專利名稱：一種納米佐劑及含有該納米佐劑的流感病毒疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米佐劑及流感病毒疫苗，具體涉及一種納米佐劑及含有該納米佐劑的流感病毒疫苗及制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流行性感冒感傳染性極強(qiáng)(主要通過(guò)飛沫或人與人密切接觸傳播)，而且流行、變異極快，同時(shí)極易引起多種并發(fā)癥，而導(dǎo)致死亡。流感分為季節(jié)性流感和大流行流感，季節(jié)性流感多發(fā)于冬季，由于季節(jié)性流感病毒大多存在于人群中，對(duì)人體免疫系統(tǒng)而言，其危害 性相對(duì)較小。但當(dāng)流感病毒突變或者跨越物種而從其他動(dòng)物感染給人類，則容易造成大流行流感。目前防止流感最有效的手段就是接種流感疫苗。但面對(duì)大流行的暴發(fā)，要在短時(shí)間內(nèi)提供足夠多的疫苗免疫易感人群，目前尚無(wú)法做到。佐劑屬于抗原輔助劑，能夠與疫苗共同使用而明顯提高疫苗的免疫效果。由于流感疫苗的生產(chǎn)在時(shí)間上屬于后延性，一旦大流行流感暴發(fā)，難于在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)出急需的疫苗量。但當(dāng)輔以較好的佐劑時(shí)，則可在增強(qiáng)流感疫苗免疫效果的同時(shí)，有效減少流感疫苗的用量，讓更多的易感人群能夠接種疫苗，以應(yīng)對(duì)大流行流感的暴發(fā)。就常規(guī)的疫苗佐劑而言，目前已經(jīng)應(yīng)用于流感疫苗的佐劑有鋁佐劑、MF59、LTK63等。鋁佐劑可以增強(qiáng)初次免疫，減少每次免疫抗原的用量以及免疫次數(shù)，但是對(duì)于嗣后加強(qiáng)免疫效果較小，且可能發(fā)生多種不良反應(yīng)。其余的MF59、LTK63，雖不良反應(yīng)較少，但對(duì)疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用不明顯。目前將粒徑小于IOOnm的乳劑稱為納米乳劑，它由油相-水相-乳化劑-助乳化劑組成，連續(xù)相為水相、分散相為油相的納米乳劑為0/W型，連續(xù)相為油相、分散相為水相的納米乳劑為W/0型。納米乳劑具有粒徑小且均勻，易于制備，穩(wěn)定性、流動(dòng)性均較好，易于注射等特點(diǎn)，可作為藥物載體應(yīng)用于多種吸收方式的藥物制劑中。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有疫苗佐劑，尤其是流感疫苗鋁佐劑存在的不良反應(yīng)，MF59、LTK63等佐劑對(duì)疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用不明顯等不足，本發(fā)明提供一種納米佐劑，還提供含有該納米佐劑的流感病毒疫苗及制備方法，可以極大增強(qiáng)疫苗免疫效果，降低不良反應(yīng)，減少每劑流感疫苗的使用量，滿足大流行流感暴發(fā)期的用量。本發(fā)明提供的是這樣一種納米佐劑，由下列質(zhì)量比的組分組成
油相10 50%
乳化劑20 50%
助乳化劑20 50%。所述油相為市購(gòu)的棉子油或注射用無(wú)水羊毛脂。
所述乳化劑為市購(gòu)的豆磷脂或卵磷脂。所述助乳化劑為市購(gòu)的海藻酸鈉或單硬脂酸甘油酯。本發(fā)明提供的納米佐劑經(jīng)過(guò)下列方法制備
A、按下列質(zhì)量比備料
油相10 50%
乳化劑20 50%
助乳化劑20 50% ；
B、將步驟A的乳化劑、助乳化劑和油相混合后，在20 60°C溫度下，按50-500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，攪拌均勻，得納米佐劑。 本發(fā)明提供的是這樣一種含有納米佐劑的流感病毒疫苗，由下列質(zhì)量比的組分組成:血凝素含量為15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗10 30%
油相10 50%·
乳化劑20 50%
助乳化劑20 50%。所述稀釋流感病毒疫苗為將流感病毒疫苗原液或半成品或成品的用注射用水稀釋到血凝素含量為15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗。所述流感病毒疫苗原液是用世界衛(wèi)生組織(WHO)提供的毒種所制備的公知公用產(chǎn)品。本發(fā)明提供的含有納米佐劑的流感病毒疫苗，經(jīng)過(guò)下列步驟制備
A、按下列質(zhì)量比備料
血凝素含量為15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗10 30%
油相10 50%
乳化劑20 50%
助乳化劑20 50% ；
B、將步驟A的乳化劑、助乳化劑和油相混合后，在20 60°C溫度下，按50-500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，攪拌均勻，得納米佐劑；
C、用注射用水稀釋步驟A的流感病毒疫苗至血凝素達(dá)15 180μ g/株.ml，得稀釋流感病毒疫苗；
D、將步驟C所得的稀釋流感病毒疫苗緩慢滴入步驟B所得納米佐劑中，同時(shí)按50-500轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌混合，直至得到均勻分散的透明的含有納米佐劑的流感病毒疫苗。制得的含有納米佐劑的流感病毒疫苗經(jīng)檢測(cè)，結(jié)果如下1.經(jīng)馬爾文粒徑檢測(cè)儀檢測(cè)，粒徑為10 IOOnm,合格；2.經(jīng)1500_8000rpm，15min離心，不分層，合格；3.經(jīng)4°C 60°C放置7 60天，無(wú)變化，合格。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果采用上述方案，即可獲得含有納米佐劑的流感病毒疫苗，其中的納米佐劑具有毒性小，性質(zhì)溫和，增溶藥物效果明顯，流動(dòng)性良好，對(duì)機(jī)體刺激性極小等優(yōu)點(diǎn)，極大增強(qiáng)了流感病毒疫苗的免疫效果，本發(fā)明提供的含納米佐劑的流感病毒疫苗，與無(wú)佐劑的流感病毒疫苗相比，具有給藥量小、生物利用度高的優(yōu)點(diǎn)；與含其他佐劑的流感疫苗相比，具有極大的增強(qiáng)疫苗生物利用度、減小刺激性、降低不良反應(yīng)、延長(zhǎng)疫苗釋放時(shí)間，以及增強(qiáng)疫苗靶向性，降低損耗率等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)系統(tǒng)查閱文獻(xiàn)和專利，目前未發(fā)現(xiàn)關(guān)于納米乳劑為佐劑的流感病毒疫苗的報(bào)道。


圖I為不同接種組在8周內(nèi)血凝抑制效價(jià)的變化。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明包括但不僅限于以下實(shí)施例。本發(fā)明實(shí)施例所用的流感病毒疫苗原液為公知公用產(chǎn)品，并且是按照《中國(guó)藥典》三部2010版中所述流感病毒裂解疫苗制造方法制備的，依據(jù)《中國(guó)藥典》三部2010版所述各項(xiàng)檢定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格的流感病毒疫苗原液。實(shí)施例I
A、用注射用水稀釋流感病毒疫苗原液至血凝素濃度為30μ g/(株.ml)， 得稀釋流感病
毒疫苗；
B、按下列質(zhì)量比備料稀釋流感病毒疫苗10g，棉子油50g，海藻酸鈉20g，豆磷脂
20g；
C、向混合攪拌瓶?jī)?nèi)加入20g豆磷脂，20g海藻酸鈉，60°C溫度下持續(xù)攪拌，轉(zhuǎn)速維持在50轉(zhuǎn)/分鐘,之后加入50g棉子油,得混合溶液；
D、在上述混合溶液中緩慢滴入步驟A的稀釋流感病毒疫苗10g，同時(shí)維持轉(zhuǎn)速在50轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌至液體為透明，得到含有納米佐劑的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗進(jìn)行如下檢測(cè)1.經(jīng)馬爾文粒徑檢測(cè)儀檢測(cè),粒徑范圍為
28.596 42. 218nm,合格；2.經(jīng)1500rpm, 15min離心分離，納米乳劑體系不分層，合格；3.經(jīng)4°C放置60天，納米乳劑體系無(wú)變化，合格。實(shí)施例2
A、用注射用水稀釋流感病毒疫苗原液至血凝素濃度為15μ g/(株.ml)，得稀釋流感病
毒疫苗；
B、按下列質(zhì)量比備料30g稀釋流感病毒疫苗，30g注射用無(wú)水羊毛脂，20g單硬脂酸甘油酯，20g豆磷脂；
C、向混合攪拌瓶?jī)?nèi)加入20g豆磷脂和20g單硬脂酸甘油酯，20°C溫度下持續(xù)攪拌，轉(zhuǎn)速維持在500轉(zhuǎn)/分鐘，之后加入30g注射用無(wú)水羊毛脂，得混合物；
D、在上述混合物中緩慢滴入稀釋的流感病毒疫苗30g，同時(shí)維持轉(zhuǎn)速在500轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌至液體為透明，得到含有納米佐劑的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗進(jìn)行如下檢測(cè)1.經(jīng)馬爾文粒徑檢測(cè)儀檢測(cè),粒徑范圍為
29.972 36. 633nm,合格；2.經(jīng)3000rpm, 15min離心分離，納米乳劑體系不分層，合格；3.經(jīng)20°C放置30天，納米乳劑體系無(wú)變化，合格。實(shí)施例3
A、用注射用水稀釋流感病毒疫苗原液至血凝素濃度為50μ g/ (株.ml);
B、按下列質(zhì)量比備料20g稀釋流感病毒疫苗，20g注射用無(wú)水羊毛脂，40g單硬脂酸甘油酯，20g豆磷脂；
C、向混合攪拌瓶?jī)?nèi)加入20g豆磷脂，40g單硬脂酸甘油酯，40°C溫度下持續(xù)攪拌，轉(zhuǎn)速維持在200轉(zhuǎn)/分鐘，之后加入20g注射用無(wú)水羊毛脂，得混合物；
D、在上述混合物中緩慢滴入稀釋的流感病毒疫苗20g，同時(shí)維持轉(zhuǎn)速在200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌至液體為透明，得到含有納米佐劑的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗進(jìn)行如下檢測(cè)1.經(jīng)馬爾文粒徑檢測(cè)儀檢測(cè),粒徑范圍為.28. 064 34. 548nm,合格；2.經(jīng)4000rpm, 15min離心分離，納米乳劑體系不分層，合格；.3.經(jīng)26°C放置50天，納米乳劑體系無(wú)變化，合格。實(shí)施例4
A、用注射用水稀釋流感病毒疫苗原液至血凝素濃度為180 μ g/(株.ml)
B、按下列質(zhì)量比備料IOg稀釋流感病毒疫苗，IOg棉子油，30g單硬脂酸甘油酯，.50g卵磷脂；
C、向混合攪拌瓶?jī)?nèi)加入50g卵磷脂，30g單硬脂酸甘油酯，30°C溫度下持續(xù)攪拌，轉(zhuǎn)速維持在300轉(zhuǎn)/分鐘，之后加入IOg棉子油，得混合物；
D、在上述混合物中緩慢滴入稀釋的流感病毒疫苗10g，同時(shí)維持轉(zhuǎn)速在300轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌至液體為透明，得到含有納米佐劑的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗進(jìn)行如下檢測(cè)1.經(jīng)馬爾文粒徑檢測(cè)儀檢測(cè),粒 徑范圍為26. 258 38. 162nm，合格；2.經(jīng)6000rpm，15min離心分離，納 米乳劑體系不分層，合格；3.經(jīng)30°C放置20天，納米乳劑體系無(wú)變化，合格。實(shí)施例5
A、用注射用水稀釋流感病毒疫苗原液至血凝素濃度為120 μ g/(株.ml)；
B、按下列質(zhì)量比備料15g稀釋流感病毒疫苗，IOg注射用無(wú)水羊毛脂，海藻酸鈉.50g,卵磷脂25g ；
C、向混合攪拌瓶?jī)?nèi)加入25g卵磷脂，50g海藻酸鈉，50°C溫度下持續(xù)攪拌，轉(zhuǎn)速維持在.100轉(zhuǎn)/分鐘，之后加入IOg注射用無(wú)水羊毛脂，得混合物；
D、在上述混合物中緩慢滴入稀釋的流感病毒疫苗15g，同時(shí)維持轉(zhuǎn)速在80轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌至液體為透明，得到含有納米佐劑的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗進(jìn)行如下檢測(cè)1.經(jīng)馬爾文粒徑檢測(cè)儀檢測(cè),粒徑范圍為.28. 972 37. 925nm,合格；2.經(jīng)8000rpm, 15min離心分離，納米乳劑體系不分層，合格；.3.經(jīng)60°C放置7天，納米乳劑體系無(wú)變化，合格。免疫效果試驗(yàn)
用實(shí)施例I提供的含有納米佐劑的流感病毒疫苗注射小鼠。小鼠為標(biāo)準(zhǔn)體重昆明種雄性小鼠，每只注射血凝素含量相當(dāng)于按照體重?fù)Q算的成人劑量的10倍的含有納米佐劑的流感病毒疫苗。Od接種一針，21d補(bǔ)種一針，每隔7d采尾血分離血清測(cè)定血凝抑制效價(jià)。同時(shí)設(shè)立注射等量生理鹽水的空白對(duì)照組、等血凝素含量的Al (OH)3佐劑流感疫苗的佐劑對(duì)照組、等血凝素含量的流感疫苗對(duì)照組。圖I為等量生理鹽水空白對(duì)照組、等血凝素含量的流感疫苗單獨(dú)注射組、等血凝素含量的Al (OH) 3佐劑流感疫苗組、等血凝素含量的含有納米佐劑的流感病毒疫苗組，其四個(gè)組注射昆明種小鼠，每隔7天采尾血，分離血清測(cè)定血凝抑制效價(jià)的比較圖。其中未經(jīng)疫苗注射的空白對(duì)照組小鼠血
清血凝抑制效價(jià)均為O ;其余三組疫苗接種8周內(nèi)的血凝抑制效價(jià)見(jiàn)表I。表I不同接種組在8周內(nèi)的血凝抑制效價(jià)變化
權(quán)利要求
1.一種納米佐劑，由下列質(zhì)量比的組分組成油相10 50%乳化劑20 50%助乳化劑20 50% ； 其中，所述油相為市購(gòu)的棉子油或注射用無(wú)水羊毛脂；所述乳化劑為市購(gòu)的豆磷脂或卵磷脂；所述助乳化劑為市購(gòu)的海藻酸鈉或單硬脂酸甘油酯。
2.如權(quán)利要求I所述的納米佐劑，其特征在于經(jīng)過(guò)下列方法制備 A、按下列質(zhì)量比備料油相10 50%乳化劑20 50%助乳化劑20 50% ； B、將步驟A的乳化劑、助乳化劑和油相混合后，在20 60°C溫度下，按50-500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，攪拌均勻，得納米佐劑。
3 一種含有如權(quán)利要求I所述納米佐劑的流感病毒疫苗，其特征在于由下列質(zhì)量比的組分組成 血凝素含量為15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗10 30%油相10 50%乳化劑20 50%助乳化劑20 50%。
4.如權(quán)利要求3所述含有納米佐劑的流感病毒疫苗，其特征在于所述稀釋流感病毒疫苗為將流感病毒疫苗原液或半成品或成品的用注射用水稀釋到血凝素含量為15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗。
5.如權(quán)利要求3所述含有納米佐劑的流感病毒疫苗，其特征在于經(jīng)過(guò)下列步驟制備 A、按下列質(zhì)量比備料 血凝素含量為15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗10 30%油相10 50%乳化劑20 50%助乳化劑20 50% ； B、將步驟A的乳化劑、助乳化劑和油相混合后，在20 60°C溫度下，按50-500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，攪拌均勻，得納米佐劑； C、用注射用水稀釋步驟A的流感病毒疫苗至血凝素達(dá)15 180μ g/株.ml，得稀釋流感病毒疫苗； D、將步驟C所得的稀釋流感病毒疫苗緩慢滴入步驟B所得納米佐劑中，同時(shí)按50-500轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌混合，直至得到均勻分散的透明的含有納米佐劑的流感病毒疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供一種納米佐劑及含有該納米佐劑的流感病毒疫苗及制備方法，含有納米佐劑的流感病毒疫苗由下列質(zhì)量比的組分組成血凝素含量為15～180μg/株.ml的流感病毒疫苗10～30%，油相10～50%，乳化劑20～50%，助乳化劑20～50%。其中的納米佐劑具有毒性小，性質(zhì)溫和，增溶藥物效果明顯，流動(dòng)性良好，對(duì)機(jī)體刺激性極小等優(yōu)點(diǎn)，極大增強(qiáng)了流感病毒疫苗的免疫效果，本發(fā)明提供的含納米佐劑的流感病毒疫苗，與無(wú)佐劑的流感病毒疫苗相比，具有給藥量小、生物利用度高的優(yōu)點(diǎn)；與含其他佐劑的流感疫苗相比，具有極大的增強(qiáng)疫苗生物利用度、減小刺激性、降低不良反應(yīng)、延長(zhǎng)疫苗釋放時(shí)間，以及增強(qiáng)疫苗靶向性，降低損耗率等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/39GK102886044SQ201210403729
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者李映波, 孫笠雯 申請(qǐng)人:李映波