恢復(fù)和重建腸道微生物群的合生素組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及合生素組合物，其包含益生菌細(xì)菌菌株和益生素物質(zhì)，當(dāng)其組合時(shí)呈現(xiàn)協(xié)同作用。所述合生素組合物在抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體所致其它腸道感染及其復(fù)發(fā)后刺激固有微生物群落恢復(fù)和重建體內(nèi)腸道樣狀況，以及預(yù)防所述疾病。
【專利說明】恢復(fù)和重建腸道微生物群的合生素組合物
[0001]發(fā)明【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及合生素(synbiotic)組合物，其包含益生菌細(xì)菌菌株和益生素物質(zhì)，當(dāng)它們組合時(shí)展示協(xié)同行為。所述協(xié)同組合物刺激固有微生物群落(indigenousmicroflora)在抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或由胃腸道病原體導(dǎo)致的其它腸道疾病及其復(fù)發(fā)之后恢復(fù)和重建體內(nèi)腸道樣條件，以及預(yù)防所述疾病。
[0003]發(fā)明背景
[0004] 腸道微生物群(miCTobiota)組成了真正的“體外器官”，其具有對(duì)于身體內(nèi)在代謝和各種免疫功能的重要作用。這個(gè)“器官”履行獨(dú)特消化功能，所述功能不能由無細(xì)菌動(dòng)物的胃腸道(GI)簡(jiǎn)單完成。但是，GI和微生物群形成在細(xì)菌物種和宿主之間的復(fù)雜代謝溝通(cross talk)。
[0005]正常情況下腸粘膜層保護(hù)上皮免于被病原體侵襲和建群，并且作為其中上皮產(chǎn)生的抗微生物因子及正常腸道微生物群的菌株一起建群的基質(zhì)。這個(gè)粘膜層組成緩沖區(qū)，其實(shí)現(xiàn)微生物群的腔室分區(qū)并且建立交流通道用于通過細(xì)菌菌株和腸道上皮之間的溝通以交換分子(Sansonetti, Mucosal Immunol, 2011，4:8-14)。
[0006]人類和動(dòng)物醫(yī)藥中增加的抗生素應(yīng)用現(xiàn)今導(dǎo)致腸道中抗生素抗性菌株的嚴(yán)重增加，這些菌株例如耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococci) (MRSA和MRSE)、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科(Enterobacteriaceae) (ESBL)、萬古霉素抗性腸球菌(Enterococcus spp) (VRE)、克拉霉素抗性幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、萬古霉素抗性艱難梭菌(Clostridum difficile)(⑶)、喹諾酮抗性空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)及假絲酵母(Candida)物種的各種菌株。
[0007]⑶在固有正常腸道菌群中數(shù)量小，但是破壞固有人類腸道微生物菌群的廣譜抗生素如克林霉素、頭孢菌素和氟喹諾酮會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生毒素的CD的腸道過度生長(zhǎng)，殺死粘膜中的腸細(xì)胞，并且引起腹瀉，其嚴(yán)重情況下導(dǎo)致具有高死亡率的假膜性結(jié)腸炎。流行性CD菌株NAP1/027比目前分離的醫(yī)院菌株產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上更多的毒素A和毒素B，并且是高度毒性的。
[0008]腸道微生物群是復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，與宿主共生。腸道雙歧桿菌(Bif)物種具有非常大量的基因以代謝結(jié)腸中的碳水化合物，而乳桿菌是小腸中的主要乳酸細(xì)菌(LAB)。
[0009]益生素發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)，如乙酸、丁酸和乳酸，其降低結(jié)腸局部pH。此外，益生素和食物纖維幫助LAB和雙歧桿菌增殖以產(chǎn)生高細(xì)胞密度及通過產(chǎn)生殺細(xì)菌物質(zhì)、抗氧化劑、降低粘膜炎癥、維持結(jié)腸粘膜完整性及促進(jìn)強(qiáng)宿主抗炎癥應(yīng)答而預(yù)防上文所述腸道病原體生長(zhǎng)。競(jìng)爭(zhēng)排斥是對(duì)抗入侵的病原體的抗微生物防御作用的另一模式。
[0010]目前使用益生菌和益生素的術(shù)語通常是涉及互補(bǔ)合生素概念，其中益生菌的選擇基于宿主所需的特定的有益作用，選擇益生素刺激固有微生物群落的生長(zhǎng)。然而，本發(fā)明使用新的協(xié)同概念的方法，其中選擇益生素刺激對(duì)宿主具有特定有益作用的益生菌的生長(zhǎng)。其也可以增加有益的宿主GI微生物群水平，但是主要目標(biāo)是攝入的益生菌的生長(zhǎng)。共培養(yǎng)刺激組合物中的對(duì)益生寡糖及人腸道中其它不可消化的碳水化合物利用不良的其它成分。
[0011]發(fā)明概述[0012]本發(fā)明第一方面涉及合生素組合物，其包含選自乳桿菌(Lactobacillus)屬和雙歧桿菌(Bifidobacteria)屬的至少兩種細(xì)菌菌株,及一或多種益生素物質(zhì),特征在于:
[0013]-所述細(xì)菌菌株中的至少一種能降解淀粉；及
[0014]-至少一種益生素物質(zhì)是淀粉。
[0015]有利地，所述能降解淀粉的細(xì)菌菌株屬于雙歧桿菌屬，或者屬于短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)物種如 Bif LUlOo
[0016]有利地，所述淀粉是抗性淀粉(RS)和/或可溶淀粉(SS)。
[0017]有利地，所述細(xì)菌菌株之一是非淀粉降解菌株，或者屬于副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)物種如 LAB LU33。
[0018]有利地，所述合生素組合物包含至少Bif LU10，及菌株LAB LU23、LAB LU28、LABLU33、BIF LU29和/或BIF LU30中的一或多種，或者包含至少Bif LUlO和LAB LU33，或者包含至少 BIF LUlO、LAB LU33 和 BIF LU30，或者包含至少 BIF LUlO、LAB LU33、BIF LU30和 LAB LU28。
[0019]有利地，所述一或多種細(xì)菌菌株在其產(chǎn)生期間已經(jīng)暴露于酸、膽汁和/或粘蛋白，由此暴露于酸包括在細(xì)菌菌株生長(zhǎng)期間使培養(yǎng)液的PH降低至pH2-5，優(yōu)選降低至PH2.5-4.5，更優(yōu)選降低至pH3-4，持續(xù)15-150分鐘，優(yōu)選持續(xù)20-140分鐘，更優(yōu)選持續(xù)30-130分鐘，更優(yōu)選持續(xù)40-120分鐘，而暴露于膽汁包括使細(xì)菌菌株在存在0.1-2.5%(重量/體積)、優(yōu)選0.5-2%、更優(yōu)選1.0-1.5%?；悄懰徕c或者1-10% (體積/體積)、優(yōu)選2-7%、更優(yōu)選3-5%豬膽汁的條件下生長(zhǎng)2-8小時(shí)，優(yōu)選2.5-7小時(shí)，更優(yōu)選3_6小時(shí)，而暴露于粘蛋白包括使細(xì)菌菌株在存在0.01-1%(體積/體積)、優(yōu)選0.03-0.7%、更優(yōu)選0.05-0.5%粘蛋白的條件下生長(zhǎng)2-8小時(shí)，優(yōu)選 2.5-7小時(shí)，更優(yōu)選3-6小時(shí)。
[0020]有利地，所述合生素組合物進(jìn)一步包含屬于由二糖、寡糖和/或多糖組成的組的益生素物質(zhì)，其中所述二糖是乳果糖，所述寡糖來自由寡聚果糖(F0S)、寡聚半乳糖(G0S)、寡聚木糖(XOS)、殼聚糖寡糖(chioses)、異麥芽糖寡糖(MOS)、阿拉伯樹膠、大豆寡糖和果膠寡糖組成的組，所述多糖來自由果膠、木聚糖、菊粉、殼聚糖和/或β -葡聚糖組成的組。
[0021]有利地，所述合生素組合物進(jìn)一步包含屬于由寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、異麥芽糖寡糖(MOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖組成的組的益生素物質(zhì)。
[0022]有利地，所述合生素組合物進(jìn)一步包含寡聚半乳糖(GOS)和/或異麥芽糖寡糖(IMOS)。
[0023]上述合生素組合物有利地用于對(duì)象的腸道粘膜建群，及預(yù)防、治療、減輕對(duì)象中抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體所致感染的癥狀和/或預(yù)防其復(fù)發(fā)。
[0024]所述抗生素相關(guān)腹灣(AAD)是由艱難梭菌(Clostridium difficile)引起的。
[0025]所述胃腸道病原體所致感染是由沙門氏菌屬(Salmonel Ia)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、產(chǎn)超廣譜 β -內(nèi)酸胺酶(Extended Spectrum Beta Lactamaseproducing, ESBL)大腸桿菌引起的。
[0026]有利地，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，如屬于由人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、牛、綿羊、豬、山羊和馬、狗、貓、嚙齒動(dòng)物和豚鼠組成的組的哺乳動(dòng)物。優(yōu)選所述對(duì)象是人。
[0027]上述合生素組合物可用于制備藥物，所述藥物用于在對(duì)象腸粘膜建群以預(yù)防、治療、減輕抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體所致感染的癥狀及預(yù)防其復(fù)發(fā)。[0028]上述合生素組合物可用于制備用于治療患有抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體所致感染的對(duì)象的藥物。
[0029]上述合生素組合物可用于在對(duì)象腸粘膜建群的方法中，所述方法包括給有需要的對(duì)象施用有效劑量的所述合生素組合物的步驟。
[0030]上述合生素組合物可用于治療對(duì)象的抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體所致感染的方法中，所述方法包括給有需要的對(duì)象施用有效劑量的所述合生素組合物的步驟。
[0031]定義
[0032]本發(fā)明中使用的術(shù)語遵循微生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員接受的標(biāo)準(zhǔn)定義。如下文列出的少數(shù)例外在本發(fā)明范圍內(nèi)進(jìn)一步定義。
[0033]如本文所用，術(shù)語“ 二糖”是當(dāng)兩個(gè)單糖經(jīng)歷縮合反應(yīng)形成的碳水化合物，所述縮合反應(yīng)包括僅從官能團(tuán)中消除小分子，如水。
[0034]如本文所用，術(shù)語“寡糖”是指含有少數(shù)目(通常2-10個(gè))糖(單糖)的糖聚合物。
[0035]如本文所用，術(shù)語“多糖”是聚合的碳水化合物結(jié)構(gòu)，由重復(fù)單元(單糖或二糖)通過糖苷鍵結(jié)合在一起而形成。這些結(jié)構(gòu)通常是線性的，但是可含有不同程度的分支。
[0036]如本文所用，術(shù)語“淀粉”是由通過糖苷鍵結(jié)合在一起的大量葡萄糖單元組成的碳水化合物。該多糖由所有綠色植物作為能量貯存產(chǎn)生。其由兩種類型分子組成:線性和螺旋直鏈淀粉及分支的支鏈淀粉。根據(jù)植物不同，淀粉通常含有20-25%直鏈淀粉和75-80%支鏈淀粉。術(shù)語淀粉包括但不限于可溶淀粉(SS)、抗性淀粉(RS)，來自谷物(水稻、小麥和玉米)、根類蔬菜(馬鈴薯和木薯)、橡子、竹芋、秘魯胡蘿卜、香蕉、大麥、面包果、蕎麥、美人蕉、可樂果、katakur1、野葛、暗綠葉黃體芋、小米、燕麥、oca、波利尼西亞竹芋、西米、高粱、甘薯、黑麥、芋頭、栗子、荸薺和山藥、豆類如蠶豆、小扁豆、綠豆、豌豆及鷹嘴豆。
[0037]如本文所用，術(shù)語“益生菌(probiotics) ”是指當(dāng)以足夠量消耗時(shí)賦予健康益處的細(xì)菌。
[0038]如本文所用，術(shù)語“益生素(prebiotics) ”是指不可消化的食物成分物質(zhì)，其以有益于健康的方式刺激消化系統(tǒng)中細(xì)菌的生長(zhǎng)和/或活性。
[0039]如本文所用，術(shù)語“合生素(synbiotics) ”是指以協(xié)同作用形式組合益生菌和益生素的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑或藥物。合生素組合物刺激組合物中存在的及固有微生物群落中的益生菌菌株的生長(zhǎng)，在體內(nèi)呈現(xiàn)出協(xié)同作用。
[0040]如本文所用，術(shù)語“對(duì)象”是指任何活的生物體如動(dòng)物或人，其需要治療或者易感于涉及不需要的或不希望的微生物的病癥，例如需要特別治療具有如下文定義的不需要的胃腸道病原體。術(shù)語對(duì)象包括但不限于人，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和猴物種，農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物如豬、山羊和馬，馴養(yǎng)哺乳動(dòng)物如狗和貓，實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物包括嚙齒類動(dòng)物如小鼠、大鼠和豚鼠。該術(shù)語不指示特定年齡或性別。因此，成年和新生對(duì)象，無論雄性或雌性，均可包含在內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，包括人和非人哺乳動(dòng)物。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述對(duì)象是人。如本文所用，術(shù)語“致病性”是指具有導(dǎo)致疾病的能力的物質(zhì)或條件。
[0041]如本文所用，術(shù)語“胃腸道病原體”或“腸病原體”包括對(duì)胃腸道(從食管至直腸)具有致病性的微生物。其包括腸細(xì)菌(enterobacteria)、腸球菌(enterococci)、棒桿菌(corynebacteria)、鳥分枝桿菌副結(jié)核菌亞種(Mycobacterium avium subspeciesparatuberculosis)、Brachyspira hyodysenteriae、細(xì)胞內(nèi)散沫花屬(Lawsoniaintracellularis)、彎曲菌屬(campylobacter)、梭狀芽孢桿菌。胃腸道致病菌可包括沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、葡萄球菌屬、空腸彎曲菌、梭狀芽胞桿菌屬、大腸桿菌、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)等。
[0042]如本文所用，術(shù)語“細(xì)菌素”或“細(xì)菌素樣物質(zhì)”是由細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)毒素，抑制相似或密切相關(guān)的細(xì)菌菌株的生長(zhǎng)。
[0043]如本文所用，術(shù)語“治療”包括嘗試預(yù)防、補(bǔ)救、減輕對(duì)象健康問題及預(yù)防其復(fù)發(fā)，通常是在診斷之后進(jìn)行。
[0044]附圖簡(jiǎn)述
[0045]圖1是胃腸道樣轉(zhuǎn)運(yùn)模擬器(GITS)的算法。
[0046]圖2是在胃腸道樣轉(zhuǎn)運(yùn)模擬(GITS)期間通過qPCR確定的細(xì)菌計(jì)數(shù)。
[0047]圖3是在小鼠模型中用合生素、益生菌和益生素混合物預(yù)防⑶I的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
[0048]圖4是一組內(nèi)所有動(dòng)物的集合的盲腸內(nèi)容物的盲腸計(jì)數(shù)。
[0049]圖5是動(dòng)物盲腸組織的組織病理學(xué)圖。
[0050]圖6是合生素組和對(duì)照組中盲腸LAB和雙歧桿菌的qPCR結(jié)果。
[0051]發(fā)明詳述
[0052]本發(fā)明涉及合生素組合物`，其包含乳桿菌(LAB)和/或雙歧桿菌(Bif)屬的至少兩種益生菌菌株，以及一或多種益生素物質(zhì)。所述組合物中存在的至少一種細(xì)菌菌株應(yīng)具有降解淀粉的能力，并且至少一種益生素物質(zhì)應(yīng)是淀粉。所述細(xì)菌菌株應(yīng)具有附著于腸道及抑制由艱難梭菌產(chǎn)生的毒素A和B的能力，但是不抑制彼此生長(zhǎng)。此外，所述組合物中存在的至少一或多種益生素物質(zhì)應(yīng)增強(qiáng)益生菌菌株的生長(zhǎng)，但是不增強(qiáng)胃腸道病原體的生長(zhǎng)。本發(fā)明的合生素組合物有利地用于在對(duì)象的腸道粘膜建群，以預(yù)防、治療、減輕抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或由胃腸道病原體所致感染的癥狀，及預(yù)防其復(fù)發(fā)。
[0053]在目前的研究中，針對(duì)其有益性質(zhì)如附著于腸粘膜層、抗艱難梭菌(CD)和/或其它腸道病原體的抗微生物活性、降解益生素物質(zhì)及產(chǎn)生抗氧化劑等，已經(jīng)篩選和表征了超過75種不同的乳桿菌和雙歧桿菌益生菌菌株。令人驚奇地，結(jié)果是這些性質(zhì)是非常菌株特異性的，并不是對(duì)于一個(gè)屬的所有菌株均是普遍的。
[0054]乳桿菌屬于包含超過100種不同乳桿菌物種的一組(微需氧的)細(xì)菌，其在生長(zhǎng)期間產(chǎn)生乳酸。它們組成正常陰道菌群和新生兒腸道菌群的主要部分，但是也組成成人正常菌群的一部分。乳桿菌能在低PH生長(zhǎng)，且耐受生長(zhǎng)培養(yǎng)基中>20%膽汁。乳酸的產(chǎn)生使其環(huán)境變?yōu)樗嵝?，這樣抑制一些有害菌的生長(zhǎng)。嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、植物乳桿菌(L.plantarium)、干酪乳桿菌(L.casei)、畐Ij干酪乳桿菌(L.paracasei)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、雙叉乳桿菌(L.bifidus)和保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)是乳桿菌屬的一些重要物種,其可用于本發(fā)明組合物中。
[0055]雙歧桿菌屬于厭氧菌類群，其在新生兒腸道中建群，隨著年齡增加而逐漸降低。在生長(zhǎng)期間其發(fā)揮有益作用，包括調(diào)節(jié)腸道微生物內(nèi)穩(wěn)態(tài)、抑制病原體和有害菌建群和/或感染腸粘膜、調(diào)節(jié)局部和全身免疫應(yīng)答、阻抑微生物群內(nèi)促致癌(pro-carcinogenic)酶活性、產(chǎn)生維生素、及將許多飲食化合物生物轉(zhuǎn)化為生物活性分子。長(zhǎng)雙歧桿菌(B.1ongum)、短雙歧桿菌(B.breve)、動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(B.1nfantis)是雙歧桿菌屬舉例的物種，其可用于本發(fā)明組合物中。
[0056]在最初的篩選后,基于如上述有益性質(zhì)從超過75種益生菌菌株中最終選擇6種菌株(即LAB LU28，LAB LU33，Bif LU10,Bif LU29和Bif LU30)。之后對(duì)選擇的菌株針對(duì)其在彼此存在的條件下-即共培養(yǎng)期間-的存活和增殖能力以及呈現(xiàn)抗微生物活性(AMA)進(jìn)行檢測(cè)。所有選擇的乳桿菌和雙歧桿菌在共培養(yǎng)期間均存活良好，且不產(chǎn)生針對(duì)彼此的細(xì)菌素樣物質(zhì)。
[0057]對(duì)選擇的菌株針對(duì)在彼此共培養(yǎng)時(shí)對(duì)益生素如寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、異麥芽糖寡糖(IMOS)、寡聚果糖(FOS)、乳果糖、阿拉伯樹膠、β-葡聚糖、木聚糖、果膠、菊粉和/或可溶的及抗性淀粉的利用也進(jìn)行了研究。選擇的益生菌菌株的共培養(yǎng)根據(jù)其在不同的益生素組合中的益生素降解能力刺激特定的細(xì)菌菌株生長(zhǎng)。令人驚奇地，非淀粉降解菌株與淀粉降解菌株在存在淀粉作為唯一可利用益生素物質(zhì)的條件下的共培養(yǎng)，刺激非淀粉降解菌株的生長(zhǎng)。這種組合物抗⑶及其它腸道病原體的AMA被保持。這表明交叉喂養(yǎng)(cross-feeding)的新概念,證實(shí)本發(fā)明組合物的菌株之間呈現(xiàn)的協(xié)同作用。當(dāng)開發(fā)最佳組合物用于在對(duì)象腸粘膜建群以預(yù)防、治療、減輕抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體所致感染的癥狀及預(yù)防其復(fù)發(fā)中使用這個(gè)概念。
[0058]來自兩或更多種所選擇的菌株與不同組合的益生素共培養(yǎng)的無細(xì)胞上清(CFS)呈現(xiàn)出抗病原體ESBL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌2167和NAP1/027的ΑΜΑ。令人驚奇地，當(dāng)CFS提取物稀釋直至1:500時(shí)仍保持抗一些病原體及稀釋1:10時(shí)抗其它病原體的ΑΜΑ，該活性顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)生長(zhǎng)的菌株的活性。這明確示出選擇的菌株呈現(xiàn)出彼此協(xié)同作用，導(dǎo)致對(duì)抗病原體的較高ΑΜΑ。此外，選擇的菌株與CD的混合物的共培養(yǎng)降低CD的生長(zhǎng)，由CD對(duì)毒素A和B的產(chǎn)生由于選擇的益生菌的存在而被強(qiáng)烈抑制。
[0059]在所述組合物中，有利但非必需地要求一或多種細(xì)菌菌株在細(xì)菌菌株的生產(chǎn)期間已經(jīng)暴露于酸、膽汁和/或粘蛋白。酸和/或膽汁暴露誘導(dǎo)細(xì)菌中應(yīng)激反應(yīng)，其增強(qiáng)在通過胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)期間的存活能力及在腸道粘膜層建群的能力，在此其產(chǎn)生抗微生物活性(AMA)使得所述菌株發(fā)揮有益作用。
[0060]暴露于酸包括使培養(yǎng)液的pH降低，其中一或多種細(xì)菌菌株在MRS培養(yǎng)基中在PH2-5、優(yōu)選ρΗ2.5-4.5、更優(yōu)選ρΗ3_4條件下生長(zhǎng)15-150分鐘、優(yōu)選20-140分鐘、更優(yōu)選30-130分鐘、更優(yōu)選40-120分鐘。暴露于膽汁可包括在細(xì)菌菌株生產(chǎn)期間在培養(yǎng)液中加入0.1-2.5%(重量/體積)、優(yōu)選0.5-2%、更優(yōu)選1.0-1.5%?；悄懰徕c或者1-10%(體積/體積)、優(yōu)選2-7%、更優(yōu)選3-10%豬膽汁，持續(xù)2-8小時(shí)、優(yōu)選2.5-7小時(shí)、更優(yōu)選3_6小時(shí)。暴露于粘蛋白包括在細(xì)菌菌株生產(chǎn)期間使細(xì)菌菌株在存在0.01-1%(體積/體積)、優(yōu)選0.03-0.7%、更優(yōu)選0.05-0.5%粘蛋白條件下生長(zhǎng)2_8小時(shí)、優(yōu)選2.5-7小時(shí)、更優(yōu)選3_6小時(shí)。
[0061] 通常將細(xì)菌在對(duì)于生長(zhǎng)“正好”最佳的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在生長(zhǎng)期間暴露于酸、膽汁或者粘蛋白對(duì)于細(xì)菌是應(yīng)激刺激。作為防御反應(yīng)，應(yīng)激基因被誘導(dǎo)，其隨之誘導(dǎo)熱激蛋白(HSP)及其它應(yīng)激蛋白產(chǎn)生，由此使得細(xì)菌更強(qiáng)壯(robust)。暴露于酸和膽汁應(yīng)激模擬胃腸道的條件。選擇的菌株與益生素的組合物的穩(wěn)定性、強(qiáng)壯性和協(xié)同作用在胃腸道模擬器(GITS)模型以及在體內(nèi)小鼠模型中證實(shí)。[0062]基于共培養(yǎng)、共喂養(yǎng)、抗CD和腸道病原體的ΑΜΑ、毒素抑制活性、耐受暴露于酸、膽汁和/或粘蛋白的能力以及體外模擬(GITS模型)和體內(nèi)小鼠模型，選擇本發(fā)明組合物的最佳成分。本發(fā)明的組合物包含乳桿菌(LAB)和/或雙歧桿菌(Bif)的至少兩種益生菌菌株及一或多種益生素物質(zhì)。此外，所述組合物中存在的至少一種細(xì)菌菌株具有降解淀粉的能力，并且至少一種益生素物質(zhì)是淀粉。[0063]有利地，能降解淀粉的細(xì)菌菌株屬于雙歧桿菌屬，如短雙歧桿菌物種或者更特別是Bif LUlO菌株。本發(fā)明的淀粉降解菌株能降解淀粉如可溶淀粉(即在腸道中可降解的淀粉)，和/或抗性淀粉(即在腸道中不可降解的淀粉)。有利地，本發(fā)明的合生素組合物進(jìn)一步包含非淀粉降解菌株，其是副干酪乳桿菌物種如LAB LU33。
[0064]因此，本發(fā)明的有利的組合物包含至少Bif LU10，和菌株LAB LU23、LAB LU28、LABLU33、BIF LU29和/或BIF LU30中的一或多種。另一有利的組合物包含至少Bif LUlO和LAB LU33，或者包含至少BIF LUlO、LAB LU33和BIF LU30。再一有利的組合物包含至少BIFLU10、LAB LU33、BIF LU30和LAB LU28。所述組合物的益處在下文論述。
[0065]本發(fā)明的合生素組合物除了淀粉之外還可進(jìn)一步包含益生素物質(zhì)，包括二糖，寡糖和/或多糖。所述二糖可以是乳果糖。所述寡糖可以是寡聚果糖(F0S)、寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、殼聚糖寡糖(chioses)、異麥芽糖寡糖(MOS)、阿拉伯樹膠、大豆和果膠寡糖。所述多糖可以是果膠、木聚糖、菊粉、殼聚糖、阿拉伯木聚糖和/或β -葡聚糖。
[0066]優(yōu)選地，除了淀粉之外的至少一或多種進(jìn)一步的益生素物質(zhì)是寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、異麥芽糖寡糖(MOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖。
[0067]因此，本發(fā)明的組合物可例如包含如上述兩或更多種細(xì)菌菌株，淀粉及一或多種進(jìn)一步的益生素物質(zhì)，包括寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、異麥芽糖寡糖(IMOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖。
[0068]本發(fā)明的組合物可有利地用于在對(duì)象的腸粘膜建群。如本文所用，術(shù)語“對(duì)象”是指需要治療或者易感于涉及不想要的或不希望的胃腸道微生物感染的病癥，例如需要特別治療具有如上述不想要的病原性胃腸道感染。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，包括人和非人哺乳動(dòng)物。當(dāng)所述對(duì)象是人時(shí)其應(yīng)用特別有益處。
[0069]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于預(yù)防、治療、減輕艱難梭菌相關(guān)腹瀉(CDAD)和/或胃腸道(GI)病原體所致感染的癥狀和/或預(yù)防其復(fù)發(fā)。如本文所用，術(shù)語“胃腸道病原體”是指可以在對(duì)象中導(dǎo)致感染的病毒、寄生蟲和細(xì)菌，例如當(dāng)所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物如人時(shí)。胃腸道致病性細(xì)菌可包括沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、葡萄球菌屬、空腸彎曲菌、梭狀芽胞桿菌屬、大腸桿菌、耶爾森氏菌屬、霍亂弧菌及其它菌屬細(xì)菌。
[0070]有利地，所述組合物可用于預(yù)防、治療、減輕由不同毒力和核糖體分型(ribotype)的艱難梭菌菌株引起的抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)的癥狀，和/或預(yù)防其復(fù)發(fā)。艱難梭菌是梭狀芽胞桿菌屬的一種厭氧種，其以較低計(jì)數(shù)組成正常腸道菌群的一部分。艱難梭菌是抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)的最嚴(yán)重的致病菌，可導(dǎo)致假膜性結(jié)腸炎，這是一種結(jié)腸的嚴(yán)重感染，通常由于抗生素對(duì)正常腸道菌群的摧毀。在生長(zhǎng)期間，艱難梭菌產(chǎn)生及分泌毒力因子，例如毒素A和B。毒素A對(duì)于所有細(xì)胞均是毒性的，而毒素B對(duì)于腸細(xì)胞是毒性的，其損害該細(xì)胞并誘導(dǎo)分泌(腹瀉)。本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防、治療、減輕由選自核糖體分型CD NAP1/027、CD1939、CD2167、CD1958、CD2165、CD2166、CD2168、CD027 和 CD1551 的艱難梭菌菌株引起的抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)的癥狀，及預(yù)防其復(fù)發(fā)。
[0071] 本發(fā)明另一方面提供了上述組合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于在對(duì)象腸粘膜建群，并用于預(yù)防、治療、減輕所述對(duì)象中抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體感染的癥狀及預(yù)防其復(fù)發(fā)。
[0072]本發(fā)明另一方面提供了上述組合物在制備用于治療患有抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體感染的對(duì)象的藥物中的應(yīng)用。
[0073]本發(fā)明另一方面提供了上述組合物在制備用于預(yù)防抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體導(dǎo)致感染的復(fù)發(fā)的藥物中的應(yīng)用。
[0074]本發(fā)明組合物中的益生素物質(zhì)和益生菌菌株可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法在任何純度水平分離，純化可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方式實(shí)現(xiàn)，如蒸餾、再結(jié)晶和層析。
[0075]用于本發(fā)明組合物中的培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞可通過使用任何方法從培養(yǎng)液中分離，包括但不限于離心、過濾或傾析。分離自發(fā)酵培養(yǎng)液的細(xì)胞任選用水、鹽水(0.9%NaCl)或者用任何合適的緩沖液洗滌。獲得的濕細(xì)胞物質(zhì)可以通過任何合適方法干燥，優(yōu)選通過凍干法。
[0076]本發(fā)明組合物中的益生素物質(zhì)和益生菌可以單獨(dú)施用或者與藥物學(xué)可接受的載體或稀釋劑一起施用，這種施用可以單一劑量或多劑量進(jìn)行。
[0077]在本發(fā)明的組合物中，益生素成分以基于所述組合物總重量的5%_99%、優(yōu)選30%_95%、更優(yōu)選50%_90%的量(重量)存在。相應(yīng)地，益生菌成分以基于所述組合物總重量的1%-15%、優(yōu)選5%-10%的量(重量)存在。如果存在，補(bǔ)足所述合生素組合物100%量的部分由另外的物質(zhì)如佐劑和/或賦形劑或者適當(dāng)?shù)奶砑觿?載體組成。
[0078]在藥物組合物(例如片劑)中,本發(fā)明的組合物組成基于所述藥物組合物總重量的40-70%，剩余部分是藥物學(xué)可接受的佐劑和/或賦形劑。
[0079]在食物組合物(例如奶酪或巧克力)中，所述合生素組合物組成所述食物組合物總重量的1-15%。
[0080]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述合生素組合物含有的細(xì)菌菌株的量相對(duì)于所述合生素組合物重量為 IxlO8 至 lxl013CFU/g，優(yōu)選 IxlO9 至 lxlOnCFU/g。
[0081]組合物可例如是片劑、丸劑囊劑、小瓶、硬膠囊或軟膠囊、水性或油性懸浮液、水性或油性溶液、乳狀液、粉末、顆粒、糖漿、酏劑、錠劑、可重建的粉末、液體制備物、霜?jiǎng)?、含片、硬糖、噴霧劑、乳霜、膏劑、膠狀物、凝膠、糊劑、注射溶液、液體氣霧劑、干粉配制物、HFA氣霧劑或者有機(jī)酸或無機(jī)酸加成鹽。
[0082]本發(fā)明的組合物可以是適于通過口服或者通過吸入或吹入(如經(jīng)鼻、氣管、支氣管)途徑施用的形式。
[0083]對(duì)于口服、口腔或舌下粘膜施用，本發(fā)明的益生素和益生菌可以與多種賦形劑組合。口服施用的液體組合物可以是例如乳狀液、糖漿或酏劑形式，或者可以是干燥產(chǎn)物形式，在使用之前用水或其它合適載體重建。其它合適的充填劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑及其它賦形劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
[0084]本發(fā)明還涉及上文定義的組合物，其中所述組合物是食物組合物、食物補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)食品組合物、藥物組合物和動(dòng)物飼料的至少之一或一部分。
[0085]本發(fā)明另一方面提供了在對(duì)象中在腸粘膜建群及預(yù)防、治療、減輕抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體所致感染的癥狀以及預(yù)防其復(fù)發(fā)的方法，所述方法包括給有需要的對(duì)象施用有效劑量的上述組合物的步驟。根據(jù)治療的病癥和患者以及施用途徑的不同，所述組合物可以不同劑量施用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物含有IxlO7至IxIO13CFU/劑和細(xì)菌菌株，優(yōu)選IxlO9至IxIO11CFU/劑和細(xì)菌菌株。
[0086]通過實(shí)驗(yàn)例證本發(fā)明的有利之處。然而，下文所述實(shí)驗(yàn)只是舉例說明本發(fā)明，不應(yīng)限制本發(fā)明。本發(fā)明權(quán)利要求書范圍內(nèi)的其它方案、應(yīng)用、目的和功能應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。
[0087]選擇本發(fā)明組合物的菌株的原理
[0088]從使用的菌株庫(kù)中選擇最有希望的菌株的主要選擇標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)抗腸道病原體包括艱難梭菌的抗微生物活性(AMA)，及附著于腸壁的能力，其通過剛果紅結(jié)合(CRB)和鹽聚集試驗(yàn)(SAT)測(cè)量。接下來的標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)至少一種或一種以上的益生素物質(zhì)的發(fā)酵。所測(cè)試的菌株的篩選結(jié)果在表1中示出。
[0089]細(xì)胞表面疏水性(CSH)是微生物在腸道內(nèi)結(jié)合及相互作用以及在粘膜層中與病原體抗?fàn)幍闹匾再|(zhì)。CSH基于如下所述CRB和SAT測(cè)定確定。CRB是通過將經(jīng)洗滌的細(xì)胞與剛果紅(于PBS中100 μ g/ml) 一起保溫10分鐘，隨后離心(9，OOOgX 30分鐘)而進(jìn)行。通過測(cè)量在480nm的吸光度上清中剩余的剛果紅確定。在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2，0.015M)中的剛果紅用作對(duì)照。CRB表示為結(jié)合的剛果紅的百分比。因此結(jié)果越接近于100則細(xì)胞表面疏水性越高。CSH通過鹽聚集試驗(yàn)(SAT)確定。10微升在PBS中的經(jīng)洗滌的細(xì)胞懸液在玻片上與范圍為0.02M至4M的各種摩爾濃度的10微升pH6.8硫酸銨混合。一分鐘后觀察聚集。SAT結(jié)果表示為菌株聚集的最低鹽濃度(M)。聚集所需鹽濃度越低意味著細(xì)胞表面疏水性越高。
[0090]潛在益生菌株的AMA使用如下微滴定平板(MTP)針對(duì)腸道病原體ESBL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、`鼠傷寒沙門氏菌和4種不同艱難梭菌而確定:通過離心(3，20(^，20111丨11，4。0從在]\--(06 Man Rogosa Sharpe)和 MRSC (含有 0.05% (w/v)鹽酸L-半胱氨酸的MRS)培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的乳桿菌和雙歧桿菌24小時(shí)培養(yǎng)物收獲無細(xì)胞上清培養(yǎng)物(CFS)濾液，所述上清用0.2微米過濾器過濾。為確定AMA，將CFS加到MTP。在滅菌腦心浸液(BHI)肉湯中制備不同稀釋液(1:1，1:10，1:100和1:500)。將100微升上清加入到微滴定孔中并且在37°C無氧保溫過夜，用Anoxomat i培養(yǎng)系統(tǒng)(MART，The Netherlands)平衡。腸道病原體細(xì)胞在Fructose Fastidious瓊脂平板上無氧生長(zhǎng)24小時(shí)。細(xì)胞用PBS洗2次，重懸于無菌PBS中。在BHI肉湯中制備A62tl=0.02的10微升腸道病原體細(xì)胞，并加入到過夜預(yù)還原的MTP中。在48小時(shí)(CD病原體)/24小時(shí)(其它病原體)后用平板分析儀在OD62tl測(cè)量生長(zhǎng)，結(jié)果表示為相對(duì)于無CFS對(duì)照孔中的生長(zhǎng)而計(jì)算的腸道病原體生長(zhǎng)抑制百分比。
[0091]


/ODt X100、
CDli K 抑制白'分比=loo —
[0092]ODt和Odc代表在LAB或者雙歧桿菌的CFS存在和不存在下的⑶生長(zhǎng)。類似地，確定乳桿菌和雙歧桿菌共培養(yǎng)提取物針對(duì)CD的ΑΜΑ。相同公式用于所有腸道病原體。[0093]潛在益生菌株降解益生素的能力的初步篩選如下進(jìn)行:乳桿菌和雙歧桿菌菌株最初在MRS/MRSC瓊脂上微有氧和無氧條件下在37°C生長(zhǎng)。每種菌株的單菌落然后作為小塊涂布在用于乳桿菌的不含葡萄糖并且具有1%(重量/體積)益生素(寡聚果糖(F0S)、寡聚木糖(XOS)、寡聚半乳糖(GOS)、菊粉(inulin)、可溶性淀粉(SS)、抗性淀粉(RS)、果膠、異麥芽糖寡糖(MOS)、乳果糖)的基礎(chǔ)MRS瓊脂或者用于雙歧桿菌的補(bǔ)加0.05% (w/v)鹽酸L-半胱氨酸瓊脂的具有1%(重量/體積)益生素(FOS, FOS (Orafti)，XOS, G0S,菊粉，SS, RS,果膠，頂OS，乳果糖)作為主要碳源的際蛋白胨酵母膏(PY)瓊脂，具有每升30mg溴甲酚紫，在微有氧(乳桿菌)或者無氧條件(雙歧桿菌)下在37°C保溫48小時(shí)。各種LAB和雙歧桿菌對(duì)FOS、FOS (Orafti)、XOS、G0S、菊粉、SS、RS和果膠的降解能力可見于表1 (見腳注)。
[0094]表1.剛果紅結(jié)合、鹽聚集試驗(yàn)、AMA及益生素降解的篩選結(jié)果
[0095]縮寫如下:-H-高活性一≤70%抑制，中等一41-69%抑制，低≤40%抑制，nd—未確定；Vw+-非常弱；2+強(qiáng)陽性；3+非常強(qiáng)陽性?；诒?提供的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇表2的益生菌株進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。[0096]
【權(quán)利要求】
1.合生素組合物，其包含選自乳桿菌(Lactobacillus)屬和雙歧桿菌(Bifidobacteria)屬的至少兩種細(xì)菌菌株,及一或多種益生素物質(zhì),特征在于: -所述細(xì)菌菌株中的至少一種能降解淀粉；及 -至少一種益生素物質(zhì)是淀粉。
2.權(quán)利要求1的合生素組合物，其中所述能降解淀粉的細(xì)菌菌株屬于雙歧桿菌屬。
3.權(quán)利要求1的合生素組合物，其中所述能降解淀粉的細(xì)菌菌株是短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)物種。
4.權(quán)利要求1的合生素組合物，其中所述能降解淀粉的細(xì)菌菌株是BifLU10。
5.權(quán)利要求1的合生素組合物，其中所述淀粉是抗性淀粉(RS)和/或可溶淀粉(SS)。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的合生素組合物，其中所述細(xì)菌菌株之一是非淀粉降解菌株。
7.權(quán)利要求6的合生素組合物，其中所述非淀粉降解細(xì)菌菌株是副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)物種。
8.權(quán)利要求6的合生素組合物，其中所述非淀粉降解細(xì)菌菌株是LABLU33。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的合生素組合物，其包含至少BifLU10，及包含菌株LAB LU23、LAB LU28、LAB LU33、BIF LU29 和 / 或 BIF LU30 中的一或多種。
10.權(quán)利要求9的合生素組合物，其包含至少BifLUlO和LAB LU33。
11.權(quán)利要求9的合生素組合物，其包含至少BIFLU10、LAB LU33和BIF LU30。
12.權(quán)利要求9的合生素組合物，其包含至少BIFLUlO, LAB LU33、BIF LU30和LABLU28。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的合生素組合物，其中所述一或多種細(xì)菌菌株在其生產(chǎn)期間已經(jīng)暴露于酸、膽汁和/或粘蛋白。
14.權(quán)利要求13的合生素組合物，其中所述暴露于酸包括在所述細(xì)菌菌株生長(zhǎng)期間使培養(yǎng)液的pH降低至pH2-5、優(yōu)選降低至pH2.5-4.5、更優(yōu)選降低至pH3-4，持續(xù)15-150分鐘、優(yōu)選20-140分鐘、更優(yōu)選30-130分鐘、更優(yōu)選40-120分鐘。
15.權(quán)利要求13的合生素組合物，其中所述暴露于膽汁包括使所述細(xì)菌菌株在存在0.1-2.5%(重量/體積)、優(yōu)選0.5-2%、更優(yōu)選1.0-1.5%?；悄懰徕c或者1-10%(體積/體積)、優(yōu)選2-7%、更優(yōu)選3-5%豬膽汁的條件下生長(zhǎng)2-8小時(shí)、優(yōu)選2.5-7小時(shí)、更優(yōu)選3-6小時(shí)。
16.權(quán)利要求13的合生素組合物，其中所述暴露于粘蛋白包括使所述細(xì)菌菌株在存在0.01-1%(體積/體積)、優(yōu)選0.03-0.7%、更優(yōu)選0.05-0.5%粘蛋白的條件下生長(zhǎng)2-8小時(shí)、優(yōu)選2.5-7小時(shí)、更優(yōu)選3-6小時(shí)。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的合生素組合物，其進(jìn)一步包含屬于由二糖、寡糖和/或多糖組成的的組的益生素物質(zhì)。
18.權(quán)利要求17的合生素組合物，其中所述二糖是乳果糖。
19.權(quán)利要求17的合生素組合物，其中所述寡糖來自由寡聚果糖(F0S)、寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、殼聚糖寡糖、異麥芽糖寡糖(MOS)、阿拉伯樹膠、大豆-寡糖和果膠-寡糖組成的組。
20.權(quán)利要求17的合生素組合物，其中所述多糖來自由果膠、木聚糖、菊粉、殼聚糖和/或β-葡聚糖組成的組。
21.權(quán)利要求17的合生素組合物，其進(jìn)一步包含屬于由寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、異麥芽糖寡糖(MOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖組成的組的益生素物質(zhì)。
22.權(quán)利要求17的合生素組合物，其進(jìn)一步包含寡聚半乳糖(GOS)和/或異麥芽糖寡糖(IMOS)。
23.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的合生素組合物，其用于在對(duì)象腸粘膜中建群。
24.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的合生素組合物，其用于預(yù)防、治療、減輕對(duì)象中抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體所致感染的癥狀，和/或預(yù)防抗生素相關(guān)腹瀉和/或胃腸道病原體所致感染的復(fù)發(fā)。
25.權(quán)利要求24的合生素組合物，其中所述抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)由艱難梭菌(Clostridium difficile)引起。
26.權(quán)利要求24的合生素組合物，其中所述胃腸道病原體所致感染是由沙門氏菌(Salmonella)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、產(chǎn)超廣譜β_內(nèi)酰胺酶(ESBL)大腸桿菌導(dǎo)致。
27.權(quán)利要求23-26的合生素組合物，其中所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
28.權(quán)利要求27的合生素組合物，其中所述哺乳動(dòng)物屬于由人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、牛、綿羊、豬、山羊和馬、狗、貓、嚙齒動(dòng)物和豚鼠組成的組。
29.權(quán)利要求23-26的合生素組合物，其中所述對(duì)象是人。
30.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的合生素組合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于在對(duì)象腸粘膜建群，以預(yù)防、治療、減輕抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體感染的癥狀，及預(yù)防抗生素相關(guān)腹瀉和/或胃腸 道病原體感染的復(fù)發(fā)。
31.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的合生素組合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療患有抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)和/或胃腸道病原體所致感染的對(duì)象。
32.在對(duì)象腸粘膜建群的方法，所述方法包括給有需要的對(duì)象施用有效劑量的權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的合生素組合物的步驟。
33.一種治療患有抗生素相關(guān)腹瀉和/或胃腸道病原體所致感染的對(duì)象的方法，所述方法包括給有需要的對(duì)象施用有效劑量的權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的合生素組合物的步驟。
【文檔編號(hào)】A61P1/00GK103491969SQ201280009395
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月9日
【發(fā)明者】T·瓦德斯特倫, A·榮, P·安巴南, K·K·孔德普迪 申請(qǐng)人:拉維沃公司