專利名稱：4-羥基水楊酰苯胺在制備防治乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及4-輕基水楊酰苯胺在制備以核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotidereductase, RR)為祀標(biāo)的防治乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢性肝炎是威脅全球人類健康的嚴(yán)重傳染性疾病之一。全世界約有20多億人曾感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV),每年由于HBV感染而死亡的人數(shù)達(dá)100萬。HBV感染不僅是引起慢性乙型肝炎、而且是引起原發(fā)性肝癌的重要生物學(xué)因素。中國(guó)、東南亞及非洲是HBV感染的高發(fā)區(qū)，原發(fā)性肝癌的發(fā)生率顯著高于美洲中部和南部等HBV感染的低發(fā)區(qū)。慢性乙型肝炎現(xiàn)有的治療主要有干擾素、核苷類藥物、胸腺素，但這些藥物長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)較嚴(yán)重的毒副作用或產(chǎn)生耐藥，且價(jià)格昂貴。因此，尋找新型、有效的抗HBV藥物是急需解決的問題。
核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotide reductase, RR)是細(xì)胞DNA合成限速酶。其功能是催化核糖核苷酸(NDPs)中核糖上C2位的羥基還原成氫，生成脫氧核糖核苷酸CdNDPs)0在細(xì)胞內(nèi)，dNDPs經(jīng)激酶作用生成三磷酸脫氧核苷(dNTPs)，為DNA合成提供原料。RR酶由2個(gè)相同的大亞基(α 2)和兩個(gè)相同的小亞基(β 2)組成四聚體(α2β 2)。Rl(在人RR又稱為Ml)代表α2部分，R2 (在人RR又稱為M2)代表β 2部分，哺乳動(dòng)物中還有另一 RR小亞基p53R2(在人RR又稱為M2B)。已經(jīng)證明，RR高表達(dá)，或由此造成的細(xì)胞內(nèi)dNTPs庫(kù)混亂，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而且，RR酶的高表達(dá)增加腫瘤治療中的化療抵抗。目前祀向針對(duì)RR酶治療相關(guān)腫瘤已逐漸成為熱點(diǎn)與重點(diǎn)。HBV基因組為雙鏈、部分環(huán)狀的DNA，由長(zhǎng)鏈和短鏈組成。HBV侵入機(jī)體后，在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，在其復(fù)制過程中病毒前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成為DNA并復(fù)制子代病毒DNA。HBV DNA合成需要以dNTPs為底物。HBV通常在靜止肝臟細(xì)胞中復(fù)制較快，但靜止肝臟細(xì)胞中的dNTPs含量較低，正常情況下無法滿足HBV的復(fù)制。最近研究表明，HBV之所以能夠在靜止肝臟細(xì)胞中復(fù)制，是因其HBx蛋白能夠阻斷R2抑制性調(diào)節(jié)因子Xl (Rfxl)的作用，在靜止肝細(xì)胞中選擇性激活R2基因表達(dá)，從而激活RR酶活性而使細(xì)胞能夠生成大量dNTPs，供HBV在靜止肝細(xì)胞中的自身復(fù)制需要，引起肝炎。4-輕基水楊酰苯胺,其結(jié)構(gòu)式為
Zh r=\_
HN.........................................................\\CM該化合物的分子式為C13H11NO3,白色粉末狀，分子量為229. 24，CAS編號(hào)為526-18-1。該化合物的通用名為柳胺酚片，目前用于肝膽病用藥，作用機(jī)制與去氫膽酸相似，能增加肝血流量，改善肝功能，可使膽汁中水分顯著增加。利膽作用較去氫膽酸強(qiáng)，能使Oddi括約肌松弛。此外尚有降低血膽固醇作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供4-羥基水楊酰苯胺的新用途，即4-羥基水楊酰苯胺在制備以核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotide reductase,RR)為祀標(biāo)的防治乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是4-輕基水楊酰苯胺在制備以核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotide reductase,RR) 為靶標(biāo)的防治乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。 本申請(qǐng)人經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該化合物能有效抑制RR酶的活性，并且其能作為RR酶抑制劑，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，可發(fā)展為肝炎和腫瘤的預(yù)防及治療藥物。具體的，所述4-羥基水楊酰苯胺用于制備抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的藥物。本發(fā)明化合物對(duì)RR酶的半數(shù)有效抑制濃度(IC5tl)的測(cè)定結(jié)果見圖1，對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞的IC10、IC25及IC50的測(cè)定見表2，對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞上清液中HBsAg的影響的測(cè)定見表3，對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞中HBV-DNA的影響見表4。該化合物可添加藥物可接受的載體，制成常規(guī)的劑型如片劑、顆粒劑、針劑等。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(I)本發(fā)明對(duì)已知藥物4-羥基水楊酰苯胺發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了多個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。(2)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)4-羥基水楊酰苯胺是RR酶的抑制劑。(3)與RR祀向抑制藥物輕基脲(Hydroxyurea, HU)比較,4-輕基水楊酰苯胺的RR酶抑制活性高10倍以上。(4) 4-羥基水楊酰苯胺的ICltl劑量對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞表達(dá)HBsAg、以及HBV DNA復(fù)制具有明顯抑制作用。4-羥基水楊酰苯胺抑制HBsAg表達(dá)作用明顯較高于HU和拉米夫定(Lamivudine，3-TC);抑制HBV-DNA拷貝數(shù)明顯高于HU、略低于3-TC。證明本發(fā)明的療效
顯著，藥理作用強(qiáng)。(5) HBV常發(fā)生變異而產(chǎn)生耐藥性，已有3-TC耐藥的報(bào)道。4_羥基水楊酰苯胺抑制HBV的機(jī)制與3-TC不同，可供臨床治療選擇使用。(6) 4-羥基水楊酰苯胺對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較高的殺傷活性。(7)4-羥基水楊酰苯胺具有抑制HBV復(fù)制和肝癌細(xì)胞增殖的雙重作用，因此與HU和3-TC比較，對(duì)肝癌的治療和預(yù)防具有重要應(yīng)用價(jià)值。(8)4-羥基水楊酰苯胺是保肝老藥，安全性高，預(yù)示著其在肝炎和癌癥領(lǐng)域有很好的藥用前景。


圖I為RR酶活性抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。縱坐標(biāo)為RR酶相對(duì)活性，是指每種化合物處理組相對(duì)于溶劑對(duì)照組RR酶活性(100%)作圖(η=3，χ±§);羥基脲(HU)；圖2為4-羥基水楊酰苯胺、羥基脲(HU)及拉米夫定(3-TC)對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞的抑制曲線；圖3為HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :藥物的重組RR酶抑制活性I、實(shí)驗(yàn)材料(I)主要試劑輕基脲(Hydroxyurea, HU, Sigma), 4-輕基水楊酰苯胺(上海泰坦化學(xué)有限公司)。
(2 )主要儀器高效液相儀(日本島津LC-10ATVP )，液體閃爍計(jì)數(shù)儀(BackmanLS6500)。2、實(shí)驗(yàn)方法( I)重組RR酶活性測(cè)定樣品制備I)準(zhǔn)備反應(yīng)樣品大腸桿菌體外表達(dá)純化的重組人RR酶大亞基Ml(序列參見SEQID NO. I)和小亞基M2蛋白(序列參見SEQ ID NO. 2)(蛋白用量為RR酶活性達(dá)到65 95%)，加雙蒸水調(diào)節(jié)體積為80 μ 1，加入不同濃度的測(cè)試化合物10 μ I ;混勻，室溫孵育3(T60min ；2)每管加入反應(yīng)緩沖液至體積100 μ I (終濃度50mM HEPES, pH 7. 2,6mM DTT,4mM magnesium acetate, 2mM ΑΤΡ,Ο. 05mM CDP, IOOmM KC1，0. 125 μ M[3H]CDP) ;37°C孵育20 30min ;沸水滅活I(lǐng)Omin ；3)加入 5 μ I 20mg/mL Η)Ε,37· 孵育 30min 60min ;沸水滅活 IOmin ;16000rpm 離心15min,取上清。(2) HPLC 測(cè)定I)色譜條件流動(dòng)相磷酸二氫銨，PH3-5 ;流速lmL/min。色譜柱C18柱。2)樣品測(cè)定將上述上清進(jìn)樣20yL ;收集HPLC分離樣品50 μ L/管，每管加入4mL閃爍液。置于閃爍計(jì)數(shù)儀中測(cè)定樣品的DPM和CPM。(3)計(jì)算RR酶活性(％)=實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)物C^DP的CPM/空白對(duì)照組的CPMX 100%。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果以RR酶代表性抑制藥物羥基脲(Hydroxyurea，HU)為陽性對(duì)照藥物，將體外表達(dá)純化的RR大、小亞基蛋白重組成RR全酶，測(cè)定藥物的RR靶向抑制作用，結(jié)果見圖I。結(jié)果表明，HU對(duì)重組RR酶活性的抑制作用呈劑量依賴性，與藥物濃度呈正相關(guān)，計(jì)算其IC5tl為96. 55 μ M (RR酶活性50%抑制時(shí)的藥物濃度)。4-羥基水楊酰苯胺對(duì)重組RR酶活性抑制作用明顯高于HU，并呈劑量依賴性，計(jì)算其IC5tl為8. 23 μ Μ,抑制活性約為HU10倍。實(shí)施例2 :藥物實(shí)驗(yàn)劑量的確定I.實(shí)驗(yàn)材料(I)細(xì)胞株!fepG2. 2. 15細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV基因，可以穩(wěn)定進(jìn)行HBV基因組復(fù)制和表達(dá))(浙江大學(xué)傳染病研究所惠贈(zèng))。(2)主要試劑DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，羥基脲(Hydroxyurea, HU, Sigma), 4-輕基水楊酰苯胺(上海泰坦化學(xué)有限公司)，拉米夫定(Lamivudine, 3-TC,日本東京仁成工業(yè)株式會(huì)社)；Cell Counting Kit_8試劑盒(CCK8,日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)。(3)主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-TEK, Elx800)。2.實(shí)驗(yàn)方法(I)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，pH 7. 2)，添加400yg/ml的G418，2mmol/L谷氨酰胺，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37°C、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到70°/Γ80%時(shí)，用含有EDTA的胰酶消化傳代。(2) CCK8試劑盒測(cè)定各藥物對(duì)IfepG2· 2. 15細(xì)胞殺傷力 將4-羥基水楊酰苯胺用去除G418的DMEM培養(yǎng)基配制成125，175，250，350，500，700 μ M共6個(gè)濃度梯度，3-TC也同樣配制成625，1250，2500，5000，10000，20000 μ M的濃度梯度，HU 則配制成 250，500，1000，2000，4000，8000，12000 μ M 的濃度梯度。H印G2. 2. 15 細(xì)胞濃度4Χ IO4個(gè)/mL,加入96孔培養(yǎng)板100 μ L/孔，置CO2孵箱37°C培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好，吸除培養(yǎng)液，加入以上不同濃度不同藥物的含藥培養(yǎng)基IOOyL/孔，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。連續(xù)培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前2h，每孔加入CCK8試劑10 μ L，于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2h后自動(dòng)酶標(biāo)儀490nm檢測(cè)各孔OD值。計(jì)算細(xì)胞存活率細(xì)胞抑制率(％)=[1_(實(shí)驗(yàn)孔OD均值/對(duì)照孔OD均值)]X 100%。擬合函數(shù)求出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)50%時(shí)藥物濃度(IC50)o3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別以RR抑制藥物HU、抗HBV藥物3-TC為陽性對(duì)照藥物，應(yīng)用MTT法(CCK8 )測(cè)定藥物的對(duì)H印G2. 2. 15的細(xì)胞毒性，計(jì)算各藥物抑制H印G2. 2. 15細(xì)胞的IC1(I、IC25及IC5tl(圖2，表2)。為檢測(cè)藥物低細(xì)胞毒性劑量時(shí)對(duì)HBV的抑制作用，后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)選用抑制細(xì)胞生長(zhǎng)為10%及25%時(shí)的藥物濃度即ICltl和IC25兩個(gè)劑量；同時(shí)陽性對(duì)照藥3-TC及HU也設(shè)置IC10和IC25兩個(gè)劑量，以保證不同藥物作用的可比性。表2 :實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)H印G2. 2. 15的細(xì)胞毒性作用
權(quán)利要求
1.4_輕基水楊酰苯胺在制備以核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotide reductase,RR)為靶標(biāo)的防治乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述4-羥基水楊酰苯胺用于制備抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了4-羥基水楊酰苯胺在制藥領(lǐng)域中的新用途。該化合物是核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotide reductase，RR)的抑制劑，通過抑制RR酶活性，阻斷乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制所需dNTPs的合成，從而達(dá)到抑制HBV復(fù)制、治療肝炎尤其是乙型肝炎的目的?？捎糜陬A(yù)防和治療乙型肝炎，具有重要應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102920688SQ20121033716
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者邵吉民, 朱維良, 徐志建, 劉霞, 陳新煥 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所