專利名稱：一種用于靶向藥物載體的核酸適體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于靶向藥物載體的核酸適體。
背景技術(shù)：
癌癥是一類引起人類死亡的主要疾病，每年全球因癌癥死亡人數(shù)大約為700萬。隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展以及對癌癥發(fā)病機(jī)制的了解，癌癥的化學(xué)藥物治療得到了很好的發(fā)展。目前大約有90多種化學(xué)藥物發(fā)展用于殺死腫瘤細(xì)胞和癌癥治療。但是這些藥物缺乏靶向特異性，在臨床上通常給患者帶來致命的副作用。同時，小分子核酸藥物在體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中都取得了比較好的結(jié)果，但是一旦應(yīng)用于體內(nèi)，就會被人體內(nèi)的酶所分解；而體外對小分子核酸藥物進(jìn)行修飾后，雖然可以抵御酶的切割，但是又改變了作用機(jī)理。因此需要發(fā)展既能靶向攜帶藥物攻擊腫瘤細(xì)胞，又能抵御核酸酶降解的靶向載體。
核酸適體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化法從DNA/RNA文庫中篩選出來的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。它通過分子內(nèi)堿基堆積、疏水、氫鍵和靜電等作用力折疊成獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，從而高特異性和高親和力識別其靶標(biāo)分子。核酸適體與靶標(biāo)分子結(jié)合的特異性和親和力與抗體相似，甚至更強(qiáng)。核酸適體具有較低的分子量、無免疫原性、快速的組織通透性和良好的代謝動力學(xué)。核酸適體一旦證實(shí)，就可以通過自動化的固相合成的方法制備，從而保證了不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異。核酸適體化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和容易通過化學(xué)修飾賦予其其它功能。更重要的是，與抗體相比，核酸適體的靶標(biāo)范圍更廣。一些與疾病緊密相關(guān)的生長因子、酶、受體以及腫瘤標(biāo)志物等物質(zhì)都能成為核酸適體的靶標(biāo)。目前針對血管表皮生長因子受體的核酸適體作為治療老年濕性黃斑疾病藥物已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)上市；同時還有八種核酸適體藥物處于不同臨床考察階段。因此針對與疾病相關(guān)分子的核酸適體作為一種潛在的靶向載體攜帶藥物吸引著研究者的注意。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種核酸適體。本發(fā)明提供的核酸適體，其為序列表中序列I所示的單鏈DNA分子。上述的核酸適體作為藥物載體的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種藥物載體。本發(fā)明提供的藥物載體，其活性成分為上述的核酸適體。上述應(yīng)用或藥物載體中，所述藥物為如下I)或2):I)預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物；所述腫瘤具體為肺腺癌；2)殺傷和/或抑制腫瘤細(xì)胞的藥物；所述腫瘤細(xì)胞具體為肺腺癌細(xì)胞；所述肺腺癌細(xì)胞進(jìn)一步具體為A549細(xì)胞系。本發(fā)明的第三個目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，為由上述的核酸適體和靶藥物連接得到的產(chǎn)物；所述產(chǎn)品為如下I)或2):I)預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品；2)殺傷和/或抑制腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品。上述產(chǎn)品中，所述靶藥物為C70三加成丙二酸二乙酸(TF70);該化合物通過如下方法合成I)向IOmg C70中加入25ml甲苯溶液,攪拌分散均勻,得到C7tl甲苯溶液；向恒壓漏斗中加入21ml甲苯溶液；2)向C7tl甲苯溶液中通入氮?dú)馐昼?，再向C7tl甲苯溶液中加入8. 1μ I溴代丙二酸二乙酯；向恒壓漏斗中的甲苯溶液中加入7. 1μ I DBU溶液，輕搖漏斗，使分散均勻，得到含DBU的甲苯溶液(溴代丙二酸二乙酯DBU=1:1，DBU :C7(I=6:1，物質(zhì)的摩爾比)；
3)繼續(xù)通入氮?dú)馐昼?，打開恒壓漏斗，開始滴加含DBU的甲苯溶液，控制溶液一小時內(nèi)加完，繼續(xù)反應(yīng)兩小時，停止反應(yīng)，以一次性濾器過濾，收集清液于50ml單口瓶中，放置過夜后過高效液相色譜柱，流動相為甲苯，流速為6ml/min。先進(jìn)樣2ml，觀察保留時間為40分鐘的峰形，確定需要收取的的樣品組分以及每次的進(jìn)樣間隔；4)收集純化后的C7tl衍生物，取樣進(jìn)行質(zhì)譜檢測。其余部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除樣品中的甲苯，加入40ml乙醇。超聲分散貼在瓶壁的C7tl衍生物，攪拌使C7tl衍生物盡量分散在乙醇溶液中。以氫氧化鈉的乙醇溶液(20mg NaOH, Iml H20,9ml乙醇)水解C7tl衍生物得到相應(yīng)的富勒酸衍生物，以O(shè). 2μπι濾器過濾，將溶液收集于無菌容器中封口備用，4°C保存?zhèn)溆茫玫絋F70。上述產(chǎn)品中，上述的核酸適體和上述C70三加成丙二酸二乙酸通過酰胺鍵連接。上述產(chǎn)品為藥物，其中，所述腫瘤為肺腺癌；所述腫瘤細(xì)胞為肺腺癌細(xì)胞；所述肺腺癌細(xì)胞具體為A549細(xì)胞系。上述的核酸適體在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述的核酸適體在制備殺傷和/或抑制腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述腫瘤為肺腺癌；所述腫瘤細(xì)胞為肺腺癌細(xì)胞；所述肺腺癌細(xì)胞具體為A549細(xì)胞系，上述產(chǎn)品為藥物。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一條核酸適體R13，它是從人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞中利用細(xì)胞篩選法得到的一段單鏈DNA分子。它對A549細(xì)胞具有很高的親和力，而且，還可以進(jìn)入A549細(xì)胞。在體外實(shí)驗(yàn)中，R13作為藥物載體攜帶光治療劑TF70，大大提高TF70對A549的殺傷作用，靶向性強(qiáng)。


圖I為共聚焦檢測核酸適體R13特異性表征圖2為流式細(xì)胞術(shù)法對R13與A549細(xì)胞的結(jié)合特異性表征圖3為TF70-R13 (酰胺鍵連接產(chǎn)物)連接示意4為藥物殺傷細(xì)胞的細(xì)胞存活率結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中部分實(shí)驗(yàn)材料和試劑如下肺腺癌A549細(xì)胞系購自ATCC，編號為CCL-185 ；肺腺癌A549細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFR-GFP (來自重組質(zhì)粒pEGFP_EGFR，由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供。質(zhì)粒PEGFP購自英駿公司Invitrogen)，命名為EGFR-A549細(xì)胞；用于培養(yǎng)肺腺癌A549的細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM+10%胎牛血清。
PBS緩沖液pH為7. 4，由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度為39mM NaH2PO4,
6ImMNa2HPO4,150mM NaCl ；結(jié)合緩沖液pH為7. 4，由PBS緩沖液和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度為lmM MgCl2,O. 05%BSA，0. 2mg/ml 酵母轉(zhuǎn)移 RNA (Invitrogen 公司及產(chǎn)品目錄號 15401-011)；洗滌緩沖液pH為7. 4，由PBS和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度為ImM MgCl2 ；FBS :胎牛血清，購自GIBCO (美國)；實(shí)施例I、核酸適體R13的獲得一、核酸適體R13的獲得I、核酸適體R13的篩選I), DNA文庫的預(yù)處理5nmol DNA 文庫(5，-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG(40N) CTC ATG GAC GTG CTGGTG AC-3’ )溶解后，經(jīng)94°C加熱和冰上冷卻處理，置于37°C待用。2)、反向篩選取3 X IO5個A549細(xì)胞，加入已預(yù)處理的DNA文庫，加入FBS,于37°C搖床中(轉(zhuǎn)速IOOrpm)孵育I小時，吸取上清。3)、正向篩選取3X 105EGFR-A549細(xì)胞珠，加入反篩后的溶液，于37°C搖床中(轉(zhuǎn)速IOOrpm)孵育I小時。吸棄上清液；用PBS洗滌細(xì)胞2次，再用細(xì)胞刮把細(xì)胞刮下來，離心洗滌3次(轉(zhuǎn)速lOOOrpm)，每次5分鐘。將EGFR-A549細(xì)胞中加入500ulPBS，95°C加熱洗脫DNA后，告訴離心(12000rpm)收集上清液用于PCR擴(kuò)增的模板。2、篩選優(yōu)化為了獲得高親和性和特異性的核酸適體，在篩選的過程中逐步改變篩選時間、正篩洗滌次數(shù)增加篩選壓力；同時用共聚焦熒光顯微鏡對每輪的篩選結(jié)果進(jìn)行了初步考察。3、PCR 及 ssDNA 分離PCR 反應(yīng)體系組成10 μ L 10XPCR 緩沖溶液(IOOmM Tri s_HCl，pH 8. 3 ；15mMMgC12)、3μ L ImM dNTPs, 3 μ L25 μ M FITC標(biāo)記的上游引物(5’_ACG CTC GGA TGC CACTAC AG-3’)和生物素標(biāo)記的下游引物(5，-GTC ACCAGC ACG TCC ATG AG_3，)、0. 25 μ LTaq熱啟動聚合酶，5-15 μ L篩選產(chǎn)物、和69-79 μ L滅菌蒸餾水。熱循環(huán)條件94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s。在擴(kuò)增之前用瓊脂凝膠電泳考察不同循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物，選取適當(dāng)?shù)难h(huán)次數(shù)。
4、ssDNA 分離利用親和素包被的葡聚糖微珠親和吸附，O. 2M的氫氧化鈉分離雙鏈，使FITC標(biāo)記的ssDNA與生物素標(biāo)記的ssDNA分離。再將FITC標(biāo)記的ssDNA過NAP-5柱子進(jìn)行脫鹽，并收集O. 5-1. 5mL之間的濾液。用UV-vis光譜測定收集溶液中的DNA濃度。DNA經(jīng)凍存低溫干燥后于_20°C保存或用于下輪篩選。5、克隆測序經(jīng)過23輪篩選后，觀察隨實(shí)驗(yàn)的即時表征，當(dāng)熒光強(qiáng)度不再增強(qiáng)時，取最后一次篩選產(chǎn)物為模板和無標(biāo)記的上下游引物按照上述PCR反應(yīng)條件和步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的無標(biāo)記DNA雙鏈產(chǎn)物按照pMDlS-T Vector試劑盒手冊操作，然后隨機(jī)測序。6、序列分析通過分析ssDNA的一級結(jié)構(gòu)，然后根據(jù)隨機(jī)序列中是否存在共同保守序列將所得 序列進(jìn)行分類。結(jié)果通過克隆，選取160個樣本進(jìn)行測序，并按照DNA —級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類，得到高度富集的適體序列，其中一條序列對A549細(xì)胞具有高度的特異性并且能進(jìn)入A549細(xì)胞。經(jīng)過序列優(yōu)化，最終的序列裁減為5 ‘-TTTATGGGTGGGTGGGGGGTTTTT-3’(序列I);序列保護(hù)時，與其相似度為75%-90%的序列都為類似序列，該序列所示單鏈DAN分子即為核酸適體R13。上述核酸適體R13可以人工合成序列I。上述核酸適體R13可分別用Cy3和Cy5標(biāo)記(Cy3和Cy5均標(biāo)記核酸適體R13的5’端)，得到Cy3標(biāo)記核酸適體R13和Cy5標(biāo)記核酸適體R13。二、核酸適體R13特異性表征I、共聚焦檢測R13特異性將Cy3標(biāo)記核酸適體R13加入肺腺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)液(將A549細(xì)胞在DMEM+10%胎牛血清中培養(yǎng)得到)，使Cy3標(biāo)記核酸適體R13在總體系中的終濃度為2uM ;共同孵育18小時(37度，5% 二氧化碳)。共孵育后做共聚焦檢測(559nm激發(fā))，激光器型號FV1000-IX81, Olympus, Japan)，收集顯微鏡型號NA O. 40，UPLASPO, Olympus，結(jié)果如圖 I所示，可以看出，發(fā)現(xiàn)核酸適體R13可以進(jìn)入A549細(xì)胞，甚至可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。2、流式細(xì)胞術(shù)法檢測R13與A549細(xì)胞的結(jié)合特異性取肺腺癌A549細(xì)胞10萬左右，用O. 02%EDTA消化，PBS洗滌二次；收集細(xì)胞，分別加入200nM的Cy5標(biāo)記核酸適體Rl3和200nM Cy5標(biāo)記的對照DNA序列(5，-AATTTTTTAATTATTTATATTA-3’，Cy5 標(biāo)記在對照 DNA 序列的 5’ 端)，37 度孵育 40 分鐘；PBS洗滌一次，用流式細(xì)胞儀檢測核酸適體R13與A549細(xì)胞的結(jié)合情況。以A549細(xì)胞不加入任何DNA片段為對照(A549細(xì)胞)。結(jié)果如圖2所示，I為A549細(xì)胞，2為A549細(xì)胞與Cy5標(biāo)記的對照序列的結(jié)合，3為A549細(xì)胞與Cy5標(biāo)記的R13的結(jié)合，可以看出，與對照序列相比，R13與A549細(xì)胞具有很高的親合力。從上述實(shí)驗(yàn)可以看出，核酸適體R13可進(jìn)入A549細(xì)胞且與其特異結(jié)合。實(shí)施例2、核酸適體R13作為靶向藥物載體的應(yīng)用一、TF70-R13 (酰胺鍵連接產(chǎn)物)的制備
1、TF70 的制備TF70為一種光治療劑，為C7tl三加成丙二酸二乙酸，其合成步驟如下I)向IOmg C70中加入25ml甲苯溶液,攪拌分散均勻,得到C7tl甲苯溶液；向恒壓漏斗中加入21ml甲苯溶液；2)向C7tl甲苯溶液中通入氮?dú)馐昼?再向C7tl甲苯溶液中加入8. I μ I溴代丙二酸二乙酯；向恒壓漏斗中的甲苯溶液中加入7. 1μ I DBU (1,8-二氮雜二環(huán)[5. 4. O]十一碳-7-烯)溶液，輕搖漏斗，使分散均勻，得到含DBU的甲苯溶液(溴代丙二酸二乙酯DBU=I: I, DBU :C7Q=6:1，物質(zhì)的摩爾比)；3)繼續(xù)通入氮?dú)馐昼?，打開恒壓漏斗，開始滴加含DBU的甲苯溶液，控制溶液一小時內(nèi)加完，繼續(xù)反應(yīng)兩小時，停止反應(yīng)，以一次性濾器過濾，收集清液于50ml單口瓶中，放置過夜后過高效液相色譜柱，流動相為甲苯，流速為6ml/min。先進(jìn)樣2ml，觀察保留時間 為40分鐘的峰形，確定需要收取的的樣品組分以及每次的進(jìn)樣間隔；4)收集純化后的C7tl衍生物，取樣進(jìn)行質(zhì)譜檢測。其余部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除樣品中的甲苯，加入40ml乙醇。超聲分散貼在瓶壁的C7tl衍生物，攪拌使C7tl衍生物盡量分散在乙醇溶液中。以氫氧化鈉的乙醇溶液(20mg NaOH, Iml H20,9ml乙醇)水解C7tl衍生物得到相應(yīng)的富勒酸衍生物，以O(shè). 2μπι濾器過濾，將溶液收集于無菌容器中封口備用，4°C保存?zhèn)溆茫玫絋F70。2、TF70_R13 (酰胺鍵連接產(chǎn)物)的制備將上述I得到的TF70與由實(shí)施例I得到的核酸適體Rl3酰胺鍵連接得到TF70-R13 ;連接示意圖如圖3所示,具體過程如下所示將O. Iml上述I得到的TF70 (O. 5mg/ml)與2. Oml純水混合，超聲分散十分鐘，加入O. 5ml MES緩沖液(pH 5. 8，O. 5M)，備用，得到TF70溶液；再將新鮮制備的EDC水溶液(7mg/ml)和Sulfo-NHS水溶液(13mg/ml)加入TF70溶液中，室溫(25°C )下攪拌活化30分鐘后加入50D由實(shí)施例I得到的核酸適體R13，繼續(xù)反應(yīng)3. O小時后對產(chǎn)物進(jìn)行超濾和透析(超濾管分子量10KD，透析袋MW cut off 3500)以除去多余的反應(yīng)物，得到TF70-R13。二、R13作為靶向藥物載體的靶向性功能驗(yàn)證將A549細(xì)胞分為如下三組處理對照組(control):將IO6的A549細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)(37度，5% 二氧化碳)3小時；TF70組將IO6的A549細(xì)胞在含有IOuM TF70的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)(37度，5% 二氧化碳)3小時；TF70-R13組將IO6的A549細(xì)胞在含有IOuM TF70-R13的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)(37度，5% 二氧化碳)3小時；然后將上述3組細(xì)胞均用強(qiáng)度為20mW/cm2的光照，照射時間為5分鐘、15分鐘、30分鐘；照射30分鐘后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)各組細(xì)胞數(shù)量，利用CCK-8方法通過450nm波長下的吸收值來反應(yīng)細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖4所示，可以看出對照組(control)的細(xì)胞存活率為100% ；
TF70組的細(xì)胞存活率為85% ；TF70-R13組的細(xì)胞存活率為8% ；從上述結(jié)果可以看出，與單獨(dú)加入TF70相比，加入TF70-R13后光照培養(yǎng)，A549細(xì)胞大量死亡；說明核酸適體R13作為靶向性藥物載體，大大提高了 TF70 對A549細(xì)胞的殺傷作用。
權(quán)利要求
1.一種核酸適體，其為序列表中序列I所示的單鏈DNA分子。
2.權(quán)利要求I所述的核酸適體作為藥物載體的應(yīng)用。
3.—種藥物載體，其活性成分為權(quán)利要求I所述的核酸適體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用或權(quán)利要求3所述的藥物載體，其特征在于 所述藥物為如下I)或2): O預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物；所述腫瘤具體為肺腺癌； 2)殺傷和/或抑制腫瘤細(xì)胞的藥物；所述腫瘤細(xì)胞具體為肺腺癌細(xì)胞；所述肺腺癌細(xì)胞進(jìn)一步具體為A549細(xì)胞系。
5.一種產(chǎn)品，為將權(quán)利要求I所述的核酸適體和靶藥物連接得到的產(chǎn)物；所述產(chǎn)品為如下I)或2): 1)預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品； 2)殺傷和/或抑制腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于所述靶藥物為C70三加成丙二酸二乙酸； 權(quán)利要求I所述的核酸適體和所述C70三加成丙二酸二乙酸通過酰胺鍵連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)品為藥物；所述腫瘤為肺腺癌；所述腫瘤細(xì)胞為肺腺癌細(xì)胞；所述肺腺癌細(xì)胞具體為A549細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求I所述的核酸適體在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述的核酸適體在制備殺傷和/或抑制腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為肺腺癌；所述腫瘤細(xì)胞為肺腺癌細(xì)胞；所述肺腺癌細(xì)胞具體為A549細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于靶向藥物載體的核酸適體。本發(fā)明提供的核酸適體，其為序列表中序列1所示的單鏈DNA分子。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一條核酸適體R13，它是從人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞中利用細(xì)胞篩選法得到的一段DNA序列。它對A549細(xì)胞具有很高的親和力，而且，還可以進(jìn)入A549細(xì)胞。在體外實(shí)驗(yàn)中，R13作為藥物載體攜帶光治療劑TF70，大大提高TF70對A549的殺傷作用，靶向性強(qiáng)。
文檔編號A61K47/48GK102876681SQ20121034810
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者方曉紅, 徐麗, 劉巧玲, 張振, 鄭俊鵬, 王春儒 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所