具有γ干擾素的抗原呈遞癌癥疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供治療黑色素瘤的試劑、方法和試劑盒。該試劑包括干擾素-γ(IFN-γ)應(yīng)答的黑色素瘤細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，并且其中所述細(xì)胞表達(dá)MHC?II類分子。在另一方面，所述試劑包括負(fù)載了干擾素-γ應(yīng)答的、非凋亡性的、表達(dá)MHC?II類的黑色素瘤細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】具有Y干擾素的抗原呈遞癌癥疫苗
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求享有2011年10月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/549681和2012年2月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/594304的全部巴黎公約優(yōu)先權(quán)及其權(quán)益，上述兩篇臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文,如同其全部?jī)?nèi)容在本文中闡述一樣。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及治療黑色素瘤、篩選適合治療的受試者、物質(zhì)組合物、方法和試劑盒。
[0004]發(fā)明背景
[0005]癌癥的特征是缺乏對(duì)癌癥有效的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的缺乏可由以下事實(shí)引起:例如許多腫瘤抗原是“自身抗原”;腫瘤細(xì)胞缺乏MHC的表達(dá)以及由此產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞缺乏腫瘤抗原的呈遞；巨噬細(xì)胞與腫瘤的關(guān)聯(lián)，該巨噬細(xì)胞表達(dá)降低免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子；以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的免疫抑制活性。對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的缺乏還可以由以下事實(shí)引起:腫瘤細(xì)胞傾向于不表達(dá)那些刺激先天性免疫應(yīng)答的分子，即刺激Toll樣受體(TLRs)或核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體的分子。癌癥包括實(shí)體腫瘤以及諸如白血病和骨髓發(fā)育不良綜合征的血液癌癥。
[0006]免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫、體液免疫、補(bǔ)體反應(yīng)(complement response)。細(xì)胞免疫包括多種細(xì)胞和多種活動(dòng)的網(wǎng)絡(luò)，涉及樹(shù)突細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞；細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞)和CD4+T細(xì)胞(輔助T細(xì)胞)。樹(shù)突細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)獲得多肽抗原，其中這些抗原可以從DC的外部獲得，也可以在DC的內(nèi)部由感染生物體來(lái)生物合成。DC處理多肽，得到長(zhǎng)度約10個(gè)氨基酸的肽，并將這些肽傳輸給MHC I類或MHC II類以形成復(fù)合體，并將復(fù)合體運(yùn)(shuttles)到DC的表面。當(dāng)攜帶MHC I類/肽復(fù)合體的DC與CD8+T細(xì)胞接觸時(shí)，結(jié)果是CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。對(duì)于MHC II類所起的作用，當(dāng)攜帶MHC II類/肽復(fù)合體的DC與CD4+T細(xì)胞接觸時(shí)，其結(jié)果是CD4+T細(xì)胞的活化和增殖(Munz等(2010)Curr.0pin.1mmunol.22:89-93 ；Monaco(1995)J.Leukocyte Biol.57:543-547 ；Robinson等(2002) Immunologyl05:252-262)。盡管呈遞抗原給T細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞能夠“活化”該T細(xì)胞，活化的T細(xì)胞可能不能夠具有有效的免疫應(yīng)答。CD8+T細(xì)胞的有效的免疫應(yīng)答通常需要DC通過(guò)一次或多次多個(gè)交互來(lái)在先刺激(prior stimulation)。這些交互包括⑶4+T細(xì)胞與DC的直接接觸(通過(guò)⑶4+Τ細(xì)胞的⑶40配體與DCs的⑶40受體接觸的方式)，或者TLR激動(dòng)劑與樹(shù)突細(xì)胞的toll樣受體(TLRs)中的一個(gè)受體的直接接觸。
[0007]體液免疫涉及B細(xì)胞和抗體。B細(xì)胞被轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞表達(dá)并分泌抗體。初始B細(xì)胞的區(qū)別在于它們不表達(dá)標(biāo)志物(marker)CD27，而抗原特異性B細(xì)胞則表達(dá)CD27 (Perez-Andres 等(2010) Cytometry Part B78B (Suppl.1)S47_S60)。分泌的抗體隨后可以與駐留在腫瘤細(xì)胞表面上的腫瘤抗原結(jié)合。結(jié)果是受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞被抗體標(biāo)記。隨著抗體與受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，結(jié)合的抗體介導(dǎo)(mediates)殺滅受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，其中殺滅 細(xì)胞是由NK細(xì)胞進(jìn)行的。盡管并沒(méi)有以配置T細(xì)胞來(lái)識(shí)別靶抗原的方式對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行配置來(lái)識(shí)別特定的靶抗原，但是NK細(xì)胞與抗體的恒定區(qū)域結(jié)合的能力使得NK細(xì)胞能夠特異性地殺滅抗體所標(biāo)記的細(xì)胞。NK細(xì)胞對(duì)抗體的識(shí)別是由與抗體的Fe部分結(jié)合的(NK細(xì)胞的)Fc受體介導(dǎo)的。這種類型的殺滅被稱為抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)。NK細(xì)胞也可以不依賴ADCC機(jī)理來(lái)殺滅細(xì)胞，在這種情況下這種殺滅需要在靶細(xì)胞中MHC I類的表達(dá)損失或缺乏(參見(jiàn)例如Caligiuri (2008)Bloodll2:461-469)。
[0008]可以使用“遲發(fā)型超敏反應(yīng)”(delayedtype hypersensitivity response)技術(shù)來(lái)區(qū)分主要涉及細(xì)胞免疫的免疫應(yīng)答或主要涉及體液免疫的免疫應(yīng)答。遲發(fā)型超敏反應(yīng)的陽(yáng)性信號(hào)表明細(xì)胞應(yīng)答(參見(jiàn)，例如Roychowdhury等(2005) AAPS J.E834-E846)。
[0009]自噬是一個(gè)穩(wěn)態(tài)過(guò)程，細(xì)胞溶質(zhì)(cytosolic)成分和細(xì)胞器通過(guò)該過(guò)程被輸送到溶酶體降解。自噬也與細(xì)胞內(nèi)病原體的先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答有關(guān)，細(xì)胞溶質(zhì)抗原借助于細(xì)胞內(nèi)病原體而被負(fù)載到主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibilitycomplex, MHC) II類分子上，用于⑶4+T細(xì)胞識(shí)別。
[0010]說(shuō)明
[0011]本文中使用時(shí)，包括所附權(quán)利要求書(shū)中使用時(shí)，除文本另有明確說(shuō)明外，諸如“一個(gè)”、“一種” (“a”和“an”)和“所述”的詞語(yǔ)的單數(shù)形式包括其相應(yīng)的復(fù)數(shù)指示物。本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文，并入的程度如同明確且單獨(dú)地指出各個(gè)出版物、專利、公開(kāi)的專利申請(qǐng)和序列表以及在所述公開(kāi)和專利文獻(xiàn)中的圖片和照片通過(guò)引用并入本文一樣。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明提供制備樹(shù)突細(xì)胞疫苗的方法，其包括用防止細(xì)胞分裂的試劑處理從第一受試者獲得的黑色素瘤細(xì)胞，用IFN-Y或IFN-Y模擬物(mimetic)處理黑色素瘤細(xì)胞，選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，并且將所選擇的黑色素瘤細(xì)胞與來(lái)自相同第一受試者的自體樹(shù)突細(xì)胞接觸。本發(fā)明還提供包含通過(guò)上述方法所制得的樹(shù)突細(xì)胞疫苗的組合物。本發(fā)明還提供的是刺激對(duì)黑色素瘤特異性抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括向患有黑色素瘤的受試者施用/給藥(administering)上述組合物。
[0014]疫苗包含來(lái)自患有黑色素瘤的給定受試者的哺乳動(dòng)物樹(shù)突細(xì)胞群落，并且其中受試者含有黑色素瘤細(xì)胞，其中當(dāng)在體外用IFN-Y或IFN-Y模擬物處理時(shí)，受試者所包含的黑色素瘤細(xì)胞包括自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，其中樹(shù)突細(xì)胞包含黑色素瘤特異性肽抗原，其中所述黑色素瘤特異性肽抗原被樹(shù)突細(xì)胞從所述黑色素瘤細(xì)胞(或者在所述黑色素瘤細(xì)胞)體外獲得，其中樹(shù)突細(xì)胞所包含的超過(guò)60%的黑色素瘤特異性肽來(lái)自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，其中樹(shù)突細(xì)胞所包含的小于40 %的黑色素瘤特異性肽來(lái)自非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，并且其中樹(shù)突細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞來(lái)自相同的受試者。本發(fā)明還提供上述樹(shù)突細(xì)胞群落，其中通過(guò)粘附到表面來(lái)獲得自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，超過(guò)80%的黑色素瘤特異性肽來(lái)自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，并且其中小于20%的黑色素瘤特異性肽來(lái)自非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，超過(guò)90%的黑色素瘤特異性肽來(lái)自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，并且其中小于10%的黑色素瘤特異性肽來(lái)自非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞。[0017]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有的黑色素瘤特異性肽均來(lái)自不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
[0018]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有的黑色素瘤特異性肽來(lái)自由于黑色素瘤細(xì)胞受到輻照而不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
[0019]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有的黑色素瘤特異性肽來(lái)自由于黑色素瘤細(xì)胞的染色體被核酸交聯(lián)劑交聯(lián)而不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
[0020]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，所有的黑色素瘤特異性肽來(lái)自IFN-Y處理過(guò)或IFN-Y模擬物處理過(guò)的黑色素瘤細(xì)胞。
[0021]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，所有的黑色素瘤特異性肽來(lái)自未經(jīng)IFN-Y處理過(guò)或未經(jīng)IFN-Y模擬物處理過(guò)的黑色素瘤細(xì)胞。
[0022]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，存在來(lái)自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的第一數(shù)目的黑色素瘤特異性肽，并且其中存在來(lái)自非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的第二數(shù)目的 黑色素瘤特異性肽，并且其中所述第一數(shù)目和第二數(shù)目二者均指的是黑色素瘤特異性抗原類的數(shù)目，黑色素瘤特異性抗原類是S-100、HMB-45、Mel-2, Melan-A,Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶中的一種，并且其中所述超過(guò)60 %是從第一數(shù)目獲得的，并且其中所述小于40 %是從第二數(shù)目獲得的。
[0023]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，存在來(lái)自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的第一數(shù)目的黑色素瘤特異性肽，并且其中存在來(lái)自非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的第二數(shù)目的黑色素瘤特異性肽，并且其中所述第一數(shù)目和第二數(shù)目二者均指的是黑色素瘤特異性抗原類的數(shù)目，黑色素瘤特異性抗原類是s-100、HMB-45、Mel-2, Melan-A,Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶中的兩種，并且其中所述超過(guò)60 %是從第一數(shù)目獲得的，并且其中所述小于40 %是從第二數(shù)目獲得的。
[0024]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，存在來(lái)自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的第一數(shù)目的黑色素瘤特異性肽，并且其中存在來(lái)自非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的第二數(shù)目的黑色素瘤特異性肽，并且其中所述第一數(shù)目和第二數(shù)目二者均指的是黑色素瘤特異性抗原類的數(shù)目，黑色素瘤特異性抗原類是s-100、HMB-45、Mel-2, Melan-A,Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶中的三種，并且其中所述超過(guò)60%是從第一數(shù)目獲得的，并且其中所述小于40%是從第二數(shù)目獲得的。其他實(shí)施方式使用上述抗原中的四種、五種、六種、七種或八種。本發(fā)明還包含完全不同的黑色素瘤特異性抗原的用途。
[0025]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有黑色素瘤特異性肽來(lái)自經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞。
[0026]本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有黑色素瘤特異性肽來(lái)自在體外經(jīng)處理而不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。本發(fā)明還包括上述疫苗，其中給定受試者是人類受試者。
[0027]此外，本發(fā)明提供疫苗，其中給定受試者是非人的哺乳動(dòng)物。
[0028]本發(fā)明公開(kāi)了刺激對(duì)黑色素瘤特異性抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括向受試者施用免疫刺激量的上述疫苗。
[0029]本發(fā)明公開(kāi)了一種方法，其中受刺激的免疫應(yīng)答包括CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和B細(xì)胞應(yīng)答中的一種或多種。[0030]本發(fā)明公開(kāi)了一種方法，其中通過(guò)ELISPOT測(cè)定、通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測(cè)定、通過(guò)四聚體測(cè)定、或者通過(guò)檢測(cè)抗原特異性抗體的產(chǎn)生來(lái)測(cè)定CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、CDS+T細(xì)胞應(yīng)答或B細(xì)胞應(yīng)答。
[0031]本發(fā)明公開(kāi)了一種方法，其中免疫應(yīng)答包括含有2年總生存率(OS)的生存時(shí)間，并且其中2年總生存率至少為60%。
[0032]此外，本發(fā)明提供了上述方法，其中所述施用包括皮下注射疫苗。
[0033]本發(fā)明公開(kāi)了一種方法，其中施用包括將每周給予的疫苗注射三個(gè)月，然后每月給予的疫苗注射五個(gè)月。
[0034]本發(fā)明公開(kāi)了制備樹(shù)突細(xì)胞疫苗的方法。
[0035]本發(fā)明公開(kāi)了制備樹(shù)突細(xì)胞疫苗的方法，該樹(shù)突細(xì)胞疫苗包含來(lái)自相同受試者的黑色素瘤細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，其中用防止細(xì)胞分裂的試劑處理一種或多種(一個(gè)或多個(gè))黑色素瘤細(xì)胞，其中用干擾素-Y (IFN-Y)或IFN-Y模擬物在體外處理所述一種或多種黑色素瘤細(xì)胞，其中選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，其中丟棄非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，并且其中向一種或多種自體樹(shù)突細(xì)胞提供所述自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，或者其中向一種或多種自體樹(shù)突細(xì)胞提供衍生自所述自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的肽。
[0036]本發(fā)明公開(kāi)包含至少一種經(jīng)干擾素(IFN)-Y處理的來(lái)自第一受試者的黑色素瘤細(xì)胞和至少一種來(lái)自相同第一受試者的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的組合物，其中黑色素瘤細(xì)胞是:自噬性的；非凋亡性的；并且表達(dá)MHC II類分子。在另一方面，本發(fā)明包括上述組合物，其中經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞負(fù)載到APC中；以及上述組合物，其中經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞未負(fù)載到APC中。在另一方面，本發(fā)明包含上述組合物，其中黑色素瘤細(xì)胞來(lái)自患有 I 期(Stage I)、II 期(Stage II)、III 期(Stage III)或 IV 期(Stage IV)黑色素瘤的受試者。此外，本發(fā)明涉及上述組合物、相關(guān)的試劑盒和相關(guān)的方法，其中APC包含至少一種樹(shù)突細(xì)胞。
[0037]在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物、試劑和相關(guān)的方法利用癌癥細(xì)胞的制劑，該制劑在IFN-Y處理后為7-AAD陰性并且annexin V陰性。這種群落(population)的非限制性例子可以是，例如約99% 7-AAD陰性和約99% annexin V陰性、或者至少約95% 7-AAD陰性和約95% annexin V陰性、或者至少約90% 7-AAD陰性和約90% annexin V陰性。
[0038]此外，本發(fā)明包含上述組合物，其中自噬是通過(guò)如下測(cè)試證明的，該測(cè)試測(cè)定微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3);以及上述組合物，其中使用7-氨基放線菌素D(7-AAD)試劑或annexin(膜聯(lián)蛋白)試劑中至少一種來(lái)證明細(xì)胞是非凋亡性的。
[0039]在方法方面，本發(fā)明提供制造如上所述組合物的方法，其包括從第一受試者中去除至少一種黑色素瘤細(xì)胞，從第一受試者中去除至少一種APC，并且允許黑色素瘤細(xì)胞與APC接觸；以及刺激對(duì)受試者或患者中黑色素瘤的免疫應(yīng)答的方法，其包含向受試者施用上述組合物。
[0040]本發(fā)明涉及一種方法，其中來(lái)自患者的黑色素瘤細(xì)胞是非凋亡性的，是自噬性的，并且其中黑色素瘤細(xì)胞通過(guò)表達(dá)MHC II類分子來(lái)對(duì)加入的IFN-Y做出應(yīng)答；以及上述方法，其中在負(fù)載到抗原呈遞細(xì)胞上之前，輻照黑色素瘤細(xì)胞。
[0041] 本發(fā)明涉及治療黑色素瘤患者中黑色素瘤的方法，其包括確定黑色素瘤細(xì)胞對(duì)IFN- Y的促凋亡作用不敏感，并給受試者施用一種或多種如上組合物。
[0042]在另一方面，本發(fā)明提供刺激或增強(qiáng)對(duì)黑色素瘤患者中黑色素瘤的免疫應(yīng)答的方法，其包括確定黑色素瘤細(xì)胞對(duì)IFN-Y的促凋亡作用不敏感，并給受試者施用一種或多種如上所述的組合物。還提供上述方法，其中免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答和先天性免疫應(yīng)答中的一種或多種。
[0043]在試劑盒方面，本發(fā)明提供用于測(cè)試對(duì)受試者中腫瘤抗原的免疫應(yīng)答的試劑盒，其中通過(guò)一種或多種上述方法來(lái)治療受試者，并且其中試劑盒包含檢測(cè)體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答和先天性免疫應(yīng)答的試劑。
[0044]定義
[0045]免疫刺激量可以是，但不限于，以可測(cè)量的量增加ELISPOT測(cè)定結(jié)果的量、以可測(cè)量的量增加ICS測(cè)定結(jié)果的量、以可測(cè)量的量增加四聚體測(cè)定結(jié)果的量、以可測(cè)量的量增加抗原特異性⑶4+T細(xì)胞的血液總數(shù)(blood population)的量、以可測(cè)量的量增加抗原特異性⑶8+T細(xì)胞的血液總數(shù)的量、或者其中當(dāng)與合適的對(duì)照相比時(shí)增加了至少30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%U00%U.5 倍、2.0 倍、3.0 倍等。合適的對(duì)照可以是對(duì)照疫苗，其中沒(méi)有用黑色素瘤細(xì)胞負(fù)載樹(shù)突細(xì)胞，或者沒(méi)有用衍生自黑色素瘤細(xì)胞的肽負(fù)載樹(shù)突細(xì)胞。 [0046]術(shù)語(yǔ)“黑色素瘤特異性抗原”包括通常與黑色素瘤相關(guān)的抗原，并且其中該抗原對(duì)于黑色素瘤來(lái)說(shuō)被認(rèn)為是唯一的，而不是與其他癌癥有關(guān)，并且此外，術(shù)語(yǔ)“黑色素瘤特異性抗原類”包括通常與黑色素瘤相關(guān)的抗原，并且其中該抗原也與諸如乳腺癌、大腸癌等其他類型癌癥有關(guān)。
[0047]在輻照本發(fā)明的黑色素瘤細(xì)胞的上下文中，“輻照”優(yōu)選地通過(guò)Y-輻照，但也包括通過(guò)X-射線、電子、中子、質(zhì)子、電磁輻照、可見(jiàn)光、紫外光等的輻照。在一個(gè)方面，輻照起到防止黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂的作用。在另一方面，輻照不僅防止細(xì)胞分裂，而且使細(xì)胞蛋白質(zhì)變性。作為輻照的替換，本發(fā)明可通過(guò)物理破壞的方式諸如超聲、空洞形成(cavitation)、脫水、離子耗竭(ion depletion)或者通過(guò)暴露于一種或多種鹽產(chǎn)生的毒性來(lái)防止黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂。
[0048]在本發(fā)明中，干擾素-Y (IFN-Y)誘導(dǎo)自噬。替換地，或者此外，可以使用自噬誘導(dǎo)劑，例如mTOR抑制劑和非mT0R(mT0R-1nd印endent)依賴型試劑。適合本發(fā)明的mTOR抑制劑包括，例如雷帕霉素(rapamycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、torinl、西羅莫司脂化物(temsirolimus)、依維莫司(everolimus)、IKK刺激、MAPK激酶抑制劑、MEK1/2抑制劑、脫水和應(yīng)激活化分子諸如饑餓所誘導(dǎo)的JNK1。非mTOR依賴型試劑包括由鋰、卡馬西平和丙戊酸誘導(dǎo)的低肌醇三磷酸(IP3)水平，或由暴露于L-型鈣離子通道拮抗劑諸如米諾地爾(minoxidil)所引起的低細(xì)胞內(nèi)鈣水平。其他非mTOR依賴型試劑包括鈣蛋白酶的化學(xué)抑制(鈣蛋白酶抑制蛋白)、鞘脂(SlP)、和諸如過(guò)氧化氫的反應(yīng)性氧(reactive oxygen),例如由饑餓或缺氧條件誘導(dǎo)的。提供了這些試劑中的一種或多種來(lái)使用，替代IFN-Y或IFN-Y模擬物。參見(jiàn)例如 Ravikumar 等(2010)Phys.Revs.90:1383-1435。
[0049]在“超過(guò)60%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語(yǔ)(百分?jǐn)?shù))涉及肽分子的數(shù)目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的數(shù)目。在“超過(guò)80%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語(yǔ)“ % ”涉及肽分子的數(shù)目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的數(shù)目。在“小于40%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語(yǔ)“%”涉及肽分子的數(shù)目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的數(shù)目。在“小于20 %的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語(yǔ)“ ％ ”涉及肽分子的數(shù)目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的數(shù)目。
[0050]在“超過(guò)60%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語(yǔ)“肽”涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子的數(shù)目的總和。在“超過(guò)80%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語(yǔ)“肽”涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子的數(shù)目的總和。在“小于40%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語(yǔ)“肽”涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子的數(shù)目的總和。在“小于20 %的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語(yǔ)“肽”涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子等的數(shù)目的總和。
[0051]術(shù)語(yǔ)“偏向自噬性和非凋亡性的”指的是，當(dāng)用IFN-Y體外處理時(shí)，癌細(xì)胞諸如黑色素瘤細(xì)胞是至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %自噬性和非凋亡性的。注意，在用于指代各種黑色素瘤細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)中存在如下差異:自噬性和非凋亡性的細(xì)胞與非自噬性和凋亡性的細(xì)胞不同。
[0052]在從一種或多種癌細(xì)胞獲得的肽的上下文中，“衍生自”或“從……獲得” (derivedfrom)包含以下內(nèi)容。癌細(xì)胞可以被分解，例如通過(guò)均化器或通過(guò)滲透破裂，從而得到粗提取物。可以使粗提取物的肽、寡肽和多肽接觸到樹(shù)突細(xì)胞，然后通過(guò)樹(shù)突細(xì)胞處理肽。“衍生自”也包括提供具有完整癌細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞，其中癌細(xì)胞是活的，或者其中已經(jīng)采用輻照處理癌細(xì)胞但癌細(xì)胞仍然具有代謝活性，或者其中已經(jīng)采用核酸交聯(lián)劑處理癌細(xì)胞但癌細(xì)胞仍然具有代謝活 性?！把苌浴卑ò┘?xì)胞碎片、游離癌細(xì)胞蛋白質(zhì)和經(jīng)輻照的癌細(xì)胞的混合物，它們被樹(shù)突細(xì)胞攝取(taken up)，因此衍生自癌細(xì)胞。
[0053]應(yīng)用于人、哺乳動(dòng)物、哺乳動(dòng)物受試者、動(dòng)物、獸醫(yī)受試者、安慰劑受試者、研究受試者、實(shí)驗(yàn)受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體時(shí)，“施用”指的是，但不限于，給受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體等接觸外源性配體、試劑、安慰劑、小分子、藥劑、治療劑、診斷劑或組合物?！笆┯谩笨缮婕袄缣幚矸椒?、藥代動(dòng)力學(xué)方法、診斷方法、研究方法、安慰劑方法和實(shí)驗(yàn)方法。細(xì)胞的處理包括給細(xì)胞接觸試劑、以及給流體接觸試劑，其中流體與細(xì)胞接觸?！笆┯谩币舶ㄖT如細(xì)胞的體外(in vitro)和活體外(ex vivo)處理,其通過(guò)試劑、診斷、結(jié)合組合物或者通過(guò)另一細(xì)胞進(jìn)行。
[0054]涉及配體和受體時(shí)，“激動(dòng)劑”包括刺激受體的分子、分子的組合、復(fù)合物、試劑的組合。例如，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的激動(dòng)劑可以包括GM-CSF、GM-CSF的變異體變白或衍生物、GM-CSF的肽模擬物、模擬GM-CSF的生物功能的小分子、或者刺激GM-CSF受體的抗體。涉及配體和受體時(shí)，拮抗劑包括抑制、抵消、下調(diào)和/或脫敏受體的分子、分子的組合物或復(fù)合物。“拮抗劑”包括抑制受體的組成性活性(constitutiveactivity)的任何試劑。組成性活性是當(dāng)不存在配體/受體相互作用時(shí)顯露的活性?！稗卓箘边€包括抑制或防止受刺激(或受調(diào)節(jié))的受體活性的任何試劑。舉例如下，GM-CSF受體的拮抗劑包括但不限于:與配體(GM-CSF)結(jié)合并防止其結(jié)合受體的抗體，或者與受體結(jié)合并防止配體與受體結(jié)合的抗體，或者其中抗體將受體封鎖在非活性構(gòu)象。
[0055]除本文另有指明或上下文指定外，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括如下內(nèi)容。表達(dá)包括mRNA的生物合成、多肽生物合成、多肽活化，例如通過(guò)翻譯后修飾，或者通過(guò)改變亞細(xì)胞位置或通過(guò)募集到染色質(zhì)使表達(dá)活化。換言之，“提高的表達(dá)”包括由磷酸酯引起的生物合成提高或活性提高，或者由細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的遷移所引起的活性提高。[0056]抗原呈遞細(xì)胞(APCs)是用于呈遞抗原給T細(xì)胞的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。APCs包括樹(shù)突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、邊緣區(qū)KupfTer細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、郎格漢斯細(xì)胞、T細(xì)胞和B 細(xì)胞(參見(jiàn)，例如 Rodriguez-Pinto 和 Moreno (2005) Eur.J.1mmunol.35:1097-1105)。樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生在至少兩個(gè)譜系中。第一譜系包括前體-DC1、骨髓DCl和成熟DC1。第二譜系包括 CD34++CD45RA-早期祖多能細(xì)胞(early progenitor multipotent cells)、CD34++CD45RA+ 細(xì)胞、CD34++CD45RA++CD4+IL-3Ralpha++ 促-DC2 細(xì)胞、CD4+CDllc_ 漿細(xì)胞樣DC2前體細(xì)胞、淋巴樣人DC2漿細(xì)胞樣-衍生的DC2、和成熟DC2 (參見(jiàn)，例如Gilliet和Liu(2002)J.Exp.Med.195:695-704 ;Bauer 等(2001)J.1mmunol.166:5000-5007 ；Arpinati等(2000)Blood95:2484-2490 ;Kadowaki 等(2001)J.Exp.Med.194:863-869 ;Liu(2002)Human Immunology63:1067-1071 ;McKenna等(2005) J.Virol.79:17-27 ;0，Neill 等(2004)Blood104:2235-2246 ；Rossi 和 Young(2005)J.Tmmunol.175:1373-1381 ；Banchereau 和Palucka(2005)Nat.Rev.Tmmunol.5:296-306)。
[0057]“有效量”包括但不限于可改善、反轉(zhuǎn)、減輕、預(yù)防或診斷醫(yī)學(xué)病情(condition)或病癥(disorder)的癥狀或跡象的量。除非另有明確指明或通過(guò)上下文指明外，“有效量”不限于足以改善病情的最小量。疾病或病癥的嚴(yán)重程度以及處理以預(yù)防、治療或減輕疾病或病癥的能力，可以通過(guò)生物標(biāo)志物或通過(guò)臨床參數(shù)測(cè)定，但不限于此。
[0058]生物標(biāo)志物包括多肽，多肽的位置/部位(例如囊泡(vesicular)、分子內(nèi)、膜結(jié)合的)，核酸，血清、尿、腦脊液中的血球計(jì)數(shù)、代謝水平，腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，癌癥干細(xì)胞計(jì)數(shù)，腫瘤水平。腫瘤水平可以通過(guò) RECIST 標(biāo)準(zhǔn)(Eisenhauer 等(2009)Eur.J.Cancer.45:228-247)來(lái)測(cè)定。表達(dá)標(biāo)志物包括mRNA的基因表達(dá)或者基因擴(kuò)增、抗原表達(dá)和多肽的表達(dá)。臨床參數(shù)包括但不限于無(wú)進(jìn)展 生存期(PFS, progression-free survival)、6月PFS、無(wú)病生存期(DFS, dsease-free srvival)、疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP, time to progression)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間(TDM, time to distant metastasis)和總生存期(overall survival)。
[0059]“標(biāo)記的”組合物可通過(guò)光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、同位素或化學(xué)方法直接或間接地檢測(cè)。例如有用的標(biāo)記包括32P、33P、35S、14C、3H、1251、穩(wěn)定同位素、表位標(biāo)簽、熒光染料、電子-致密試劑、底物或酶例如在酶聯(lián)免疫測(cè)定中使用的酶或f Iuorettes (例如參見(jiàn) Rozinov 和 Nolan (1998) Chem.Biol.5:713-728)。
[0060]評(píng)估免疫應(yīng)答的方法
[0061]本發(fā)明還提供用于表征免疫應(yīng)答的ELISPOT測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)和四聚體測(cè)定(參見(jiàn)例如，Pardoll 的 US2007/0190029 ；Chattopadhyay(2008)CytometryA.200873:1001-1009 ；VolIers(2008)Immunology.123:305-313 ；Lalvan1.等(1997)J.Exp.Med.186:859-865 ；ffaldrop(1997)J.Clin.1nvest.99:1739-1750 ；Hudgens(2004)J.1mmunol.Methods288:19-34 ；Goulder(2001)J.Virol.75:1339-1347 ；Goulder(2000)J.Exp.Med.192:1819-1831 ; Anthony (2003)Methods29:260-269 ；Badovinac 和Harry (2000) J.1mmunol.Methods238:107-117)。通過(guò)腫瘤學(xué)臨床試驗(yàn)中所使用的終點(diǎn)來(lái)評(píng)估患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答，包括客觀反應(yīng)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))、總生存期、無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)、無(wú)病生存時(shí)間、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間、6月PFS、12月PFS等等。
[0062]疫苗
[0063]本發(fā)明的樹(shù)突細(xì)胞疫苗可以通過(guò)皮內(nèi)、結(jié)內(nèi)、粘膜或皮下途徑或上述的任意組合來(lái)施用。每劑可以包括約IOX IO3個(gè)樹(shù)突細(xì)胞、20X IO3個(gè)細(xì)胞、50X IO3個(gè)細(xì)胞、IOOX IO3個(gè)細(xì)胞、200 X IO3個(gè)細(xì)胞、500 X IO3個(gè)細(xì)胞、I X IO6個(gè)細(xì)胞、2 X IO6個(gè)細(xì)胞、20 X IO6個(gè)細(xì)胞、50X IO6 個(gè)細(xì)胞、100X IO6 個(gè)細(xì)胞、200X 1066、500X 106、1X IO9 個(gè)細(xì)胞、2X IO9 個(gè)細(xì)胞、
5X IO9個(gè)細(xì)胞、IOX IO9個(gè)細(xì)胞等等。施用頻率可以是例如一周一次、一周二次、兩周一次、三周一次、四周一次、一個(gè)月一次、兩個(gè)月一次、三個(gè)月一次、四個(gè)月一次、五個(gè)月一次、六個(gè)月一次等等。進(jìn)行施用的天的總數(shù)目可以是一天、2天或3天、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、或20等等。應(yīng)當(dāng)理解的是，任何給定的施用可以包含同一天中兩次或更多次注射。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用整個(gè)腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹(shù)突細(xì)胞，其中至少10%、其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的負(fù)載到樹(shù)突細(xì)胞中的衍生自黑色素瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)存在于整個(gè)腫瘤細(xì)胞中。在非限制性實(shí)施方式中，樹(shù)突細(xì)胞疫苗在燒瓶中、小瓶中、瓶子中、注射器、導(dǎo)管中、套管中等等。為了施用，至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%的被施用的樹(shù)突細(xì)胞是樹(shù)突細(xì)胞。
[0064]疫苗均勻性
[0065] 在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含樹(shù)突細(xì)胞的疫苗，該樹(shù)突細(xì)胞包含衍生自體外負(fù)載的黑色素瘤肽，其中疫苗以至少5/95、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10、95/5、98/2、99/1等的樹(shù)突細(xì)胞/黑色素瘤細(xì)胞的比例包含樹(shù)突細(xì)胞(包含黑色素瘤肽的DC和不包含黑色素瘤肽的DC的總和)。本發(fā)明還提供包含樹(shù)突細(xì)胞的疫苗，該樹(shù)突細(xì)胞包含衍生自體外負(fù)載的黑色素瘤肽，其中疫苗以至少5/95、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10、95/5、98/2、99/1 等的[樹(shù)突細(xì)胞]/ [既非DC又非黑色素瘤的細(xì)胞]的比例包含樹(shù)突細(xì)胞(包含黑色素瘤肽的DC和不包含黑色素瘤肽的DC的總和)。本發(fā)明示出了一種帶間隔的容器，其中第一間隔包含黑色素瘤細(xì)胞，并且第二間隔包含樹(shù)突細(xì)胞。兩個(gè)間隔可以通過(guò)以下物質(zhì)來(lái)分離:膜、過(guò)濾器、閥門、導(dǎo)管、耦合器來(lái)分離，其防止黑色素瘤細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞接觸，但其中手動(dòng)傳輸或其中去除膜或打開(kāi)閥門時(shí)允許黑色素瘤細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞接觸，使得黑色素瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞片段和/或黑色素瘤肽可以負(fù)載到樹(shù)突細(xì)胞上。
[0066]干擾素-Y模擬物
[0067]本發(fā)明包含模擬物，例如干擾素- Y模擬物，例如模擬肽95-132 (Ahmed (2007)J.1mmunol.178:4576-4583 ；Fulcher (2008) FEBS Lett.582:1569-1574)。本發(fā)明提供IFN- Y模擬物，其中總的目的是獲取富含自噬性和非凋亡性黑色素瘤細(xì)胞的黑色素瘤細(xì)胞群落。IFN-模擬物包括例如具有與干擾素-Y相同激動(dòng)劑活性的抗體。
[0068]使黑色素瘤細(xì)胞失活
[0069]本發(fā)明提供其中癌癥細(xì)胞失活的組合物和方法，例如通過(guò)輻射失活或通過(guò)核酸交聯(lián)劑的方式失活。示例性交聯(lián)劑具有交聯(lián)DNA但不修飾蛋白質(zhì)的能力。核酸烷基化劑可以是β _丙氨酸、N-(卩丫唳-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙基酯。在一些實(shí)施方式中，核酸靶向化合物是經(jīng)由UVA輻照活化的補(bǔ)骨脂素化合物。例如，核酸靶向化合物可以是4’ -(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(本文中也稱為〃S-59〃)?？梢杂?50微摩爾補(bǔ)骨脂素 S-59 和 3J/cm2UVA 光(FX1019 福照裝置，Baxter Fenwal, Round Lake, IL)來(lái)失活細(xì)胞。用S-59進(jìn)行的失活被稱為光化學(xué)處理，并且導(dǎo)致細(xì)胞的完全失活?？梢詼y(cè)試各種濃度的核酸交聯(lián)劑在失活細(xì)胞方面的效力，例如在防止細(xì)胞分裂方面的效力。S-59的特征在于其交聯(lián)核酸但保持蛋白質(zhì)完整未被修飾的能力。細(xì)胞可以懸浮于含0、1、10、100和1000nM補(bǔ)骨脂素S-59的5mL生理鹽水中?？梢匀缦碌剌椪彰總€(gè)樣品?？梢砸訧OOnM的濃度加入 S-59。以大約 2J/cm2 (FX1019 福照裝置,Baxter Fenwal, Round Lake, II1.)的劑量UVA輻照樣品。并然后將每個(gè)樣品轉(zhuǎn)移到15mL管、離心并去除上清液，然后用5mL生理鹽水洗滌、離心并去除上清液，并且最終的沉淀懸浮于0.5mL的生理鹽水中(Dubensky的美國(guó)專利 Nos.7833775 和 7691393)。
[0070]富集非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞
[0071]可以使黑色素瘤細(xì)胞群落富含非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，例如通過(guò)使用如下技術(shù):將非凋亡性且自噬性細(xì)胞與非自噬性且凋亡性的細(xì)胞分離，其中分離是通過(guò)將自噬性且非凋亡性的細(xì)胞粘附到表面來(lái)進(jìn)行的，其中其他細(xì)胞處于浮動(dòng)狀態(tài)。還可以通過(guò)去除凋亡的細(xì)胞來(lái)獲得富含非凋亡性黑色素瘤細(xì)胞的群落，例如通過(guò)對(duì)磷脂酰絲氨酸特異的抗體的方式去除。通過(guò)經(jīng)固定化的抗體的方式去除細(xì)胞的技術(shù)是已知的(Onodera (1998) Ther.Apher.2:37-42)。對(duì)磷脂酰絲氨酸特異的抗體是已知的(例如EMDMillipore,Billerca, MA) 0也可以用熒光抗磷脂酰絲氨酸抗體標(biāo)記黑色素瘤細(xì)胞的主體群落(bulk population),其中通過(guò)流式細(xì)胞法、親和層析法、免疫磁性分離(參見(jiàn)例如Hoeppener (2012)Recent Results Cancer Res.195:43-58 ；Dainiak(2007)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.106:1-18)除去標(biāo)記的凋亡黑色素瘤細(xì)胞。
[0072]細(xì)胞凋亡的抑制劑
[0073]Z-VAD(Z-VAD-f mk)是一種細(xì)胞凋亡的抑制劑，其可以從例如 Enzo Life Sciences (Exeter, UK) > R&D Systems(Minneapolis,MN) >Tocris Biosciences(Bristol, UK) > BioMol(Plymouth Meeting, PA)和 EMDChemicals (Gibbstown, NJ)獲得。Z-VAD-fmk 是一種合成妝 Z-Val-Ala-Asp (OMe)-CH2F。半胱天冬酶(caspases,胱天蛋白酶)是半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶家族。半胱天冬酶被死亡受體連接(ligation)而活化，例如TRAIL、FAS、通過(guò)DNA損傷、應(yīng)激、血清饑餓以及在某些細(xì)胞類型中干擾素。半胱天冬酶在包括核斷裂、染色質(zhì)濃縮和細(xì)胞質(zhì)完整性損失的細(xì)胞凋亡的高度調(diào)節(jié)過(guò)程中起關(guān)鍵的作用。泛蛋白酶抑制劑(pan-capase)z-VAD-fmk(節(jié)氧羰基-纈氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-[O-甲基]-氟甲基酮)不可逆地結(jié)合半胱天冬蛋白酶的催化位點(diǎn)，并抑制它們?cè)谡T導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的功能。在對(duì)IFN-Y應(yīng)答時(shí)抑制細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡的能力可以是如下方式:通過(guò)此方式產(chǎn)生非凋亡性但自噬性細(xì)胞，而無(wú)洗滌選擇步驟來(lái)去除浮動(dòng)的凋亡細(xì)胞。
[0074]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在將腫瘤細(xì)胞負(fù)載到樹(shù)突細(xì)胞上或其他類型的抗原呈遞細(xì)胞(APC)上之前，用IFN-Y處理腫瘤細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在將腫瘤細(xì)胞負(fù)載到樹(shù)突細(xì)胞上或其他類型APC上之前，未用IFN-Y處理腫瘤細(xì)胞。
[0075]本發(fā)明提供藥物、試劑、試劑盒(包括診斷試劑盒)，其中藥物、試劑、試劑盒包含樹(shù)突細(xì)胞、抗體或抗原。本發(fā)明還提供施用含至少一種樹(shù)突細(xì)胞和至少一種抗原的組合物的方法、刺激抗體形成的方法、刺激ADCC的方法、刺激補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性的方法、以及確定患者適用性的方法和試劑盒、在臨床試驗(yàn)中確定患者入選/排除標(biāo)準(zhǔn)的方法和試劑盒、預(yù)測(cè)對(duì)藥物或試劑的應(yīng)答的方法。現(xiàn)有技術(shù)中已描述補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(參見(jiàn)例如 Goodman 等(1990) J.Clin.0ncol.8:1083-1092 ；Cheson (2010) J.Clin.0ncol.28:3525-3530)。本發(fā)明的藥物組合物、試劑和相關(guān)方法包含⑶83陽(yáng)性樹(shù)突細(xì)胞，其中⑶83是通過(guò)用IFN-Y處理的癌細(xì)胞負(fù)載而誘導(dǎo)的。在本發(fā)明的⑶83方面，⑶83被誘導(dǎo)了至少2%、至少3%、至少4%、6%、7%、8%、9%、10%等。在另一方面，排除如下DC試劑或DC相關(guān)方法，其中樹(shù)突細(xì)胞的⑶83不能通過(guò)用IFN-Y處理的癌細(xì)胞負(fù)載而可檢測(cè)地誘導(dǎo)。
[0076]圖
[0077]圖1展現(xiàn)了在用IFN- Y處理之前(左)和IFN- Y處理72小時(shí)之后(右)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的圖形。處理后，培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞要么是浮動(dòng)的、非自噬性且凋亡的，要么是粘附的、自噬性且非凋亡的。浮動(dòng)的細(xì)胞示出表達(dá)凋亡標(biāo)志物磷脂酰絲氨酸。浮動(dòng)的細(xì)胞示出具有相對(duì)較少的表達(dá)的MHC II類，而粘附細(xì)胞示出具有過(guò)度表達(dá)的MHC II類。
[0078]圖2A-D示出了用于負(fù)載樹(shù)突細(xì)胞的經(jīng)IFN-Y處理的自體腫瘤細(xì)胞的特征。在15% FBS/ECS中在RPMI中使用或者不使用1000IU/mL IFN-y處理自體黑色素瘤腫瘤細(xì)胞72小時(shí)，收獲并用IOOGy輻照并凍存。然后在AIMV中將細(xì)胞解凍，并采樣用于流式細(xì)胞，以及用于在抗原負(fù)載DC之前制備用于免疫印跡的細(xì)胞裂解物。四個(gè)獨(dú)立的自體黑色素瘤細(xì)胞系的例子示于圖2A、圖2B和圖2C中。通過(guò)IFN-Y處理自體腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體(圖2D)。在使用或者不使用1000IU/mL IFN-y處理72小時(shí)后收獲腫瘤細(xì)胞，然后測(cè)定MHC I類和II類。使用對(duì)照同類型抗體來(lái)認(rèn)定陽(yáng)性群落。深色數(shù)據(jù)點(diǎn)表示中值平均+/-95%置信區(qū)間。N = 65。
[0079]在一個(gè)方面，本發(fā)明排除用于負(fù)載樹(shù)突細(xì)胞的非自體腫瘤細(xì)胞，并且排除使用用于負(fù)載樹(shù)突細(xì)胞的非自體腫瘤細(xì)胞的方法。
[0080]圖3A和3B描述用自體黑色素瘤細(xì)胞系負(fù)載的樹(shù)突細(xì)胞的表型，其中使用干擾素-Y處理自體黑色素瘤細(xì)胞系或未使用干擾素-Y處理自體黑色素瘤細(xì)胞系。使用或者不使用1000IU/mL IFN-Y處理一組四個(gè)自體黑色素瘤細(xì)胞系72小時(shí)，輻照并凍存。然后在AIMV中將細(xì)胞解凍，并在收獲和通過(guò)流式細(xì)胞法測(cè)定⑶80、⑶83、⑶86和MHC II類的表達(dá)之前，與自體樹(shù)突細(xì)胞組合大約24小時(shí)(圖3A)。數(shù)據(jù)總結(jié)于圖3B中。示出了平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD), η = 4。
[0081]圖4Α和4Β示出了劑型(dose)制備所使用的樹(shù)突細(xì)胞的表型。在用經(jīng)IFN-Y處理的、輻射的自體腫瘤細(xì)胞負(fù)載之前(Pre-ATC Load DC1N= 53)和負(fù)載之后(Post-ATCLoad DC, N = 65),通過(guò)流式細(xì)胞法評(píng)估DC的樣品對(duì)于⑶80、⑶83、⑶86和MHC II類的表
達(dá)。使用FACS Caliber?球來(lái)設(shè)置初始流式細(xì)胞儀儀器設(shè)定，然后在整個(gè)數(shù)據(jù)的采集中保持該設(shè)定不變(圖4A)。在圖4B中，比較ATC負(fù)載之前和ATC負(fù)載之后的百分?jǐn)?shù)表示的值和平均熒光強(qiáng)度(MFI) +SD0 *p = 0.019且林p = 0.0009。
[0082] 圖5A至5C示出了經(jīng)干擾素-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行自噬。選擇商業(yè)可購(gòu)得的黑色素瘤細(xì)胞系，并在5% FBS/RMPI中用10001U/mL IFN-y培育72小時(shí)。在培育期結(jié)束時(shí)拍攝SK-5-Mel細(xì)胞培養(yǎng)基的相位差顯微鏡照片(圖5A)，示出了具有自噬體的囊泡的放大的細(xì)胞。在用IFN-Y處理之前，通過(guò)使用GFP-LC3B構(gòu)建轉(zhuǎn)染來(lái)證明自噬體的確定和形成(圖5B)。通過(guò)使用用于LC3B的抗體蛋白質(zhì)印跡(圖5C)，來(lái)確定IFN- Y處理后的自噬誘導(dǎo)，確認(rèn)LC3的更快的遷移形式，已經(jīng)表明LC3與自噬性血管形成相關(guān)。[0083]圖6A和6B展現(xiàn)了對(duì)干擾素-Y應(yīng)答時(shí)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬。用10001U/mL的IFN-y培育SK-5-Mel細(xì)胞72小時(shí)，之后收集非粘附群落和粘附的群落并通過(guò)使用7-AAD和Annexin-V流式細(xì)胞法測(cè)定細(xì)胞凋亡和自噬(圖6A)。使用Enzo Cyto-1D自噬檢測(cè)染料，通過(guò)測(cè)定制造商所提供的染料的平均強(qiáng)度峰位移，通過(guò)流式細(xì)胞法來(lái)測(cè)定自噬(圖6B)。圖6C中示出了，與5% FBS/RPMI相比，峰位移的倍數(shù)變化(fold change)，其中無(wú)血清作為自噬誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照。
[0084]圖7公開(kāi)了阻斷半胱天冬酶活性后的自噬誘導(dǎo)并不影響在黑色素瘤細(xì)胞中對(duì)IFN- Y應(yīng)答時(shí)的自噬誘導(dǎo)。在20uM的泛半胱天冬酶抑制劑z-VAD或其對(duì)照化合物z_FA存在下，用1000IU/mL的IFN- Y處理SK_5_Mel細(xì)胞72小時(shí)。收獲細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞法測(cè)定自噬，如圖6C中所示。
[0085]圖8示出了 SK-5-Mel細(xì)胞，其用1000IU/mL的IFN- Y在IOuM的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)存在下培育72小時(shí)。然后收獲細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞法測(cè)定細(xì)胞凋亡和MHC II 類(HLA-DR)表達(dá)。
[0086]圖9示出了來(lái)自由患者 腫瘤樣本(N = 36)所產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞系的IFN- Y處理過(guò)的細(xì)胞，測(cè)定其在MHC II類或細(xì)胞凋亡方面的變化。所示數(shù)據(jù)為平均熒光強(qiáng)度土SE的平均值。
[0087]圖10示出了經(jīng)IFN- Y處理的細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞法從用于負(fù)載患者特異性疫苗免疫治療的樹(shù)突細(xì)胞的樣品測(cè)定其MHC II類或細(xì)胞凋亡。示出了 MHC II類的倍數(shù)變化、平均熒光強(qiáng)度和凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(Annexin-V陽(yáng)性)。
[0088]圖11和圖12示出了 MHC II類的誘導(dǎo)和細(xì)胞凋亡的缺乏之間的相關(guān)性，在接受用自噬性、非凋亡性、經(jīng)干擾素-Y處理的腫瘤細(xì)胞負(fù)載的樹(shù)突細(xì)胞的患者中表現(xiàn)出更好的無(wú)進(jìn)展生存期(圖11)和總生存期(圖12)。
[0089]圖13示出了來(lái)自三次試驗(yàn)的生存曲線。點(diǎn)圖(Kaplan-Meier)是步進(jìn)式曲線,表明在臨床試驗(yàn)的過(guò)程中研究受試者生存的百分?jǐn)?shù)。設(shè)計(jì)各個(gè)組DC-54(實(shí)心圓)、TC-74(實(shí)心方塊)、TC-24(實(shí)心三角形)以及DC-18(線)。最差的生存發(fā)生在TC-24組。第二差的生存組是TC-74。TC-24指的是在涉及24個(gè)受試者的研究中腫瘤細(xì)胞的疫苗。DC-54指的是樹(shù)突細(xì)胞疫苗，其中對(duì)54個(gè)受試者進(jìn)行處理，并且其中疫苗包含與經(jīng)輻照的自體腫瘤細(xì)胞一起共同培養(yǎng)的自體樹(shù)突細(xì)胞(DCs)。
[0090]進(jìn)一步說(shuō)明
[0091]自體樹(shù)突細(xì)胞生成
[0092]SSficoled apheresis products 的塑料粘附法(plastic adherence method)(Choi 等(1998)Clin.Cancer Res.4:2709-2716 ;Luft 等(1998)Exp.Hematol.26:489-500 ；Cornforth 等(2011) Cancer Tmmunol.1mmunother.60:123-131),在補(bǔ)充有各 lOOOIU/mL 的IL-4(CellGenix, Freisberg, Germany)和 GM-CSF(Bertex, Seattle, WA) (DC 培養(yǎng)基)的不含抗生素的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen, Grand Island, NY)中，生成樹(shù)突細(xì)胞。然后在用經(jīng)IFN- Y處理的、輻照的自體腫瘤細(xì)胞負(fù)載之前，將燒瓶培養(yǎng)6天。
[0093]IFN-Y自體腫瘤細(xì)胞系生成和藥物的制備
[0094]根據(jù)Cornforth 等(Cornforth 等(2011)Cancer Immunol.1mmunother.60: 123-13 I ;DiI Iman 等(1993)J.1mmunother.Emphasis TumorTmmunol.14:65-69 ;Dillman 等(2000) Cancer Biother.Radiopharm.15:161-168),生成純的腫瘤細(xì)胞。然后用1000U/mL的干擾素-Y (InterMune, Brisbane, CA)培育腫瘤細(xì)胞72小時(shí)，用來(lái)自銫源的 IOOGy 輻照并凍存(Selvan 等(2007) Int.J.Cancerl22:1374-1383 ；Selvan等(2010)Melanoma Res.20:280-292)。從凍存中恢復(fù)經(jīng)IFN-Y處理且輻照的腫瘤細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，然后加入培養(yǎng)的樹(shù)突細(xì)胞(DCs)，然后培育約24小時(shí)。通過(guò)用橡皮淀帚輕輕刮取來(lái)收獲負(fù)載了抗原的DCs，并凍存。獲得經(jīng)IFN-Y處理或未處理的腫瘤細(xì)胞和負(fù)載的DCs的多個(gè)等分部分,用于流式細(xì)胞評(píng)價(jià)和臺(tái)盼藍(lán)拒染(trypan-blueexclusion)測(cè)定。
[0095]皮膚黑色素瘤的分期(Staging)
[0096]本發(fā)明的藥物或試劑可以施用于黑色素瘤患者，其中黑色素瘤診斷為I期、II期、III 期或 IV 期(Mohr 等(2009) Ann.0ncology (Suppl.6) vil4-vi21)。例如 I 期指的是具有原發(fā)(初始)黑色素瘤而無(wú)區(qū)域或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)的患者。II期包括無(wú)淋巴結(jié)疾病或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)的患者，其中患者的進(jìn)一步特征在于:例如損傷大于Imm且小于或等于2mm厚的覆上皮(overlying epithelium)潰瘍,或者損傷大于2mm且小于或等于4mm厚的上皮潰瘍。III期黑色素瘤包括病理記錄波及區(qū)域淋巴結(jié)或在途(in-transit)轉(zhuǎn)移或衛(wèi)星(satellite)轉(zhuǎn)移的損傷，其中患者可具有例如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)或更多個(gè)受感染的淋巴結(jié)。IV期黑色素瘤定義為 存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中轉(zhuǎn)移僅位于遠(yuǎn)處皮膚、皮下組織或淋巴結(jié)，其中轉(zhuǎn)移涉及肺轉(zhuǎn)移，或者其中轉(zhuǎn)移涉及所有其他內(nèi)臟部位。
[0097]本發(fā)明包含預(yù)防性施用的方法，也就是用于尚未或從未診斷為患有黑色素瘤的受試者。本發(fā)明包含施用的方法，其中受試者此前已被診斷為黑色素瘤并且此前已得到成功治療以消除黑色素瘤(或者經(jīng)歷過(guò)自動(dòng)完全痊愈)，并且其中在根除后預(yù)防性施用。
[0098]腫瘤抗原
[0099]本發(fā)明的黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)Mage、Mart-l、Mel_5、HMB45、S100或酪氨酸酶中的一種或多種(Dillman 等(2011) Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals26:407-415),但并不限于此。在一個(gè)方面，腫瘤抗原的檢測(cè)使用未暴露于IFN-Y的細(xì)胞，而在另一方面，腫瘤抗原的檢測(cè)在經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞上進(jìn)行(參見(jiàn)例如Cornforth等(2011)CancerBiotherapy Radiopharmaceuticals26:345-351)。本發(fā)明包含表達(dá)一種或多種黑色素瘤抗原或者包含一種或多種分離的黑色素瘤抗原的組合物的黑色素瘤細(xì)胞，如Dubensky的US2007/0207171所公開(kāi)的，其通過(guò)引用以其全文并入本文。
[0100]測(cè)定細(xì)胞凋亡
[0101]可以使用多種試劑來(lái)檢測(cè)或測(cè)定細(xì)胞凋亡，例如熒光染料標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白，通過(guò)用染料諸如碘化丙烷和7-氨基放線菌素D(7-AAD)染色，通過(guò)測(cè)定線粒體內(nèi)膜勢(shì)的損失，通過(guò)測(cè)定半胱天冬酶的活化或裂解。參見(jiàn)例如George等(2004)Cytometry PartA.59A:237-2450細(xì)胞凋亡的早期活動(dòng)是磷脂酰絲氨酸暴露于質(zhì)膜的外表面，其可以通過(guò)熒光染料標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白檢測(cè)?？捎玫姆椒軌騾^(qū)分活細(xì)胞、壞死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。本發(fā)明使用通過(guò)7-ADD測(cè)定為非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞、通過(guò)膜聯(lián)蛋白V測(cè)定為非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞、在IFN-Y處理后經(jīng)凋亡性測(cè)定為非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞(Dillman 等(2011)Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals26:407-415)、或者通過(guò)一種或多種生物標(biāo)志物Bcl-2、半胱天冬酶-3、P53或存活素測(cè)定為非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞(Karam等(2007)Lancet Oncol.8:128-136)。本發(fā)明的藥物組合物、試劑和相關(guān)方法排除經(jīng)IFN-Y處理的凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，其中根據(jù)例如Herlyn等的美國(guó)專利N0.7544465、Thorpe等的美國(guó)專利7714109來(lái)測(cè)定細(xì)胞凋亡，其通過(guò)引用并入本文。
[0102]測(cè)定自噬
[0103]自噬是用于降解許多蛋白質(zhì)和某些細(xì)胞器的自然存在的過(guò)程。自噬介導(dǎo)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器周轉(zhuǎn)、饑餓應(yīng)答、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡等。與微管相關(guān)的蛋白輕鏈3(LC3)監(jiān)測(cè)自噬。在一種方法中，可以通過(guò)測(cè)量LC3的轉(zhuǎn)化來(lái)檢測(cè)自噬，其涉及LC3-1或LC3-1I的轉(zhuǎn)化。LC3-1I的量與自噬體的數(shù)目相關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，LC3是細(xì)胞溶質(zhì)的且可溶的，而LC3-1I存在于膜上。LC3-1I具有更大的分子量，因?yàn)槠渑c脂質(zhì)結(jié)合(conjugated)?？梢詼y(cè)量LC3加工，例如通過(guò)western印跡,而自曬、自曬小泡和自曬體可以通過(guò)顯微鏡測(cè)定。自曬可以是定量的，例如通過(guò)檢測(cè)加工的LC3-11、通過(guò)早期與晚期自噬性區(qū)室(compartment)之間的比例、或者通過(guò)自卩遼體積。參見(jiàn)(Mizushima 和 Yoshimori (2007) Autophagy3:542-546:634-641 ；Tanida等(2008)Methods Mol Biol.445:77-88 ；Eng.等(2010)Autophagy6:634-641)。在一個(gè)方面，本發(fā)明使用自噬作為篩選工具，用于選擇合適的自噬性癌細(xì)胞，其中可以根據(jù)在一個(gè)或多個(gè)具體階段中自噬的出現(xiàn)來(lái)選擇細(xì)胞。這些自噬階段包括:(1)通過(guò)自噬體隔離胞質(zhì)區(qū)室，(2)使用溶酶體融合自噬體，以形成自溶酶體，并且(3)通過(guò)溶酶體內(nèi)的蛋白酶來(lái)降解自溶酶體內(nèi)容物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括主要顯示第一階段、主要顯示第二階段、主要顯示第三階段、主要顯示所有三個(gè)階段的細(xì)胞。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明包含顯示第一階段、第二階段、第三階段、第一和第二、第二和第三階段或者顯示所有三個(gè)階段的細(xì)胞。
[0104]干擾素-Y (IFN-Y )信號(hào)傳導(dǎo) [0105]IFN-Y (II型干擾素)信號(hào)傳導(dǎo)依賴于一些基因的表達(dá)，諸如IFN-Y受體、STATl、STAT2,STATl 同源二聚體、STAT1/STAT2 異源二聚體、IRF-UGAS 和 IRF-E。研究表示 IFN-Y信號(hào)傳導(dǎo)依賴于IFN-Y受體(IFNGR1鏈；IFNGR2鏈)。細(xì)胞表面上IFNGR的低表達(dá)能夠阻斷IFN- Y 信號(hào)傳導(dǎo)的某些方面(Schroder 等(2004) J.Leukocyte boil.75:163-189)。在一個(gè)方面，本發(fā)明排除使用表現(xiàn)出IFNGR的低表面表達(dá)的癌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明篩選表達(dá)STATl同源二聚體的那些癌細(xì)胞，使用這些細(xì)胞，并且基本上排除那些不表達(dá)STATl同源二聚體的細(xì)胞。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明考慮篩選那些具有STATl磷酸化(絲氨酸-727)的細(xì)胞。本發(fā)明還考慮排除來(lái)自具有STATl基因中功能突變?nèi)笔У幕颊叩陌┘?xì)胞(參見(jiàn)例如Dupuis 等(2001)Science293:300-303 ；Schroder 等(2004)J.Leukoc.Biol.75:163-189)。下面關(guān)注IRF基團(tuán)家族。RF-l、IRF-2和IRF-9均參與IFN-Y信號(hào)傳導(dǎo)。本發(fā)明涵蓋了使用表達(dá)這些IRF基因族基因中的一種或多種基因的癌細(xì)胞，或者排除未表達(dá)這些基因中一種或多種的癌細(xì)胞。
[0106]IFN-Y應(yīng)答基因
[0107]在一些示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明包含生物材料、組合物、試劑和方法，其要求使用對(duì)IFN-Y應(yīng)答的黑色素瘤細(xì)胞或腫瘤前期的黑色素瘤細(xì)胞。可以通過(guò)一種或多種IFN-Y應(yīng)答基團(tuán)的表達(dá)測(cè)定，來(lái)確認(rèn)、區(qū)分和選擇黑色素瘤細(xì)胞。已經(jīng)確認(rèn)了許多 IFN- Y 應(yīng)答基團(tuán)(參見(jiàn)例如 Halonen 等(2006) J.Neuroimmunol.175:19-30 ；MacMicking(2004) 11:601-609 ;Boehm等(1997) 15:749-795)。所述測(cè)定可以涉及從患者中去除一種或多種黑色素瘤細(xì)胞、在添加的IFN-Y存在和不存在情況下培養(yǎng)細(xì)胞、并確定對(duì)IFN-y的應(yīng)答。在該測(cè)定中，IFN-Y誘導(dǎo)的基因表達(dá)可以通過(guò)對(duì)以下敏感的試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)，上述試驗(yàn)對(duì)以下敏感:轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到IFN-Y誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子、IFN-Y誘導(dǎo)的基因的mRNA的表達(dá)、表達(dá)的多肽等等。IFN-Y應(yīng)答基因可以包括例如，用于免疫應(yīng)答、編碼轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的基因、細(xì)胞凋亡基因、用于細(xì)胞生長(zhǎng)或維持的基因、用于脂質(zhì)代謝的基因、介導(dǎo)胞吞或胞吐的基因、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)基因、糖代謝基因、細(xì)胞粘附基因以及無(wú)確定功能(established function)的基因。
[0108]在一個(gè)方面，本發(fā)明排除使用IFN-Y處理時(shí)具有以下特點(diǎn)的黑色素瘤細(xì)胞:表現(xiàn)出MHC II類表達(dá)降低，在MHC II類的表達(dá)方面未表現(xiàn)出可檢測(cè)到的變化，表現(xiàn)出MHC II類表達(dá)增加10%或更少，表現(xiàn)出MHC II類表達(dá)增加15%或更少，表現(xiàn)出MHC II類表達(dá)增加20 %或更少、25 %或更少、30 %或更少、40 %或更少、50 %或更少等等。在一個(gè)方面，百分?jǐn)?shù)的值指的是存在于來(lái)自給定受試者或患者的活檢或部分活檢中的黑色素瘤細(xì)胞群落的平均表達(dá)值。
[0109]用于篩選IFN- Y應(yīng)答癌細(xì)胞的IFN- Y誘導(dǎo)基因的非限制性列表
[0110]ab000677, JAB/S0CS1 ；m63961, IFN- Y 誘導(dǎo)蛋白(mag-1) ；m35590,巨噬細(xì)胞炎性蛋白 l-β ；ml9681, MCP-1 (JE) ；y07711, zyxin ；M34815, IFN- y 誘導(dǎo)的單核因子(MIG)；m33266,干擾素誘導(dǎo)蛋白IO(IP-1O) ；U44731,嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白；U88328，細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子 _3 (Sup.0f cytokine signalling-3, S0CS-3) ；M21065,干擾素調(diào)節(jié)因子I ;M63630，GTP 結(jié)合蛋白(IRG-47) ;U19119, G-蛋白樣 LRG-47 ;L27990，Ro 蛋白；M31419, 204 干擾素活化蛋白；af022371，干擾素誘導(dǎo)蛋白203 ；U28404, MIP-1 α受體；U43085，糖皮質(zhì)激素減弱反應(yīng)基因 39 (Glucocorticoid-attenuated response39) ；x56123, Talin ；m31419, 204 干擾素活化蛋白；U53219, GTPase IGTP ； 138444, T 細(xì)胞特異蛋白；M31418, 202干擾素活化蛋白；d38417,芳香烴(Arylhydrocarbon)受體；m26071,組織因子(mtf)；D13759，Cot 原癌基因；M18194,纖維連接蛋白;u59463, ICH-3 ;M13945, pim-Ι 原癌基因；L20450，DNA 結(jié)合蛋白(參見(jiàn) Gil 等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci98:6680-6685)。本發(fā)明包含 IFN-Y 誘導(dǎo)基因 CIITA(參見(jiàn)例如 Chan 等(2010) J.Leukocyte Biol.88:303-311 ；Kwon等(2007)Mol.1mmunol.44:2841-2849)的用途。
[0111]本發(fā)明包含對(duì)如下IFN-Y誘導(dǎo)基因中一種或多種的表達(dá)的測(cè)量，作為用于確認(rèn)施用藥物的患者的資格或選擇施用藥物的患者的篩選過(guò)程。這些基因包括:(基因I)FCGR1A、(基因 2)IL6R、(基因 3)CXCL9、(基因 4) CLCSF14,(基因 5) UBD,(基因 6) C/EBPalpha 和(基因 7)MHC2TA(CIITA)(參見(jiàn) Waddell 等(2010)PLoS 0NE5:e9753)。還包括這些基因的特定簇在確認(rèn)資格過(guò)程中的用途，例如基因I和2、2和3、3和4、4和5、5和6、6和7、I和3、I和4、I和5、I和6、I和7、2和4、2和5、2和6、2和7、3和5、3和6、3和7、4和6、4和7、5和7以及這些基因的組合，例如1、2、3 ;或3、4、5 ;或4、5、6 ;或5、6、7 ;或1、
3、4 ;或 1、3、5，或 1、3、6，或 1、3、7 ;或 1、2、4 ;或 1、2、5 ;或 1、2、6 ;或 1、2、7 等等。(這些基因編號(hào)是任意的。)
[0112]干擾素-Y處理
[0113]包含暴露于IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞的試劑和相關(guān)方法說(shuō)明如下。本發(fā)明包含如下細(xì)胞，其中IFN-Y應(yīng)答基因的誘導(dǎo)為至少20% (對(duì)照值的1.2倍)、至少30%、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少100 % (對(duì)照值的2.0倍)、至少2.5倍、至少3.0倍、至少4.0倍等。
[0114]本發(fā)明排除的是具有以下特征的黑色素瘤細(xì)胞群，其中在IFN-Y處理后，小于90%是自噬性的、小于80%是自噬性、小于70%是自噬性、小于60%是自噬性、小于50%是自噬性、小于40%是自噬性等等。
[0115]本發(fā)明排除的是具有以下特征的黑色素瘤細(xì)胞群，其中在IFN-Y處理后，小于90 %是非凋亡性的、小于80 %是非凋亡性的、小于70 %是非凋亡性的、小于60 %是非凋亡性的、小于50%是非凋亡性的、小于40%是非凋亡性的等等。
[0116]本發(fā)明排除的是具有以下特征的黑色素瘤細(xì)胞群，其中在IFN-Y處理后，小于90%是非粘附性的、小于80%是非粘附性的、小于70%是非粘附性的、小于60%是非粘附性的、小于50%是非粘附性的、小于40%是非粘附性的等等。
[0117]測(cè)量MHC 11類的表達(dá)
[0118]使用對(duì)MHC II類基因產(chǎn)物特異的抗體或核酸探針，可以測(cè)量MHC II類的表達(dá)。這些 MHC II 類產(chǎn)物包括 HLA-DPAl、HLA-DPBU HLA-DQAl、HLA-DQBU HLA-DRA, HLA-DRBl 以及HLA-DM 和 HLA-D0(參見(jiàn)例如 Apostolopoulos.等(2008)Human Vaccines4:400-409)。
[0119]例如，本發(fā)明包含試劑、治療方法和診斷方法，其要求黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)STATl和STAT2，從而具有活性STATl信號(hào)傳導(dǎo)通路、具有活性STAT2信號(hào)傳導(dǎo)通路或者具有活性STATl和STAT2信號(hào)傳導(dǎo)通路。
[0120]本發(fā)明提供藥物組合物或藥物試劑、相關(guān)施用方法以及治療方法，其導(dǎo)致以下生存數(shù)據(jù):危害比(hazard ratio, HR)小于1.0、HR小于0.9、HR小于0.8、HR小于0.7、HR小于0.6、HR小于0.5、HR小于0.4、HR小于0.3等。本發(fā)明結(jié)果可以為總生存數(shù)據(jù)、無(wú)進(jìn)展生存數(shù)據(jù)、疾病進(jìn)展時(shí)間數(shù)據(jù)等。本發(fā)明還提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的6月PFS。此外，本發(fā)明提供至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %等的6月總生存率/期。此外，本發(fā)明提供至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的I年(或2年)PFS。此外，本發(fā)明提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的I年(或2年)總生存率(參見(jiàn)例如U.S.Dept, of Healthand Human Services.Food and Drug Administration.Guidance for Industry.Clinicaltrial endpoints for the approval of cancer drugs and biologies (April2005))。
[0121]IFN-y的使用和自噬的誘導(dǎo)
[0122]在IFN- Y處理后誘導(dǎo)自噬是一種確定對(duì)系統(tǒng)性(systemic) IFN- Y處理的應(yīng)答的方法，如通過(guò)增加主要組織相容性II類復(fù)合體測(cè)定。如果在暴露于培養(yǎng)基中IFN-Y后，活檢的黑色素瘤腫瘤細(xì)胞的可測(cè)量的群落發(fā)生自噬而不是細(xì)胞凋亡，則這表明這些患者將有利地對(duì)系統(tǒng)性IFN-Y處理應(yīng)答。此外，如果從活檢中確定了成功細(xì)胞系，患者也會(huì)從細(xì)胞治療產(chǎn)品受益，該細(xì)胞治療產(chǎn)品由來(lái)自自噬性但非凋亡性粘附(adherent)群落的經(jīng)IFN-y處理的純化的腫瘤細(xì)胞系制得。
[0123]本發(fā)明包含分離和表征從自噬性、非凋亡性細(xì)胞所分離的主要組織相容性復(fù)合體,上述細(xì)胞是從用干擾素-Y處理的腫瘤細(xì)胞系收集的。主要組織相容性復(fù)合體包含對(duì)CD4+T細(xì)胞特異的抗原，并且已經(jīng)與抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答相關(guān)。復(fù)合體代表不會(huì)存在于非自噬性細(xì)胞中的大型抗原庫(kù)(repertoire)，這是因?yàn)樵谧允尚约?xì)胞中誘導(dǎo)的溶酶體介導(dǎo)的抗原加工活動(dòng)。
[0124]由經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞系所產(chǎn)生的非凋亡性的、自噬性腫瘤細(xì)胞可以與樹(shù)突細(xì)胞整合，以增強(qiáng)抗原呈遞，這是因?yàn)樵谧允尚阅[瘤細(xì)胞的表面上高水平的主要組織相容性復(fù)合體。該過(guò)程會(huì)得到由兩種細(xì)胞類型融合而產(chǎn)生的新的細(xì)胞產(chǎn)物。
[0125]對(duì)IFN-Y的應(yīng)答時(shí)誘導(dǎo)自噬的過(guò)程可以以不導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的方式誘導(dǎo)。通過(guò)用半胱天冬酶抑制劑和干擾素-Y合并處理腫瘤細(xì)胞，可以阻斷細(xì)胞死亡(并最終阻斷耐受性凋亡細(xì)胞的形成)的過(guò)程，而不抑制自噬的誘導(dǎo)或主要組織相容性II類復(fù)合體的增加。
[0126]消除凋亡細(xì)胞同時(shí)保留有活力的自噬性細(xì)胞的程序
[0127]黑色素瘤的研究表明在臨床試驗(yàn)中凋亡細(xì)胞的存在與差生存率之間具有相關(guān)性(Cornforth等(2011)Cancer Immunol.1mmunother.60:123-131 ;Dillman等(2011)CancerBiother.Radiopharmaceuticals26:407-415)。下面研究調(diào)查了在體外 IFN-Y 處理黑色素瘤腫瘤細(xì)胞后自噬的誘導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和MHC II類分子。
[0128]過(guò)濾[0129]下面提供“過(guò)濾”程序。本發(fā)明提供方法以及通過(guò)這些方法所產(chǎn)生的細(xì)胞，其用于增強(qiáng)非凋亡性細(xì)胞中黑色素瘤細(xì)胞群落。在體外IFN-Y處理之前，在任意給定的黑色素瘤細(xì)胞群落中，第一百分?jǐn)?shù)細(xì)胞可以偏向于是凋亡性的，并且第二百分?jǐn)?shù)細(xì)胞可以偏向于是非凋亡性的。在本發(fā)明上下文中，偏向指的是體外IFN-Y處理刺激第一百分?jǐn)?shù)細(xì)胞(或第一子群落細(xì)胞)的細(xì)胞凋亡，但不刺激第二百分?jǐn)?shù)細(xì)胞(或第二子群落細(xì)胞)的細(xì)胞凋亡。在多個(gè)實(shí)施方式中，可以使用體外IFN-Y處理來(lái)富集用于樹(shù)突細(xì)胞疫苗中的黑色素瘤細(xì)胞的免疫學(xué)刺激群落，通過(guò)迫使偏向于凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。一旦偏向于凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的子群落經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，就可以將這些細(xì)胞去除并丟棄。
[0130]本項(xiàng)研究的方法如下。在測(cè)定自噬、細(xì)胞凋亡和MHC II類表達(dá)之前，用1000IU/mL的IFN-Y培育自體黑色素瘤腫瘤細(xì)胞系和模型黑色素瘤腫瘤細(xì)胞系72小時(shí)。通過(guò)采用對(duì)LC3II的抗體的免疫印跡并通過(guò)采用Enzo’ s CytolD?自噬檢測(cè)試劑盒的流式細(xì)胞法，來(lái)
檢測(cè)自噬。通過(guò)使用7-AAD和Annexin-V染色和對(duì)MHC II類的抗體的流式細(xì)胞法，分別測(cè)定細(xì)胞凋亡和MHC II類誘導(dǎo)。
[0131]本研究的結(jié)果證明IFN-Y既誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系中自噬性細(xì)胞群落又誘導(dǎo)凋亡性的細(xì)胞群落。凋亡性的群落主要發(fā)現(xiàn)于非粘附群落中，而自噬性細(xì)胞保持粘附到燒瓶上。用抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻斷自噬會(huì)抑制對(duì)IFN-Y應(yīng)答時(shí)MHC II類陽(yáng)性細(xì)胞的誘導(dǎo)(39.4% IFN- Y vs.10.0% IFN- y +3-MA)。用泛半胱天冬酶抑制劑Z-VAD抑制半胱天冬酶活性來(lái)在經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞中防止細(xì)胞凋亡但不干擾自噬(2.75 ±0.15IFN-Y vs.3.04±0.27IFN-Y+Z-VAD，倍數(shù)變化)。綜上所述，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與低水平的自噬和MHC II類誘導(dǎo)有關(guān)。本發(fā)明提供消除凋亡性的細(xì)胞同時(shí)保護(hù)有活力的自噬性細(xì)胞的方法或程序以及IFN-Y處理能夠增強(qiáng)這類基于細(xì)胞的免疫治療的有效性。
[0132]第一研究的材料和方法
[0133]自體樹(shù)突細(xì)胞生成
[0134]通過(guò)如前所述的塑料粘附法(Choi等(1998)Clin.Cancer Res.4:2709-2716 ;Luft等(1998) Exp.Hematol.26:489-500)，生成樹(shù)突細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將自體采血術(shù)產(chǎn)物進(jìn)行f icoll-hypaque (GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom)密度梯度分離。將所得到的外周血單核細(xì)胞置于無(wú)抗生素的AIM-V培養(yǎng)基中(Invitrogen, Grand Island, NY),上述培養(yǎng)基補(bǔ)充有在以15X106cells/mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning-Costar，Corning, NY)中各 1000IU/mL 的 IL-4 (CellGenix, Freisberg, Germany)和GM-CSF(Beriex, Seattle, WA) (DC培養(yǎng)基)。培育一小時(shí)后，丟棄未粘附群落，并將新鮮DC培養(yǎng)基加入到燒瓶中。第二天早晨，丟棄未粘附細(xì)胞，用室溫PBS將燒瓶洗滌一次，并加入新鮮DC培養(yǎng)基。然后將燒瓶培養(yǎng)6天，在這段時(shí)間進(jìn)行流式細(xì)胞評(píng)估來(lái)測(cè)定該方法(負(fù)載DC之前)所產(chǎn)生的DC的百分?jǐn)?shù)和表型。
[0135]自體腫瘤細(xì)胞系生成
[0136]將先前報(bào)道的生成和表征的純腫瘤細(xì)胞擴(kuò)展到2億個(gè)細(xì)胞，然后在15% FBS/ECS 中在 RPMI (完全培養(yǎng)基)中用 1000IU/mL 的 IFN-y (InterMune, Brisbane, CA)培育72 小時(shí)，用來(lái)自銫源的 IOOGy 輻照并凍存(Choi (1998)Clin.Cancer Res.4:2709-2716 ；Luft(1998)Exp.Hematol.26:489-500 ；Dillman(1993)J.1mmunother.Emphasis TumorImmunol.14:65-69)，如前所述。從凍存中恢復(fù)經(jīng)IFN-Y處理且輻照的腫瘤細(xì)胞，用PBS洗滌3次，然后加入體外培養(yǎng)的DC，并培育約24小時(shí)。通過(guò)用橡皮淀帚輕輕刮取來(lái)收獲負(fù)載了抗原的DC，并以相等的量在9-11個(gè)等份中凍存。獲得細(xì)胞的等分部分，用于流式細(xì)胞評(píng)價(jià)，其代表負(fù)載后的DC細(xì)胞。
[0137]流式細(xì)胞法
[0138]使用對(duì)從BD Pharmingen San Diego, CA獲得的表面標(biāo)志物的單克隆抗體:結(jié)合PerCp的MHC II類抗體、結(jié)合APC的⑶IIc抗體，⑶80抗體、⑶83抗體、結(jié)合PE的⑶86抗體，進(jìn)行樹(shù)突細(xì)胞群落的表型表征。使用同型對(duì)照來(lái)測(cè)定百分陽(yáng)性細(xì)胞。使用來(lái)自BDPharmingen的對(duì)結(jié)合FITC的MHC I和II類的抗體、Annexin-V-PE和7-氨基放線菌素D(7-AAD)，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的流式細(xì)胞法。在每個(gè)批次之前，使用CaliBRITE流式細(xì)胞校準(zhǔn)(BD Pharmingen)，并且在流式細(xì)胞數(shù)據(jù)的整個(gè)收集過(guò)程中使用相同的儀器設(shè)定。
[0139]免疫印跡測(cè)定
[0140]用 Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific, Rockford, IL)加蛋白酶抑制劑混合物(Roche, Indianapolis, IN)以10，000細(xì)胞/uL在冰上，制備細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞裂解物。將大約25uLs/道的細(xì)胞裂解物在12.5% Tris-甘氨酸凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用針對(duì)如下的抗體進(jìn)行探測(cè):鈣網(wǎng)蛋白(MBL，Woburn, MA)、Hsp-60、Hsp-70、Hsp-90 (R&D Systems, Minneapolis, MN)、HMBG-1 (Cell Signaling, Danvers, MA)、ICAM-1 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA)、Mel-4、Mart_l(Signet, Emeryville, CA)、酪氨酸酶(Upstate, Lake Placid, NY)和 GADPH(Calbiochem, Darmstadt, Germany)。
[0141]免疫組織化學(xué)
[0142]使用免疫細(xì)胞化學(xué)程序 ，測(cè)定黑色素瘤系對(duì)一組(panel)抗原的表達(dá)。在存在或不存在1000IU/mL IFN- Y的情況下，在8室培養(yǎng)載玻片(Thermo Fisher, Rochester, NY)中培養(yǎng)細(xì)胞。72小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，并固定在冷丙酮中。阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，用適當(dāng)?shù)膶?duì)所列抗原的一抗(primary antibodies)培育細(xì)胞。使用生物素化抗鼠(anitmouse)或兔免疫球蛋白、結(jié)合超敏感酶的鏈霉親和素標(biāo)記(Super Sensitiveenzyme-conjugated streptavidin labeling)和辣根過(guò)氧化物酶色原體(chromogen)以及底物試劑盒(Biogenex, San Ramon, CA),進(jìn)行免疫組織化學(xué)。采用同型匹配對(duì)照抗體,研究如下抗人多克隆或單克隆抗體的活性:S_100和HMB-45 (Biogenex, San Ramon, CA)、Mel_2、Mel-5、art_l (Signet, Dedham, MA)、酪氨酸酶和 Mage-1 (Thermo Scientific, Fremont, CA)、Me I an-A > HLA-1 類和 HLA-1I 類(Dako, Denmark)。
[0143]統(tǒng)計(jì)分析
[0144]在雙尾檢驗(yàn)的學(xué)生t檢驗(yàn)中，兩樣本的方差相等。通過(guò)P值< 0.05確定顯著差異。
[0145]第一研究的結(jié)果
[0146]在完全培養(yǎng)基中，對(duì)用IFN-Y培育72小時(shí)應(yīng)答時(shí)，在自體黑色素瘤腫瘤細(xì)胞系中差異地引起細(xì)胞死亡。在經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞上或者未經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞上,進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)拒染料測(cè)定，其表 明在經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞中向更低活力的顯著趨勢(shì)(89.1±6.8%vs.84.9±9.3%，P = 0.014, N = 47)。通過(guò)流式細(xì)胞法分析四個(gè)自體黑色素瘤細(xì)胞系的樣本的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)(圖1A)，其表明黑色素瘤細(xì)胞對(duì)IFN-Y誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡差異地敏感，其中一些細(xì)胞顯示更遲的細(xì)胞凋亡或“死亡”群落(7-AAD+/AnneXin-V+)，而其他細(xì)胞顯示出更早的細(xì)胞凋亡或“即將死亡”群落(7-AAD-/AnneXin-V+)的信號(hào)。IFN-Y處理后所得到的凋亡性細(xì)胞的存在與無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期中顯著降低有關(guān)(Comforth(2010)CancerImmunol.1mmunother.Resistance to the proapoptotic effects of interferon-gammaon melanoma cells used in patient-specific dendritic cell immunotherapy isassociated with improved overall survival)。對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(log-rank test)表明IFN-y處理黑色素瘤腫瘤細(xì)胞后較低的活力與所研究患者中總生存期明顯相關(guān)。
[0147]將在存在或不存在IFN-Y的情況下發(fā)育的細(xì)胞裂解物進(jìn)行各種分子的免疫印跡，這些分子可能是免疫的重要介導(dǎo)物(圖1B)。在用IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞的設(shè)定中，熱休克蛋白似乎被差異性地調(diào)控，但基本上仍存在于細(xì)胞制劑中，尤其是在hsp-70的情況下。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白、鈣網(wǎng)蛋白和高遷移率族蛋白I(HMGB-1)似乎在某些情況下IFN-Y處理后被正調(diào)節(jié)(圖1B)。相反，普通黑色素瘤抗原(mel-4、Mart-1和酪氨酸酶)通常似乎被IFN- Y負(fù)調(diào)節(jié)，而ICAM-1被顯著正調(diào)節(jié)(圖1C)，ICAM-1是一種與對(duì)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感度有關(guān)的淋巴細(xì)胞黏附分子(Hamai (2008) Cancer Res.68:9854-9864)。事實(shí)上發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性更敏感。此外，一組黑色素瘤相關(guān)抗原的免疫組織化學(xué)表明，IFN-Y導(dǎo)致在許多考查的抗原中抗原表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)(表1)。
[0148]IFN-Y的使用導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合體I類和II類的正調(diào)節(jié)(Bohn(1998)J.1mmunol.161:897-908)。如圖1D中所示，用IFN-y處理自體黑色素瘤細(xì)胞導(dǎo)致幾乎普遍的且顯著的MHC I類正調(diào)節(jié)(P = 2.8X 10_8),中值倍數(shù)誘導(dǎo)(median fold induction)為2.91 ± 1.13(95% C.1.)。此外，MHC II類的平均熒光強(qiáng)度也顯著較高，但稍遜色(P =
0.039)，中值誘導(dǎo)為4.23±2.66(95% C.1.)。在自體黑色素瘤細(xì)胞表面上MHC II類分子的水平通常低于MHC I類分子，但在70%的情況下，對(duì)IFN- Y處理應(yīng)答時(shí)對(duì)于MHC II類分子來(lái)說(shuō)誘導(dǎo)高2倍，這是因?yàn)镸HC II類表達(dá)的低初始水平。在抗原負(fù)載到樹(shù)突細(xì)胞上時(shí)，腫瘤細(xì)胞上這些分子的存在可以提供將MHC復(fù)合體“易裝”(“cross dressing”)到抗原呈遞細(xì)胞上的機(jī)會(huì)(Dolan (2006) J.1mmunol.277:6018-6024, Dolan (2006)J.1mmunol.176:1447-1455)。
[0149]用IFN-Y培育一組四個(gè)代表性自體黑色素瘤細(xì)胞系，并等量負(fù)載到樹(shù)突細(xì)胞上，然后通過(guò)流式細(xì)胞法測(cè)定⑶80、⑶83、⑶86和MHC II類的表達(dá)。結(jié)果表明，在負(fù)載經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞后，觀察到表達(dá)⑶83的樹(shù)突細(xì)胞的陽(yáng)性群落百分?jǐn)?shù)的小幅但明顯增加(圖2)。此外，在⑶86散點(diǎn)圖(左上象限)中標(biāo)出更多的未經(jīng)處理的腫瘤細(xì)胞，結(jié)果是⑶86陽(yáng)性群落百分?jǐn)?shù)明顯減少，表明未經(jīng)IFN-Y處理的腫瘤細(xì)胞仍然存在。此效果最可能地是由于IFN-Y誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因?yàn)榈蛲鲂约?xì)胞更可能被之前報(bào)告的樹(shù)突細(xì)胞吞噬。
[0150]如圖3中所示，負(fù)載前DC的樣本表明其表達(dá)CD80 (39.0± 16.2 % ),CD83 (7.1±6.9% )、CD86(73.6±19.5% )并且是 MHC II 類陽(yáng)性的，并且具有96.2±5.0%活力。負(fù)載的DC具有顯著更高百分?jǐn)?shù)的⑶83(9.4±7.1% ,P = 0.019)和顯著更高的平均熒光強(qiáng)度(172.9±79.0，p = 0.0009)，表明用經(jīng)輻照的、IFN-Y處理的腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC在一些樹(shù)突細(xì)胞中誘導(dǎo)成熟(圖3B)。
[0151]第一研究討論
[0152]在抗腫瘤免疫的上下文中，抗原負(fù)載、成熟和施用的方案以及在基于樹(shù)突細(xì)胞(DC)的免疫治療的指導(dǎo)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這種類型的治療包含經(jīng)純化的自體腫瘤細(xì)胞作用抗原的來(lái)源的用途，并且包含與腫瘤相關(guān)抗原的患者特異庫(kù)(repertoire) (Selvan(2010)Melanoma Res.20:280-292 ；DiIIman(2007)CancerBiother.Radiopharm.22:309-321)。一些臨床試驗(yàn)使用未純化的自體實(shí)體(bulk)腫瘤。這種抗原來(lái)源可能具有已污染的成纖維細(xì)胞和壞死組織(O’Rourke (2007)Melanoma Res.17:316-322)。與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)的抗原可以存在于經(jīng)純化的細(xì)胞系中(Di I Iman (2006) New Engl.J.Med.355:1179-1181)。IFN-gamma 處理提高 MHC II 類分子的表達(dá)。MHC II類分子對(duì)于對(duì)基于樹(shù)突細(xì)胞的治療的應(yīng)答非常重要。存在于吞噬物質(zhì)中的分子(諸如鈣網(wǎng)蛋白、HMGB-1和熱休克蛋白)可對(duì)成熟信號(hào)有貢獻(xiàn)，該貢獻(xiàn)可以是除細(xì)胞因子混合物貢獻(xiàn)之外的貢獻(xiàn)。本發(fā)明中DCs的制備表現(xiàn)出成熟的趨勢(shì)，其可與晚期凋亡性細(xì)胞的吞噬有關(guān)(Ip(2004)J.1mmunol.173:189-196)。已經(jīng)知曉凋亡性細(xì)胞的使用與樹(shù)突細(xì)胞的生成有關(guān)，與負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物或負(fù)載壞死細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞相比，該樹(shù)突細(xì)胞在刺激淋巴細(xì)胞IFN-Y分泌方面更有效，表明負(fù)載了凋亡性細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞在體內(nèi)更有效。對(duì)IFN- Y的促凋亡(proapoptotic)作用的耐性與更好的臨床結(jié)果有關(guān)(Cornforth (2010)Cancer Immunol.1mmunother.60:123-131) ? 成熟 DC 分泌的白細(xì)胞介素-12 (IL-12)可以導(dǎo)致細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL ;CD8+T細(xì)胞)穩(wěn)健的活性?；铙w外成熟是否導(dǎo)致持久的腫瘤免疫的問(wèn)題已經(jīng)得到解決。也已經(jīng)表明，通過(guò)未成熟DC誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)(抑制抗原特異性CTLs)發(fā)生在使用細(xì)胞因子成熟的DC時(shí)。本文調(diào)查導(dǎo)致成熟的信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)的順序的重新評(píng)估，以改善DC成熟方案。因此，在本研究中在不需要體外細(xì)胞因子成熟的情況下經(jīng)輻照的腫瘤細(xì)胞作為抗原來(lái)源的用途可能是DC免疫治療的更優(yōu)選的方法，因?yàn)楸疚闹械淖C據(jù)表明DC已經(jīng)開(kāi)始成熟過(guò)程。注射后，這些“正在成熟”("maturing")的DCs可以通過(guò)分泌趨化因子，來(lái)完成成熟過(guò)程，該趨化因子會(huì)吸引表達(dá)許可(licensing)、抗原特異性⑶40L的⑶4+T細(xì)胞。已經(jīng)證明，諸如樹(shù)突細(xì)胞在對(duì)佐劑GM-CSF應(yīng)答時(shí)所產(chǎn)生的CCL17/TARC的血清趨化因子與更好的無(wú)進(jìn)展生存率有關(guān)。在某些情況下，樹(shù)突細(xì)胞活化淋巴細(xì)胞可能需要諸如⑶80和⑶86的輔助刺激分子的表達(dá)。作為成熟的標(biāo)志物，⑶83表達(dá)在成熟樹(shù)突細(xì)胞上，并且可對(duì)應(yīng)于能夠誘導(dǎo)更有效免疫應(yīng)答的樹(shù)突細(xì)胞(Prazma (2008) Immunol.Lett.115:1-8)。這表示在藥物組合物中所有細(xì)胞中的一部分。在任何藥物團(tuán)中，成熟DCs單獨(dú)的數(shù)目可以與更好的患者應(yīng)答有關(guān)或者可以與更好的患者應(yīng)答無(wú)關(guān)。
[0153]第一研究的表
[0154]表1:使用患者特異性細(xì)胞基于樹(shù)突細(xì)胞的治療中黑色素瘤細(xì)胞系中對(duì)干擾素-Y應(yīng)答時(shí)與普通腫瘤相關(guān)的抗原表達(dá)水平的變化。
【權(quán)利要求】
1.來(lái)自受試者的樹(shù)突細(xì)胞群落，其包含: 黑色素瘤特異性肽，其來(lái)自從患有黑色素瘤的受試者采集的黑色素瘤細(xì)胞， 其中所述黑色素瘤特異性肽由樹(shù)突細(xì)胞從所述黑色素瘤細(xì)胞體外獲得，所述黑色素瘤細(xì)胞被IFN-Y或IFN-Y模擬物體外處理， 其中超過(guò)60%的被IFN-Y或IFN-Y模擬物體外處理的所述黑色素瘤細(xì)胞是自噬性和非凋亡性的，并且 其中樹(shù)突細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞來(lái)自相同受試者。
2.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞群落，其中: 超過(guò)80 %的被IFN- Y或IFN- Y模擬物體外處理的所述黑色素瘤細(xì)胞是自噬性和非凋亡性的。
3.用于如權(quán) 利要求1所述受試者的疫苗，其包含如權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物樹(shù)突細(xì)胞群落。
4.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞，其中基本上所有的體外獲得的黑色素瘤特異性肽均來(lái)自不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞，其中基本上所有黑色素瘤特異性肽來(lái)自由于黑色素瘤細(xì)胞受到輻照而不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞，其中基本上所有黑色素瘤特異性肽來(lái)自由于黑色素瘤細(xì)胞的染色體被核酸交聯(lián)劑交聯(lián)而不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞,其包含來(lái)自用IFN-Y和輻射處理過(guò)的黑色素瘤細(xì)胞的黑色素瘤特異性肽。
8.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞，其包含黑色素瘤特異性肽，其中所有所述肽來(lái)自用IFN-Y和輻射處理過(guò)的黑色素瘤細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞群落，其中所述自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞通過(guò)粘附到表面而獲得。
10.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞，其中基本上所有黑色素瘤特異性肽來(lái)自經(jīng)體外處理而不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞，其中所述受試者是人受試者。
12.如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞，其中所述受試者是非人的哺乳動(dòng)物。
13.黑色素瘤疫苗，其包含至少一種成熟樹(shù)突細(xì)胞，所述成熟樹(shù)突細(xì)胞來(lái)自患有黑色素瘤的受試者， 其中所述至少一種成熟樹(shù)突細(xì)胞是通過(guò)與來(lái)自相同受試者的至少一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞接觸而制得的， 其中與所述至少一種成熟樹(shù)突細(xì)胞接觸的所述至少一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞是未分裂的、自噬性和非凋亡性的。
14.刺激對(duì)黑色素瘤特異性抗原免疫應(yīng)答的方法，其包括給如權(quán)利要求1所述的受試者施用免疫刺激量的如權(quán)利要求1所述的樹(shù)突細(xì)胞，或者給如權(quán)利要求13所述的受試者施用免疫刺激量的如權(quán)利要求13所述的疫苗。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中被刺激的所述免疫應(yīng)答包括CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和B細(xì)胞應(yīng)答中的一種或多種。
16.如權(quán)利要求17所述的方法，其中可通過(guò)ELISPOT測(cè)定、通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測(cè)定、通過(guò)四聚體測(cè)定、或者通過(guò)檢測(cè)抗原特異性抗體的產(chǎn)生來(lái)測(cè)定所述CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答或B細(xì)胞應(yīng)答。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答包括含有2年總生存率(OS)的生存時(shí)間，并且其中所述2年總生存率至少為60%。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述施用包括皮下注射所述疫苗。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述施用包括將每周給予的所述疫苗注射三個(gè)月，然后每月給予的所述疫苗注射五個(gè)月。
20.制備樹(shù)突細(xì)胞疫苗的方法，其包含來(lái)自相同受試者的黑色素瘤細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，所述方法包括: 用防止細(xì)胞分裂的試劑處理一種或多種黑色素瘤細(xì)胞； 用干擾素- Y (IFN-Y)或IFN-Y模擬物在體外處理所述一種或多種黑色素瘤細(xì)胞； 選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞； 丟棄非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞； 將自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞與一種或多種自體樹(shù)突細(xì)胞接觸； 允許由所述一種或多種自體樹(shù)突細(xì)胞攝取至少一種黑色素瘤衍生的肽。
21.組合物，其包含: 來(lái)自第一受試者的經(jīng)干擾素-Y (IFN-y)處理的黑色素瘤細(xì)胞，和來(lái)自相同第一受試者的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，其中所述黑色素瘤細(xì)胞是: 自噬性的；且 非凋亡性的。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)MHCII類。
23.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述APCs是樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述黑色素瘤細(xì)胞包含黑色素瘤特異性肽，并且其中所述黑色素瘤特異性肽并不包含于APCs中。
25.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述黑色素瘤細(xì)胞包含黑色素瘤特異性肽，并且其中至少一種黑色素瘤特異性肽被APCs攝取并被APCs包含。
26.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞被負(fù)載到APC 中。
27.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞未被負(fù)載到APC 中。
28.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述黑色素瘤細(xì)胞的自噬是通過(guò)如下測(cè)試證明的，該測(cè)試測(cè)定微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (LC3)。
29.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中使用7-氨基放線菌素D(7-AAD)試劑或annexin試劑中至少一種來(lái)證明所述黑色素瘤細(xì)胞是非凋亡性的。
30.在受試者中刺激免疫應(yīng)答的方法，所述受試者患有黑色素瘤且包含黑色素瘤細(xì)胞，其中所述受試者是與第一受試者相同的受試者，包括施用免疫有效量的如權(quán)利要求21所述的組合物。
31.制造如權(quán)利要求1的疫苗或權(quán)利要求21的組合物的方法，其包括將至少一種自噬性、非凋亡性的黑色素瘤腫瘤細(xì)胞與至少一種抗原呈遞細(xì)胞(APC)接觸，其中所述至少一種自噬性、非凋亡性的黑色素瘤腫瘤細(xì)胞來(lái)自第一人受試者,并且其中所述至少一種APC來(lái)自相同的第一人受試者。
32.制備樹(shù)突細(xì)胞疫苗的方法，其包括:用防止細(xì)胞分裂的試劑處理從第一受試者獲得的黑色素瘤細(xì)胞；用IFN-Y或IFN-Y模擬物處理所述黑色素瘤細(xì)胞；選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞；并且將所選擇的黑色素瘤細(xì)胞與來(lái)自相同第一受試者的自體樹(shù)突細(xì)胞接觸。
33.組合物，其包含通過(guò)如權(quán)利要求32所述的方法制得的樹(shù)突細(xì)胞疫苗。
34.刺激對(duì)黑色素瘤特異性抗原免疫應(yīng)答的方法，其包括給患有黑色素瘤的受試者施用如權(quán)利要求33所述 的組合物。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103957925SQ201280051821
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月20日
【發(fā)明者】安德魯·康福思, 羅伯特·迪爾曼 申請(qǐng)人:加利福尼亞干細(xì)胞公司