專利名稱：抗口蹄疫疫苗組合物及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體涉及抗口蹄疫病毒、特別是抗O型口蹄疫病毒的重組疫苗組合物及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是動(dòng)物A類傳染病之首,是當(dāng)今世界上嚴(yán)重危害豬、牛、羊等偶蹄類動(dòng)物的烈性傳染病。近年來，口蹄疫的爆發(fā)和流行，給很多國(guó)家的畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前已知口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)有7種血清型(歐洲型A、O和C ;非洲型SATl、SAT2和SAT3 ；以及亞洲I型)以及多種亞型(例如見Kleidet al.，1981，Science 214:1125-1129)，其中傳播最為廣泛的是O型 FMDV。FMDV 是細(xì)小 RNA病毒科(Picornaviridae) 口蹄病毒屬(Aphthovirusgenus)的成員，由三種外殼病毒蛋白(包括VP1、VP2、和VP3)的60個(gè)拷貝包繞一條單鏈正義RNAΓ8.5kb)所構(gòu)成。研究表明，在O型FMDV中，這三種病毒蛋白中的VPl與病毒的感染能力最相關(guān)。在VPl蛋白中存在兩個(gè)免疫原性區(qū)域，即第141-160位和第200-213位氨基酸殘基部分。它們分別位于兩個(gè)突出的、無序的、高彈性的環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。第145-147位區(qū)域的環(huán)狀結(jié)構(gòu)包含一個(gè)保守的三體結(jié)構(gòu)Arg-Gly-Asp (RGD區(qū))，參與細(xì)胞表面受體附著(BelshamGJ and Martinez-Salas E，Genome organization, translation andreplication offoot-and-mouth disease virus RNA`，p.19—52，2004，F(xiàn)oot andMouth Disease CurrentPerspectives, Edited by: Sobrino F and Domingo E) 3D 蛋白是 FMDV 中的 RNA-依賴性的RNA聚合酶，擁有被豬T細(xì)胞所識(shí)別的抗原性表位(Belsham GJ and Martinez-Salas E，Genome organization, translation and replication of foot-and-mouth disease virusRNAj p.19—52，2004，F(xiàn)oot and Mouth Disease Current Perspectives, Edited by:SobrinoF andDomingo E)。預(yù)防接種應(yīng)能控制FMDV的傳播?，F(xiàn)有的抗口蹄疫疫苗使用滅活的病毒為疫苗，實(shí)踐證實(shí)，此種疫苗可通過病毒RNA的體內(nèi)重組而引起疾病的傳播(Brown，F(xiàn).An overviewof the inactivation of FMDV and the implicationswhen residual virus is presentin vaccines.Dev Biol Stand 1991;75:37-41)。同時(shí)，此種疫苗使用化學(xué)滅活劑進(jìn)行病毒的滅活，在運(yùn)輸過程中需要低溫冷鏈運(yùn)輸和冰箱保存。在一些發(fā)展中國(guó)家的農(nóng)村沒有冰箱，因此，疫苗在注射時(shí)可能已經(jīng)失去了大部分效力。而生產(chǎn)過程中FMDV活病毒泄露的可能性，使得這種疫苗的生產(chǎn)成為環(huán)境不安全因素。而本發(fā)明的FMDV表位特異性疫苗可以誘導(dǎo)接種疫苗的動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)FMDV的抗體反應(yīng)，其使用和生產(chǎn)都非常安全，易于處理、儲(chǔ)存和運(yùn)輸。同時(shí)，這種疫苗還可以設(shè)計(jì)滿足特殊的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供安全有效的針對(duì)FMDV、特別是O型FMDV的重組疫苗及其制備方法和應(yīng)用。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗FMDV的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其包含重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)從N端到C端包括:-FMDV外殼蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)；-免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其功能性片段；和-FMDV的3D蛋白或其免疫原性片段。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗FMDV的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其包含:(i)重組蛋白質(zhì) ，所述重組蛋白質(zhì)從N端到C端包括:-FMDV外殼蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)；和-免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其功能性片段；以及(ii)FMDV的3D蛋白或其免疫原性片段。在本發(fā)明的疫苗組合物的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述重組蛋白質(zhì)包括所述抗原性表位的2至5次串聯(lián)重復(fù)，更優(yōu)選地，所述重組蛋白質(zhì)包括所述抗原性表位的3次串聯(lián)重復(fù)。在本發(fā)明的疫苗組合物的一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原性表位彼此通過肽接頭相連接和/或所述抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)通過肽接頭與所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列相連接。優(yōu)選地，所述肽接頭為SEQ ID NO: 11和SEQ IDNO: 12 在本發(fā)明的疫苗組合物的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述FMDV是O型FMDV，且所述抗原性表位是來自O(shè)型FMDV外殼蛋白的抗原性表位。更優(yōu)選地，所述抗原性表位是來自O(shè)型FMDV VPl蛋白的抗原性表位。例如，所述來自O(shè)型FMDV VPl蛋白的抗原性表位可包含選自 SEQ ID NO: 9 (VPl 的第 141-160 位氨基酸)和 SEQ ID NO: 10 (VPl 的第 200-213 位氨基酸)的氨基酸序列或由上述氨基酸組成。在本發(fā)明的上述疫苗組合物的一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述串聯(lián)重復(fù)是兩種來自O(shè)型FMDV VPl蛋白的抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)，所述兩種VPl蛋白抗原性表位分別包含SEQ ID N0:9或SEQ IDNO: 10的氨基酸序列或分別由上述氨基酸組成。本發(fā)明的疫苗組合物可施用于豬、牛、或羊等偶蹄類動(dòng)物，以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗FMDV感染的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述重組蛋白質(zhì)中的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)來自與接受疫苗接種的動(dòng)物相同的物種。本發(fā)明的疫苗組合物還可包含藥用可接受的載體和/或佐劑。 本發(fā)明也包括如上所述的重組蛋白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的疫苗組合物中的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供制備用于本發(fā)明的抗FMDV疫苗的重組蛋白質(zhì)的方法，其包括如下步驟:-獲得編碼所述重組蛋白質(zhì)的多核苷酸；
-構(gòu)建含有所述多核苷酸的表達(dá)載體；-將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；和-在適合所述重組蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，收集并純化所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明還涉及預(yù)防動(dòng)物的FMDV感染的方法，其包括給有此需要的動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的疫苗組合物。


圖1:本發(fā)明的抗FMDV疫苗的構(gòu)建示意圖。A:實(shí)施例中制備的疫苗組合物A，其中O型FMDV VPl蛋白的抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)片段、動(dòng)物免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)和FMDV的3D蛋白連接為一個(gè)重組蛋白(由“3R-1G⑶”編碼)。B:實(shí)施例中制備的疫苗組合物B，其中O型FMDV VPl蛋白的抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)片段和動(dòng)物免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)連接為一個(gè)重組蛋白(由3R-1GC編碼)，而FMDV的3D蛋白為單獨(dú)的成分。圖2:考馬斯藍(lán)染色本發(fā)明的疫苗組合物A中的重組蛋白質(zhì)(由“3R-1G⑶”編碼)，M:蛋白分子量標(biāo)記；泳道1:總蛋白；泳道2:可溶性蛋白；泳道3:包涵體(溶于6M尿素)；泳道4:包涵體(溶于8M尿素)。圖3:使用抗FMDV血清以免疫印跡法檢測(cè)本發(fā)明的疫苗組合物A中的重組蛋白質(zhì)(由“3R-1G⑶”編碼)，M:蛋白分子量標(biāo)記；泳道1:總蛋白；泳道2:可溶性蛋白；泳道3:包涵體(溶于6M尿素)；泳道4:包涵體(溶于8M尿素)。圖4:考馬斯藍(lán)染色和免疫印跡法檢測(cè)本發(fā)明的疫苗組合物B中的重組蛋白質(zhì)(由“3R-1GC”編碼)。A:來自表達(dá)由3R-LGC片段編碼的重組蛋白質(zhì)的細(xì)菌(經(jīng)IPTG誘導(dǎo)前后)的總蛋白裂解物經(jīng)考馬斯藍(lán)染色:以來自豬的抗FMDV血清對(duì)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的總蛋白裂解物中的重組蛋白質(zhì)(由3R-1GC片段編碼)進(jìn)行免疫印跡法檢測(cè)。圖5:考馬斯藍(lán)染色和免疫印跡法檢測(cè)本發(fā)明的疫苗組合物B中的3D蛋白質(zhì)成分。序列說明SEQ ID NO:1:實(shí)施例中使用的編碼串聯(lián)重復(fù)排列的FMDV VPl蛋白抗原性表位的DNA序列；SEQ ID NO:2:實(shí)施例中使用的串聯(lián)重復(fù)排列的FMDV VPl蛋白抗原性表位的氨基酸序列；SEQ ID NO: 3:實(shí)施例中使用的編碼豬免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的DNA序列；SEQ ID NO:4:實(shí)施例中使用的豬免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列；SEQ ID NO: 5:實(shí)施例中使用的編碼FMDV 3D蛋白的DNA序列；SEQ ID NO:6:實(shí)施例中使用的FMDV 3D蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO: 7:實(shí)施例中使用的編碼本發(fā)明重組蛋白的DNA序列(“3R-1G⑶”)；SEQ ID NO:8:實(shí)施例中使用的由“3R-1GCD”編碼的重組蛋白的氨基酸序列；SEQ ID N0:9:0型FMDV VPl蛋白的第141-160位氨基酸序列；SEQ ID NO: 10:0型FMDV VPl蛋白的第200-213位氨基酸序列；SEQ ID NO: 11:可用于本發(fā)明的肽接頭GGSSGG ；
SEQ ID NO: 12:可用于本發(fā)明的肽接頭GGGSGGGGS ；SEQ ID NO:1 3:實(shí)施例中使用的由“3R-1GC”編碼的重組蛋白的氨基酸序列；SEQ ID NO: 14:實(shí)施例中使用的編碼本發(fā)明重組蛋白的DNA序列(“3R-1GC”)；SEQ ID NO: 15:用于擴(kuò)增編碼豬scIgG的cDNA片段的scIgG 5’引物;SEQ ID NO: 16:用于擴(kuò)增編碼豬scIgG的cDNA片段的scIgG 3’引物;SEQ ID NO: 17:用于克隆編碼FMDV的3D蛋白的核酸的3D 5’弓丨物；SEQ ID NO: 18:用于克隆編碼FMDV的3D蛋白的核酸的3D 3’引物；SEQ ID NO: 19:合成 3R-1GCD 片段所使用的 3R-1GCD 5’ 引物;SEQ ID NO:20:合成 3R-1GCD 片段所使用的 3R-1GC 3’ 引物 I ;SEQ ID NO:21:合成3R-1GCD片段所使用的D5’引物；SEQ ID NO:22:合成 3R-1GCD 片段所使用的 3R-1GCD 3’ 引物；SEQ ID N0:23:擴(kuò)增 SEQ ID NO: 14 所使用的 3R-1GC 5’ 引物和SEQ ID N0:24:擴(kuò)增 SEQ ID NO: 14 所使用的 3R-1GC 3’ 引物 2。
具體實(shí)施例方式在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗FMDV的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其包含重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)從N端到C端包括:FMDV外殼蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)；免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其功能性片段；和FMDV的3D蛋白或其免疫原性片段。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗FMDV的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其包含:(i)重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)從N端到C端包括:(a) FMDV外殼蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)；和(b)免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其功能性片段；以及(ii)FMDV的3D蛋白或其免疫原性片段。在本發(fā)明的疫苗組合物的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述FMDV是O型FMDV，且所述抗原性表位是來自O(shè)型FMDV外殼蛋白的抗原性表位，例如是來自O(shè)型FMDV VPl蛋白的抗原性表位。在本發(fā)明的抗O型FMDV的疫苗組合物中，用于構(gòu)建所述重組蛋白質(zhì)的FMDV VPl蛋白抗原性表位可以是已知的VPl蛋白主要抗原性表位，例如是O型FMDV VPl蛋白的第141-160位氨基酸(SEQ ID NO:9)或第200-213位氨基酸(SEQ ID NO: 10)所代表的表位。這些表位已經(jīng)被證實(shí)能激發(fā)感染FMDV的動(dòng)物的B淋巴細(xì)胞反應(yīng)。為了增強(qiáng)本發(fā)明疫苗的重組蛋白質(zhì)的免疫原性，在所構(gòu)建的用作本發(fā)明的疫苗的重組蛋白質(zhì)中，所述FMDV抗原性表位(例如VPl蛋白的抗原性表位)以串聯(lián)重復(fù)的形式進(jìn)行排列，并且所述串聯(lián)重復(fù)可以是一種或多種FMDV抗原性表位(例如VPl蛋白的抗原性表位)的串聯(lián)重復(fù)。就此而言，“抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)”指的是重復(fù)排列的各個(gè)(相同的或不同的)表位序列在重組蛋白質(zhì)的氨基酸序列中直接地或通過接頭間接地順序相連接，從而使得各個(gè)(相同的或不同的)表位序列以串聯(lián)的方式相連接并重復(fù)2至多次，例如3次。在本發(fā)明的疫苗組合物的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述重組蛋白質(zhì)包括所述抗原性表位的2至5次串聯(lián)重復(fù)。重復(fù)次數(shù)多于5次也是可行的，不過，重復(fù)次數(shù)低于5次更利于以重組方式表達(dá)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)。 更優(yōu)選地，所述重組蛋白質(zhì)包括所述抗原性表位的3次串聯(lián)重復(fù)。在本發(fā)明疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述重組蛋白質(zhì)中的串聯(lián)重復(fù)是兩種O型FMDVVPl蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，串聯(lián)重復(fù)中的兩種VPl蛋白抗原性表位分別是O型FMDV VPl蛋白的第141-160位氨基酸(SEQ ID NO:9)和第200-213位氨基酸(SEQ ID N0:10)所代表的兩種表位，其中所述兩種表位是串聯(lián)排列的，且這種串聯(lián)排列的重復(fù)次數(shù)為3次。試驗(yàn)證明，這種重組蛋白質(zhì)有效誘導(dǎo)了動(dòng)物體產(chǎn)生針對(duì)O型FMDV的特異性免疫應(yīng)答，從而保護(hù)動(dòng)物。圖1以抗O型FMDV疫苗組合物為例給出了本發(fā)明疫苗的構(gòu)建示意圖，其中所述重組蛋白質(zhì)的N端為O型FMDV VPl蛋白的抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，隨后是家畜的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，而FMDV的3D蛋白可直接連接于免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的C端(圖1A)，也可為單獨(dú)的蛋白成分(圖1B)。在本發(fā)明疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述重組蛋白質(zhì)中的抗原性表位之間和/或所述串聯(lián)重復(fù)之間以肽接頭相連接。連接抗原性表位和/或串聯(lián)重復(fù)的肽接頭不能影響抗原性表位的線性結(jié)構(gòu)。可用于本發(fā)明中的肽接頭的實(shí)例例如為GGSSGG(SEQ ID NO: 11)和GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12)。本發(fā)明的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，以SEQ ID NO: 11作為肽接頭并未影響重組蛋白質(zhì)中串聯(lián)重復(fù)排列的抗原性表位的線性結(jié)構(gòu)，且所述重組蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)了保護(hù)性抗體的產(chǎn)生。此外，在本發(fā)明疫苗的重組蛋白質(zhì)中，所述抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)也可通過上述肽接頭與所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列相連接。為了使串聯(lián)重復(fù)排列的抗原性表位能夠展現(xiàn)在重組蛋白質(zhì)分子的表面，本發(fā)明將免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)或其功能 性片段連接于串聯(lián)重復(fù)排列的抗原性表位，例如VPl蛋白抗原性表位。免疫球蛋白分子的重鏈恒定區(qū)能將抗體可變區(qū)的序列展現(xiàn)在免疫球蛋白分子表面。利用免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的這一特性，本發(fā)明以串聯(lián)重復(fù)排列的抗原性表位區(qū)替代免疫球蛋白重鏈分子的可變區(qū)，由此使得免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)所展現(xiàn)在重組蛋白質(zhì)分子表面的部分為抗原性表位，例如VPl蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)。將本發(fā)明的疫苗施用到動(dòng)物體內(nèi)后，體液中的B細(xì)胞表面的IgM單體分子便能與重組蛋白質(zhì)分子中的抗原性表位相接觸，從而被激活，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本發(fā)明的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這樣設(shè)計(jì)的疫苗在動(dòng)物中誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫應(yīng)答，達(dá)到了保護(hù)動(dòng)物免于感染的目的。用于本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)優(yōu)選地來自家畜。為了降低重組蛋白質(zhì)分子中免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)部分的免疫原性，優(yōu)選地使用來自與被免疫動(dòng)物相同物種的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)可來自IgA、IgM、IgE、IgD、或IgG或其亞型。免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的“功能性片段”指的是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的一部分，所述部分仍能夠?qū)⒖乖员砦坏拇?lián)重復(fù)展現(xiàn)在重組蛋白質(zhì)分子表面。用于本發(fā)明疫苗的另一個(gè)部分或成分是FMDV 3D蛋白或其免疫原性片段，優(yōu)選地是完整的3D蛋白。FMDV 3D蛋白可以與外殼蛋白如VPl蛋白抗原性表位來自同一類型的FMDV，例如O型FMDV，或者也可以來自不同類型的FMDV。例如，在本發(fā)明的疫苗中，VPl蛋白抗原性表位可來自O(shè)型FMDV，而3D蛋白可來自O(shè)型FMDV或者來自A型或亞洲I型FMDV。在本發(fā)明的疫苗中，F(xiàn)MDV 3D蛋白可直接連接于免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的C端，形成包括FMDV VPl蛋白的抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)、以及FMDV 3D蛋白的完整重組蛋白質(zhì)?；蛘撸?D蛋白可作為獨(dú)立的蛋白質(zhì)成分與包括VPl蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的重組蛋白質(zhì)一起構(gòu)成本發(fā)明的疫苗的有效成分。在本發(fā)明的疫苗中引入FMDV 3D蛋白，無論其是作為重組蛋白質(zhì)的一部分或是作為獨(dú)立的成分，都是為了激發(fā)被免疫動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。T細(xì)胞可以攻擊動(dòng)物體內(nèi)被病毒染的細(xì)胞，通過清除這些被感染的細(xì)胞，徹底清除病毒。因此，T細(xì)胞在保護(hù)動(dòng)物免于病毒感染的過程中起著關(guān)鍵的作用。在使用本發(fā)明的疫苗免疫動(dòng)物后，疫苗的蛋白質(zhì)成分被體內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞(APC)攝取、加工、處理，最終被MHC分子提呈于APC表面，誘導(dǎo)抗原特異性殺傷性T淋巴細(xì)胞的活化、增殖并產(chǎn)生免疫記憶細(xì)胞。FMDV 3D蛋白的“免疫原性片段”指的是3D蛋白的一部分，所述部分同樣能夠有效激發(fā)被免疫動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。在本發(fā)明疫苗的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述重組蛋白質(zhì)的N端為O型FMDV VPl蛋白的兩種抗原性表位(SEQ ID NO:9 (VPl的第141-160位氨基酸)和SEQ ID NO: 10 (VPl ^第200-213位氨基酸)，表位之間以肽接頭SEQID NO: 11連接)的3次串聯(lián)重復(fù)，所述串聯(lián)重復(fù)在其C端以肽接頭SEQ IDN0:11連接于免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(SEQ ID N0:4)，而重組蛋白質(zhì)的C端為O型FMDV完整的3D蛋白序列，由此形成完整的重組蛋白質(zhì)(SEQ IDNO:8) 0在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述重組蛋白質(zhì)的N端為O型FMDVVP1蛋白的兩種抗原性表位(SEQ ID NO: 9 (VPl 的第 141-160 位氨基酸)和 SEQ ID NO: 10 (VPl 的第 200-213 位氨基酸)，表位之間以肽接頭SEQ IDN0:11連接)的3次串聯(lián)重復(fù)，重組蛋白質(zhì)的C端為免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO:4)，兩者以肽接頭SEQ ID NO: 11連接，而完整的3D蛋白為分開的獨(dú)立成分，由此所述重組蛋白質(zhì)(SEQ ID NO: 13)成分和3D蛋白質(zhì)(SEQID NO:6)成分共同構(gòu)成疫苗組合物的有效成分。如上所述的重組蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的范圍。在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的疫苗組合物中的重組蛋白質(zhì)。在具體的實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含如SEQ IDN0:7或SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列。 獲得編碼本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的多核苷酸的方法是本領(lǐng)域人員已知的，例如可采用化學(xué)合成的方法直接制備多核苷酸分子?；蛘?，可分別獲得編碼抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其功能性片段、以及FMDV 3D蛋白或其免疫原性片段的核酸分子，引入編碼肽接頭的序列，再連接成為編碼完整重組蛋白質(zhì)的多核苷酸。例如，可通過RT-PCR方法自動(dòng)物脾臟細(xì)胞中擴(kuò)增得到編碼免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的多核苷酸，以及自FMDV樣品中擴(kuò)增得到編碼3D蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可用于制備本發(fā)明的疫苗成分，例如通過將所述多核苷酸插入合適的載體并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以表達(dá)所述重組蛋白質(zhì)。因此，在另一方面，本發(fā)明還提供制備用于誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗FMDV的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的重組蛋白質(zhì)的方法，其包括如下步驟:-獲得編碼如上所述的重組蛋白質(zhì)的多核苷酸；-構(gòu)建含有所述多核苷酸的表達(dá)載體；-將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；和-在適合所述重組蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，收集并純化所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)。
用于將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的表達(dá)載體也是本領(lǐng)域人員已知的，例如為原核或真核表達(dá)載體。用于表達(dá)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞例如是大腸桿菌和酵母。本發(fā)明的抗FMDV的疫苗組合物包含有效量的疫苗有效成分，即所述完整的重組蛋白質(zhì)或者重組蛋白質(zhì)和獨(dú)立的3D成分，以及藥用可接受的載體和佐劑。所述動(dòng)物例如是豬、牛、或羊等偶蹄類動(dòng)物。有效量是指疫苗成分的量足以誘導(dǎo)被免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗FMDV的特異性免疫應(yīng)答。合適的載體和佐劑例如為無機(jī)佐劑，如氫氧化鋁、磷酸鋁等；有機(jī)佐劑，如CpGDNA、多聚腺苷酸等；微生物及其提取物；油佐劑等。本發(fā)明還涉及預(yù)防動(dòng)物的FMDV感染的方法，其包括給有此需要的動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗的施用途徑可以是任何合適的蛋白質(zhì)疫苗的施用途徑，例如為皮下注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射或靜脈注射。有效量是指足以誘導(dǎo)被免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗FMDV的特異性免疫應(yīng)答的疫苗成分的量，其可以通過例如常規(guī)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)而容易地確定。本發(fā)明疫苗中的蛋白質(zhì)組分可以100-2000微克、優(yōu)選地200-1000微克的總量施用。例如，以實(shí)施例中制備的疫苗組合物A中的重組蛋白質(zhì)為例，單次施用200-1000微克的所述重組蛋白質(zhì)均可在動(dòng)物中產(chǎn)生有效的抗O型FMDV保護(hù)性免疫應(yīng)答，用于檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)抗FMDV的疫苗組合物的效果的方法和技術(shù)是本領(lǐng)域人員已知的。這些方法和技術(shù)包括FMDV體外培養(yǎng)及滴定技術(shù)(包括倉(cāng)鼠細(xì)胞培養(yǎng)、病毒體外繁殖及病毒蛋白質(zhì)的制備)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(包括免疫動(dòng)物血清的收集、血清中和試驗(yàn)、乳鼠保護(hù)試驗(yàn)、ID5tl、LD5tl測(cè)定、豬攻毒試驗(yàn))以及動(dòng)物免疫應(yīng)答測(cè)試(如血清中和抗體應(yīng)答、T細(xì)胞應(yīng)答分析)。實(shí)施例以下實(shí)施例用于舉例說明本發(fā)明，其無意于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:構(gòu)建重組基因和表達(dá)載體1.1.合成編碼串聯(lián)重復(fù)排列的VPl蛋白抗原性表位的DNA用DNA合成法合成編碼串聯(lián)重復(fù)排列3次的兩種VPl蛋白抗原性表位的DNA序列，其中抗原性表位序列使用了最新流行的O型FMDV中的表位序列，即O型FMDV VPl蛋白的第141-160位氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和第200-213位氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。編碼各串聯(lián)重復(fù)排列的VPl蛋白抗原性表位的核苷酸序列之間引入了編碼肽接頭(SEQ IDNO: 11)的核苷酸序列，并在5’端引入編碼甲硫氨酸的密碼子，在3’端額外引入一個(gè)編碼肽接頭(SEQ ID NO: 11)的核苷酸序列(該接頭用于將串聯(lián)重復(fù)排列的抗原性表位與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)片段連接在一起)。由此得到的產(chǎn)物以“3R”片段表示，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。1.2.獲得編碼豬免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列用RT-PCR方法從動(dòng)物脾臟細(xì)胞中擴(kuò)增出免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的編碼核酸，具體如下。采用FastPrep Kit(Gibco)從豬的脾臟樣品中提取和純化含有豬免疫球蛋白IgG單鏈重鏈恒定區(qū)(scIgG)mRNA的總mRNA。利用RT-PCR方法擴(kuò)增豬的編碼scIgG的cDNA 片段，所用引物(Kacskovics, 1. , Sun, J., Butler, J.E.Five putative subclassesof swine IgG identified from the cDNAsequences of a single animal.J Immunol1994; 153:3565-73)如下:scIgG 5’ 弓丨物:5，-GCCCCCAAGACGGCCCCA-3’ SEQ IDN0:15scIgG 3，引物:5，-TCATCATTTACCCTGAGT-3’ SEQ ID NO: 16逆轉(zhuǎn)錄使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)，反應(yīng)條件為:M_MLV 5X反應(yīng)緩沖液(250mMTris-HCl (pH8.3), 375mM KCl, 15mM MgCl2, 50mM DTT) 5 μl ;dNTP，10mM，各 1.25μl ;重組RNasin RNA酶抑制劑25單位；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200單位;2 μ g mRNA ;0.5 μ g引物;加無RNA酶的水至終體積25 μl。在37° C反應(yīng)60分鐘后，70° C，滅活15分鐘。所得產(chǎn)物作為模板用于隨后的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系共25 μ 1，其中含有:
2.5 μl 的 10 X PCR 緩沖液(IOOmM Tris-HCl, ρΗ8.4，500mM KCL, lmg/ml 明膠)，0.5 μl 的1OmM dNTP，0.5μl 50mM 的 MgCl2,1 μl 的 scIgG 5’ 引物(SEQ ID NO: 15) (1OmM), 1 μl 的scIgG 3’引物(SEQ ID NO: 16) (1OmM)，0.2 μl 的 Taq聚合酶(Promega)，1 μl模板，18.3 μl的 ddH20。PCR 的條件為:95° C，5 分鐘；95° C 30 秒，52° C 30 秒，72° C 2 分鐘，共 34個(gè)循環(huán)；最后72° C，5分鐘。由此制備得到的擴(kuò)增產(chǎn)物以“IGC”片段表示，經(jīng)過測(cè)序分析其具有SEQID NO:3所示的序列。1.3.連接編碼串聯(lián)重復(fù)區(qū)和豬免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的核酸連接編碼串聯(lián)重復(fù)的VPl蛋白抗原性表位的核酸(3R片段)和豬免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的 cDNA(IGC 片段)。連接反應(yīng)體系為:300mM Tris-HCl (ρΗ7.7)，IOOmM MgCl2, 50mMDTT和ImM ATP。編碼串聯(lián)重復(fù)排列的VPl蛋白抗原性表位的核酸和重鏈恒定區(qū)的cDNA片段的摩爾比為1:1。用2u T4DNA連接酶和0.2u T4 RNA連接酶(Promega)來提高平頭連接的效率。連接產(chǎn)物以“3R-1GC”片段表示，其具有SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。1.4.獲得編碼FMDV的3D蛋白的核酸采用以下引物從感染O型FMDV的病豬的水泡樣品中克隆編碼FMDV的3D蛋白的核酸:3D 5，引物:5’ -CCATCTCCAAGACTCAGGGTAAAGGGTTGATC SEQ IDN0:17GTCGACACC-3>3D 3，引物:5，-GTATGCGTCACCGCAC-3，SEQ ID NO: 18RT-PCR反應(yīng)條件與擴(kuò)增IGC中所用條件相同。從FMDV中擴(kuò)增出的產(chǎn)物以“D”片段表示，其編碼FMDV的3D蛋白，具有如SEQ ID N0:5所示的序列。1.5.獲得編碼完整重組蛋白質(zhì)的核酸將如上制備的“3R-1GC”片段與從FMDV中擴(kuò)增出的編碼3D蛋白的“D”片段用重疊PCR連接，得到編碼完整重組蛋白質(zhì)的核酸分子“3R-1G⑶”。具體步驟如下。(1)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增“3R-1GC”片段的引物:3R-1GCD 5’ 引物:5’ -AGCTGAATTCATGGTACCAAACCTG-3’ SEQ ID NO: 193R-1GC 3’ 弓丨物 1:5’ -GGTAGAGGTTCTGAGTCCCATTTCCCAACT SEQ ID NO:20AGCAGCTGTGG-3’其中3R-1GCD 5，引物與“3R-1GC”片段的5，端互補(bǔ)，而3R-1GC 3，引物I部分與“3R-1GC”片段的3’端互補(bǔ)，部分與“D”片段的5’端互補(bǔ)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到3R-1GCD的3R-1GC部分，其3’端的部分序列與“D”片段的5’端相同。(2)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增“D”片段的引物:D5，引物:5’ -CCATCTCCAAGACTCAGGGTAAAGGGTTGASEQ ID NO:21
TCGTCGACACC-3’3R-1GCD 3’ 引物:5’ -AGCTTCTAGAAATTTATGCGTCACCGCAC-3，SEQ ID NO:22其中D5’引物部分與“D”片段的5’端互補(bǔ)，部分與“3R-1GC”片段的3’端互補(bǔ)，而3R-1G⑶3’引物與“D”片段的3’端互補(bǔ)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到3R-1G⑶的D部分，其5’端的部分序列與“3R-1GC”片段的3’端相同。(3)各取5yg的3R-1GC部分和D部分互為PCR的引物和模板，95° C變性I分鐘，65° C延伸2分鐘，共6個(gè)循環(huán)。然后在該反應(yīng)體系中再加入3R-1G⑶5’引物和3R-1G⑶3’引物，95° C變性I分鐘，55° C 30秒，72° C延伸2分鐘，共20個(gè)循環(huán)。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物即為3R-1G⑶(SEQ ID N0:7)，編碼實(shí)施例2中制備的疫苗組合物A中的重組蛋白質(zhì)。1.6.構(gòu)建表汰載體將如上所述制備得到的擴(kuò)增產(chǎn)物“3R-1G⑶”經(jīng)EcoRI和XbaI酶切后插入細(xì)菌表達(dá)載體 pET22b (Novagen Inc.),得到質(zhì)粒 p3R_IGCD。使用如下引物對(duì)前面1.3節(jié)中制備得到的“3R-1GC”進(jìn)行PCR擴(kuò)增:3R-1GC 5’ 引物:5’ -AGCTGAATTCATGGTACCAAAC-3，SEQ ID NO:233R-1GC 3，引物 2:5，-AGCTTCTAGATCATCATTTACCCTGAGT-3，SEQ ID NO:24擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XbaI酶切后插入細(xì)菌表達(dá)載體pET22b (Novagenlnc.)，得到質(zhì)粒 p3R-1GC。實(shí)施例2:疫苗制備`2.1.制備本發(fā)明的疫苗組合物A2.1.1.表汰3R-1GCD編碼的重鉬蛋白質(zhì):將感受態(tài)細(xì)胞(E.Coli, BL21)置于冰上融解后，于冰上預(yù)冷的管中每管加300 μ I感受態(tài)細(xì)胞。每管加20 μ I在實(shí)施例1中制備得到的質(zhì)粒P3R-1G⑶，混勻，冰上放置40分鐘。于42° C水浴熱休克45秒。每管加I mlL-培養(yǎng)基(無抗生素)，于37° C搖床震蕩溫育45分鐘，使質(zhì)粒表達(dá)蛋白。將轉(zhuǎn)化好的細(xì)菌鋪于含氨芐青霉素的培養(yǎng)板上，37° C過夜。挑選氨芐青霉素抗性的細(xì)菌克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行DNA測(cè)序，挑選含有具有正確序列的質(zhì)粒的菌株。將菌株置于LB培養(yǎng)基中，在37° C培養(yǎng)生長(zhǎng)至OD=0.5，加入0.4 mM IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá)，4小時(shí)后收集菌體。細(xì)菌細(xì)胞的懸液經(jīng)超聲破碎后，于4° C，10，OOOxg離心10分鐘，除去殘留的細(xì)菌碎片。上清液直接用于免疫印跡分析。30，OOOxg離心收集不溶性蛋白(包涵體)，用LB培養(yǎng)基洗一次，隨后按25ml/g沉淀的量與溶解緩沖液 1(SB1:100 mM NaH2PO4,10 mM Tris-HCl,20 mM咪唑，pH8.0，ImM DTT,8 M尿素，1.5M NaCl)混勻并不時(shí)搖動(dòng)，在室溫溫育20-30分鐘。玻璃狀的不溶性細(xì)胞壁經(jīng)65，OOOxg離心30分鐘去除。上清液經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾，得到含有重組蛋白質(zhì)的蛋白樣品。用His-Trap柱純化以獲得表達(dá)的重組蛋白(Porath, J.，Carlsson, J.，Olsson,
1., Belfrage, G.Metal chelateaffinity chromatography, a new approach to proteinfraction.Nature 1975;258:598-99)。將 5-lOmg/ml 的上述蛋白樣品置于 1x5cm 用 SBl 預(yù)平衡的His-Trap柱上。在p3R_IG⑶質(zhì)粒中表達(dá)的重組蛋白帶有HIS尾。結(jié)合的蛋白用50ml SBl洗后，用洗脫緩沖液2(EB2:SBl+0.5 M NaCl+480 mM咪唑，pH8.0)洗脫結(jié)合的蛋白。洗脫的蛋白用SBl稀釋10倍后，在同樣條件下進(jìn)行二次層析。合并洗脫蛋白，蛋白的濃度采用Bio-Rad蛋白分析試劑盒,按照廠家的說明書進(jìn)行。調(diào)節(jié)蛋白濃度在0.3-0.4mg/ml，用5L 50 mM Tris，pH7.5，1.0M NaCl多次換液透析72小時(shí)。另以類似的方法，但將8M尿素?fù)Q做6 M尿素來溶解蛋白，純化蛋白質(zhì)。純化的蛋白儲(chǔ)存于4° Co2.1.2.SDS-PAGE和免瘡印跡分析3R-1GCD編碼的重鉬蛋白:重鉬蛋白的表達(dá)由SDS-PAGE凝膠電泳顯示。SDS-PAGE驗(yàn)證表明獲得的重組蛋白質(zhì)的分子量與預(yù)期的一致(圖2)。目的蛋白的表達(dá)由免疫印跡(AmershamECL免疫印跡試劑盒)確定(Gel electrophoresis of proteins(Hammes, B.D., Rickwood,D.,eds.),IRLPress, Oxford, 1981)。在免疫印跡分析中，使用了來源于被0型FMDV感染的豬的抗FMDV的抗血清(圖3)，證實(shí)重組蛋白具有抗原性，能與上述抗血清發(fā)生反應(yīng)。2.1.3.獲得疫苗組合物A:在重組蛋白質(zhì)中加入乳化劑206(SEPPIC公司，法國(guó))混勻，即得到本發(fā)明的疫苗組合物A(含有由3R-1G⑶編碼的重組蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:8)作為活性組分)。2.2.制備本發(fā)明的疫苗組合物B按照與前面2.1節(jié)類似的方式使用質(zhì)粒P3R-1GC表達(dá)并純化由3R-1GC編碼的重組蛋白質(zhì)(具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列)。該重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE考馬斯藍(lán)染色和免疫印跡檢測(cè)(使用來自豬的抗FMDV血清)的鑒定結(jié)果見圖4。將實(shí)施例1中1.4節(jié)所獲得的編碼FMDV的3D蛋白的核酸克隆入表達(dá)載體pETlOO-D-TOPO (Invitrog en)，得到質(zhì)粒 pET100_P3D。載體 pET100-D-T0P0 已經(jīng)由生產(chǎn)商進(jìn)行線性化，可直接與目的片段連接用于在細(xì)菌中表達(dá)重組蛋白質(zhì)。采用前面2.1.1節(jié)所述的類似方式，使用質(zhì)粒PET100-P3D轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 codon plus。培養(yǎng)的細(xì)菌經(jīng)0.4M的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)4小時(shí)，以表達(dá)3D蛋白。使用SDS-PAGE和抗-his抗體對(duì)表達(dá)并純化的3D蛋白進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色和免疫印跡檢測(cè)，鑒定結(jié)果見圖5。將由3R-1GC編碼的重組蛋白質(zhì)和3D蛋白按照等摩爾比混合，加入乳化劑206(SEPPIC公司，法國(guó))混勻，即得到本發(fā)明的疫苗組合物B (含有由3R-1GC編碼的重組蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:1 3)和3D蛋白(SEQ ID NO:6)作為活性組分)。實(shí)施例3 -M FMDV疫苗的效力3.1.細(xì)朐培養(yǎng)倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞株(BHK21)(購(gòu)自ATCC，ATCC CCL-10)在加入了 10%熱滅活胎牛血清(FBS) (Gibco)、青霉素(100U ml—1)、鏈霉素(100 μ g ml—1)、并配有Earle鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EMEM) (Gibco)中培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為 37。C 及 5% CO2(Barnett, P.V., L.Pullen, R.F.Staple, L.J.Lee, R.Butcher, D.Parkinson, and T.R.Doel.1996.A protectiveant1-peptide antibody against theimmunodominant site of the A24 Cruzeiro strainof foot-and-mouth disease virusand its reactivity with other subtype virusescontaining the same minimumbinding sequence.J.Gen.Virol.77:1011-1018)。3.2.FMDV繁殖及制各病毒蛋白FMDV來自疾病流行時(shí)被FMDV感染的豬的水泡的上皮組織。當(dāng)BHK21單層細(xì)胞生長(zhǎng)至80%滿時(shí)，均勻地在細(xì)胞層表面加入一毫升FMDV液以繁殖FMDV。細(xì)胞先在37° C中培養(yǎng)45分鐘，當(dāng)BHK21細(xì)胞表現(xiàn)出75%的細(xì)胞病變效果時(shí)，把它們收集并加入20毫升不含胎牛血清及配有Earle鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EMEM)。培養(yǎng)后加入0.01 M的二乙烯亞胺(Binaryethylenimine) (Sigma)并放在37° C中I小時(shí)以滅活FMDV,然后再加入7%的聚乙二醇(PEG 6000) (Sigma)并放于4° C中過夜以沉淀滅活后的FMDV。病毒總蛋白經(jīng)ΑΟ,ΟΟΟ 'ρπι、2小時(shí)超離心法取得。在259mn處測(cè)定光密度，確定純化病毒蛋白的濃度，10D=132 μ g(Barnett, P.V.，L Pullen, R.F.Staple, L J.Lee，R.Butcher, D.Parkinson, and T.R.Doel.1 996.A protectiveant1-peptide antibody against theimmunodominant site of the A24 Cruzeiro strainof foot-and-mouth disease virusand its reactivity with other subtype virusescontaining the same minimumbinding sequence.J.Gen.Virol.77:1011-1018)。病毒蛋白用于T細(xì)胞增殖試驗(yàn)。3.3.FMDV 50%致感染劑量(ID=)鑒定分析為檢測(cè)FMDV 50%致感染劑量(ID5ci)的濃度，25只對(duì)FMDV血清反應(yīng)陰性的豬用作50%致感染劑量(IDJ的分析。動(dòng)物被分為五組，每組五只?？谔阋卟《疽罕贿B續(xù)十倍稀釋(如10-4，10-5，10-6，10—7及10—8)，并分別注入豬中的頸部肌肉。于病毒攻毒的2-10日后，每日觀察鼻、口、舌和足的水泡形成及量度體溫。有口蹄疫癥狀和體溫超過40° C的豬將被診斷為口蹄疫陽性，因感染FMDV而導(dǎo)致50%的豬出現(xiàn)陽性癥狀時(shí)所使用的稀釋濃度為口蹄疫病毒液的 ID5q，即 I ID5q (Collen，T.，R.Dimarchi，and T.R.Doel.1991.A T Cell Epitopein VPl of Foot—and—Mouth Disease Virus is Immunodominantfor Vaccinated Cattle.J.1mmunol.14G: 749-755.Tabogaj 0.，C.Tamij E.Carrillo, J.1.Nunez, A.Rodriguez, J.C.Saizj E.Blanco, M.L Valero, X.Roigj J.A.Camareroj D.Andreuj M.G.Mateuj E.Giraltj E.Domingo, F.Sobrinoj andE.L.Palma.1 997.A Large-Scale Evaluation of PeptideVaccines againstFoot—and—Mouth Disease:Lack of Solid Protection in Cattle andIsolation ofEscape Mutants.J.Virol.7 1:2604-2614)。3.4.免疫接種的豬的血■清收集和攻毒試驗(yàn)FMDV攻毒試驗(yàn)是最終鑒定重組疫苗的效率的方法?？偣?5只對(duì)FMDV血清反應(yīng)為陰性的豬(2.5月大，重約25千克)被用作病毒攻毒的分析。豬被分成五組:(a)五只豬作陰性對(duì)照組(注射Iml PBS) ； (b)五只豬作陽性對(duì)照組(注射口蹄疫商品疫苗(滅活全病毒)2ml，蘭州，中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，劑量按廠商指示)；其余c、d、e組的豬注射如上所述的疫苗組合物A，即重組蛋白質(zhì)(由“3R-1G⑶”編碼):(c)五只豬每只注射0.2毫克(mg)重組蛋白質(zhì)；⑷五只豬注射0.5毫克(mg)重組蛋白質(zhì)；(e)五只豬每只注射I毫克(mg)重組蛋白質(zhì)。在測(cè)試如上所述的疫苗組合物B時(shí)，分組情況同疫苗組合物A組，注射的總蛋白量與疫苗組合物A相同，其中重組蛋白質(zhì)(由“3R-1GC”編碼)與3D蛋白的摩爾比為1:1。豬經(jīng)由頸肌第一次注射疫苗，并于21日后再次接種同樣劑量的疫苗。血清樣本于第O及51日于每組的動(dòng)物中收集并加以測(cè)試。一周后用1000倍ID5tl的FMDV攻毒，而診斷口蹄疫的發(fā)病標(biāo)志與上面ID5tl鑒定部分分析所用的標(biāo)志相同(Rodriguez，A.，J.C.Salzj 1.S.Novella, D.Andreuj and F.Sobrin0.1994.Antigenic Specificity ofPorcine T Cell Response againstFoot-and-Mouth Disease Virus StructuralProteins:1dentification of T HelperEpitopes in VPl.Virology 205:24-33)。3.5.血清杭體 中和反應(yīng)測(cè)試(SNT)為鑒定五組分別接受重組蛋白質(zhì)、口蹄疫商品疫苗及緩沖液注射的豬對(duì)FMDV的特異性抗體應(yīng)答，依照口蹄疫世界參考實(shí)驗(yàn)室規(guī)定的程序進(jìn)行血清中和試驗(yàn)(SNT)(Chapter 2.1.1 Foot and mouth disease.1n: “OIE Manual，，.0ff ice Internationaldes Epizooties，Paris，1996; 47-56.) 而抗體的濃渡則以 1g10SN5。方式表示(Salt，J.S., P.V.Barnett, P.Danij and L.William.1998.Emergency vaccination of pigs againstfoot-and-mouth disease:protectionagainst disease and reduction in contacttransmission.Vaccine 16:746-754)。結(jié)果如表 I 和 2 所不。表1、抗體中和反應(yīng):接種200微克(Ug)、500微克(Ug)及I毫克(mg)的重組
蛋白質(zhì)(疫苗組合物A)和緩沖液及口蹄疫商品疫苗后51日的豬的抗體中和反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種用于誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗口蹄疫病毒的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其包含重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)從N端到C端包括: -口蹄疫病毒外殼蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)； -免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其功能性片段；和 -口蹄疫病毒的3D蛋白或其免疫原性片段。
2.一種用于誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗口蹄疫病毒的特異性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其包含: (i)重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)從N端到C端包括: -口蹄疫病毒外殼蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)；和 -免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其功能性片段；以及 ( ) 口蹄疫病毒的3D蛋白或其免疫原性片段。
3.權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，其中所述重組蛋白質(zhì)包括所述抗原性表位的2至5次串聯(lián)重復(fù)。
4.權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，其中所述重組蛋白質(zhì)包括所述抗原性表位的3次串聯(lián)重復(fù)。
5.權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，其中所述抗原性表位彼此通過肽接頭相連接和/或所述抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)通過肽接頭與所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列相連接。
6.權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，其中所述口蹄疫病毒是O型口蹄疫病毒，且所述抗原性表位是來自O(shè)型口蹄疫 病毒外殼蛋白的抗原性表位。
7.權(quán)利要求6的疫苗組合物，其中所述抗原性表位是來自O(shè)型口蹄疫病毒VPl蛋白的抗原性表位。
8.權(quán)利要求7的疫苗組合物，其中所述VPl蛋白抗原性表位包含選自SEQID N0:9和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求7的疫苗組合物，其中所述串聯(lián)重復(fù)是兩種VPl蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)，所述兩種VPl蛋白抗原性表位分別包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求5的疫苗組合物，其中所述肽接頭選自SEQID NO: 11和SEQ ID NO: 12。
11.權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)來自與所述動(dòng)物相同的物種。
12.權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，其中所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)包含SEQID NO:4的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，其中所述口蹄疫病毒的3D蛋白包含SEQID NO:6的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述重組蛋白質(zhì)具有如SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求2的疫苗組合物，其中所述重組蛋白質(zhì)具有如SEQIDNO:13所示的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求1或2的疫苗組合物,其中所述動(dòng)物是豬、牛、或羊。
17.權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，還包含藥用可接受的載體和/或佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體涉及抗口蹄疫重組疫苗的構(gòu)建、制備及其應(yīng)用。所述疫苗包括口蹄疫病毒、特別是O型口蹄疫病毒的VP1蛋白抗原性表位的串聯(lián)重復(fù)、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其功能性片段、和口蹄疫病毒的3D蛋白或其免疫原性片段。所述疫苗能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗口蹄疫病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61P31/14GK103169962SQ20121047061
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者王歈 申請(qǐng)人:法羅斯疫苗公司