利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑果枸杞多糖的復(fù)合酶微波提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑果構(gòu)杞多糖的復(fù)合酶 微波提取方法。
【背景技術(shù)】
[000引 黑果構(gòu)杞化Murr.)藏藥稱為"旁瑪"，為茄科（Solanceae)、茄 族（SolanceaeReihb)、構(gòu)杞亞族（Lyciinaewettst)構(gòu)杞屬（Zj心fufflL.)。多年生灌木， 具棘刺，漿果球形，成熟后為紫黑色，有很高的光合效率和較強(qiáng)抗逆性，是我國西北特有的 抗鹽抗旱野生植物種，主要分布于青海、西藏、新疆等地。黑果構(gòu)杞味甜多汁，含豐富的維生 素、有機(jī)酸及糖類，民間常生食或棒汁做飲料；黑果構(gòu)杞也具有一定的醫(yī)療保健功能，其味 甘、性平、清屯、熱，藏醫(yī)用于治療屯、熱病、屯、臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥，并且藥效顯著，被 收載于《四部醫(yī)典》、《晶珠本草》等藏醫(yī)藥經(jīng)典著作中；《維吾爾藥志》記載，維吾爾族醫(yī)生 常用黑果構(gòu)杞果實(shí)及根皮治療尿道結(jié)石、月經(jīng)不調(diào)、癖巧、齒銀出血等病癥；民間用作滋補(bǔ) 強(qiáng)壯、明目及降壓藥。研究表明，黑果構(gòu)杞多糖具有良好的抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力及降血糖的 功能。
[0003] 目前，運(yùn)用于黑果構(gòu)杞多糖的提取方法大致可分為；熱水浸提法、超聲法、微波法、 超聲-微波協(xié)同萃取法等4類。但無論哪種方法，都是W破壞多糖和蛋白質(zhì)的結(jié)合，通過溶 媒加W分離為基本原理，并在該一前提下，盡量保證多糖不被過多水解，再經(jīng)過適當(dāng)干燥處 理，獲得粗多糖。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，所得黑果構(gòu)杞多糖含量大多集中在10%左右。目前，黑果構(gòu) 杞果實(shí)多糖最佳提取工藝為：提取溫度90 °C，提取時(shí)間為60min,提取3次。在上述條 件下，3次提取多糖得率分別為；3. 34%，3. 72%，3. 95%，平均得率為3. 67 + 0. 31%，黑果構(gòu)杞 果實(shí)粗多糖含量為46. 62% (江建紅等，2009)。
[0004] 中國專利CN103333268公開了一種黑果構(gòu)杞多糖的制備方法。該方法在制備過程 中采用超微粉碎技術(shù)，將已提取過色素的黑果構(gòu)杞殘?jiān)M(jìn)行粉碎，然后進(jìn)行脫脂處理得到 脫脂黑果構(gòu)杞粉末，脫脂粉末先經(jīng)過酶解處理，再采用低溫凍融技術(shù)，反復(fù)凍融，最后經(jīng)過 濾、醇沉、脫蛋白處理、凍干等工序得到抗氧化活性黑果構(gòu)杞多糖成品。該方法與傳統(tǒng)提取 方法相比，具有收率高、活性強(qiáng)、成本低的優(yōu)點(diǎn)。但提取過程中凍融技術(shù)需要用到超低溫冰 箱，而且凍融過程耗時(shí)長，所W并不適合工業(yè)化生產(chǎn)。此外，脫蛋白處理所設(shè)及的Sevag由 氯仿和正了醇按照體積比4:1組成，處理不當(dāng)很容易造成有害溶劑殘留，產(chǎn)生健康安全隱 患。
[0005] 因此，為了合理和高效利用黑果構(gòu)杞資源，亟需提供一種操作簡單、提取率高、安 全的從黑果構(gòu)杞果實(shí)中制備活性多糖的方法。有關(guān)復(fù)合酶-微波輔助提取黑果構(gòu)杞抗衰老 活性多糖的專利未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、提取率高的利用響應(yīng)曲面法優(yōu) 化黑果構(gòu)杞多糖的復(fù)合酶微波提取方法。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑果構(gòu)杞多糖的復(fù)合酶微波 提取方法，包括W下步驟： 山樣品制備： 將黑果構(gòu)杞果實(shí)洗凈，在25~30°C溫度下烘干48~7化后粉碎至40~80目，按20~40血/g料液比加入體積濃度為80%的己醇溶液，在25°C ~35°C浸泡2~化后過濾，得到濾渣，該濾 渣于40~60°C下干燥12~2化，即得脫除脂類、色素和小分子糖的黑果構(gòu)杞果粉；然后在微波 反應(yīng)器中，按15~25血/g不同的料液比加入復(fù)合酶溶液，40~50°C靜置浸泡1. 5~2.化的不 同時(shí)間，在300~400W的不同微波功率下按20~30min的不同時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)提取，提取后的溶 液分別W 4000~5000轉(zhuǎn)/min進(jìn)行離屯、，15~20min后收集上清液A，該上清液A經(jīng)50~60°C 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/6~1/8后，得到濃縮產(chǎn)物；所述濃縮產(chǎn)物中加入其體積3~4 倍的無水己醇溶液混勻，當(dāng)其溶液中己醇濃度為80%時(shí)，于2~6°C下靜置12~2化，再分別W 4000~5000轉(zhuǎn)/min進(jìn)行離屯、，15~20min后收集沉淀；沉淀加水復(fù)溶后，W 4000~5000轉(zhuǎn)/min 進(jìn)行離屯、，15~20min后收集上清液B，該上清液B于-70°C ~ -85°C預(yù)凍4~6h，最后在大氣 壓力為10~100化、溫度為-55°C ~ -70°C的條件下冷凍干燥24~72h，得到對應(yīng)于不同微波功 率的黑果構(gòu)杞多糖提取物干燥粉末； 所述復(fù)合酶溶液是指蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等質(zhì)量混合后加去離子水配制而成的 抑為4~5的溶液； 口)用苯酪-硫酸法測定每個(gè)提取液中多糖含量： ① 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作： 準(zhǔn)確稱取10mg葡萄糖，配制成濃度為0.1mg/mL的溶液，分別取0血、0.1血、0.2血、 0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0.6mU依次補(bǔ)加蒸饋水至1mL;W蒸饋水作對照，分別向其中加 入0.5血6%的苯酪，振蕩搖勻，垂直快速加入2.5血濃H2SO4,振蕩搖勻后，靜止30min, 冷卻至室溫，然后在490nm波長下測吸光值，W糖溶液濃度yg/mL為橫坐標(biāo)，吸光值為縱 坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； ② 樣品中多糖含量的測定： 將樣品配置成60 y g/mL的溶液，取樣品1mU不加蒸饋水，其余操作均與所述步驟① 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同；在490 nm波長下比色，所得數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的總糖含量； 樹實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析： ① 單因素試驗(yàn)： 依次改變微波功率、提取時(shí)間、浸泡時(shí)間、料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，用苯酪-硫酸法 測定所得的黑果構(gòu)杞多糖提取物中多糖的含量，并按下式計(jì)算多糖產(chǎn)率，每次處理重復(fù)= 次： 多糖產(chǎn)率（％)=[(多糖含量X提取物重量）/果粉重量]X 100%; ② 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)： 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取多糖提取效果影響較顯著的微波功率、提取時(shí)間、浸泡時(shí) 間、料液比該4個(gè)因素，利用Desi即Expert8. 0軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)，W微波功率Xi、提取時(shí)間X2、浸泡時(shí)間X3和料液比X4為自變量，W多糖的產(chǎn)率為響應(yīng) 值y，建立多元二次回歸方程： y=-17. 47108+0. 12776Xi+0. 45350X2-1.29400X3-0. 14273X4-0.OOO8OX1X2+ 0.00320X1X3+0. 00029XA-0.00200X2X3+0.00120X2X4+0.OI8OOOX3X廣 1. 60067X1〇-3Xi2-2. 45667X1〇-3乂22+ 4. 33333XlO-sXs'-l. 06667X (4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與優(yōu)化： 利用Design Expert 8.0軟件根據(jù)多元二次回歸方程進(jìn)行繪圖分析，得到回歸方程的 響應(yīng)面及其等高線圖。
[000引本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明不僅利用復(fù)合酶酶解技術(shù)破壞植物細(xì)胞壁促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性多糖成分的充分 溶出、水解果實(shí)中蛋白質(zhì)成分提高多糖含量、避免氯仿等有害溶劑造成的安全隱患，而且利 用低功率微波穿透式內(nèi)外加熱，在降低活性多糖結(jié)構(gòu)破壞風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)促進(jìn)多糖溶出、節(jié)省 提取時(shí)間。
[0009] 2、與正交法相比，本發(fā)明采用Box-Behnken Desi即S炬抓）中屯、組合設(shè)計(jì)模型的 響應(yīng)面分析法，用4個(gè)變化因子、3個(gè)水平及少量的實(shí)驗(yàn)組(僅29組實(shí)驗(yàn)）就可W得出優(yōu)化 結(jié)果，獲得最佳產(chǎn)率，在提高了提取效率的同時(shí)降低了能耗和污染物排放，具有工業(yè)化生產(chǎn) 的實(shí)際意義；并且所得的最佳提取條件不是設(shè)定的值，而是在設(shè)定條件的范圍之內(nèi)。
[0010] 3、本發(fā)明獲得的黑果構(gòu)杞多糖最終產(chǎn)品為棟色粉末，易溶于水，經(jīng)測試其糖含量 為609(^66%，糖醒酸含量為2. 8°/cK3. 4%，不含蛋白質(zhì)，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醒酸、 半乳糖組成，不僅能夠有效阻止自由基的產(chǎn)生，而且能夠顯著清除已產(chǎn)生的自由基。
[0011] (1)糖醒酸含量檢測采用間哲基聯(lián)苯法，具體如下： ①標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別量取0. 1g/LD-GalA標(biāo)準(zhǔn)溶液0uL、50yUlOOyL、200yL、300yL、400uL轉(zhuǎn)于玻璃試管（1.8X18cm)中，加蒸饋水補(bǔ)至400uL，每個(gè)濃度 重復(fù)=個(gè)樣品。向每支試管中加入氨基橫酸試劑40 搖勻，再向各管加入濃硫酸2. 5 111以振蕩均勻，沸水浴煮沸20min。冷卻至室溫后，向各管中加入間哲基聯(lián)苯試劑40UL， 搖勻，室溫放置15min。在A525皿處測定吸光度A。W吸收度A為縱坐標(biāo)，D-半乳糖醒 含量（yg)為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012] ②樣品中糖醒酸含量測定；取濃度0.1g/L左右的樣品溶液400uL，按標(biāo)準(zhǔn)曲 線制備方法之操作，測定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計(jì)算其中的糖醒酸含量。重復(fù)3 次，結(jié)果取平均數(shù)。
[0013] 口)蛋白質(zhì)含量檢測采用考馬斯亮藍(lán)法，具體如下； ①考馬斯亮藍(lán)試劑的配置： 稱取10mg考馬斯亮藍(lán)G-250,溶解于5血的95%己醇中，加入10血的85%磯酸，用 蒸饋水定容至100 111以過濾備用。最終試劑中考馬斯亮藍(lán)的濃度為0.01% (w/v)，己醇濃度 為 4. 7% (w/v)。
[0014] ②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 分別取50yg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0血、0.2血、0.4血、0.6血、0.8血、1.0血，加蒸 饋水補(bǔ)至1.0mU分別向每支試管中加入考馬斯亮藍(lán)試劑4mU迅速振蕩混勻，靜置5min 后在595皿處測定光吸收值A(chǔ)595皿。W吸收度A595皿為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白質(zhì)量C (yg)為橫坐標(biāo)，制