優(yōu)選的靈長類動物包括恒河猴(Macacus mulatta)、非洲綠猴(Chlorocebus aethiops)、狨猴 (Callithrix jacchus)、松鼠猴(Saimiri sciureus)、食蟹猴和狒狒(Papio hamadryas)。 在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，靈長類動物不是猿，例如，是不同于黑猩猩的靈長類動物。非人靈長類動物通常用于候選人類治療劑的安全性和有效性試驗(yàn)，并且它們的注意事項(xiàng)、給藥方式、生物學(xué)和其他相關(guān)特征對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，在將任何抗體給予任何非人靈長類動物(或在任何試驗(yàn)中使用來自非人靈長類動物的組織、細(xì)胞或蛋白)之前，將確定候選抗-人類NKG2A抗體與來源于非人靈長類動物的 NKG2A的交叉反應(yīng)性。
在某些具體實(shí)施方式
中，非人靈長類動物用作用于可通過調(diào)節(jié)NKG2A的化合物治療的疾病或癥狀的模型。例如，可以使用自身免疫疾病、過敏反應(yīng)、癌癥或感染性疾病的模型，例如，用來評價(jià)抗體治療或減輕該疾病或癥狀的能力。雖然不以任何方式限制本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)，但是某些非人靈長類動物對于研究特定形式的疾病或癥狀是尤其有用的。例如，狨猴已用作用于研究免疫性和心血管疾病的模型動物，松鼠猴用作用于研究感染性疾病的模型動物，獼猴(包括恒河猴)用作用于研究特異性化合物的藥效和毒性的模型動物，以及狒狒作為外科研究、移植和生物材料的模型。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，將抗-NKG2A的抗體給予非人靈長類動物以評價(jià)這些抗體在結(jié)合和/或調(diào)節(jié)NKG2A活性方面的效力。在這樣的具體實(shí)施方式
中，抗體可以以任何劑量、頻率或劑型給藥，并且事實(shí)上可以變化這樣的因素以評價(jià)它們對藥效的相對影響?？贵w的效力可以用大量方式中的任何一種評價(jià)。例如，可以評價(jià)抗體與NKG2A或表達(dá)NKG2A 的細(xì)胞的體內(nèi)結(jié)合、抗體對在細(xì)胞例如NK細(xì)胞上的NKG2A表達(dá)的體內(nèi)影響，或抗體對NKG2A 活性的體內(nèi)影響，例如，如使用本文中描述的任何試驗(yàn)測量NK細(xì)胞活性。在這樣的具體實(shí)施方式
中，通常將抗體給予非人靈長類動物，并且例如在從非人靈長類動物獲得的生物樣品上檢測其影響?？商鎿Q地，可以在體外實(shí)施某些方法，其中考察抗體對例如從非人靈長類動物獲得的表達(dá)NKG2A的細(xì)胞的作用。
為了評價(jià)抗-人類NKG2A抗體的結(jié)合，可以將抗體直接或間接地標(biāo)記。例如，可以在給藥之前用放射性同位素標(biāo)記該抗體，并且給藥后通過考察各種在不同時(shí)間點(diǎn)獲得的生物樣品(例如，血、各種組織或器官、免疫相關(guān)的組織如骨髓、脾、淋巴系統(tǒng)成分或其他) 來評價(jià)其在動物體內(nèi)的定位。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，獲得PBL，并且利用例如熒光標(biāo)記的第二抗體(其中檢測結(jié)合的抗體，例如，通過FACS分析)來確定抗體與NK細(xì)胞的結(jié)八口 ο
類似地，可將抗體給予非人靈長類動物并且評價(jià)它們對NKG2A活性的影響。例如， 可以在給予抗-NKG2A抗體前和后獲得NK細(xì)胞，并且可以利用任何標(biāo)準(zhǔn)方法來評價(jià)NKG2A 的活性、表達(dá)、和/或兩個(gè)(或更多)組細(xì)胞的數(shù)量?？梢云谕钄郚KG2A刺激(由此通過該受體阻斷NK細(xì)胞的抑制)的本發(fā)明的活化抗體增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性?？梢云谕宦?lián)NKG2A 受體的本發(fā)明的抑制性抗體降低NK細(xì)胞的活性并且降低存活NK細(xì)胞的數(shù)量。可以引起非人靈長類動物體內(nèi)的NK細(xì)胞活性改變的兩種類型的抗體都被認(rèn)為適合用于治療人類的疾病(其中希望NK細(xì)胞活性升高或降低)。
在另一組具體實(shí)施方式
中，將抗-NKG2A的抗體給予非人靈長類動物以便評價(jià)這些抗體的安全性，以及它們的各種藥代動力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)。安全性可以用大量方法中的任何一種進(jìn)行評價(jià)。例如，可以通過確定半致死劑量(LD50)(通常以毫克每千克(mg/kg)表達(dá))來評價(jià)這些抗體的整體毒性，其中數(shù)值50是指被研究動物中的死亡百分?jǐn)?shù)。除了決定 LD50外，還可以通過監(jiān)測動物對于給藥的任何可檢測反應(yīng)，包括通過心率、血壓等表現(xiàn)的行為、身體、或生理變化來評價(jià)安全性。反應(yīng)也涉及血液和其他的試驗(yàn)室為基礎(chǔ)的試驗(yàn)，以檢查器官功能的標(biāo)記物指示，如用于腎功能的肌酸或BUN，凝血酶原，膽紅素，白蛋白，或確定肝功能的各種酶或其他(參見，例如，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th edition,通過引用結(jié)合在此)。
用于評價(jià)該抗體的體內(nèi)藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的方法是標(biāo)準(zhǔn)的并且在本領(lǐng)域是熟知的(參見，例如，He et al. (1998) J. Immunol. 160 :1029-1035 ；Alyanakian et al. (2003) Vox Sanguinis 84 :188-192，Sharma et al. (2000) JPET 293 :33_41，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。這樣的試驗(yàn)通常包括將抗-NKG2A抗體給予非人靈長類動物，并且在給藥后31的不同時(shí)間檢測該抗體的水平(在血漿和其他組織中)、分布、結(jié)合、穩(wěn)定性和其他性質(zhì)。這樣的試驗(yàn)是臨床前研究的重要組成部分，并且通過確定該抗體的體內(nèi)半衰期、分布、生物利用度等有助于確定通過給予抗體達(dá)到最佳的表達(dá)NK細(xì)胞的靶向作用的治療窗以及由此的正確給藥方式(例如，給藥的頻率和劑量)。
聯(lián)合抗-NKG2A抗體的效力、安全性、藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的研究，多種劑型和給藥方案也可以系統(tǒng)地進(jìn)行試驗(yàn)研究以獲得抗-人類NKG2A抗體的最佳效力和安全性。例如，可以確定治療窗(具有高度治療成功的可能性的該抗體的血漿濃度范圍)，以及那些在體內(nèi)靶向NKG2A和調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性方面最安全和有效的給藥方案和劑型。例如，可以每I、 2、3、4、5或6天或每1、2、3或4周等給予抗體，并且考察其安全性、效力、動力學(xué)等參數(shù)。同樣地，在任何一個(gè)時(shí)間給予的抗體的劑量可以變化并且考察相同的參數(shù)，或可以檢測給藥的劑量和頻率的任何組合。而且，也可以在非人靈長類動物內(nèi)檢測不同的劑型，例如包含不同賦形劑不同組合的抗-NKG2A抗體、或NKG2A抗體與其他治療劑的不同組合(依賴于待治療的癥狀，例如治療癌癥的化學(xué)治療物質(zhì))的組合物。同樣，可以比較不同的給藥途徑，例如靜脈、肺部、局部等等。改變給藥參數(shù)的這樣的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。
藥物纟目合物
本發(fā)明也提供了組合物(例如藥物組合物)，其包含有效量的在任何合適載體中的任何本發(fā)明的抗體，包括其片段和衍生物。
可用于這些組合物中的藥學(xué)上可接受的載體包括，但不限于，離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白如人類血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和的植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)類，如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素基物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本發(fā)明的組合物可以口服、腸胃外給藥，通過吸入噴霧、局部地、經(jīng)直腸地、經(jīng)鼻地、向頰地、經(jīng)陰道地或通過植入池給藥。如本文中所使用的術(shù)語“腸道外的”包括皮下的、 靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、胸骨內(nèi)的、胸內(nèi)的、肝內(nèi)的、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。 對于局部疾病例如RA，經(jīng)常將該組合物局部給藥，例如，在發(fā)炎的關(guān)節(jié)。
本發(fā)明的組合物的無菌可注射形式可以是水性或油質(zhì)懸液。這些懸液可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，利用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑配制。無菌的可注射制劑也可以是在非毒性腸道外可接受的稀釋液或溶劑中(例如在1，3_ 丁二醇中)的無菌可注射溶液或懸液。這些可采用的可接受載體或溶劑是水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，傳統(tǒng)地使用無菌不揮發(fā)性油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以使用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。脂肪酸如油酸和其甘油衍生物在制備可注射制劑是有用的，因?yàn)槭翘烊坏乃帉W(xué)上可接受的油，如橄欖油或蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙基化形式。這些油溶液或懸浮液也可以包含長鏈醇稀釋劑或分散劑，如羥甲基纖維素或類似的分散劑(其通常用于藥學(xué)上可接受的劑量形式，包括乳液和懸浮液)。其他經(jīng)常使用的表面活性劑，如吐溫、司盤和其他的乳化劑或生物利用度增強(qiáng)劑(其通常用于藥學(xué)上可接受的固體、液體或其他劑型)也可用于配制制劑的目的。
本發(fā)明的組合物可以以任何口服可接受的劑型(包括，但不限于膠囊劑、片劑、水性懸液或溶液)口服給藥。如果是口服使用的片劑，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。 通常還加入潤滑劑，例如硬脂酸鎂。對于以膠囊形式的口服給藥，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)要求口服用水性懸液時(shí)，將活性成分與乳化劑和懸浮劑聯(lián)合。如果需要，也可以添加某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。
可替換地，本發(fā)明的組合物可以以直腸給藥的栓劑形式給藥。這些可以通過混合該藥物與合適的無刺激性賦形劑(其在室溫下是固體的，但在直腸溫度下是液體，因此在直腸內(nèi)會溶解以釋放藥物)進(jìn)行制備。這樣的物質(zhì)包括可可油、蜂蠟、聚乙二醇。這樣的組合物是根據(jù)藥劑領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備的。
本發(fā)明的組合物可以局部給藥，尤其是當(dāng)治療目標(biāo)包括通過局部施加容易到達(dá)區(qū)域和器官，包括眼、皮膚、關(guān)節(jié)或腸下段。合適的局部制劑對于這些區(qū)域或器官的每一個(gè)都容易制備。腸下段的局部施加可以直腸栓劑(見上文)或合適的灌腸劑來實(shí)現(xiàn)。也可以使用局部的皮膚貼。
對于局部施加，組合物可以制成合適的藥膏，其包含懸浮或溶解在一種或多種載體中的活性成分。用于本發(fā)明化合物的局部給藥的載體包括但不限于，礦物油、液體石蠟、 白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水?？商鎿Q地，該組合物可以制成合適的洗液或霜劑，其包含懸浮或溶解在一種或多種藥學(xué)上可接受的載體中的活性成分。 合適的載體包括，但不限于礦物油、單硬脂酸山梨醇酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
對于眼科應(yīng)用，在有或沒有防腐劑的情況下，將該組合物可以在等滲pH調(diào)節(jié)的無菌鹽水中制成微粉化懸液，或優(yōu)選地在等滲PH調(diào)節(jié)的無菌鹽水中制成溶液，如苯扎氯銨 (benzylalkonium chloride)?？商鎿Q地,對于眼科應(yīng)用，該組合物可以制成藥膏例如凡士林油。
本發(fā)明的組合物也可以通過鼻氣霧劑或吸入進(jìn)行給藥。這樣的組合物可以根據(jù)藥劑領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行制備，并且可以在鹽水中制成溶液，采用芐醇或其他合適的防腐劑， 吸收促進(jìn)劑以增強(qiáng)生物利用度、碳氟化合物和/或其他傳統(tǒng)的增溶劑或分散劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的抗體或治療化合物可以單獨(dú)或與用于靶向輸送到患者或動物的另一物質(zhì)一起并入脂質(zhì)體(在抗體情形下的“免疫脂質(zhì)體”)。這樣的其他物質(zhì)可以包括用于遞送基因治療基因或用于遞送活化NK細(xì)胞或者抑制成熟樹突細(xì)胞的反義RNA、RNAi或siRNA，或者用于通過其他方式活化NK細(xì)胞(或抑制樹突細(xì)胞)的毒素或藥物，或者任何本文中描述的對于本發(fā)明目的有用的其他藥物。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的抗體或其他化合物可以被修飾以提高其生物利用度、體內(nèi)半衰期等。例如，可以使用大量形式的聚乙二醇的任一種和本領(lǐng)域已知的連接方法(參見，例如，Lee et al. (2003)Bioconjug Chem. 14(3) :546-53 ； Harris et al. (2003)Nat Rev Drug Discov. 2(3) :214-21 ;Deckert et al. (2000)Int J Cancer. 87 (3) :382-90)將抗體和其他的化合物聚乙二醇化。
確定給藥的劑量和頻率
如上面描述的，本發(fā)明的一個(gè)重要部分是在非人靈長類動物中試驗(yàn)抗-NKG2A抗體，以確定安全和有效的給藥劑量和頻率。合適的起始給藥方案可以通過研究利用其他已經(jīng)開發(fā)的治療性單克隆抗體的經(jīng)驗(yàn)來確定。已證實(shí)多種單克隆抗體在臨床條件下有效，例如利妥昔單抗(Rituximab)、曲妥單抗(Trastuzumab)、奧馬佐單抗(Omalizumab)、托西莫單抗(Tositumomab)、阿侖單抗(Alemtuzumab)、替伊莫單抗(Zevalin)、Oncolym并且本發(fā)明的抗體可以使用類似的給藥方案(即制劑和/或劑量和/或給藥方案)。給藥的進(jìn)度和劑量可以根據(jù)對于這些產(chǎn)品已知的方法來確定，例如使用制造商的說明書。例如，單克隆抗體可以是在IOOmg(IOmL)或500mg(50mL)單次使用小瓶中的10mg/mL的濃度。對于IV給藥，該產(chǎn)品可以在9. Omg/mL氯化鈉、7. 35mg/mL朽1檬酸鈉二水化物、O. 7mg/mL聚山梨醇酯80 和無菌水中配制成注射用的。將PH值調(diào)節(jié)到6.5。對于本發(fā)明的抗體的示例性合適劑量范圍可以在約10mg/m2和500mg/m2之間。然而，可以理解，這樣的進(jìn)度是示范性的并且最佳進(jìn)度和方案可以在考慮該抗體的親和力和抗-NKG2A活性調(diào)節(jié)以及必須在臨床試驗(yàn)中確定的抗體耐受性的基礎(chǔ)上進(jìn)行修改?？紤]抗體的親和力和它的藥代動力學(xué)參數(shù)而確定用針對 NKG2A的抗體飽和細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)或一星期或一個(gè)月的注射量和進(jìn)度。
然而，可以理解，這些進(jìn)度是示范性的并且最佳進(jìn)度和方案可以在考慮該抗體的親和力和抗-NKG2A活性調(diào)節(jié)以及必須在臨床或臨床前試驗(yàn)中確定的抗體耐受性的基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。考慮抗體的親和力和它的藥代動力學(xué)參數(shù)而確定用針對NKG2A的抗體保護(hù)細(xì)胞 24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)或一星期或一個(gè)月的注射量和進(jìn)度。
在現(xiàn)在的方法中給予患者或非人靈長類動物的劑量應(yīng)該足以在一定時(shí)間內(nèi)在患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)有益的效果。劑量可以通過使用的特定調(diào)節(jié)劑的效力和患者的癥狀，以及待治療的體重或區(qū)域的表面積來確定。劑量的大小也將通過在特定患者中可能伴隨給藥的任何不良負(fù)作用的存在、類型和程度來確定。在確定特定患者的待給予化合物的有效量中，醫(yī)生可以評估該化合物的循環(huán)血漿水平、化合物毒性和抗-化合物抗體的產(chǎn)生。通常，化合物的劑量當(dāng)量在典型的患者中為約lng/kg到10mg/kg。給藥可以通過單次或分開的劑量完成。
結(jié)合人類和非人靈長類動物NKG2A受體的本發(fā)明的抗體可以有利地用于確定給藥的劑量和頻率。選擇用于利用抗-NKG2A抗體的治療的最佳治療窗的選擇可以基于將抗體給予非人靈長類動物來實(shí)現(xiàn)。盡管已建議在短時(shí)間內(nèi)(24小時(shí)共培養(yǎng))的NK細(xì)胞活化以避免骨髓細(xì)胞(BMC)的毒性，但是已經(jīng)證實(shí)更長(48小時(shí)骨髓細(xì)胞與活化的NK細(xì)胞的共培養(yǎng))時(shí)間會有害影響造血重建(Koh et al. (2002)Biol. Blood Marrow Transplant. 8 17-25)。然而，采用允許在個(gè)體內(nèi)的NK細(xì)胞暴露于NK細(xì)胞活化的抗-NKG2A抗體達(dá)更長時(shí)間(例如比24小時(shí)或甚至48小時(shí)更長)的給藥方案是非常有價(jià)值的。雖然不希望受理論限制，但是這樣的方案(其中抗-NKG2A抗體存在大于24小時(shí)或48小時(shí))將使抗-NKG2A抗體接觸并活化在個(gè)體內(nèi)的足夠量的NK細(xì)胞用于針對靶標(biāo)的有效治療。因此，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一種用抗NKG2A抗體治療個(gè)體的方法，其包括將所述的個(gè)體暴露于抗-NKG2A抗體達(dá)到大于24小時(shí)，更優(yōu)選大于48小時(shí)的時(shí)間期。最優(yōu)選地，本發(fā)明包括給予所述個(gè)體具有大于24小時(shí)、或48小時(shí)、或更優(yōu)選地至少5、6、7、10、14或20天的血漿半衰期的抗-NKG2A 抗體。最優(yōu)選地，本發(fā)明包括給予所述患者包含F(xiàn)e部分，優(yōu)選地G2或G4型的Fe部分的抗-NKG2A抗體。如本文進(jìn)一步討論的，可以使用阻斷NKG2A功能的任何合適抗體，例如具有Z199或Z270結(jié)合特異性的抗體。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，抗體可以給予第二次或更多次劑量，并且抗體可以是嵌合的、CDR接枝的人類或人源化的抗體。
本發(fā)明提供了一種鑒定對于針對人類NKG2A的治療抗體合適給藥方案的方法，該方法包括使用某種給藥方案，優(yōu)選地其中抗體的劑量和頻率變化的一系列方案將抗體給予非人靈長類動物，并且確定在非人靈長類動物中表達(dá)NKG2A的細(xì)胞的活性和對于特定給藥方案療法對靈長類動物的骨髓細(xì)胞(BMC)和/或造血細(xì)胞，尤其是骨髓來源細(xì)胞重建的影響。優(yōu)選地，所述方法進(jìn)一步包括在給予抗-NKG2A抗體之后評估骨髓重建，通常涉及確定對于骨髓重建到正常例如接近抗NKG2A治療之前觀察的水平或預(yù)定的水平所需要的天數(shù)。 然后可以選擇或鑒定允許骨髓重建到正常的給藥方案。
該方法可以進(jìn)一步包括確定在非人靈長類動物中的表達(dá)NKG2A的細(xì)胞的活性和/ 或鑒定或選擇在表達(dá)NKG2A的細(xì)胞活性方面導(dǎo)致可檢測調(diào)節(jié)的給藥方案。
所述的給藥方式可以表達(dá)為例如根據(jù)個(gè)體暴露于活化NK細(xì)胞的抗-NKG2A抗體的時(shí)間和抗體給藥的頻率。基于這樣的參數(shù)，可以根據(jù)使用的特定抗體，例如考慮抗體的血漿半衰期、親和力、生物利用度(或達(dá)到峰值血清濃度的時(shí)間)等來調(diào)整給藥的頻率和劑量。
確定一種給藥方案在哺乳動物體內(nèi)允許骨髓重建部分或完全恢復(fù)或正?；⑶覍?dǎo)致在表達(dá)NKG2A的細(xì)胞活性方面可檢測到的調(diào)節(jié)，表明該給藥方案適用于人類。
內(nèi)源性的人類免疫球蛋白的分解代謝速率已被很好表征。IgG的半衰期根據(jù)同種型變化，對于IgGl、IgG2和IgG4達(dá)到3周而對于IgG3接近I周。除非藥代動力學(xué)通過抗原結(jié)合或免疫原性改變，完整的人類IgG單克隆抗體將顯示與內(nèi)源性IgG相當(dāng)?shù)乃幋鷦恿W(xué)。如前面討論的，人類IgGl、IgG2和IgG4同種型的特別長的半衰期是由于FcRn的分解代謝保護(hù)。FcRn表達(dá)在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和吞噬細(xì)胞上表達(dá)。當(dāng) IgG經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)吞時(shí)，內(nèi)含體的低pH值促進(jìn)IgG Fe結(jié)構(gòu)域結(jié)合FcRn，其使IgG再循環(huán)到細(xì)胞表面并且補(bǔ)救IgG不被溶酶體降解。相比于其他IgG同種型，IgG3的較短半衰期是由于在FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的單個(gè)氨基酸的不同(在435位置用精氨酸取代組氨酸)。
完整小鼠IgGl和IgG2抗體的消除比相應(yīng)的人類同種型快得多。鼠抗體的半衰期在人體內(nèi)為在12到48小時(shí)的范圍內(nèi)。鼠抗體在人體內(nèi)的短半衰期是由于小鼠Fe結(jié)構(gòu)域與人類FcRn的低結(jié)合親和力。人類FcRn結(jié)合人類、兔和豚鼠IgG，但對大鼠、牛、羊或小鼠 IgG的結(jié)合不明顯；小鼠FcRn結(jié)合來自所有這些物種的IgG?？贵w片段(包括F(ab’)2、 Fab和scFV)缺乏Fe結(jié)構(gòu)域，并且不與FcRn結(jié)合。因此，這些片段的半衰期實(shí)質(zhì)上比完整 IgG的短，其中主要通過它們的分子量確定半衰期。低分子量Fab和scFv片段經(jīng)歷腎清除， 其加速消除。報(bào)道的半衰期對于F(ab’)2片段為在11到27h的范圍內(nèi)，而對于Fab片段為在O. 5到21h的范圍內(nèi)。單價(jià)和多價(jià)scFv構(gòu)建體的為半衰期可以從幾分鐘到幾小時(shí)的范圍內(nèi)。
抗原結(jié)合可以明顯影響抗體的藥代動力學(xué)。如果抗體結(jié)合內(nèi)化的細(xì)胞膜抗原或與從循環(huán)中有效清除的分泌抗原形成的免疫復(fù)合體，該抗原在抗體清除時(shí)充當(dāng)“泄口 (sink)”。一個(gè)抗原泄口將產(chǎn)生劑量依賴的藥代動力學(xué)。如果劑量水平不足以使抗原庫飽和，這抗原介導(dǎo)的清除會起主要作用并且抗體的半衰期會比內(nèi)源性IgG的半衰期短；在使抗原飽和的劑量水平下，RES-介導(dǎo)的清除會起主要作用并且半衰期與內(nèi)源性IgG類似。
本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
描述了一種給藥方案，其中抗-NKG2A抗體在第一次給藥中給予?？?NKG2A抗體的第一劑量活化NK細(xì)胞并且可以間接地通過激活NK細(xì)胞來抑制個(gè)體內(nèi)的骨髓細(xì)胞重建。給予的抗-NKG2A抗體的第二劑量符合骨髓的細(xì)胞重建恢復(fù)的藥效外形，例如在當(dāng)期望個(gè)體骨髓細(xì)胞重建的速度具有至少部分恢復(fù)時(shí)進(jìn)行給藥。因此， 通過利用與人類和非人靈長類動物體內(nèi)的受體交叉反應(yīng)的抗NKG2A抗體，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一種其中NK細(xì)胞與抗-NKG2A抗體接觸超過24小時(shí)(在該期間已報(bào)道骨髓重建未受影響)的方法。
在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，抗-NKG2A抗體的第二劑量將在初次給藥之后的至少 6、7、8、9或10天給藥，并且優(yōu)選在初次給藥之后的至少14、15、16或20天給藥。最優(yōu)選地抗-NKG2A抗體的第二劑量是在評價(jià)受治者體內(nèi)抗-NKG2A抗體的血漿濃度確定達(dá)到初始 (給藥)濃度的一半的時(shí)間(天)之后的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者至少14、15、 16或20天給藥，優(yōu)選在抗-NKG2A抗體的至少一個(gè)血漿半衰期的持續(xù)時(shí)間之后的至少6_10 天或至少15-20天?？商鎿Q地，該方法可以以抗-NKG2A抗體的峰值血清濃度來表示，其中抗-NKG2A抗體的第二劑量在評價(jià)受治者體內(nèi)抗-NKG2A抗體血漿濃度達(dá)到個(gè)體峰值血清濃度的一半的時(shí)間(天)之后的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者至少14、15、16或20天給藥。
在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
中，抗-NKG2A抗體的第二劑量是在評價(jià)受治者體內(nèi)抗-NKG2A抗體的血漿濃度確定達(dá)到不可檢測濃度的時(shí)間(天)之后的至少2、3、4、5、6、7、 8、9或10天或者至少14、15、16或20天給予，優(yōu)選在至少2、3、4或更多個(gè)抗-NKG2A抗體的血漿半衰期的持續(xù)時(shí)間之后的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10天或者至少14、15、16或20天給藥。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，描述的給藥方案用于包含G2b，優(yōu)選G4亞型(分別IgG2b或IgG4)的Fe區(qū)域的抗體。優(yōu)選所述抗體具有約5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、 21天或優(yōu)選約10 15天、15-21天的半衰期。優(yōu)選地該抗體包含基本上不與NK細(xì)胞上的 Fe受體(CD16)結(jié)合的Fe區(qū)域。所述抗體優(yōu)選以第一劑量、以及第二劑量和/或隨后的劑量給藥，其中第二和/或隨后的劑量是在評價(jià)抗體達(dá)到其初始濃度的一半之后的至少6、7、 8、9、10、14、15、16或20天給藥的。所述第二和/或隨后的劑量也可以以給藥后的絕對天數(shù)表達(dá)，例如，優(yōu)選在初次給藥后至少6、7、8、9或10天，并且優(yōu)選在第一次給藥后至少14、 15、16、20、21、24、28、30或35天給藥。所述抗體可以是包含天然存在的Fe部分，優(yōu)選天然存在的人類Fe部分的抗體，或更優(yōu)選地可以包含修飾，例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代以增強(qiáng)抗體的血漿半衰期和/或改變與Fe受體的結(jié)合，例如增強(qiáng)與Fcn受體的結(jié)合以延長血漿半衰期、或減少與Fe YlIIa的結(jié)合以減輕對NK細(xì)胞不期望的毒性(ADCC)。這樣的修飾可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法實(shí)施，這些修飾中的多種將進(jìn)一步在本文中描述。
在又一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，描述的給藥方案用于抗體片段，優(yōu)選例如用本文描述的聚乙二醇修飾的F(ab’)2片段，以具有約5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、21天的血漿半衰期。所述抗體優(yōu)選以第一劑量給藥，以及第二和/或隨后的劑量給藥，其中第二和/ 或隨后的劑量在評價(jià)抗體達(dá)到其初始濃度的一半之后的至少6、7、8、9、10、14、15、16或20 天給藥。所述第二和/或隨后的劑量也可以以給藥后的絕對天數(shù)表達(dá)，例如，優(yōu)選在初次給藥后的至少6、7、8、9或10天，優(yōu)選在第一次給藥后的至少14、15、16、20、21、24、28、30或35 天。
藥物組合物
根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)重要的具體實(shí)施方式
，抗-NKG2A抗體和/或其他化合物可以與一種或多種另外的治療劑一起配制，其中所述另外的治療劑包括對于特定治療目的(該抗體或化合物被給予)而正常使用的藥物。另外的治療劑通常按照在單一治療中用于治療特定疾病或癥狀所常用的劑量給藥。這樣的治療劑包括，但不限于治療癌癥中所使用的治療劑(“抗癌化合物”，包括化學(xué)治療化合物、激素、血管形成抑制劑、凋亡劑等)；用于治療傳染病的治療劑(包括抗病毒化合物)；用于其他免疫治療的治療劑，例如自身免疫性疾病、 炎性障礙和移植排斥的治療劑；細(xì)胞因子；免疫調(diào)節(jié)劑；輔助化合物；或針對激活和抑制NK 細(xì)胞受體的其他抗體和其他抗體的片段。除非另有指明，下面列出的聯(lián)合組合物可以包括本發(fā)明的活化抗體、抑制抗體或細(xì)胞毒素-抗體結(jié)合物。
用于治療癌癥的治療劑包括化學(xué)治療劑(包括干擾DNA復(fù)制、有絲分裂和染色體分離的藥物，以及破壞多核苷酸前體合成和精確度的試劑)、激素治療劑、抗血管形成劑以及誘導(dǎo)凋亡的試劑。
作為示例性考慮的化學(xué)治療藥包括但不限于烷化劑，抗代謝藥，細(xì)胞毒性抗生素，長春花生物堿，例如阿霉素、更生霉素、自力霉素、洋紅霉素、道諾霉素、亞德里亞霉素、三苯氧胺、紅豆杉醇、紫杉特爾(taxotere)、長春新堿、長春堿、長春瑞濱、依托撲沙 (VP-16)、5_氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、硫替派、氨甲葉酸、喜樹堿、放線菌素-D、 絲裂霉素C、順鉬(CDDP)、氨喋呤、考布他汀(combretastatin)及其衍生物和前物。
激素類藥劑包括但不限于例如LHRH促效劑，如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、 和布舍瑞林；抗雌激素類，如三苯氧胺和托瑞米芬；抗雄激素類諸如氟他米特、尼魯米特、 去乙酰環(huán)丙氯地孕酮和比卡魯胺；芳香酶抑制劑，如阿納托唑、依西美坦、來曲唑和法倔唑 (fadrozole);以及孕激素類,如美沙洛爾(medroxy)、氯地孕酮和甲地孕酮。
許多用于聯(lián)合療法的示例性化學(xué)治療劑列于美國專利第6，524，583號的表C中， 將其披露的藥物具體地通過引用結(jié)合在此。列出的每一個(gè)藥物是示例性的而不是限制性的° 技術(shù)人員關(guān)注"Remington' s Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33，in particular pages 624-652。劑量變化可能取決于待治療疾病。實(shí)施治療的醫(yī)師將能夠確定單個(gè)受治者的合適劑量。
抗血管形成劑的實(shí)例包括中和抗體、反義RNA、siRNA、RNAi、RNA適體和每一針對 VEGF或VEGF受體的核糖核酸酶，(美國專利第6，524，583號，將其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。也可以使用具有拮抗特性的VEGF變異體，如在WO 98/16551中所描述的，明確地以引用方式并入本文。用于與聯(lián)合療法有關(guān)的另外的示例性抗血管形成劑列于美國專利第 6，524，583號的表D中，將這些藥物和披露內(nèi)容明確地通過引用結(jié)合在此。
示例性的細(xì)胞凋亡劑包括但不限于bcr_abl, bcl_2 (不同于bcl_l,細(xì)胞周期蛋白Dl ;基因庫登記號為M14745，X06487 ;美國專利第5，650，491和5，539，094號；將其均通過引用結(jié)合在此)和包括Bcl-Xl、Mcl-l、Bak、Al及A20的家族成員。bcl_2的過表達(dá)首先發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞淋巴瘤。致癌基因bcl-2通過結(jié)合繼而滅活凋亡Bax (路徑中的一個(gè)蛋白) 而發(fā)揮作用。抑制bcl-2的功能阻止了 Bax的失活，從而使凋亡路徑繼續(xù)。這類致癌基因的抑制(例如，使用反義核苷酸序列、RNAi, siRNA或小分子化合物)被考慮用于本發(fā)明以促進(jìn)凋亡(美國專利第5，650，491 ;5，539，094和5，583，034號；將其每一個(gè)均通過引用結(jié)合在此)
可以與本發(fā)明的分子聯(lián)合使用的有用的抗病毒劑包括但不限于蛋白酶抑制劑、 核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和核苷類似物?？共《緞┑膶?shí)例包括但不限于疊氮胸苷、阿昔洛韋、gangcyclovir、阿糖腺苷、5-碘脫氧尿苷、三氟尿苷和病毒唑，以及磷碳鈉、金剛烷胺、金剛乙胺、沙奎那韋、印地那韋、安潑那韋、洛匹那韋、利托那韋、α -干擾素；阿德福韋、clevadine、恩替卡韋(entecavir)和普來可那立(pleconaril)。
對于自身免疫性或炎性障礙，已知的對于一種或多種類型的自身免疫性或炎性障礙、或自身免疫性或炎性障礙的任一癥狀或特征有效的其他化合物，除其他之外，包括免疫抑制劑，例如硫唑嘌呤(例如依木蘭)，瘤可寧(例如苯丁酸氮芥)，癌得星(例如環(huán)磷酰胺)，環(huán)孢霉素(例如山地明，Neoral)，氨甲葉酸(例如甲氨蝶呤膠囊劑)，皮質(zhì)激素，潑尼松(例如去氫可的松，強(qiáng)的松)，依那西普(例如Enbrel)，英夫利昔單抗(例如小前指羽)， TNF抑制劑，F(xiàn)K-506，雷怕霉素，麥考酚酸嗎乙酯，來氟米特，抗淋巴細(xì)胞球蛋白，脫氧精胍菌素或OKT。
免疫調(diào)節(jié)化合物的優(yōu)選實(shí)例包括細(xì)胞因子。其他實(shí)例包括，具有優(yōu)選具有活化或增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，或誘導(dǎo)或促進(jìn)NK細(xì)胞增生的作用的化合物。免疫調(diào)節(jié)化合物的實(shí)例包括但不限于N0D和PKR受體的配體；TLR(Toll類受體)的促效劑，如TLR3(dsRNA， poly I :C和polyA:U)促效劑，TLR4 (ANA380，艾沙托立賓，LPS和模擬物，如MPL)促效劑， TLR7 (寡核苷酸，ssRNA)促效劑，TLR9 (寡核苷酸如CpG)促效劑，其許多實(shí)例描述于Akira 和Takeda((2004)Nature Reviews 4:499、)中；阻斷在NK細(xì)胞上的抑制受體(如抑制 KIR2DL1和KIR2DL2/3活性)的抗體或用作NK細(xì)胞活性受體的抗體(如與NCR受體抗體 NKp30,NKp44或NK046交聯(lián)的抗體)。在根據(jù)本發(fā)明的組合方法中可以使用各種細(xì)胞因子。 用于本發(fā)明考慮的組合中的細(xì)胞因子的實(shí)例包括IL-I a、IL-1 β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL_21、TGF_P 、GM_CSF、M_CSF、 G-CSF、TNF- a、TNF- β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG, MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN- a、 IFN-β、IFN-Y。在本發(fā)明的聯(lián)合治療或組合物中使用的細(xì)胞因子根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案給藥，該方案與諸如患者的癥狀和細(xì)胞因子的相對毒性的臨床顯示一致。
以實(shí)例的方式，輔助化合物可以包括抗催吐藥如5-羥色胺拮抗劑和治療藥如酚噻嗪系、取代的苯酰胺類、抗組胺劑、丁酰苯、皮質(zhì)激素、地西泮和大麻素類；二膦酸鹽如唑來膦酸和帕米膦酸；以及造血生長因子如促紅細(xì)胞生成素和G-CSF，例如非格司亭 (filgrastim)、來諾拉提(Ienograstim)和 darbepoietin。
可與本發(fā)明的活化抗-NKG2A抗體一起配制的其他治療劑包括可以活化NK細(xì)胞的其他化合物。例如，可以利用刺激NCR的化合物，例如NKp30、NKp44和NKp46 (參見，例如 PCT WO 01/36630，Vitaleet al. (1998)J. Exp. Med. 187 :2065-2072, Sivoriet al. (1997) J.Exp. Med. 186 :1129-1136 ；Pessinoet al. (1998)J.Exp. Med. 188 :953-960 ；Pessinoet al. (1998) J. Exp Med. 188 :953-960 ;將其全部披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)；作為KIR抑制性受體的抑制劑(參見，例如 Yawata et al. (2002)Crit Rev Immunol 22:463-82; Martinet al. (2000)Immunogenetics. 51 :268-80 ；Lanier (1998)Annu Rev Tmmunol.16 359-93 ;將其全部披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。優(yōu)選地，使用一種活化劑，例如NKp30的天然配體或活化抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，使用TGF-β I的抑制劑，因?yàn)門GF-β I可以下調(diào) ΝΚρ30(參見，例如 Castriconiet al. (2004) C. R. Biologies327 :533_537，將其全部披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。
可以與本發(fā)明的抑制性抗-NKG2A抗體一起配制的治療化合物是可以抑制NK細(xì)胞的化合物。這樣的化合物包括NCR的抑制劑，例如NKp30，NKp44和NKp46，活化NKG2受體(例如NKG2C)的抑制劑；抑制性KIR受體的活化劑或抑制性Ly49受體的活化劑。
本發(fā)明的活化性抗體也可以和抗原(期望其可耐受)一起配制。認(rèn)為由本發(fā)明的活化性抗體引起的殺傷樹突細(xì)胞增強(qiáng)將使得此時(shí)免疫系統(tǒng)中存在的抗原耐受。這樣的組合物對于治療自身免疫性疾病以及變態(tài)反應(yīng)很有用。可以和本發(fā)明的活化性抗體配制的抗原的實(shí)例包括，mylein堿性蛋白、豕草屬和其他花粉及植物變應(yīng)原，引起寵物變態(tài)反應(yīng)的變應(yīng)原，引起食物過敏的變應(yīng)原(如花生和其他堅(jiān)果變應(yīng)原，奶制品變應(yīng)原，芝麻和其他種子類變應(yīng)原)或昆蟲變應(yīng)原。
動物和人用藥量(基于毫克每平方米體表面積)的相互關(guān)系描述于Freireichet al. (1966)Cancer Chemother Rep 50 :219。人體表面積可以近似地由患者的身高和體重確定。參見，例如 Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N. Y. , 1970, 5370 本發(fā)明的化合物的有效量可以在約O. OOlmg/kg至約1000mg/kg的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為O. Olmg/ kg至約100mg/kg,更優(yōu)選地0. lmg/kg至約10mg/kg ;或任意范圍,其中該范圍的下限為在0.001mg/kg至900mg/kg之間的任何量,該范圍的上限為在0. lmg/kg至1000mg/kg之間的任何量(例如0. 005mg/kg至200mg/kg,0. 5mg/kg至20mg/kg)。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員認(rèn)識到的，有效量也將隨治療的疾病、給藥途徑、賦形劑使用以及與其他治療方式共同使用的可能性(如其他試劑的使用)而變化。
對于包含另外的治療劑的藥物組合物，另外的治療劑的有效量為在單一療法方案中只使用該另外試劑時(shí)正常使用的劑量的約20%至100%之間。優(yōu)選地，有效量在正常單一治療劑量的約70%至100%之間。這些另外的治療劑的正常的單一治療劑量在本領(lǐng)域是熟知的。參見，例如，Wellset al. ,eds. ,Pharmacotherapy Handbook, 2. sup. nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000) ；PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000,Deluxe Edition,Tarascon Publishing,Loma Linda,Calif. (2000), 將其每一個(gè)的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。
希望以上列舉的另外的治療劑的一些可以和本發(fā)明中的化合物協(xié)同發(fā)揮作用。當(dāng)這種作用發(fā)生時(shí)，允許該另外的治療劑和/或本發(fā)明中的化合物的有效劑量將比單一療法中要求的減少。這具有如下優(yōu)點(diǎn)另外的治療劑或本發(fā)明化合物的毒副作用最小化，效力協(xié)同提高，使給藥或使用簡單和/或減少化合物制備或制劑的總費(fèi)用。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到上述的治療劑可落入兩個(gè)或多個(gè)上面披露的類別。對于本發(fā)明的目的，認(rèn)為這些治療劑均是各種不同治療劑的成員，并且作為在某一具體類別中的任何治療劑的特征也不能從另一具體類別中排除。
在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的抗體和選自上述任何藥劑或變應(yīng)原的第二治療劑或變應(yīng)原，其中，所述抗體和第二藥劑為獨(dú)立的劑型， 但是彼此關(guān)聯(lián)。如本文所使用術(shù)語“彼此關(guān)聯(lián)”指的是一種單獨(dú)劑型與另一種一起包裝，或者彼此附著，使之很明顯該單獨(dú)劑型是作為相同方案的部分進(jìn)行銷售和給藥的。藥物和抗體優(yōu)選一起包裝在透明包裝物或其他多腔包裝物中，或者作為連接的，但使用者可以分開 (例如，通過撕開兩個(gè)容器之間的劃線)的單獨(dú)密封容器(如箔囊或其類似物)中。
在又一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，包括(在單個(gè)容器中)a)本發(fā)明的抗體；以及b)第二治療劑或變應(yīng)原。再次，上述的任何治療劑或變應(yīng)原都可以存在于該試劑盒中。
抗NKG2A抗體和組合物的應(yīng)用
本發(fā)明的活化性抗體使NK細(xì)胞在接觸靶細(xì)胞時(shí)能溶解在其表面上帶有HLA-E或 Qalb的靶細(xì)胞。因此，根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式
，本發(fā)明提供了一種在包括NK細(xì)胞和所述靶細(xì)胞的種群中重建NK細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞溶解的方法，其中，所述NK細(xì)胞的特征在于在其表面上的NKG2A，并且所述靶細(xì)胞的特征在于在其表面上存在HLA-E或Qalb,所述方法包括使所述NK細(xì)胞與上述活化性單克隆抗體或其片段接觸的步驟。
這種活性對于治療特征在于在其細(xì)胞表面上表達(dá)HLA-E或Qalb的有害細(xì)胞的疾病非常有用。一種這樣的細(xì)胞類型是樹突細(xì)胞，優(yōu)選成熟的樹突細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了一種治療自身免疫性或炎癥疾病或至少部分由樹突細(xì)胞過剩和活動亢進(jìn)引起的其他任何疾病的方法。治療這樣的疾病的方法包括對患者給予包含活化性抗體的本發(fā)明的非細(xì)胞毒性組合物的步驟的。
使用本方法可以治療的示例性自身免疫性疾病(除其他之外)包括溶血性貧血、 惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、韋格納肉芽腫、自身免疫性肝炎、白塞氏病、 克隆氏病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬皮病、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合癥、I型糖尿病、眼葡萄膜炎、葛瑞夫茲氏病、阿爾茨海默病、心肌炎、風(fēng)濕熱、硬皮病、強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、重癥肌無力、多肌炎、格林巴利綜合癥、多發(fā)性硬化、斑禿、 天皰瘡/類天皰瘡、大皰性類天皰瘡、橋本氏甲狀腺炎、牛皮癬和白癜風(fēng)。
可以通過這些方法治療的炎癥性疾病的實(shí)例包括，但不限于，腎上腺炎、牙槽炎、 膽囊膽管炎、闌尾炎、龜頭炎、瞼炎、支氣管炎、粘液囊炎、心炎、蜂窩組織炎、宮頸炎、膽囊炎、聲帶炎、耳蝸炎、結(jié)腸炎、結(jié)膜炎、膀胱炎、皮炎、憩室炎、腦炎、心內(nèi)膜炎、食管炎、咽鼓管炎、纖維組織炎、毛囊炎、胃炎、胃腸炎、銀炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、內(nèi)耳炎、喉頭炎、淋巴管炎、乳腺炎、耳炎、腦脊膜炎、子宮炎、粘膜炎、心肌炎、肌炎、鼓膜炎、腎炎、神經(jīng)炎、睪丸炎、骨軟骨炎、耳炎、心包炎、腱鞘、腹膜炎、咽炎、靜脈炎、脊髓灰質(zhì)炎、前列腺炎、牙髓炎、視網(wǎng)膜炎、鼻炎、輸卵管炎、鞏膜炎、seleiOchoroiditis、陰囊炎、鼻竇炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口腔炎、滑膜炎、咽鼓管炎、腱炎、扁桃體炎、尿道炎和陰道炎。
也已表明，樹突細(xì)胞同種異體反應(yīng)性NK細(xì)胞殺傷提高了骨髓移植中造血細(xì)胞移植物的移入(L. Ruggeri et al.，Science，2002，295 :2097-2100)。因此，在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種提高患者造血細(xì)胞移植物移入的方法，該方法包括給予患者包含活化性抗體的本發(fā)明的組合物的步驟。移植過程得到明顯改善，表現(xiàn)為移植物抗宿主疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重度的降低、移植物的存活延長、或通過移植所治療的疾障礙狀的減輕或消除(如造血癌)。這個(gè)方法優(yōu)選地用于非白血性白血病的治療。
已經(jīng)證實(shí)癌細(xì)胞由于在其細(xì)胞表面上存在HLA-E，可以逃避殺傷。HLA-E已經(jīng)在手術(shù)摘除的惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測到(J. Wischhusen et al. , JNeuropathol Exp Neurol. 2005 ；64 (6) 523~8);也在白血病衍生的細(xì)胞系、黑素瘤、黑素瘤衍生的細(xì)胞系和頸部腫瘤中檢測到(R Marin et al.， Immunogenetics. 2003 ;54(11) :767-75)。因此，在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種治療患癌癥患者的方法，其中，所述癌癥以細(xì)胞表達(dá)HLA-E為特征，所述方法包括給予所述患者包括活化性抗體的本發(fā)明的組合物的步驟。
根據(jù)這種方法可以治療的癌癥的實(shí)例包括，但不限于癌，包括膀胱的、乳房的、結(jié)腸的、腎臟的、肝臟的、肺臟的、卵巢的、前列腺的、胰腺的、胃的、宮頸的、甲狀腺的和皮膚的癌，包括鱗狀上皮細(xì)胞癌；淋巴性造血系瘤，如非白血性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、霍杰金淋巴瘤、非霍杰金淋巴瘤、毛細(xì)胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；髓樣造血系瘤，包括急慢性髓細(xì)胞性白血病和前髓細(xì)胞性白血?。婚g充質(zhì)細(xì)胞起源腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸胎癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤；中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、 成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)鞘瘤；間充質(zhì)細(xì)胞起源的腫瘤,包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他腫瘤，包括黑素瘤、著色性干皮病、角化棘皮瘤、精原細(xì)胞瘤、甲狀濾泡癌和畸胎瘤。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選可以治療的癌癥包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性膠質(zhì)瘤、非白血性白血病、 黑素瘤和頸部腫瘤。
病毒感染細(xì)胞也使用HLA-E表達(dá)作為避免NK細(xì)胞殺傷的機(jī)制。HLA-E的表達(dá)和丙型肝炎病毒感染細(xì)胞相關(guān)(J. Mattermann et al, American Journal of Pathology. 2005 ；166 :443-453);以及細(xì)胞巨化病毒感染細(xì)胞有關(guān)(C. Cerboni et al. ,Eur J Immunol. 2001 ;31 (10) :2926-35)。因此，在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種治療患病毒感染患者的方法，其中，所述病毒感染的特征在于感染細(xì)胞表達(dá)HLA-E，所述方法包括給予所述患者包括活化性抗體的本發(fā)明的組合物的步驟。
通過這種方法可以治療的病毒感染的實(shí)例包括，但不限于以下病毒引起的感染 家族逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如人類免疫缺陷病毒如HIV-I (也稱為HTLV-III、LAV或HTLV-III/ LAV、或HIV-III ;和其他分離物、如HIV-LP));小核糖核酸病毒科(如脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、EV病毒、柯薩奇病毒、鼻病毒屬、埃可病毒群);Calciviridae (如引起胃腸炎的菌株)；披蓋病毒科(如馬腦炎病毒、風(fēng)疹病毒)；黃病毒科(如登革熱病毒、腦炎、黃熱病毒)；冠狀病毒科(如冠形病毒)；彈狀病毒科(如水泡性口炎病毒、狂犬病毒)；纖絲病毒科(如ebola病毒)；副粘病毒科(如副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(如流感病毒)或禽流感病毒(H5N1或相關(guān)病毒)；Bungaviridae (如漢坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒屬和Nairo病毒);沙粒病毒科(出血熱病毒);呼腸孤病毒科(如呼腸病毒、orbiviurses和輪狀病毒)；雙RNA病毒；肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；微小病毒科(細(xì)小病毒)；乳頭多瘤空泡病毒科(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科 (多數(shù)腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV) I和2、水痘-帶狀皰疹病毒、細(xì)胞巨化病毒(CMV));痘病毒科(類天花病毒、常見正痘病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(如非洲豬霍亂病毒)；以及未分類的病毒(如海綿狀腦病病原，丁型病毒性肝炎(被認(rèn)為是乙型肝炎病毒的不完全伴隨體)，非甲、非乙型肝炎動因(I類=中心傳送型；2類=經(jīng)注射途徑傳送型 (如丙型肝炎);Norwalk及相關(guān)病毒，和星狀病毒)。
最優(yōu)選地，被治療的病毒感染選自丙型肝炎病毒感染或巨細(xì)胞病毒感染。
本發(fā)明的活化性抗體還可以用于誘導(dǎo)對抗原的耐受性。因此，根據(jù)另一具體實(shí)施方式
，本發(fā)明提供了一種在患者體內(nèi)誘導(dǎo)對抗原的耐受性的方法，該方法包括給予所述患者包括活化性抗體的本發(fā)明的組合物；以及給予所述患者抗原(對其期望是耐受的)的步驟。該方法優(yōu)選用于治療變態(tài)反應(yīng)癥，其中，該抗原是一種變應(yīng)原。抗原的選擇可以由上面列出的包括本發(fā)明的活化性抗體和抗原的聯(lián)合組合物制成的那些抗原。
包括本發(fā)明的抑制性抗體或細(xì)胞毒素-抗體結(jié)合物的組合物對于殺傷NK細(xì)胞、降低NK細(xì)胞的活性、抑制NK細(xì)胞的增殖、阻止對NK細(xì)胞溶解作用敏感的細(xì)胞的溶解、或減少種群中NK細(xì)胞的數(shù)量非常有用。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式
，本發(fā)明提供了一種降低NK細(xì)胞活性、減少NK細(xì)胞增生、阻止對NK細(xì)胞溶解作用敏感的細(xì)胞的溶解或減少NK細(xì)胞數(shù)量的方法，該方法包括使NK細(xì)胞與本發(fā)明中的抑制性抗體或細(xì)胞毒素-抗體結(jié)合物組成的組合物接觸的步驟。這些方法尤其對于以NK細(xì)胞活性過高和/或增殖旺盛為特征的疾病有效。
例如，共有的PCT公開WO 2005/105849總體描述了抗多種NK細(xì)胞受體的抗體用于治療NK型LDGL的應(yīng)用。PCT公開W02005/115517披露了 NK細(xì)胞活性過高與胰島自身免疫性出現(xiàn)、進(jìn)展、階段和/或侵襲性有關(guān)，因此在I型糖尿病中發(fā)揮作用。因此，根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式
，本發(fā)明提供了一種治療患有以NK細(xì)胞活性過高或NK細(xì)胞過度增殖為特征的疾病的患者的方法，該方法包括給予所述患者包括抑制性抗體或細(xì)胞毒素抗體結(jié)合物的根據(jù)本發(fā)明的組合物的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，疾病選自NK型LDGL或I型糖尿病。
上述任何一種治療方法都可以包括給予患者適用于被治療癥狀的第二治療劑的另外的步驟。可以給予患者的第二治療劑類型的實(shí)例包括細(xì)胞因子，細(xì)胞因子抑制劑，造血生長因子，胰島素，抗炎藥，免疫抑制劑，抗癌化合物(如化學(xué)治療化合物，抗血管形成化合物，促凋亡化合物，激素劑，干擾DNA復(fù)制、有絲分裂和/或染色體分離的化合物，或阻斷多聚核苷酸前體的合成與準(zhǔn)確度的藥劑)，輔助化合物(如疼痛減輕劑或止吐藥)，激動活化性NK細(xì)胞受體的化合物(如NKp30、NKp44、NKp46)，抑制性NK細(xì)胞受體的拮抗劑(如KIR 受體抑制劑)，TGF-β I的拮抗劑，刺激抑制性NK細(xì)胞受體的化合物(如天然配體，抗體或能夠刺激CD94/NKG2A受體或抑制性KIR受體如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1和 KIR3DL2的活性的小分子)，或活化性NK細(xì)胞受體的抑制劑(如NKp30、NKp44或NKp46)。
上述種類的化合物的具體實(shí)例列在關(guān)于藥物組合和任何這樣的具體化合物的部分中提出，以及這類治療劑的任何其他成員可以在本發(fā)明的方法中給予患者。選擇使用的治療劑可由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地決定并且取決于治療或預(yù)防的癥狀本身的性質(zhì)、癥狀的嚴(yán)重性、被治療患者的全身總體健康狀況和治療醫(yī)生的判斷。
第二治療劑可以和本發(fā)明的抗-NKG2A組合物同時(shí)、或先于、或之后給藥。當(dāng)同時(shí)給予時(shí)，第二治療劑可以作為單獨(dú)配制的組合(即，作為多劑型)或作為包含該抗體的組合物的一部分進(jìn)行給藥。
在一些具體實(shí)施方式
中，在給予本發(fā)明的NKG2A抗體組合物之前，評價(jià)NK細(xì)胞上的NKG2A或其他可能蛋白的表達(dá)，和/或檢測樹突細(xì)胞(優(yōu)選成熟的樹突細(xì)胞)的活性或數(shù)量、和/或其他細(xì)胞上NKG2A配體(如HLA-E或Qalb)的存在。這可以通過從患者獲得的 NK細(xì)胞或樹突細(xì)胞的樣本并對于NK細(xì)胞應(yīng)用免疫測定法進(jìn)行試驗(yàn)以確定細(xì)胞上標(biāo)記物相對主體如KIR受體、其他NKG2受體、或NCR(如NKp30、NKp44、NKp46)來實(shí)現(xiàn)。也可應(yīng)用其他方法來檢測這些蛋白的表達(dá)，如基于RNA的方法，例如，RT-PCR或RNA印跡法。在患者體內(nèi)檢測到表達(dá)NKG2A的NK細(xì)胞表明該方法很適用于治療該患者。
所述治療可以涉及多輪的抗體。例如，在首輪給藥后，可再次檢測表達(dá)NKG2A的NK 細(xì)胞的水平和/或活性，和/或樹突細(xì)胞或在細(xì)胞表面上表達(dá)NKG2A或HLA-E，或Qalb的其他細(xì)胞，而且果合適，可實(shí)施另外一輪的給藥。這樣，可實(shí)施多輪的受體/細(xì)胞/配體檢測和抗體組合物給予，例如，直到疾病得到控制。
還應(yīng)當(dāng)理解，使用本方法可以生產(chǎn)和/或使用多于一種抗體。例如，可以使用針對 NKG2A不同表位、針對NKG2A、CD94或HLA-E的不同組合、針對可能存在于任何個(gè)體的這三種蛋白的任何不同同種型的抗體的組合，當(dāng)適于獲得NKG2A刺激抑制或NK細(xì)胞活性抑制的理想水平，這可以是總體上或在任何個(gè)體病人(例如，在分析病人的表達(dá)NKG2A的細(xì)胞以確定適當(dāng)?shù)闹委煼桨钢?。
只要已知特定治療方法對于患者障礙本身的情況無害，而且不會顯著抵消NKG2A 抗體的療效，其與本發(fā)明的聯(lián)合就值得考慮。
本發(fā)明也可能和經(jīng)典的方法如外科手術(shù)等聯(lián)合應(yīng)用。當(dāng)一種或多種第二治療劑或方法與本發(fā)明療法聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，不要求組合的效果是每個(gè)療法單獨(dú)進(jìn)行時(shí)觀察的效果的加合。雖然通常期望至少的累加效應(yīng)，但只要本發(fā)明的抗體組合物對抑制或活化NK細(xì)胞保持有效，則本發(fā)明的方法可以另外包括使用第二治療劑或其他方法。而且，對聯(lián)合治療顯示協(xié)同效應(yīng)沒有特殊要求，雖然這確實(shí)是可能且有益的?；贜KG2A抗體的治療可以先于或在其他治療之后，例如，間隔可在幾分鐘到數(shù)周和數(shù)月的范圍內(nèi)。也可以考慮利用本發(fā)明的抗 NKG2A組合物的多于一次的給藥。第二治療劑或其他方法可能和本發(fā)明的NKG2A抗體組合物在交替數(shù)日或數(shù)周互換給予；或先用抗-NKG2A治療一個(gè)循環(huán)，再用其他治療或方法治療一輪。無論何種情形，對于包括給予病人第二治療劑的附加步驟的方法，所有要求就是以發(fā)揮治療的有益效果的聯(lián)合有效量遞送第二治療劑和本發(fā)明的抗體，而不考慮給藥的次數(shù)。
可以理解，本發(fā)明的給予病人抗體和組合物的方法也可以用于治療動物，或者在動物模型中檢測任何本文描述的方法或組合物對于人類疾病的效力。因此，本文使用的術(shù)語“患者”指的是任何溫血動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選靈長類動物，最優(yōu)選人類。
本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的實(shí)驗(yàn)部分披露，其應(yīng)被認(rèn)為是說明性的并且不限制本申請的范圍。
實(shí)施例
實(shí)施例I :由⑶94/NKG2A+KIR-NK細(xì)胞的一個(gè)亞群介導(dǎo)的自體iDC的殺傷
在外源性IL-2存在下培養(yǎng)的多克隆NK細(xì)胞開始就表現(xiàn)出很強(qiáng)對iDC的溶解活性。因此，在本研究中，從供者體內(nèi)AM、AC、DB分離出的多克隆NK細(xì)胞種群有效地殺傷自體或者同種異體的iDC。然而，在適當(dāng)?shù)目?HLA I類mAb存在的情況下，針對自體iDC的溶解活性增強(qiáng)。
這些數(shù)據(jù)可能是由于發(fā)生在DC上的自身I類HLA和NK細(xì)胞上的抑制性受體之間存在的抑制性相互作用中斷的結(jié)果。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們得出這樣的假設(shè)在整個(gè) NK細(xì)胞池中，只有一部分表現(xiàn)出自發(fā)的針對iDC的細(xì)胞毒性，而由于它們的受體和I類HLA 分子及之間有效抑制性作用，其他NK細(xì)胞沒有這種細(xì)胞毒性。為了分析這種可能性，對從供者AM、AC、DB中分離的NK細(xì)胞克隆體評估其對自體(及同種異體)iDC的溶解活性。同我們的假設(shè)一致，只有一部分NK細(xì)胞克隆體溶解了自體iDC。其他克隆體只顯示很小或者沒有細(xì)胞毒性。此外，當(dāng)把自體iDC換成同種異體iDC時(shí)，溶解的克隆體的百分比稍有增加 (見下文)。
為了證實(shí)某些NK細(xì)胞不具有溶解iDC的能力是否反映了其抑制性NKR與I類HLA 分子的相互作用，分析了這些克隆體在抗-HLA I類mAb不存在或存在條件下(即在阻斷這種抑制性相互作用的條件下)溶解自體iDC的能力。在這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，NK細(xì)胞克隆體被分為三種不同的功能種類，并進(jìn)一步分析了其中HLA
I類特異性受體的表達(dá)，包括殺傷Ig-類受體(KIR) 2DL、KIR3DL1和CD94/ NKG2A(即人類主要的MHC I類特異性抑制性受體)。
第一組(A組)的NK細(xì)胞的特征在于對iDC的高度自發(fā)溶解活性。在抗HLA I類 HiAb存在的情況下，它們的溶解活性的強(qiáng)度不能或者僅僅最低限度地增強(qiáng)。這些克隆體根據(jù)抑制性受體的表達(dá)(因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)⑶94/NKG2A，但缺少KIR2DL和KIR3DL1 (其與自體HLA I類等位基因反應(yīng)))是相當(dāng)一致性的。第二組(B組)NK細(xì)胞克隆體也是以能夠自發(fā)性殺傷iDC為特征。然而，與A類克隆體不同的是，它們的細(xì)胞毒性在抗HLA I類mAb存在的情況下有所增加。這意味著，產(chǎn)生的抑制性相互作用抑制而沒有消除NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用。這組細(xì)胞同樣由⑶94/NKG2A+克隆體和缺少與自體HLA I類等位基因反應(yīng)的KIR組成。值得注意的是，B組NK克隆體的溶胞活性在抗-⑶94mAb存在的情況下也會增加，因而表明細(xì)胞毒性的(部分)抑制的確是由CD94/NKG2A介導(dǎo)的。
屬于第三組(C組)的NK克隆體不顯示針對自體iDC的細(xì)胞毒性。然而，在抗HLA I類mAb存在的情況下，iDC被有效溶解，表明有效的抑制性相互作用的發(fā)生。這些NK克隆體對于抑制性受體的表達(dá)是更多異源性的。值得注意的是，事實(shí)上所有表達(dá)對于自體HLA I 類等位基因特異性的KIR2DL或KIR3DL1的NK克隆體都被包括在這個(gè)組中此外，這些克隆體的一部分的特征在于表達(dá)單個(gè)KIR，而其他以不同特異性表達(dá)多個(gè)KIR。針對iDC的溶胞活性的重建可不僅利用抗-HLA I類mAb而且利用抗-KIR mAb獲得(參見下文)。
最后，小部分的C組NK細(xì)胞克隆是KIR-⑶94/NKG2A+。它們的細(xì)胞毒性可以通過 mAb-介導(dǎo)的CD94的封閉或者通過抗-HLAI類mAb進(jìn)行重建。這些數(shù)據(jù)表明(a)不是所有的NK細(xì)胞都能夠殺傷自體iDC (雖然所有的NK細(xì)胞在抗-HLA I類mAb存在的情況下都能溶解iDC) ； (b)顯示對iDC的自發(fā)細(xì)胞溶解活性的克隆體限于特征在于⑶94/NKG2A+KIR表型的NK亞組(A組和B組)；(c)表達(dá)KIR2DL或KIR3DL1的克隆體，其對于自體HLAI型等位基因是特異性的，不殺傷自體iDC (C組)。
一些NK克隆體表達(dá)自反應(yīng)性KIR和⑶94/NKG2A。在所有情況下，它們被限于C組并且它們的細(xì)胞溶解活性可以通過抗-HLA
I類和抗-KIRmAb進(jìn)行重建，而抗-⑶94mAb只有很小或沒有作用。最后，需要提到的是，發(fā)現(xiàn)KIR+NKG2A-克隆體只在其中iDC來源于同種異體(KIR錯配)個(gè)體的實(shí)驗(yàn)中顯示對iDC的溶胞活性。在這種情況下，KIR+NKG2A-細(xì)胞顯示出同種異體反應(yīng)性，這是由于表達(dá)的KIR不能識別在同種DC上的HLA I類等位基因。代表性NK克隆體AM4 (KIR3DL1+) 不能殺傷自體同源iDC(BW4+BW6-)，而其溶解同種異體iDC，KIR錯配的(BW4-BW6+) iDC。對自體同源iDC的殺傷可以在抗-HLA I類mAb存在下進(jìn)行重建，而對同種異體iDC的殺傷不進(jìn)行顯著修飾。
另一個(gè)顯示KIR區(qū)別自體同源和同種異體(KIR錯配)iDC的能力的實(shí)例是由與 KID2DL1和KID2DL2共表達(dá)的克隆體DB3提供的。這種克隆體可以被定義為“不非同種異體反應(yīng)性的”，因?yàn)樵贙IR表現(xiàn)型的基礎(chǔ)上，應(yīng)該識別所有不同的HLA-C等位基因(包括I組和2組)。事實(shí)上，這種克隆體不殺傷自體同源或同種異體iDC，而對這兩種靶細(xì)胞的溶解可以通過抗-HLA I類mAb有效地進(jìn)行重建。此外，針溶解的重建可通過針對自體同源(CWl/CW3) iDC的抗-KID2DL2mAb和通過對同種異體(CW2/CW4) iDC的抗_KID2DLlmAb進(jìn)行重建。 最后，如所期望的，在NKG2A+KIR-克隆體的情況下，在殺傷自體同源或者同種異體iDC的能力上沒有實(shí)質(zhì)區(qū)別。
實(shí)施例2-iDC對NK介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感性反映了 HLA-E I類分子的下調(diào)
前面的研究證明，iDC和mDC在HLA I類表面表達(dá)上顯示出顯著的差異。因此，通過使用對HLA-A、HLA-B, HLA-C和HLA-E分子的單形鈦決定子特異性的mAb，已證明正在成熟的DC極大地上調(diào)在細(xì)胞表面處的HLA I類的表達(dá)。此外，HLA I類的上調(diào)代表了通過其 mDC變得抗NK細(xì)胞介導(dǎo)的溶解的關(guān)鍵機(jī)制。
為了直接評價(jià)各種HLA I類分子在代表不同DC成熟階段的細(xì)胞上的表達(dá)，我們比較地分析了 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E在單核細(xì)胞(來源于相同個(gè)體的iDC和mDC)上的表達(dá)。與iDC相比，所有的HLA I類分子在mDC中都被高度上調(diào)。顯著地，與單核細(xì)胞(即， iDC的前體)相比，它們在iDC中被顯著下調(diào)。因此，看起來來自單核細(xì)胞的iDC的產(chǎn)生不僅導(dǎo)致新型表面分子(例如，CDla)和功能特性的獲得(或者上調(diào))，而且還導(dǎo)致包括CD14 和HLA-A，HLA-B, HLA-C和HLA-E分子的各種分子的表達(dá)的損失(或者下調(diào))。這意味著 HLA I類下調(diào)的程度被調(diào)整為使iDC變得對由特定亞群的NK細(xì)胞(⑶94/NKG2A+KIR-)介導(dǎo)的溶解更敏感的水平。
根據(jù)這種思路，由于KIR+NK細(xì)胞不能殺傷iDC，可以想象，由iDC表達(dá)的HLA-B或者HLAC分子的量足以產(chǎn)生KIR交聯(lián)和抑制性信號的傳遞。另一方面，HLA-E的下調(diào)足以使一部分的KIR-NKG2A+NK細(xì)胞殺傷iDC。事實(shí)上，可以看到，HLA-E(如通過HLA-E特異性 3D12mAb檢測的)在iDC中幾乎是無法檢測的，而其在mDC上僅被部分再表達(dá)。然而，在所有情況下，與來源于相同個(gè)體的單核細(xì)胞或PBL相比，mDC中的HLA-E表達(dá)較低。出人意料的是，雖然HLA-A，HLA-B和HLA-C分子通過mDC表達(dá)在水平高于通過PHA胚細(xì)胞表達(dá)，但 HLA-E的表面表達(dá)在mDC中一直低于PHA胚細(xì)胞的表達(dá)。在上下文中，前面的研究有力證明，自體同源的PHA胚細(xì)胞對不依賴效應(yīng)子NK細(xì)胞的KIR/NKG2A表型的NK溶解具有高度的抗性。
實(shí)施例3-小部分的NK克降體可以介導(dǎo)殺傷mDC
與前面的報(bào)道一致，多克隆NK細(xì)胞不能有效地殺傷mDC，我們證明大多數(shù)溶解iDC 的NK細(xì)胞克隆體不能殺傷mDC。然而，令人感興趣的是，mDC被一小部分屬于A組的NK克隆體(即，顯示具有不能通過抗-HLA I類mAb增強(qiáng)的自發(fā)性抗iDC細(xì)胞溶解活性的那些) 溶解。與iDC相比，自體同源mDC的溶解更少，并且可以在抗-HLA I類mAb存在下被增強(qiáng)。 這意味著，與iDC相比，mDC中的HLAE的更高表達(dá)導(dǎo)致通過CD94/NKG2A的更有效信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(這也通過抗-⑶94mAb增加它們的溶解的能力)。關(guān)于B組NK克隆(即，能夠殺傷iDC 并且其溶解性可以通過抗HLA I類mAb增強(qiáng))，它們不顯示對mDC的細(xì)胞溶解性；然而，在抗-HLA I類或者抗_CD94mAb存在的情況下，細(xì)胞溶解活性可以表現(xiàn)出來。最后，屬于C組 (大多數(shù)情況為KIR+)的克隆體不能殺傷iDC，也不能殺傷mDC。對mDC的細(xì)胞毒性只有在 HLA I類和KIR之間的相互作用的mAb介導(dǎo)的中斷后才能檢測到。
實(shí)施例4-KIR-NKG2A+NK細(xì)胞在殺傷DC活件中的不均勻件
如上所述，屬于A組和B組的NK細(xì)胞克隆體的特征在于同源性KIR-NKG2A+表面顯型，而C組包括KIR+NKG2A-或者KIR-NKG2A+兩種克隆體，(或者，較少見地，KIR+NKG2A+克隆體)。假定通過KIR的負(fù)性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)比通過NKG2A的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)更有效(或者由于它們的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力上的本質(zhì)差別或者由于DC上的特異性HLA I類配體的不同可利用度)， 應(yīng)當(dāng)清楚為何KIR-NKG2A+細(xì)胞在全部三組NK克隆體中都是可檢測的。由于給定NK細(xì)胞克隆體的細(xì)胞溶解活性是抑制性(KIR，NKG2A)和引發(fā)性(NCR，NKG2D)受體之間的平衡的結(jié)果，我們分析了這些分子在不同組的NK細(xì)胞中的表達(dá)水平。尤其是，我們將注意力集中在NKG2A和NKp30的表達(dá)(即，觸發(fā)在誘導(dǎo)NK細(xì)胞介導(dǎo)的iDC和mDC溶解中起重要作用的 NCR)。
首先，對屬于A、B、C組的NKG2A+KIR-克隆體的NKG2A表面表達(dá)水平進(jìn)行了評估。 與A和B組相比，屬于C組的NK克隆體表達(dá)非常高水平的NKG2A。而且，與B組克隆體相比， A組克隆體的特征在于NKG2A表達(dá)更低。這些數(shù)據(jù)表明，在NKG2A表達(dá)水平和殺傷iDC (和 mDC)能力之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。iDC中表達(dá)的低量HLA-E分子可以被表達(dá)高或低水平的 NKG2A的NK細(xì)胞有差別地探測到，而mDC (表達(dá)更高水平的HLA-E)僅通過特征在于非常低 NKG2A表面密度的NK克隆體對溶解敏感。至于NKp30的表達(dá)，在分析的多數(shù)NKG2A+克隆體中是可比的。與這些數(shù)據(jù)一致，在抗-HLA I類mAb存在的情況下(即，在沒有抑制性相互作用的情況下)，它們殺傷iDC的能力沒有顯示顯著的差別。
討論不一致性甚至存在于細(xì)胞溶解反應(yīng)強(qiáng)度的NKG2A+KIR-細(xì)胞之中。這似乎與 NKG2A的表面密度負(fù)相關(guān)。因此，表達(dá)低水平NKG2A的NK克隆體(A組)溶解iDC和mDC， 而表達(dá)更高水平NKG2A的那些克隆體僅殺傷iDC，或者，在極少數(shù)情況下，(NKG2A亮)既不能殺傷iDC也不能殺傷mDC。
顯著地，我們也證明了，與單核細(xì)胞相比，HLA-E的表面表達(dá)在iDC中急劇減少，而在mDC中部分恢復(fù)。相反，在iDC中減少的HLA-B和HLA-C的細(xì)胞表面水平仍然足以有效地結(jié)合 KIR3DL1 或 KIR3DL2。
一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)是對能夠殺傷自體同源mDC的屬于A組的NK細(xì)胞克隆體的小亞組 (5%-10%)的鑒定。這些NK克隆體不表達(dá)自體反應(yīng)性KIR，并且特征在于低水平的NKG2A。 這就使這些NK細(xì)胞易于探測到HLA-E對靶細(xì)胞的下調(diào)(與表達(dá)高水平NKG2A的NK細(xì)胞相比)。因此，在抗HLA I類mAb存在的情況下，出現(xiàn)的NKG2A低的NK細(xì)胞對iDC的細(xì)胞溶解活性沒有增強(qiáng)。另一方面，在mDC(表達(dá)高水平的HLA-E)中，抗HLA I類mAb的添加則會引起細(xì)胞溶解活性的增強(qiáng)，表明如果提供足夠水平的受體-配體相互作用，則通過A組克隆體表達(dá)的NKG2A分子可以抑制細(xì)胞溶解。可以想象，在mDC中，某些程度的不均勻性可能在 HLA-E表達(dá)中存在，并且可能在NKp30的配體的表達(dá)中存在。假定一部分NK細(xì)胞具有區(qū)分表達(dá)不同量的HLA-E的各細(xì)胞的能力，可能在mDC中，只有一部分可以表達(dá)組賦予對該特定亞組的NK細(xì)胞的抗性的HLA-E表面密度。
實(shí)施例5-抗NKG2A mAb的Z270增加NK細(xì)胞系對未成熟樹突細(xì)胞的溶解能力
Z270是一種抗NKG2A的小鼠IgGl單克隆抗體。Z270的氨基酸序列在SEQ ID NO 中列出。由于Z270是一種鼠抗體，所以它不與人類Fe受體結(jié)合，因此在人類細(xì)胞系統(tǒng)或者缺乏帶有鼠Fe受體的任何系統(tǒng)用作本發(fā)明的活化性抗體。相反，在包括帶有鼠Fe受體的系統(tǒng)中，Z270是本發(fā)明的抑制性抗體，這是由于其IgGl恒定區(qū)結(jié)合于這樣的Fe受體。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生表達(dá)NKG2A的人類NK細(xì)胞克隆體和未成熟樹突細(xì)胞(類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞或髓樣樹突細(xì)胞)。檢測所得人類NK細(xì)胞克隆體BH3，BH18, BH34對自體未成熟樹突細(xì)胞的溶解活性。在對CD94的單克隆抗體(IgM)及對NKG2A的單克隆抗體(Z270， IgGl)存在或者不存在的情況下，平行地測試每種細(xì)胞對未成熟樹突細(xì)胞的溶解活性。為了比較，同時(shí)在抗HLA I類抗體和對照IgGl (抗-2B4抗體)存在的情況下，測定細(xì)胞溶解活性。
如下表I所示，在沒有抗體或?qū)φ湛贵w抗_2B4mAb存在的情況下，NK克隆體表現(xiàn)出較少的iDC溶解。然而，在抗-CD94、抗-NKG2AmAb Z270或抗-HLA I類mAb存在的情況下，可能重建自體同源性iDC的殺傷。這個(gè)結(jié)果證明，干擾NKG2A功能重建了 iDC的NK細(xì)胞溶解。它還證明單克隆抗體Z270的NKG2A結(jié)合區(qū)能夠阻斷NKG2A的抑制功能。
表I :自體同源iDC的溶解
NK克隆體BH3BH18BH34對照溶解257382318抗 CD94134124552376抗-NKG2A(Z270)98419772108抗-HLA I類139726032498抗-2B4(對照 IgGl)236353292
實(shí)施例6-利用抗-NKG2A抗體重建自體同源靶細(xì)胞溶解
檢測了人類NK主體細(xì)胞對在沒有抗體或者mAb Z199或mAbZ270存在的情況下表達(dá)HLA-E的自體同源PHA胚細(xì)胞靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。通過標(biāo)準(zhǔn)4小時(shí)51Cr釋放測定來評價(jià)細(xì)胞溶解活性。在微滴定板中以每孔3000個(gè)細(xì)胞使用所有靶細(xì)胞。變化NK細(xì)胞的數(shù)量以產(chǎn)生在O. 01-100之間的效應(yīng)子/靶比率(如圖I中所示)。
在沒有抗體的情況下，NK細(xì)胞幾乎沒有針對表達(dá)HLA-E的靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。然而，在抗-NKG2A抗體Z270 (具有mlgGl恒定區(qū))或者Z199 (具有mIgG2b恒定區(qū)) 存在情況下，NK克隆體變得不能識別它們的HLA-E配體，并且顯示較強(qiáng)的對PHA胚細(xì)胞靶的細(xì)胞溶解活性。Z270具有鼠IgGl恒定區(qū)，而Z199具有鼠IgG2b恒定區(qū)。這些抗體都不能與人類Fe受體結(jié)合。
類似地，NK主體細(xì)胞對HLA-E陽性自體同源PHA胚細(xì)胞的殺傷的抑制可以通過利用以下物質(zhì)有效逆轉(zhuǎn)Z270F(ab’)2片段(圖2)、阻斷通過KIR2DL1和KIR2DL2，3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗-KIRmAb DF200或pan2D、或者抗體W6/32。而且，在該檢測條件(E/T比=1，50μ g/ ml mAb)下，PHA胚細(xì)胞不被NK主體細(xì)胞殺傷，但是這種抑制可以通過利用Z270mAB或者 Z270Fab片段得到逆轉(zhuǎn)。
實(shí)施例7-材料和方法
mAb。將以下mAb (在發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的)用于本研究JT3A(IgG2a，抗-⑶3)， AZ20 和 F252(分別為 IgGl 和 IgM，抗-NKp30)，cl27(IgGl，抗-CD16)，c218(IgGl，抗-CD56)， EB6b(IgGl,抗-KIR2DL1 和 KIR2DS I)，GL183(IgGl,抗-KIR2DL2、KIR2DL3 和 KIR2DS2)， FES172(IgG2a,抗-KIR2DS4)， Z27(IgGl，抗-KIR3DL1)， XA185(IgGl，抗-CD94)， Z199， Z270 (IgG2b，抗-NKG2A)，A6-136 (IgM,抗 HLA I 類)，131 (IgGl，抗-HLA-A 等位基因，包括 A3、A11 和 A24)和E59/53 (IgG2a，抗-HLA-A) [Ciccone 等，(1990) PNAS USA 87 :9794-9797 ； Pende 等，(1998) JImmunol. 28 :2384-2394]。單抗 F4/326 (IgG，抗 HLA-C) [Marsh 等，(1990) Tissue Antigens 36 :180-186]，116-5-28 (IgG2a，抗_HLA_Bw4 等位基因)和 126-39 (IgG3， 抗_HLA_Bw6等位基因)是由Dr K. Gelsthorpe (Sheffield, GB)(第十二屆HLA國際研討會)友好提供的，以及 3D12(IgGl，抗-HLA-E) [Lee 等· (1998) J. Immunol. 160 :4951-4960] 是由 Dr. Daniel Geraghty (Fred Hutchinson 腫瘤研究所，Seattle, WA)提供的。
抗-CDla(IgGl-PE)，抗-CD14 (IgG2a)，抗-CD83 (IgG2b)和抗-CD86 (IgG2b_PE) 從 Immunotech (Marseille,法國)購買的。D1.12(IgG2a,抗 HLA_DR)mAb 是由 Dr R. S. Accolla(Pavia,意大利)提供的。HP2.6(IgG2a,抗 _CD4)mAb 是由 Dr P. Sanchez-Madrid(Madrid,西班牙)提供的。
多克隆或者克隆NK細(xì)胞種群的傳代。為了獲得PBL，在FicolI-Hypaque梯度上和可塑性黏附細(xì)胞的衰竭分離了 PBMC。通過用抗-⑶3(JT3A)、抗-⑶4(HP2.6)和抗-HLA-DR(D1. 12)mAb (4 °C，30 分鐘)隨后用包被了 Dynabeads (Dynal, Oslo,挪威) 的羊抗-鼠(4°C，30分鐘)培養(yǎng)PBL，以及免疫磁性測定來分離富集的NK細(xì)胞。將 CD3-CD4-HLA-DR-細(xì)胞在 100U/ml rIL-2 (Proleukin, Chiron Corp. , Emeryville, CA)和I.5ng/ml PHA(Gibco Ltd,Paisley,GB)存在下在輻射飼養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)，以獲得多克隆 NK細(xì)胞種群，或者在進(jìn)行一定稀釋后就獲得如前所述的NK細(xì)胞克隆體。
DC的傳代。將來源于健康供體和塑性粘附細(xì)胞的PBMC在IL_4和 61 ^ ( 印1'0仏(*，倫敦，GB)存在二者最終濃度分別為20ng/ml和50ng/ml)的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，將細(xì)胞通過對應(yīng)于iDC的⑶14-⑶Ia+⑶83-表型進(jìn)行表征。為了形成 CD14-CDla+CD83+CD86+mDC,將 iDC 用最終濃度為 I μ g/ml 的 LPS(Sigma-Aldrich, St. Louis, MI)刺激兩天。
流式細(xì)胞熒光分析和細(xì)胞溶解活性。為了進(jìn)行一種或兩種顏色的細(xì)胞熒光分析 (FACSCalibur,Becton Dickinson 和 Co. ,Mountain View, CA),用適當(dāng)?shù)?mAb 接著用 PE-或 FITC-結(jié)合的同種型特異性羊抗-鼠第二試劑(Southern Biotechnology Associated, Birmingham)對細(xì)胞進(jìn)行染色。利用4_h[51Cr]釋放法來檢測多克隆及單克隆NK細(xì)胞種群針對自體同源性或者異源性DC的溶解能力。所加的各種mAb的濃度為10 μ g/ml用于掩蔽實(shí)驗(yàn)。E T比率在上下文中指出。
實(shí)施例8-Z270重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的嵌合
小鼠雜交瘤細(xì)胞系(Z270)的冰凍細(xì)胞小球解凍后利用RNeasy Midi試劑盒 (Qiagen cat. No. 75142)處理以分離 71 μ g 的總 RNA。利用 Amersham Biosciences 第一鏈合成試劑盒(Amersham Biosciences, Cat. No. 27-9261-01)，將大約 5 微克的 Z270RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以生產(chǎn)Z270cDNA。利用大量不同的IgH引物結(jié)合恒定區(qū)引物，將免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)cDNA通過PCR擴(kuò)增，以便確定哪一個(gè)引物對最適用于PCR。類似地，利用多個(gè)IgK 引物結(jié)合K恒定區(qū)引物將免疫球蛋白K鏈可變區(qū)(VK)進(jìn)行擴(kuò)增。
對于每一個(gè)重鏈和輕鏈可變區(qū)的合適引物進(jìn)行鑒定并分別結(jié)合到 pCR2.1 -TOPO vectors 中，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌TP010細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增和測序 (利用BigDye 終止子V3. OCycle測序反應(yīng)試劑盒(ABI))。重鏈可變區(qū)(Z270VH)的 DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別在SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中列出。輕鏈可變區(qū) (Z270VK)的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別在SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4中列出。
Z270VK的嵌合包括借助于合適的引物和PCR引入Hind III限制性酶切位點(diǎn)、 Z270VK DNA序列的5’末端的Kozak翻譯起始位點(diǎn)和K2A/RFT2 κ引導(dǎo)序列以及3’末端的剪接供體位點(diǎn)和Bam HI限制性酶切位點(diǎn)。所得PCR產(chǎn)物被克隆到編碼人類κ輕鏈的恒定區(qū)的載體中，以便編碼含Z270輕鏈的可變區(qū)的全長嵌合輕鏈。所得chZ270VK的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別在SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6中列出。
Z270VH的嵌合包括借助于合適引物和PCR引入Hind III限制性酶切位點(diǎn)、Z270VH DNA序列的5’末端的Kozak翻譯起始位點(diǎn)和A003引導(dǎo)序列，以及3’末端的包含天然Apa I限制性酶切位點(diǎn)的YC區(qū)。所得PCR產(chǎn)物被克隆入編碼人類IgGl重鏈的恒定區(qū)的載體中，以便編碼包含Z270重鏈的可變區(qū)的全長嵌合性IgGl重鏈。所得chZ270VH的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別在SEQID NO 7和SEQ ID NO 8列出。
所得的包含質(zhì)粒的重鏈和輕鏈同時(shí)被電穿孔入表達(dá)所得Z270的人類IgGl-κ嵌合構(gòu)建體的COS 7細(xì)胞中。
實(shí)施例9-新mAb的牛成
mAb通過使5周齡Balb C小鼠NK克隆體SA260 (⑶94亮)免疫來產(chǎn)生。在不同的細(xì)胞融合后，首先選擇 mAb Z199 和 Z270 JBMoretta et al.，(1994) J. Exp. Med. 180 545 描述的。利用一種或兩種顏色的熒光細(xì)胞熒光分析來對活化的NK細(xì)胞種群對于CD94分子的分布進(jìn)行測試分析，如在Moretta等(1994)中描述的。
陽性單克隆抗體進(jìn)一步對其重建由NK克隆體的細(xì)胞溶解的能力進(jìn)行篩選。通過標(biāo)準(zhǔn)4-h51Cr釋放測定來評估NK克隆體的細(xì)胞溶解活性其中針對用各種HLA I類基因轉(zhuǎn)染或沒有轉(zhuǎn)染的P815小鼠細(xì)胞系或ClR人細(xì)胞系檢測效應(yīng)子NK細(xì)胞。用于這些研究中的其他靶細(xì)胞通過用各種HLA類轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的人HLA-I類-LCL721. 221細(xì)胞系表示，如在 Sivori et al. (1996)Eur. J. Immunol. 26 :2487-2492 中描述的。
實(shí)施例IO-PBL的純化和多克降或同源NK細(xì)胞系的產(chǎn)牛
PBL通過Ficoll Hypaque梯度和排除可塑性粘附細(xì)胞從健康供體獲得。為了獲得富集的NK細(xì)胞，將PBL用抗⑶3、抗⑶4和抗HLA-DR mAb孵育(在4°C，30min)，隨后用羊抗鼠磁性小珠(Dynal)孵育(在4°C, 30min),以及通過本領(lǐng)域已知的方法(Pende等，1999) 進(jìn)行免疫磁性選擇。將⑶3_，⑶4_，DR_細(xì)胞培養(yǎng)在受輻照的飼養(yǎng)層細(xì)胞以及100U/ml白細(xì)胞介素 2 (Proleukin, Chiron Corporation)和 I. 5ng/ml 植物凝集素 A (Gibco BRL)以獲得多克隆NK細(xì)胞種群。NK細(xì)胞通過有限稀釋進(jìn)行克隆并且NK細(xì)胞的克隆體應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)對細(xì)胞表面受體的表達(dá)進(jìn)行表征。
實(shí)例11-對來自猴的全血染色以鑒定結(jié)合抗NKG2a mAb的受體的個(gè)體表汰
材料
猴血恒河猴和食蟹猴的血購自Centre de Primatologie, ULP, Strasbourg。狒狒猴血購自 Centre de Primatologie, CNRS, Station Rousset0 將猴血收集在包含 EDTA 或枸櫞酸鈉的“真空離心”管中。收集后的血在24小時(shí)內(nèi)處理并于室溫保存。
抗體FITC-CD3、FITC-CD4、FITC-CD14、FITC-CD20和 CyCr_CD45 來自 BD Pharmingen, PC7-CD16獲自Beckman Coulter ;所有這些克隆體與猴PBMC發(fā)生交叉反應(yīng)。 PE-GaM(羊 F (ab，)2 片段抗 _ 鼠 IgG (H+L) -PE)和 OptiLyse C 購自 Beckman Coulter。 抗-NKG2a mAb (克隆體 Z270，鼠 IgGl)，以 I μ g/ml 應(yīng)用。
其他試劑PBS(IX)獲自 Gibco Invitrogen ;鼠血清來自 Janvier 的 NMRI 鼠；37% 甲醒來自Sigma。
方法
根據(jù)以下方案進(jìn)行細(xì)胞染色
-100μ I 血+10μ I 的 IOX 純化的 mAb
-室溫?cái)嚢璺跤?0min
-用3ml PBS 清洗(1400RPM，IOmin,室溫)
-加入100 μ I 的 PE-GaM 或 PE-GaH，最后為 I : 200，振蕩
-室溫?cái)嚢璺跤?0min
-用3ml PBS 清洗(1400RPM，IOmin,室溫)
-加入50μI的20%鼠血清，振蕩并孵育IOmin
-加入30 μ I 60 μ I 的 FITC-CD3、(-CD4、-CD14、-CD20)、PC7-CD16、CyCr_CD45 混合物或10 μ I的各自相應(yīng)的同種型對照
-室溫?cái)嚢璺跤?0min
-加入500 μ I OptiLyse' C,振蕩并孵育 IOmin
-加入500μ I PBS，振蕩并孵育IOmin
-用3ml PBS 清洗(1400RPM, IOmin,室溫)
-在300μ I PBS+0. 2%甲醛中重懸細(xì)胞。
按照以下步驟實(shí)施流式細(xì)胞計(jì)數(shù)
-樣本在XL/MCL細(xì)胞計(jì)數(shù)器(BeckmanCoulter)上運(yùn)行。用EXPO 32vl. 2軟件 (Beckman Coulter)實(shí)施采集和分析。
-主要對通過其FSC和SSC特征鑒定的淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析。
-分析T細(xì)胞或NK細(xì)胞小室
T細(xì)胞=⑶3+淋巴細(xì)胞，被定義為在Ly上選通的抗-⑶3染色柱狀圖的陽性細(xì)胞。
NK細(xì)胞=⑶3XD56+淋巴細(xì)胞，對應(yīng)于在⑶3/⑶56點(diǎn)圖中的⑶3_⑶56+通道(象限的左上部分)。
結(jié)果
對NKG2A單克隆抗體Z270與恒河猴、食蟹猴及狒狒的結(jié)合進(jìn)行評估。將食蟹猴主體NK細(xì)胞(第16天，300 μ I)與mAb (I μ g/ml)在4°C孵育30min，清洗并用PE-GaM在4°C 標(biāo)記20min。圖I示出了與食蟹猴NK細(xì)胞的結(jié)合，以及IgGl和抗-⑶16結(jié)合，表明Z270結(jié)合于食蟹猴NK細(xì)胞。將獼猴(恒河猴)NK細(xì)胞(來自全血)用mAb孵育，清洗并用PE-GaM 標(biāo)記。結(jié)果(示于表2)表明克隆體Z270與恒河猴NK細(xì)胞結(jié)合。最后，將狒狒NK細(xì)胞(來自全血)用mAb孵育，清洗并用PE-GaM標(biāo)記。結(jié)果(示于表3)表明克隆Z270與狒狒NK 細(xì)胞結(jié)合。
實(shí)施例12 :染色來自猴的全血以鑒定結(jié)合抗_NKG2a mAb的受體的個(gè)體表汰。
材料
將來源于恒河猴和食蟹猴的猴全血收集在包含EDTA或者枸櫞酸鈉的試管中?？贵wFITC-CD3、FITC-CD4、FITC-CD14、FITC-CD20 和 CyCr_CD45 來源于 BD Pharmingen, PC7-CD 16獲自Beckman Coulter ;所有這些克隆體與PBMC交叉反應(yīng)。PE-GaM(羊F (ab，)2 片段抗-鼠 IgG(H+L)-PE)和 OptiLyse C購買自 Beckman Coulter。其他試劑=PBS(IX) 獲自 Gibco Invitrogen ;37% 甲醒來自 Sigma。
方法
根據(jù)以下方案進(jìn)行細(xì)胞染色
將100 μ I 的全血(EDTA)+11 μ I mAb 溶液，Ζ270 或 Z 199 (10 μ g/ml)或同種型對照在室溫孵育30分鐘。
用PBS清洗，加入100 μ I PE-或FITC GaM(最后為1/200)在常溫放置30分鐘。
·用PBS清洗，力卩入50 μ I的20 %小鼠血清，力卩入60 μ I的含 FITC-抗-CD3、-CD4、-CD14、-CD20 的 CyCr_CD45、PC7-CD16，并在常溫放置 30 分鐘。
·加入500 μ I的optilyseC，并在常溫放置10分鐘
·加入500 μ I的PBS，并在常溫放置10分鐘
·用PBS和O. 2 %甲醛清洗
· ·分析集中在⑶45 *小細(xì)胞(⑶45/SSC)然后在和⑶16+CD3TD4TD14XD2(T細(xì)胞上。
結(jié)果
對NKG2A單克隆抗體Z270和Z299與恒河猴NK細(xì)胞和食蟹猴NK細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)行分析和比較。食蟹猴主體NK細(xì)胞(第16天，300 μ I)用mAb (I μ g/ml)在4°C孵育30min， 清洗并用PE-GaM在4°C標(biāo)記20分鐘。表4示出了 Z199和Z270與食蟹猴NK細(xì)胞的結(jié)合， 以及IgGl和抗-⑶16結(jié)合，表明Z199和Z270結(jié)合于食蟹猴NK細(xì)胞。將獼猴(恒河猴)NK 細(xì)胞(來自于全血)用mAb孵育，清洗并用PE-GaM標(biāo)記，結(jié)果(示于表5)表明克隆體Z199 和Z270都與獼猴NK細(xì)胞結(jié)合。
進(jìn)一步觀察至Ij(Biassoni et al.，(2005) J. Immunol. 174 :5695-5705)，除了 NKG2A 外，Z199還與食蟹猴NKG2C結(jié)合，此外，這種mAb在更改殺傷試驗(yàn)中導(dǎo)致P815靶細(xì)胞的溶解增強(qiáng)。后者的溶解增強(qiáng)與利用人類NK細(xì)胞觀察到的結(jié)果相反，并且與抑制性受體NKG2A 期望的結(jié)果相反。因此，盡管不希望受理論限制，但本發(fā)明的發(fā)明人提出，Z199在食蟹猴中通過活化性受體NKG2C發(fā)揮作用。Z270也結(jié)合食蟹猴細(xì)胞并在更改殺傷試驗(yàn)中導(dǎo)致P815 靶細(xì)胞的溶解增強(qiáng)，表明Z270還識別食蟹猴中的NKG2C。
然而，依據(jù)染色的細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度，這兩種mAb在相同物種(例如，食蟹猴) 上的結(jié)合水平極不相同。這表明，這兩種抗體差異地結(jié)合于NKG2A表位。
表權(quán)利要求
1.一種選自由Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2、Fv片段、雙抗體和單鏈抗體組成的組的單克隆抗體或其片段，其特征在于 a.與NKG2A特異性結(jié)合； b.不與人類FeY受體IIIa特異性結(jié)合； c.當(dāng)結(jié)合到人類NK細(xì)胞上的NKG2A時(shí)，使所述NK細(xì)胞在靶人類細(xì)胞與所述NK細(xì)胞接觸時(shí)溶解在靶細(xì)胞表面上帶有HLA-E或Qalb的所述靶人類細(xì)胞；并且 d.進(jìn)一步的特征在于不與NKG2C或NKG2E特異性結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體或其片段，進(jìn)一步的特征在于防止人類NKG2A與HLA-E結(jié)合。
3.一種組合物，包括權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
4.一種藥物組合物在制備用于治療患者的自身免疫性或炎性障礙的藥物中的應(yīng)用，所述藥物組合物包括單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體或其片段的特征在于 a.與NKG2A特異性結(jié)合； b.不與人類FeY受體IIIa特異性結(jié)合；以及 c.當(dāng)結(jié)合到人類NK細(xì)胞上的NKG2A時(shí)，使所述NK細(xì)胞在靶人類細(xì)胞與所述NK細(xì)胞接觸時(shí)溶解在靶細(xì)胞表面上帶有HLA-E或Qalb的所述靶人類細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中，所述單克隆抗體或其片段的進(jìn)一步特征在于，不與NKG2C或NKG2E特異性結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其中，所述單克隆抗體或其片段的進(jìn)一步特征在于，防止人類NKG2A與HLA-E結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗NKG2A的單克隆抗體。本發(fā)明提供的單克隆抗體或其片段的特征在于與NKG2A特異性結(jié)合；不與人類Fcγ受體IIIa特異性結(jié)合；當(dāng)結(jié)合到人類NK細(xì)胞上的NKG2A時(shí)，使所述NK細(xì)胞在靶人類細(xì)胞與所述NK細(xì)胞接觸時(shí)溶解在靶細(xì)胞表面上帶有HLA-E或Qa1b的所述靶人類細(xì)胞；進(jìn)一步的特征在于不與NKG2C或NKG2E特異性結(jié)合。本發(fā)明還涉及包括單克隆抗體或其片段的藥物組合物在制備用于治療患者的自身免疫性或炎性障礙的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P37/02GK102977213SQ201210214930
公開日2013年3月20日 申請日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月28日
發(fā)明者阿萊斯山德羅·莫雷塔, 埃馬努埃拉·馬爾切納羅, 弗朗索瓦·羅馬涅, 帕斯卡萊·安德烈 申請人:依奈特制藥公司, 熱那亞大學(xué)