專利名稱：枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及枸杞提取物的新用途，具體涉枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用。
背景技術(shù)：
慢性應激障礙是指個體面對長期特殊環(huán)境變化而不能調(diào)整和穩(wěn)定內(nèi)穩(wěn)態(tài)時所經(jīng)歷的持續(xù)的情感變化及心理壓力。其致病機制在于應激原刺激機體失穩(wěn)態(tài)應激刺激持續(xù)或反復存在，則應激的效應累積形成穩(wěn)態(tài)應變負荷，循環(huán)和組織中的應激相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌介質(zhì)和細胞因子持續(xù)升高，進而發(fā)展為穩(wěn)態(tài)應變超負荷。由于大量神經(jīng)內(nèi)分泌介
質(zhì)和細胞因子的長期作用，導致各系統(tǒng)器官、組織和細胞功能異常。其中創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder, PTSD)是指由于生命受到威脅、遭遇悲劇導致的精神、軀體癥狀持續(xù)的臨床綜合征。1980年美國精神病協(xié)會《精神障礙統(tǒng)計診斷手冊》DSM-III (第三版)中確立了 PTSD的診斷標準。1993年P(guān)TSD正式納入《國際疾病分類》ICD-10(第十版)。隨后1994年美國精神障礙診斷統(tǒng)計分類手冊-第四版(DSM-IV)將PTSD歸在焦慮障礙中，并將其分為三種類型急性(癥狀持續(xù)小于3個月)、慢性(癥狀至少持續(xù)3個月)、伴延遲起病(癥狀在應激后至少6個月才出現(xiàn))。PTSD癥狀主要表現(xiàn)為對創(chuàng)傷事件的闖入性記憶為特征的病理性重現(xiàn)、對創(chuàng)傷相關(guān)線索的回避、持續(xù)性的高喚醒，以及對創(chuàng)傷經(jīng)歷的選擇性遺忘和情感麻木，患者因此而感到痛苦不堪。PTSD癥狀一般在遭受創(chuàng)傷后數(shù)日甚至數(shù)月后出現(xiàn)，病程可長達數(shù)年。不同類型導致的創(chuàng)傷后應激障礙發(fā)病率不同，有調(diào)查發(fā)現(xiàn)在美國經(jīng)歷過創(chuàng)傷事件的普通人群有25% 30%的人患有PTSD ;—些特殊創(chuàng)傷，如性暴力等，可以導致更高的發(fā)病率。在職業(yè)衛(wèi)生領(lǐng)域，因突發(fā)事故造成的PTSD，也有較高的發(fā)病率。據(jù)美國精神病協(xié)會統(tǒng)計，美國PTSD的人群總患病率為I % 14%，平均為8%，個體終身患病危險性達3% 5%，女性約為男性的2倍。德國研究結(jié)果顯示患病群體為1.3%，而阿爾及利亞顯示高達37.4%。而我國伍志剛、張本等分別對洞庭湖嚴重洪澇災區(qū)成人和唐山大地震所致孤兒PTSD發(fā)病率調(diào)查情況顯示為33. 89%和23%。2008年“5. 12”汶川地震極重災區(qū)幸存者三個月后罹患失眠、夢魘、閃回等PTSD典型癥狀困擾的人約有18.4 %。PTSD以其發(fā)病率高，病程長，療效差等嚴重影響創(chuàng)傷救治，是醫(yī)學研究難點。PTSD的發(fā)生一方面給患者本身造成生理殘疾，患精神病或軀體疾病(如心血管疾病、睡眠障礙、抑郁所致的自殺等)的危險性顯著增加，使患者的生存質(zhì)量顯著下降；另一方面因患者工作功能減退，給社會造成沉重的經(jīng)濟負擔。目前關(guān)于PTSD的臨床藥物治療多次采用苯ニ氮卓類(benzodiazepines, BZ)抗焦慮藥、抗抑郁藥、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)、單胺氧化酶抑制藥、非典型抗精神病藥、心境穩(wěn)定劑和抗驚厥藥、交感神經(jīng)阻滯劑等，但是長期應用抗焦慮藥易導致依賴，停藥出現(xiàn)戒斷反應，還損害認知功能；其它ー些藥物總是由于藥物作用機制不同，不良反應多。中藥在創(chuàng)傷后應激障礙治療中的作用一直為醫(yī)學工作者所關(guān)注。目前國內(nèi)已經(jīng)開展的研究包括逍遙散加減、益智仁等都有不錯的療效。
枸杞是中國傳統(tǒng)的藥食兼用的名貴中藥材，其味甘、性平，具有補肝腎、益精血和明目的功能，近年來，一直受到臨床和營養(yǎng)研究領(lǐng)域的高度重視。枸杞的藥理和保健作用與其中含有的生物活性物質(zhì)枸杞多糖有很大關(guān)系?，F(xiàn)代科學研究表明，枸杞多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫、清除氧自由基、抑制腫瘤、延緩衰老、降血脂、降血糖和抗疲勞等作用，具有廣闊的開發(fā)應用前景。雖然在預防和治療慢性應激以及創(chuàng)傷后應激障礙有良好的研究效果，但主要還是以復方制劑出現(xiàn)，未見有關(guān)藥、食兼用的成分單獨應用枸杞及其枸杞提取物一枸杞多糖成分預防和治療應激的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用，該藥物具有預防和治療應激、改善認知的功能。本發(fā)明用枸杞的提取物一枸杞多糖(Lycium barb arum polysaccharides)為活性成分，加入藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。本發(fā)明所述的枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用，其特征是將提取 的純度> 50%的枸杞多糖裝入膠囊或制成片劑。進ー步，將提取的枸杞多糖，裝入膠囊，每粒含枸杞多糖500 mg,或制成片劑，每片含枸杞多糖500 mg。所述的枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用，其特征是將提取的純度^ 50%的枸杞多糖與玉米淀粉混合均勻,裝入膠囊或制成片劑。進ー步,姆粒膠囊含枸杞多糖500 mg、含玉米淀粉IOOmg ;或者姆片含枸杞多糖500mg、玉米淀粉IOOmg。本發(fā)明的有益效果藥物由枸杞多糖組成的單方制劑，具有抗應激作用，能夠于預防和治療慢性應激和或創(chuàng)傷后應激障礙，改善認知的功能，藥效明確，安全性高，為臨床提供了ー種新的用藥選擇。


圖I是對照、應激、預防性LBP灌胃和治療性LBP灌胃組大鼠拒俘反應與對照組比較圖，(* P〈 O. 05，** P〈 O. 01 ;與應激組比較# P < O. 05, # # P < O. 01)。圖2是對照、應激、預防性LBP灌胃和治療性LBP灌胃組大鼠應激后lw，2w, 4w僵立反應比較與對照組比較圖，(* P < 0.05，* * P〈 O. 01 ;與應激組比較# P < O. 05,# #P < O. 01) O圖3-1.是應激后Iw水迷宮空間探索軌跡圖。圖3-2.是應激后2w水迷宮空間探索軌跡圖。圖3-3.是應激后4w水迷宮空間探索軌跡圖。圖3-4.是預防性LBP3d灌胃應激后Iw水迷宮空間探索軌跡圖。圖3-5.是預防性LBP3d灌胃應激后2w水迷宮空間探索軌跡圖。圖3-6.是預防性LBP3d灌胃應激后4w水迷宮空間探索軌跡圖。圖3-7.是應激后灌胃LBPlw水迷宮空間探索軌跡圖。圖3-8.是應激后LBP2w水迷宮空間探索軌跡圖。
圖3-9.是應激后LBP4w水迷宮空間探索軌跡圖。圖4-1.是幽閉電刺激大鼠海馬神經(jīng)元各區(qū)形態(tài)學特點圖(4w，HE、Nissl和Silver 染色)。圖4-2.是LBP預防灌胃對幽閉電刺激大鼠海馬神經(jīng)元各區(qū)形態(tài)學影響圖(4w，HE、Nissl 和 Silver 染色)。圖4-3. LBP治療灌胃對幽閉電刺激大鼠海馬神經(jīng)元各區(qū)形態(tài)學影響圖(4w，HE、Nissl 和 Silver 染色)。圖4-4.是對照組、應激組、應激前LBP、應激后LBP組大鼠海馬CAl的神經(jīng)元密度圖(均數(shù)土標準差，神經(jīng)元/50 mm2)。圖4-5.是對照組、應激組、應激前LBP、應激后LBP組大鼠海馬CA3的神經(jīng)元密 度圖(均數(shù)土標準差，神經(jīng)元/50 mm2)。圖4-6.對照組、應激組、應激前LBP，應激后LBP組大鼠海馬DG的神經(jīng)元密度圖(均數(shù)土標準差，神經(jīng)元/50 mm2)。圖5-1.是對照、應激、應激前LBP，應激后LBP組大鼠海馬DG區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)圖(均數(shù)土標準差)。圖5-2.激光共聚焦顯微鏡觀察3d預防性低劑量灌胃大鼠應激后Iw海馬DG區(qū)BrdU陽性表達圖(右邊上部為BrdU核染色，左邊為DAPI核染色)。圖5-3.是激光共聚焦顯微鏡觀察3d預防性低劑量灌胃大鼠應激后4w海馬DG區(qū)BrdU陽性表達圖(右邊上部為BrdU核染色，左邊為DAPI核染色)。圖5-4.是激光共聚焦顯微鏡觀察高劑量灌胃大鼠應激后Iw海馬DG區(qū)BrdU陽性表達圖(右邊上部為BrdU核染色，左邊為DAPI核染色)。圖5-5.是激光共聚焦顯微鏡觀察高劑量灌胃大鼠應激后2w海馬DG區(qū)BrdU陽性表達圖(右邊上部為BrdU核染色，左邊為DAPI核染色)圖.5-6.是激光共聚焦顯微鏡觀察高劑量灌胃大鼠應激后4w海馬DG區(qū)BrdU陽性表達圖(右邊上部為BrdU核染色，左邊為DAPI核染色)。
具體實施例方式實施例一枸杞多糖的制備稱取枸杞果肉干粉末IOOg,石油醚(60 — 90°C)回流脫脂二次，每次I h。再用80%こ醇回流提取2次，每次2h，以除去單糖和低聚糖。將藥渣加500ml水90で水浴提取二次，合并二次提取液。旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀上減壓濃縮至150 ml，加少量活性炭脫色，過濾。濾液加5倍量95%こ醇，放置過夜，抽濾后的沉淀以100 ml水溶解重復醇沉一次。沉淀以95%こ醇、無水こ醇、丙酮、こ醚多次洗滌，60で干躁，即得枸杞多糖，純度> 50%。過篩，裝膠囊，即得枸杞多糖膠囊；每粒膠囊含枸杞多糖500 mg ;或者制成片劑，每片含枸杞多糖500 mg，配加玉米淀粉lOOmg。除了采用上述方法提取外，也可以采用傳統(tǒng)水提取法、快速酶提取法、超聲波、微波輔助水以及超臨界C02萃取等多種提取法，不同方法枸杞提取物均具有預防和治療慢性應激障礙和或創(chuàng)傷后應激障礙得藥效。枸杞多糖也可參照CN 101029088A公開的“ー種枸杞多糖的制備方法”制備，也可以直接購買市售產(chǎn)品，如純度> 50%的枸杞多糖，批號20100409，陜西瑞康生物工程有限公司提供，臨用時加生理鹽水制成2 mg/ml, 20 mg/ml濃度的藥液供藥理實驗用。以下通過具體藥效學實驗證明本發(fā)明的有益效果。實驗材料動物SD大鼠，雄性，體重210±26g，重慶市第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供，普通級動物，許可證SCXK (yu) 2007017。試藥試劑枸杞多糖，純度彡50%，批號20100409，陜西瑞康生物工程有限公司生產(chǎn)；氯化鈉注射液，批號K090915，四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；
戊巴比妥鈉，丹麥進ロ分裝；多聚甲醛分析純，批號20100501，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)；無水こ醇，批號20100509，重慶茂業(yè)化學試劑有限公司生產(chǎn)；磷酸ニ氫鈉，批號20091105，重慶川東化工集団有限公司生產(chǎn)；磷酸氫ニ鈉，批號90519，重慶博弈化學試劑有限公司生產(chǎn)；蔗糖分析純，批號20081113，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)；ニ甲苯，批號20090911，重慶川東化工集団有限公司化學試劑廠生產(chǎn)；大鼠BrdU單克隆抗體，批號B2531，美國Sigma提供；fcdU，批號 118K4835，美國 Sigma 提供；羊抗小鼠FITC，批號ZF-0312，進ロ分裝中國中衫金橋公司提供。實驗儀器曠場測試系統(tǒng)(美國Smart公司)，冰凍切片機(CM1900美國Leica)，激光共聚焦掃描系統(tǒng)(TCSSP2，德國Leica)，蠟塊切片機(SM2000R，德國Leica)，臺式低溫離心機(美國Sigma2-16k), YLS-17B穿梭箱(山東益研發(fā)展有限公司)，高架十字迷宮(美國Smart公司)，幽閉電擊箱(自制)，水迷宮系統(tǒng)(中國中國醫(yī)科院藥物研究所)實驗例I :枸杞多糖對幽閉電擊致PTSD大鼠一般狀態(tài)、體重和拒付反應觀察。SD大鼠72只，雄性，體重210土26g，實驗分組為對照組，18只；幽閉電擊應激組，18只；LBP低劑量預防組，18只；LBP高劑量治療組，18只；對照組大鼠每天給大鼠等量生理鹽水灌胃，不給予應激；LBP低劑量預防組，在電擊前3天，每日I次，固定時間為上午8 :00灌胃，每次每只10 mg/kg,連續(xù)3天；LBP高劑量治療組按每日每次20 mg/kg,每組18只，觀察時間點為應激后lw，2w,4w。拒俘反應以動物從未接觸過的手套抓大鼠，觀察其反應。記分標準0 :很容易抓取動物；1 :尖叫或者回避；2 :尖叫并回避；3 :逃脫；4 :逃脫并尖叫；5 :試圖撕咬手套；6 :主動躍起攻擊。總分用于評價動物恐懼與沖突素質(zhì)特征的改變。分別在應激前、應激后lw，2w，4w秤量大鼠體重，計算體重變化率。體重變化百分率=(應激后lw，2w, 4w體重ー應激前體重)/應激前體重X 100 %。進行雙因素方差分析。實驗結(jié)果參見圖I :一般觀察與對照組大鼠相比，經(jīng)幽閉+電刺激后大鼠出現(xiàn)行為異常，主要表現(xiàn)為行動遲緩，對外界刺激極少作出反應和易激怒；容易躁狂型(13只)。而預先灌胃低劑量組大鼠和高劑量灌胃組大鼠比較溫順和安靜，配合研究人員的任何操作。體重改變與對照組大鼠相比，幽閉電刺激大鼠的體重明顯降低，隨著時間降低，應激后前2w體重降低最顯著(P < 0.01)。低、高劑量灌胃組表現(xiàn)為體重持續(xù)增加，且高劑量灌胃組的體重増加幅度在應激后4周較低劑量組明顯(P < O. 05)拒俘反應改變與對照組大鼠相比，幽閉電擊組的拒付反應強烈，保持對陌生手套的竭カ掙脫(評分為3分)或者為尖叫、逃脫(評分4分)，且在應激最初2w時間內(nèi)拒俘反應保持穩(wěn)定，第4周，組間評分平均略有下降，仍維持高反應性。預先灌胃組則在應激后4周反應穩(wěn)定，為I. 5 ±O. 55，高劑量灌胃組則在應激后Iw反應為尖叫或回避，到4w時則為容易抓取或者輕微掙脫反應組間值為O. 33 ±O. 52。枸杞多糖能夠顯著平靜應激大鼠情緒，減少創(chuàng)傷后應激障礙/慢性應激的體重減少。實驗例2 :枸杞多糖對慢性應激大鼠的自由活動的影響。 采用大鼠曠場行為檢測。SD大鼠，雄性，體重210±26g，實驗分組為對照組、幽閉電擊應激、LBP低劑量預防組、LBP高劑量治療組。對照組大鼠每天給大鼠等量生理鹽水灌胃，不給予應激。LBP低劑量預防組，在電擊前3天，毎日I次，固定時間為上午8:00灌胃，每次每只10 mg/kg，連續(xù)3天；LBP高劑量治療組按每日每次20 mg/kg。每組24只，觀察時間點為應激后lw，2w，4w。用一 100 cm XlOO cm X48 cm木制箱，底板有25個20cmX20 cm的方格，光照度為60 lux，設置屏障，操作室內(nèi)隔音。觀察者在行為實驗室內(nèi)用攝像系統(tǒng)記錄動物在曠場木箱內(nèi)5 min的行為表現(xiàn)，包括水平活動、直立次數(shù)、修飾次數(shù)、呆滯和排便量。其中水平行走、探究、呆滯和修飾行為通過攝像分析系統(tǒng)獲得數(shù)據(jù)，每只動物的排便量是以曠場試驗結(jié)束后排便的顆粒數(shù)來表示。實驗結(jié)果與對照組大鼠相比，幽閉電擊大鼠的曠場行為隨著時間改變明顯，橫向穿格、直立次數(shù)明顯減少(P < O. 01),修飾次數(shù)在應激后lw,2w明顯減少，4w無差異。與應激組相比，低劑量預防組，應激后lw，橫向穿格沒有差異，但是直立行為減少，梳洗行為增加(P < O. 05)。應激后2w橫向運動和直立行為明顯増加(P < O .01)，梳洗行為無差異，應激后4周時各項行為皆較應激組増加明顯(P < O. 01)，曠場行為隨應激時間延長行為表現(xiàn)下降但降低幅度低于應激組。高劑量灌胃組曠場行為增加明顯，且在第4周與對照組仍有差異(P < 0.05)。高劑量組各項行為皆高于低劑量灌胃預防組。枸杞多糖預防性劑量服用可顯著減少應激對大鼠曠場行為的影響，治療性服用效果較預防效果明顯。(見表I)表I.枸杞多糖對PTSD大鼠曠場實驗的影響
權(quán)利要求
1.枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用，其特征是將提取的純度>50%的枸杞多糖裝入膠囊或制成片劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用，其特征是將提取的枸杞多糖，裝入膠囊，每粒含枸杞多糖500 mg,或制成片劑，每片含枸杞多糖500mg。
3.枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用，其特征是將提取的純度>50%的枸杞多糖與玉米淀粉混合均勻，裝入膠囊或制成片劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用，其特征是每粒膠囊含枸杞多糖500啤、含玉米淀粉IOOmg ;或者每片含枸杞多糖500啤、玉米淀粉IOOmg0
全文摘要
本發(fā)明公開枸杞多糖在制備防治慢性應激的藥物中的應用，其特征是將提取的純度≥50％的枸杞多糖裝入膠囊或制成片劑。每粒含枸杞多糖500㎎，或制成片劑，每片含枸杞多糖500㎎。將提取的純度≥50％的枸杞多糖與玉米淀粉混合均以，裝入膠囊或制成片劑。每粒膠囊含枸杞多糖500㎎、含玉米淀粉100mg；或者每片含枸杞多糖500㎎、玉米淀粉100mg。本發(fā)明的有益效果藥物由枸杞多糖組成的單方制劑，具有抗應激作用，能夠于預防和治療慢性應激障礙，改善認知的功能，藥效明確，安全性高，為臨床提供了一種新的用藥選擇。
文檔編號A61K31/715GK102813670SQ20121034935
公開日2012年12月12日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者高潔, 楊策, 劉良明, 伍亞民 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院