專利名稱：針對典型性豬瘟病毒的嵌合疫苗抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物健康領(lǐng)域，特別地涉及在豬中形成針對此類病毒 的早期且強有力的免疫應(yīng)答的新型嵌合抗原，其包含與刺激細胞和體
液免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)分子相偶聯(lián)的典型性豬瘟病毒(Classic Swine Fever Virus, CSFV)的病毒亞單位。
現(xiàn)有技術(shù)
典型性豬瘟(CSF)也稱為豬霍亂，由于其高傳染性特征及其世界 范圍的分布而被視為豬中最重要的疾病，并且它被包括在世界動物衛(wèi) 生組織(World Animal Health Organization)的通凈艮疾病列表中。 這種疾病的病原體即CSFV是黃病毒科(F7a72'Wr2'tfae)的瘟病毒屬的 病毒。已知它是具有脂質(zhì)包膜的病毒，其直徑為40 - 60 nin和呈現(xiàn)六 方對稱，并且具有單鏈核糖核酸(RNA)作為遺傳物質(zhì)(Kumraerer等 人 (2000 ) . The genetic basis for cytopathogenicity of pestviruses . Vet. Microbiol. 77: 117-128; Mo醒ing等人(2003 ). Clinical signs and epidemiology of Classical Swine Fever; a review of new Knowledge. Vet. Journal 165: 11-20)。
CSF是高度接觸傳染性的疾病，在其急性形式中呈現(xiàn)出發(fā)熱、毛 細管變性、內(nèi)臟器官壞死和死亡。主要臨床征象在2-6天的潛伏期后 出現(xiàn)，最初產(chǎn)生發(fā)熱、運動減少和食欲缺乏，這在接下來的時間內(nèi)變 得更糟并且體溫可以達到42TC。此外，出現(xiàn)白細胞減少癥，其中白細 胞系歹,J (white series)的值小于8000/mm3血液。豬還形成結(jié)膜炎、 便秘，隨后為在末期中的腹瀉、嘔吐、缺乏運動協(xié)調(diào)、抽搐和肌肉輕癱。在整個腹部、豬口鼻部、耳和腿的內(nèi)部部分中擴展的紅色膚色是 明顯的。在大多數(shù)致死病例中，腦的組織病理學(xué)顯示具有高度血管化
的非化膿性腦炎(Moenning等人(2002 ) Clinical Signs and Epidemiology of Classical Swine Fever. A review of new knowledge. Vet. Journal 161: 1-10)。
CSFV在感染期間的行為如同免疫抑制劑(Susa等人(1992 ) Pathogenesis of Classical Swine Fever: B-lymphocyte deficiency caused by Hog Cholera virus. J， Virol. 66: 1171-1175 )，并且 在感染后2-3周時開始檢測到中和抗體(Laevens等人(1998 ) . An experimental infection with a classical swine fever virus in weaner pigs. II. The use of serological data to estimate the day of virus introduction in natural outbreaks. Vet. Q. 20: 46-49 )。感染的末期與循環(huán)系統(tǒng)中以及淋巴組織中B淋巴細胞顯著減 少相關(guān)聯(lián)(Susa等人(1992 ) Pathogenesis of Classical Swine Fever: B—lymphocyte deficiency caused hog cholera virus. J. Virol. 66: 1171-1175 )。大多數(shù)得病的豬在感染后10 - 20天死亡， 其死亡率超過95%。 CSF特征性的尸檢損害屬于出血素質(zhì)，其中在大 多數(shù)器官系統(tǒng)中出現(xiàn)瘀斑。這些瘀斑在腎、膀胱和淋巴節(jié)中更常見， 盡管它們還可以出現(xiàn)在脾、喉、粘膜和漿膜中(Mouwen等人(1983 ) Atlas of Veterinary Pathology, Bunge， Utrecht The Netherlands )。
經(jīng)胎盤感染是CSF的其他臨床形式；在這種情況下，病毒能夠通 過懷孕母豬胎盤感染胎兒。這種感染的后果可以是流產(chǎn)、產(chǎn)出死亡的
后代、木乃伊化、畸形、產(chǎn)出虛弱的豬和在器官分化中的問題。取決 于感染出現(xiàn)時的懷孕時間，可以由于通過母豬進行的感染而生出CSFV 免疫耐受性后代(垂直傳播)。小豬保持受感染狀態(tài)和病毒血癥直至 死亡，其中導(dǎo)致CSFV散布穩(wěn)定地集中于該獸群中(Moenning等人 (2003) Clinical Signs and Epidemiology of Classical Swine Fever: a review of new knowledge. Vet. Journal 165: 11—20)。 與CSF相關(guān)的死亡率構(gòu)成了受影響國家的經(jīng)濟問題，其中對發(fā)展中國家的經(jīng)濟和社會形勢的損害具有影響。由于這些原因，在具有高的豬 密度和高的病毒流行的國家中，必須應(yīng)用基于疫苗接種的控制計劃。 在其中豬生產(chǎn)主要由政府以津貼補助的高度發(fā)達的國家例如歐洲、美 國和加拿大中，應(yīng)用通過樸殺進行的根除法。然而，成本是極高的并 且那些國家仍易受可能的地方性動物病的影響。
歐盟(EU)被視為這種疾病再度出現(xiàn)的高危地區(qū)，這是由于豬群 的高密度、不接種疫苗的政策以及其與東歐國家(在那里CSFV是地方 性動物病)在地理學(xué)上相接近。與這個區(qū)域中這種疾病再度出現(xiàn)相關(guān) 的問題之一是存在具有CSF的地方性感染的野豬(Laddomada ( 2000 ) Incidence and control of CSF in wild boars in Europe. Vet. Microb， 73: 121-30 )。這種再度出現(xiàn)已經(jīng)發(fā)生，盡管在歐盟內(nèi)部實 現(xiàn)了一致的控制計劃，其包括整個接觸傳染性群體的衛(wèi)生處死和限制 豬從受影響地區(qū)輸出到無病地區(qū)(van Oirschot ( 2003 ) Vaccinology of Classical Swine Fever: from lab to field. Vet Microbiol, 96: 367-384 )。因而，當(dāng)務(wù)之急是必需開發(fā)誘導(dǎo)早期且安全的免疫應(yīng) 答的疫苗，其保證針對感染和病毒傳播的保護。
已開發(fā)了基于完整病毒的針對CSFV的疫苗具有經(jīng)結(jié)晶紫或福爾 馬林滅活的病毒的疫苗(Biront等人(1988 ) Classical swine fever related infections. LiessB.M. Ed. Martinus Nijhoff Publishing, Boston: 181-200 )，具有通過在兔中進行傳代而減毒的病毒的疫苗， 例如Sinlak毒林(Baibikov等人，RU 2182495 )和Upinizied Chinese 毒林(Dahle等人(1995 )Assessment of safety and protective value of a cell culture modified strain C vaccine of hog cholera/classical swine fever virus. Berl-Munch. Tieraztl. Wsch， 108: 20-25 )，或者具有在兔、豚鼠和豬的細胞培養(yǎng)中進行減 毒的病毒的疫苗(Kachiku等人，JP 73001484; Terpstra等人(1990 ) Development and properties of a cell culture produced for hog cholera based on Chinese strain. Ditsh. Tierarztl. Wsch. 97: 77-79 )。由于可能包含活性病毒的級分，這些類型的疫苗構(gòu)成危險，所述活性病毒在易感動物上進行接種后將產(chǎn)生新的CSF爆發(fā)。此外， 在某些情況下，需要重復(fù)免疫接種以獲得保護性免疫應(yīng)答，因為滅活 影響病毒的免疫原性性質(zhì)。
在具有減弱的毒力的活疫苗的特定情況下，它們具有潛在的風(fēng)險， 即發(fā)生部分減毒或毒力回復(fù)。在任何一種情況下，它們都將產(chǎn)生致病 性病毒顆粒，所述致病性病毒顆粒在對易感動物接種后允許獸群中 CSF的感染、臨床疾病和傳播。這些問題對懷孕母豬造成更大的危險， 因為該病毒可以感染高度易感的胎兒，并且被感染的后代傳播該疾病。
存在基于已證實減毒的CSFV毒林的疫苗，如C Chinese毒抹、PAV 250毒林、Thierval毒林和IFFA/A-49毒抹(Bjiirlund， H. JV.等人 (1998) Molecular characterization of the 3' noncoding region of classical swine fever virus vaccine strains. Virus Genes 16: 307-312 j La畫is 等人(1978 ) Hog Cholera Virus: Active immunization of piglets with the Thiverval strain in the presence and absence of calostral passive immunity. Vet. Microbiology 3: 31-43)。這些毒林僅在其中該疾病是地方性動物病 的國家中使用，因為它們具有無法區(qū)分已接種疫苗的動物和感染了天 然病毒的動物的不便。用這些毒林進行疫苗接種的動物在血清學(xué)測試 中產(chǎn)生如同受感染動物中相同的應(yīng)答。用基于減毒病毒的疫苗產(chǎn)生的 特異性抗CSFV抗體干擾CSF感染的診斷。所述診斷通過免疫檢測在扁 桃體中的傳染性病毒來進行，而所述疫苗病毒毒林恰恰在扁桃體中進 行增殖。由于這些原因，減毒的毒林不適合在根除計劃中使用。用 LK-VNIIVVM毒林進行疫苗接種和用以弗氏佐劑配制的經(jīng)純化的 Shi-Myng毒林進行另外的超免疫是另一個例子。但是，在40-45個位 置中的免疫接種在其中每天必須對數(shù)百只動物進行疫苗接種的疫苗接 種活動中是不可行的(Balashova等人，RU2183972 )。
用包含完整病毒的這些疫苗進行免疫接種還干擾在由CSFV引起 的感染和由可以感染豬的瘟病毒屬的其他成員(如牛病毒性腹竭病毒 (縮寫為BVDV)和邊界病病毒(縮寫為BDV))引起的感染之間的區(qū)另寸性i貪斷(Dahle等人(1991 ) Clinical Post Mortem and Virological Findings after Simultaneous Inoculation of Pigs with Hog Cholera and BVD Virus. J. Med. Vet. 38: 764-772)。
為了避免基于完整病毒的疫苗的那些不便，合適的結(jié)果是使用完 全無害的疫苗，如基于通過重組方式獲得的病毒亞單位或蛋白質(zhì)的變 體。這些變體應(yīng)當(dāng)保護獸群免于病毒毒林的再引入，并且還允許通過 簡單的血清學(xué)方法來區(qū)分已接種疫苗的動物和被感染的動物。在這個
意義上，已開發(fā)出了基于病毒亞單位的疫苗。包含病毒蛋白質(zhì)如病毒 包膜的E2糖蛋白的疫苗(Bo證a等人(2000 ) Duration of the onset of the herd immunity induced by E2 subunit vaccine against classical Swine Fever virus. Vaccine 18: 1374-1381 )是安全的, 因為它們的使用不涉及毒力回復(fù)的任何風(fēng)險并且不干擾診斷。這些疫 苗允許區(qū)分被感染的動物和已接種疫苗的動物，因為產(chǎn)生的抗體僅針 對病毒區(qū)段具有反應(yīng)性。因此，它們對于CSF根除計劃是方便的。
已開發(fā)出了在原核生物中表達E2蛋白質(zhì)的幾種重組疫苗和基于 此類蛋白質(zhì)的合成肽的疫苗(Chen等人，W0 200232453 )。在這些情 況下，蛋白質(zhì)是非糖基化的，因此它的免疫原性和保護能力受到影響。 另一種疫苗候選物使用病毒載體以用于在真核生物細胞中表達E2的 異源基因，所述病毒載體如豬假狂犬病病毒(Peeters等人(1997 ). Biologically safe, non-transmissible pseudorabies virus vector vaccine protects pigs against both Aujeszky，s disease and classical swine fever. J. Gen. Virol. 78: 3311-3315 )、 豬天 花病毒(Gibbs等人，US62117882 )和豬腺病毒(Nagy等人， WO200183737 )。在這些情況下，由野生型病毒進行的病毒感染產(chǎn)生針 對相同血清型的病毒載體的中和抗體。因此，針對CSFV的免疫應(yīng)答的 誘導(dǎo)受到影響。此外，由于規(guī)章問題，基于豬假狂犬病病毒和豬天花 病毒的表達載體不能在已宣布沒有這些病毒的國家中應(yīng)用。此外，痘 苗病毒已用作載體，但世界衛(wèi)生組織(World Health Organization) 的條例阻礙其使用(Meyeers等人，EP 1087014 )。
7基于用于在肌細胞和骨細胞中表達E2蛋白質(zhì)的棵露脫氧核糖核 苷酸(DNA)的疫苗具有這樣的不便，即需要較高濃度的DNA以誘導(dǎo)應(yīng) 答，因為使用棵露DNA的轉(zhuǎn)染效率極低。這種疫苗服從于阻礙其應(yīng)用 的強有力的規(guī)章控制(Audonnet等人，WO 20152888 )。
使用由桿狀病毒介導(dǎo)的昆蟲細胞表達系統(tǒng)來產(chǎn)生作為抗原的E2 導(dǎo)致可行的替代方案(Van-Rjin等人(1999 ) An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on enveloped glycoprotein E2 of classical swine fever virus. Vaccine, 17: 433-440; Kretzdorn等人，US 20040028701 )。在這 個系統(tǒng)中，重組E2作為糖蛋白產(chǎn)生，這相對于非糖基化的變體而言增 加了其免疫原性。不產(chǎn)生針對桿狀病毒的抗體，因為桿狀病毒進一步 被滅活，并且不存在對于豬的致病影響。然而，在疫苗接種后3周之 后誘導(dǎo)出針對感染的有效保護，并且不存在針對子宮內(nèi)感染的完全保 護。
因此，在CSF預(yù)防中的重要問題是不存在這樣的亞單位重組疫苗， 其允許在已接種疫苗的動物和被感染的動物之間的區(qū)別性診斷，并且 在疫苗接種后能夠產(chǎn)生早期保護，從而消除從懷孕母豬向其后代的經(jīng) 胎盤傳播。
發(fā)明詳述
本發(fā)明解決了上文提及的問題。新型疫苗包含嵌合抗原，所述嵌 合抗原包含與免疫系統(tǒng)刺激性分子相組合的病毒亞單位，這允許形成 保護豬不受CSFV感染的早期免疫應(yīng)答。所提出的解決方案的另一個優(yōu) 點是，由于嵌合抗原中與病毒蛋白質(zhì)相組合的刺激性分子的免疫增強 效應(yīng)，它消除了從受感染的懷孕母豬到其后代的病毒傳播。
特別地，本發(fā)明涉及針對CSF的嵌合抗原，其具有CSFV包膜的 E2糖蛋白作為主要組分。E2糖蛋白的細胞外區(qū)段用作與免疫系統(tǒng)刺激 性蛋白質(zhì)(在本發(fā)明背景中稱為"分子佐劑")相偶聯(lián)的免疫原，以增強早期細胞免疫應(yīng)答的刺激和更高CSFV中和抗體滴度的誘導(dǎo)。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述免疫系統(tǒng)刺激性蛋白質(zhì)是 a干擾素，或CD154分子的細胞外區(qū)段。在一個優(yōu)選實施方案中，所 述oc干擾素或CD154分子的細胞外區(qū)段可以來自任何哺乳動物。
基于嵌合蛋白質(zhì)的本發(fā)明的疫苗抗原從免疫接種后第l周開始保 證在已接種疫苗的豬中的保護，當(dāng)以105LD5。(引起50。/。被CSFV感染 的動物死亡的病毒劑量)攻擊它們時。此類保護由針對CSFV的強烈細 胞免疫應(yīng)答介導(dǎo)，該強烈細胞免疫應(yīng)答與合并在嵌合抗原中的元素組 合直接相關(guān)。還觀察到中和抗體誘導(dǎo)的時間減少，所述中和抗體誘導(dǎo) 在疫苗接種后第2周出現(xiàn)。這有助于增加在已接種疫苗的豬中的針對 CSFV的保護。經(jīng)免疫的動物不呈現(xiàn)臨床疾病的跡象，并且在用此類病 毒攻擊后任何一天中都不能從體液中分離出CSFV。
E2-分子佐劑這樣的嵌合抗原阻止CSFV從母豬向其胎兒的垂直傳 播。這些蛋白質(zhì)在懷孕母豬中誘導(dǎo)早期保護，這延遲臨床疾病的形成， 并且在用105 LDs。的CSFV攻擊后，不僅在母體中而且在胎兒中均不允 許病毒增殖。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述嵌合疫苗抗原的特征在于實質(zhì)上包 含CSFV的E2糖蛋白的細胞外區(qū)段(或結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列，其在 序列表中作為Seq ID. No. 1呈現(xiàn)；和豬的CD154分子的細胞外區(qū)段 的氨基酸序列，其為Seq ID. No. 2。所述嵌合疫苗抗原實質(zhì)上包含 此類氨基酸序列，但它還可以包括來自CSFV的任何分離林的E2的細 胞外區(qū)段。
本發(fā)明的另一個方面是，嵌合疫苗抗原可以通過重組方法、合成 方法或者通過化學(xué)綴合來獲得。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，作 為融合蛋白來產(chǎn)生基于包含E2his(與6組氨酸尾巴融合的E2的細胞 外區(qū)段)和分子佐劑的嵌合蛋白質(zhì)的變體。為此，將由4個重復(fù)的 Gly4Ser ( 4G4S )單元組成的間隔肽和免疫系統(tǒng)刺激性分子加至E2his 的C-末端。4G4S肽的摻入允許多肽鏈具有一定程度的松弛。這保證蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)的正確三級結(jié)構(gòu)折疊，以獲得具有類似于天然蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)的融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的疫苗抗原之一具有在其c-末端處融
合的豬CD154分子的細胞外區(qū)段以作為分子佐劑(E2his-CD154)。
迄今為止，仍未探究用于生產(chǎn)針對CSFV的重組疫苗候選物的在動 物中的表達系統(tǒng)如生物反應(yīng)器。然而，乳腺以正確折疊蛋白質(zhì)三級結(jié) 構(gòu)的方式表達糖基化重組蛋白質(zhì)的能力構(gòu)成了足夠的表達系統(tǒng)，以產(chǎn) 生具有高免疫原性和保護能力的E2糖蛋白。由腺病毒栽體介導(dǎo)的在反 芻動物的乳腺中的瞬時表達系統(tǒng)構(gòu)成了以快速且簡單的方式獲得重組 蛋白質(zhì)的高表達水平的工具(Toledo等人，W0 2004/034780 )。這種 方法對于重組E2的生產(chǎn)非常有用，目的是應(yīng)用旨在根除CSF的疫苗接 種計劃。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的目的疫苗抗原在泌乳過程 中表達于經(jīng)基因改造的哺乳動物的乳腺上皮細胞中，并且分泌到乳中。 重組嵌合分子在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳中產(chǎn)生，或者通過使用腺病毒載 體直接轉(zhuǎn)化非轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳腺上皮來產(chǎn)生。在本發(fā)明的其他實 施方案中，所述嵌合疫苗抗原在經(jīng)基因改造的酵母中產(chǎn)生。此類抗原 在酵母的培養(yǎng)基中獲得，所述酵母用嵌合基因和允許重組蛋白質(zhì)表達 并分泌到培養(yǎng)基中的調(diào)控序列進行轉(zhuǎn)化。
天然CSFV的E2蛋白質(zhì)作為同二聚體暴露在病毒包膜上，通過鏈 間二硫橋而得到穩(wěn)定。這決定了，產(chǎn)生針對呈現(xiàn)在同二聚體上的構(gòu)象 表位的保護性中和抗體。在本發(fā)明過程中開發(fā)的疫苗抗原在允許這些 重組蛋白質(zhì)正確折疊的表達系統(tǒng)中產(chǎn)生。遺傳構(gòu)建體的設(shè)計保證融合 蛋白的三級結(jié)構(gòu)不改變。重組疫苗抗原通過簡單的金屬離子親和層析 步驟而容易地純化。
遺傳構(gòu)建體的設(shè)計、表達系統(tǒng)的使用和純化操作的相對簡單性保 證了，在本發(fā)明中描述的針對CSFV的疫苗抗原保持了類似于病毒E2 蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性性質(zhì)。用在表達系統(tǒng)例如巴斯德畢赤酵母 pa^oWs)或山羊乳腺中產(chǎn)生的嵌合分子進行免疫接種導(dǎo)致 早期且強有力的免疫應(yīng)答。E2的細胞外結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生同二聚體，其提供 了用于產(chǎn)生保護性中和抗體的構(gòu)象表位。來自CD154的區(qū)段充當(dāng)分子佐劑，其刺激已接種疫苗的豬的免疫系統(tǒng)，從疫苗接種后第l周開始
產(chǎn)生保護動物不受CSFV影響的細胞免疫應(yīng)答。這兩種分子在包含間隔 肽的嵌合蛋白質(zhì)中的組合保證了每種分子的正確折疊。所使用的表達 系統(tǒng)允許重組蛋白質(zhì)以其糖基化形式進行表達。它還幫助獲得具有正 確的三級結(jié)構(gòu)的分子。
本發(fā)明的另一個方面是能夠產(chǎn)生針對CSFV的保護性免疫應(yīng)答的 疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物包含前面所描述的嵌合抗 原，所述嵌合抗原包含E2糖蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域和分子佐劑。此類疫 苗組合物可以通過全身或粘膜途徑施用于動物，目的為預(yù)防CSF以及 避免在豬群中由CSFV感染所產(chǎn)生的物料和經(jīng)濟損失。
附圖簡述


圖1.在還原條件下經(jīng)由SDS-PAGE來分析在用Ad-E2his-sec腺 病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PK-15細胞中的E2his表達。(A)SDS-PAGE，泳道1: 來自經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的培養(yǎng)基，泳道2:來自未處理的細胞的培養(yǎng)基， MWM:分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。(B)使用針對組氨酸尾巴的單克隆抗體通 過Western印跡法免疫鑒定E2his，泳道1:來自經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的培養(yǎng) 基；泳道2:來自未處理的細胞的培養(yǎng)基；泳道3:關(guān)于組氨酸尾巴的 陽性對照，MWM:分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。(C)使用來自被CSFV感染的豬 的多克隆血清通過Western印跡法免疫鑒定E2his,泳道1:來自未處 理的細胞的培養(yǎng)基；泳道2:來自用Ad-E2his轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的培養(yǎng)基， MWM:分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。
圖2.分才斤在用Ad-E2his-sec和Ad-E2hisCD154-sec腺病毒載體 轉(zhuǎn)導(dǎo)的PK-15細胞中E2his和E2his-CD154的表達條件。在非還原條 件下通過SDS-PAGE分開培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。目的分子的免疫鑒定通過 使用針對CSFV的E2蛋白質(zhì)的單克隆抗體(Mab)( Mab-1G6 )的Western 印跡法來進行。泳道l:來自用Ad-E2his-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的培養(yǎng) 基；泳道2:來自用Ad-E2hisCD154-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的培養(yǎng)基，
iiMWM:分子量標(biāo)記。
圖3.在用Ad-E2his-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的山羊的乳中E2his的表達動 力學(xué)。在非還原條件下通過SDS-PAGE分開存在于相應(yīng)于每個擠奶曰的 乳清樣品中的蛋白質(zhì)。E2his的免疫鑒定通過使用Mab-1G6的Western 印跡法來進行。泳道PK:在用Ad-E2his-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PK-15細胞 的培養(yǎng)基中表達的E2his陽性對照；泳道C-:來自未處理的山羊的乳 清樣品；泳道l-8:來自用Ad-E2his-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的山羊的乳清樣 品，相應(yīng)于腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后8個擠奶日中的每一天。
圖 4. 在用 Ad-E2hisCD154-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的山羊的乳中 E2his-CD154的表達動力學(xué)。在非還原條件下通過SDS-PAGE分開存在 于相應(yīng)于每個擠奶日的乳清樣品中的蛋白質(zhì)。E2his-CD154分子的免 疫鑒定通過使用Mab-lG6的Western印跡法來進行。泳道1-5:來自 用Ad-E2hisCD154-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的山羊的乳清樣品，相應(yīng)于腺病毒轉(zhuǎn) 導(dǎo)后5個擠奶日中的每一天；泳道C-:來自未處理的山羊的乳清樣品； 泳道PK:在用Ad-E2hisCD154-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PK-15細胞的培養(yǎng)基中 表達的E2his-CD154陽性對照。
圖5.在非還原條件下在SDS-PAGE中分開的E2his的純度和鑒定 分析。蛋白質(zhì)在用Ad-E2his-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的山羊的乳中表達，并且純 化通過金屬離子親和層析來進行。(A)純化的不同步驟的SDS-PAGE。 (B)通過使用Mab 1G6的Western印跡法進行的免疫鑒定。泳道1: 在用Ad-E2his-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PK-15細胞的培養(yǎng)基中表達的E2his 陽性對照；泳道2:來自未處理的山羊的乳清樣品；泳道3:來自用 Ad-E2his-sec載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的山羊的乳清樣品，其作為用于層析的起始材 料而獲得；泳道4:不與基質(zhì)結(jié)合的材料；泳道5:用20mM咪唑洗滌； 泳道6:用50 mMn米喳洗滌；泳道7:以200 mM。米唑洗脫。
圖6.存在于被CSFV強毒抹感染的豬血清中的抗體對于E2his疫 苗抗原的2種同種型所進行的抗原識別的比較。從用Ad-E2his-sec 腺病毒載體轉(zhuǎn)化的山羊的乳中純化出的E2his通過電泳法和Western 印跡法在還原條件(單體)和非還原條件(同二聚體)下進行分析。(A) SDS-PAGE。 (B)使用被CSF感染的豬的多克隆血清的Western 印跡法，泳道l:在非還原條件下分開的E2his;泳道2:在還原條件 下分開的E2his。
圖7.在用單劑量的E2his疫苗抗原進行疫苗接種的2組豬中獲 得的中和抗體的動力學(xué)，其中抗體滴度通過過氧化物酶聯(lián)中和測定法 來測定。組A以30Mg/動物的劑量進行接種，和組B以50Mg/動物的 劑量進行接種。這2個組在疫苗接種后3周以105 LDs。的CSF病毒劑 量進行攻擊。結(jié)果顯示為滴度倒數(shù)的幾何平均值。
圖8.淋巴組織增生測定法，其使用在用E2-CD154抗原(組D和 E)和E2his (組F)疫苗接種后第5天從豬中分離的淋巴細胞。結(jié)果 表示為刺激指數(shù)(SI),其被定義為經(jīng)刺激的培養(yǎng)物的每分鐘計數(shù) (count per minute, cpm)值和未處理的對照培養(yǎng)物的cpm值之間的 比率。誘導(dǎo)了 SI>2的淋巴組織增生應(yīng)答被視為是陽性的。評估了在 用CSFV處理的培養(yǎng)物中的增殖，以及在用CSFV和針對豬CD4結(jié)構(gòu)域 的Mab處理的培養(yǎng)物中的增殖抑制。
圖9. PK-15細胞中的抗病毒活性測定法，其使用來自用E2-CD154 (組D和E)和E2his (組F)抗原進行疫苗接種的豬的血清。結(jié)果表 示為滴度倒數(shù)的幾何平均值。
圖10.在用E2-CD154 (組H)和E2his (組I)抗原進行疫苗接 種的2組豬中獲得的中和抗體的動力學(xué)，其中使用50jug/動物的劑量。 抗體滴度通過過氧化物酶聯(lián)中和測定法來測定。結(jié)果顯示為滴度倒數(shù) 的幾何平均值。
實施例
實施例1:編碼CSFV E2和豬CD154的細胞外結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段的獲 得，和pMOS-E2his-CD154質(zhì)粒的克隆。
通過逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR )從Cuban CSFV"Margarita"分離林的病毒基因組(在國家生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI )的數(shù) 據(jù)庫中的登記號為AJ704817 )中擴增出編碼363個氨基酸的E2的細 胞外結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段。在3' oligo中包括關(guān)于6組氨酸尾部的編碼 序列，以便允許抗原的簡單純化。
編碼210個氨基酸的豬CD154的細胞外結(jié)構(gòu)域的序列通過化學(xué)合 成來獲得，其中采用歐洲野豬(S"s"roA)的CD154基因(NCBI登 記號AB040443 )作為序列原型。在編碼該分子的序列的5'末端中包括 編碼4個重復(fù)的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ( 4G4S )單元的肽的區(qū)域。通 過亞克隆入pM0S-BLUE質(zhì)粒(Amersham， USA )中，緊在E2his編碼序 列中的6組氨酸尾巴后插入合成的序列(4G4S-CD154 )。獲得 pMOS-E2his-CD154質(zhì)粒。
實施例2:具有用于哺乳動物細胞的分泌信號的E2his和E2his-CD154
分子的遺傳構(gòu)建。
將通過RT-PCR獲得的、相應(yīng)于E2his的序列插入質(zhì)粒pAEC-SPT 的^ IHo/ V位點中(Herrera等人(2000 ) Biochem. Byophys Res. Commun. 279: 548-551 )。由此，獲得載體pE2his-see,其包 含編碼E2his的序列，在該序列之前為人組織纖溶酶原激活物(htPA) 的分泌信號，并且在人巨細胞病毒的立即早期啟動子(CMVP)的轉(zhuǎn)錄 控制下。
將亞克隆在pM0S-BLUE載體中的、相應(yīng)于E2his-CD154的序列插 入質(zhì)粒pAEC-STP中關(guān)于核酸內(nèi)切酶I的限制位點中。由 此，獲得載體pE2hisCD154-sec，其包含編碼E2his-CD154的序列， 在該序列之前為htPA的分泌信號，并且在CMVP的轉(zhuǎn)錄控制下。
實施例3:產(chǎn)生重組腺病毒載體，其包含具有關(guān)于哺乳動物細胞的分 泌信號的編碼E2his和E2his-CD154的序列。
基于 AdEasy 系統(tǒng) (AdEasy —Vector system ， QuantumBiotechnologies, EE. UU )來產(chǎn)生復(fù)制缺陷的腺病毒載體(Ad-厶El， △ E3)。將質(zhì)粒pAdTrack-CMV用作轉(zhuǎn)移載體。
通過用iVco I和AcoW V限制性核酸內(nèi)切酶進行酶促消化從質(zhì)粒 pE2Ms-sec中提取出具有htPA的分泌信號的編碼E2his的序列 (E2his-sec)，并且將它插入pAdTrack載體的五coW V限制位點中。 獲得質(zhì)粒pAdT-E2his-sec，其中E2his的可分泌變體處于CMVP的轉(zhuǎn) 錄控制下。
通過用A" I和I限制性核酸內(nèi)切酶進行酶促消化從質(zhì)粒 pE2his-CD154-sec中提取出編碼可分泌的E2his-CD154的序列，并且 將它插入pAdTrack載體的f;w2 I限制位點中。獲得重組質(zhì)粒
pAdT-E2hisCD154-sec,其中E2his-CD154的可分泌變體處于CMVP的 轉(zhuǎn)錄控制下。
轉(zhuǎn)移腺病毒載體pAdT-E2his-sec和pAdT-E2hisCD154-sec通過 用尸邁e I限制性核酸內(nèi)切酶進行酶促消化來線性化，以便產(chǎn)生重組腺 病毒基因組。將每種線性載體各自與pAdEASY-l載體一起共電穿孔到 大腸軒菌(fsc力er/c力/a co//) BJ"5183菌林中。pAd—E2his—sec和 pAd-E2hisCD154-sec載體的重組基因組通過同系物的重組來獲得。其 中之 一 包含編碼E2his-sec 的序列，和另一個包含編碼 E2his-CD154-sec分子的序列。在這兩種情況下，它們保持在CMVP的 轉(zhuǎn)錄控制下。
重組腺病毒基因組進一步用尸ac I核酸內(nèi)切酶進行消化，并且分 開地在HEK-293A補充細胞系中進行轉(zhuǎn)染，其中獲得感染性病毒粒子。 產(chǎn)生了 2種腺病毒載體Ad-E2his-sec和Ad-E2hisCD154-sec。所述 載體獨立地在HEK-293A細胞系中進行擴增，直至獲得1xl0"集落形成 單位/mL ( CFU/mL )的滴度，并且它通過在CsCl梯度中的雙重離心進 行純化。所述載體進一步逆貯存緩沖液(10 mM Tris pH 8. 0， 2 mM MgCl2， 4%蔗糖)進行透析，并且保持于-70'C。
Ad-E2his-sec和Ad-E2hisCD154-sec腺病毒載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細 胞以及介導(dǎo)E2his和E2his-CD154分子的表達和分泌到培養(yǎng)基中的能力通過在PK15豬細胞系中的感染測定法進行確證。在非還原條件下通 過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )分開在受感染細 胞的培養(yǎng)基中存在的蛋白質(zhì)樣品，并且使用針對CSFV的E2的單克隆 抗體(ccE2-lG6)通過Western印跡法進行分析(圖1和2)。
E2his和E2his-CD154糖蛋白的分子量分析證明它們相應(yīng)于所述 蛋白質(zhì)的二聚和三聚同種型。在圖2的泳道1中，觀察到相應(yīng)于 E2-CD154的二聚同種型(180 kDa )和三聚同種型(270 kDa )的2個 條帶。
實施例4:原位轉(zhuǎn)導(dǎo)山羊乳腺上皮以用于在乳中生產(chǎn)E2his和 E2his-CD154。
對于使用表達盒E2his和E2his-CD154的乳腺上皮轉(zhuǎn)化，使用 Ad-E2his-sec和Ad-E2hisCD154-sec重組腺病毒載體。在這兩種情況 下，通過經(jīng)乳頭的通道對乳房進行直接輸注而將所述載體接種在正在 泌乳的山羊的乳腺中。腺病毒載體感染符合乳腺上皮的分泌性上皮細 胞，這允許重組蛋白質(zhì)的表達。
使用處于天然泌乳的第二個月并且平均產(chǎn)量為lL/天的山羊。最 初對雌性山羊進行擠乳直至從乳房中去除乳以便轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒載體，隨 后通過乳頭的通道將等滲鹽水溶液直接輸注到池(cistern)中，其中 對乳房進行輕柔的按摩以保證充分洗滌乳腺。通過乳房的徹底擠乳來 去除鹽水溶液，并且該過程重復(fù)2次。隨后，以在包含36 mM EGTA 的鹽水溶液中1()9CFU/mL的滴度輸注腺病毒接種物。每個乳房的輸注 體積是可變的，并且保證池的全部充滿，這取決于乳房的容量。輸注 后，對乳房實施按摩，以便促進腺病毒接種物均勻分布到乳腺中并達 到腺泡的分泌性上皮細胞。腺病毒接種物在24小時后通過擠乳來去 除。為了消除池中或乳腺管中的殘留腺病毒載體，通過輸注鹽水溶液 再次沖洗乳腺。
24小時后，通過人工擠乳開始從經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物中收集乳。以12 小時的間隔每天進行2次擠乳。將收集的乳貯存于-70'C。對于每個擠乳樣品，分析E2his和E2his-CD154重組蛋白質(zhì)在乳中的表達動力學(xué) (圖3和4)。證明了重組蛋白質(zhì)的分子大小相應(yīng)于二聚和三聚同種 型。所獲得的在接種后第2 - 8天的E2his的平均表達為1. 03 g/L， 其中每只動物的平均產(chǎn)量為5.22 g。對于重組分子E2his-CD154，獲 得0. 73 g/L的平均表達，其中平均產(chǎn)量為3. 04 g/動物。
實施例5:從山羊乳中純化E2his和E2his-CD154抗原。
分別將包含E2his和E2his-CD154重組疫苗抗原的每個擠乳日的 樣品相混合，并于4。C在15 000 g下離心30分鐘。分離可溶相(乳 清)并棄去脂肪相。將收集的乳清以1:4的比例稀釋在乳分離緩沖液 (10 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2， pH: 8.0)中。將混合物在冰上冷 卻30分鐘，并于4X:在15 000 g下離心30分鐘。上清液和沉淀物通 過SDS-PAGE和Western印跡法進行分析。確定，此類重組蛋白質(zhì)的大 部分存在于可溶相中，而沉淀物主要包含酪蛋白。
包含目的重組抗原(E2his和E2his-CD154)的乳清級分通過在 0.8juM和0.4jliM膜(Millipore)中進行系列過濾而得到澄清，并且 進一步施加到用Ni-NTA-Agarose基質(zhì)(Qiagen, USA)填充的XK16 純化柱(Amersham， USA)中。進行使用lOOmM磷酸鹽緩沖液，20 raM 咪唑，pH7.2 (第一次洗滌)以及100mM磷酸鹽緩沖液，50mM咪唑， pH7. 2 (第二次洗滌)的2個洗滌步驟。洗滌后，在100mM磷酸鹽緩 沖液，20mM咪唑，pH 7.2中洗脫目的蛋白質(zhì)。將相應(yīng)于純級分的峰 逆10 mM磷酸鹽緩沖液，pH 7. 2進行透析(圖5)。
從山羊乳中的E2his和E2his-CD154的純化操作對于這兩種疫苗 抗原來說是相同的。以高于90%的純度水平獲得這兩種蛋白質(zhì)。以70 0/o的回收率獲得E2his，和在E2his-CD154的情況下，獲得58%的回 收率。純化的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE和Western印跡法進行分析，以便 確定蛋白質(zhì)聚集體形成。可以確定，在乳中產(chǎn)生的E2his的二聚同種 型(同二聚體)被來自受CSFV感染的豬的多克隆血清有效地識別，這 表明該分子的這種特異的構(gòu)象增加分子抗原性(圖6)。實施例6:在巴斯德畢赤酵母甲醇營養(yǎng)酵母中的表達載體的構(gòu)建。
巴斯德畢赤酵母表達載體PPS1Q用I限制性核酸內(nèi)切酶進行 消4匕，以{更在酉良酒酵母(SaccAaro/zy^e; cerew /se )蔑糖轉(zhuǎn)4b酵 (Suc2)的分泌信號的3'末端處摻入目的編碼序列。將由PCR擴增的 E2編碼序列插入pPS10質(zhì)粒的iVae I限制位點中。通過用5fea I-fcM V限制性核酸內(nèi)切酶進行酶促消化而從pM0S-E2his-CD154質(zhì)粒中移出 E2his-CD154編碼序列，并插入pPS10的I限制位點中。由此， 獲得pPS-E2his和pPS-E2his-CD154質(zhì)粒，其中編碼這兩種分子的序 列與釀酒酵母的Suc2的分泌信號向偶聯(lián)，并且保持在巴斯德畢赤酵母 醇氧化酶(A0X1)啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。
重組質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶進行線性化，并且將它們電 穿孔入巴斯德畢赤酵母MP36菌林的電感受態(tài)細胞中。由此，產(chǎn)生了用 質(zhì)粒pPS-E2his和pPS-E2his-CD154穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母MP36 菌林的幾個克隆。這種菌林是組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變體，因此重組酵 母獲得His+表型，從而允許其的選擇。
還通過Southern印跡法來分析最初通過斑點印跡法鑒定的重組 酵母，以便確定可以通過巴斯德畢赤酵母A0X1基因的替換而發(fā)生的整 合模式，產(chǎn)生Muts-His表型(曱醇的低使用)。A0X1的基因替換通過 在酵母基因組中和在質(zhì)粒中存在的A0X1啟動子區(qū)域和A0X1區(qū)域的 重組而發(fā)生，結(jié)果消除了 A0X1基因的編碼區(qū)。具有Muts表型的重組 酵母支持A0X2基因中的醇氧化酶產(chǎn)生，但它在甲醇中的生長率很低。 此外，可以通過替換來獲得整合模式，表型1^1+-11"+。
編碼E2his和E2his-CD154變體的序列保持在A0X1啟動子(其可 通過曱醇誘導(dǎo))調(diào)控下。巴斯德畢赤酵母分泌低水平的蛋白質(zhì)，并且 其培養(yǎng)基不需要蛋白質(zhì)補充物，因此，可以預(yù)期，分泌的異源蛋白質(zhì) 構(gòu)成了培養(yǎng)基中的總蛋白質(zhì)的大部分(直至超過80% )。重組蛋白質(zhì) 的生產(chǎn)在5L的發(fā)酵罐中進行。表達的誘導(dǎo)通過在5天期間向培養(yǎng)物中 加入甲醇來進行，并在發(fā)酵培養(yǎng)基中獲得重組蛋白質(zhì)。E2his以0.143mg/mL的水平分泌到重組酵母培養(yǎng)基中。在E2his-CD154的情況下， 獲得0. 122 mg/mL的表達水平。
實施例7:從巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基中純化E2his和E2his-CD154抗原。
將發(fā)酵產(chǎn)物于4。C在10 000 g下離心30分鐘，以便從液相中分 離出生物量。培養(yǎng)基在0. 8 ja M和0. 2 m M膜(Mi 11 ipore )中進行過濾， 并將它施加到用Ni-NTA-Agarose基質(zhì)(Qiagen， USA)填充的XK16 純化柱(Amersham, USA)中。進行使用lOOmM磷酸鹽緩沖液，30mM 咪唑，pH7. 2的洗滌，并且目的蛋白質(zhì)用100 mM磷酸鹽緩沖液，200 mM咪唑，pH7. 2進行洗脫。將純的級分逆lOmM磷酸鹽緩沖液進行透 析。用于從經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母的發(fā)酵上清液中純化E2his 和E2his-CD154的操作程序?qū)τ谶@兩種疫苗抗原來說是相同的。以高 于95%的純度水平獲得這兩種蛋白質(zhì)。以83。/。的回收率獲得E2his， 和在E2his-CD154的情況下，獲得78%的回收率。
實施例8:在用可分泌的E2his變體進行疫苗接種的豬中的保護試驗。
在這個測定法中使用24只健康豬，其體重為大約20kg、具有對 于CSFV而言陰性的血清學(xué)并且屬于未疫苗接種和不含CSF的獸群。將 豬分成每組8只動物的組，并且將它們飼養(yǎng)在無限制地獲得水和食物 的3個分開的實驗房間(A、 B和C)中。
組A和組B的動物用包含E2his抗原的疫苗組合物以30y g(組A) 和50jag (組B) /動物的單劑量進行免疫接種，以及組C用安慰劑進 ^f亍免疫接種。將抗原配制在油包水乳狀液中，并且通過在頸中經(jīng)肌內(nèi) 途徑注射2 ml來進行接種。由比例為1:1 (V/V)的佐劑和磷酸鹽鹽 水溶液構(gòu)成的安慰劑以相同條件進行接種。在免疫接種后的第3周， 通過肌內(nèi)注射用105 LDs。的同源的CSFV "Margarita"毒林對所有動物 進行攻擊。
考慮到?jīng)]有觀察到正常臨床參數(shù)改變這一事實，用E2his疫苗組
19合物進行接種不產(chǎn)生不利反應(yīng)。在免疫接種笫2周后在經(jīng)疫苗接種的 組中獲得高于1/50的中和抗體滴度(被視為具有保護性)。在第3 周后，滴度增至1/1600 - 1/6400 (圖7)。在經(jīng)疫苗接種的組(A和B) 之間沒有觀察到免疫應(yīng)答的差異。已接種疫苗的豬不發(fā)展出發(fā)熱或該 病的臨床癥狀，并且在攻擊后的時期中從淋巴細胞中沒有制得病毒分 離物。然而，安慰劑組發(fā)展出該病的所有臨床癥狀，包括發(fā)熱、出血 和非化膿性腦炎。在這個組中，從攻擊后第4天直到處死當(dāng)天獲得病 毒分離。在此，證實了，釆用所建議的疫苗接種方案用E2his組合物 (以30jag的劑量進行施用)進行疫苗接種的斷奶豬保持受到保護而 不出現(xiàn)臨床癥狀和CSFV感染。
實施例9:在用可分泌的E2his抗原進行疫苗接種的懷孕母豬中的垂 直保護試驗。
取在血清學(xué)上對于CSFV而言陰性的、來自無CSF疾病或疫苗接種 史(3年前)的獸群的IO只母豬。在斷奶后，通過激素處理來誘導(dǎo)發(fā) 情周期，并且在3天后對所有母豬進行授精。授精與免疫接種同時進 行。在5只母豬的一個組中，通過在頸中通過肌內(nèi)途徑注射2mL來施 加實施例7(組B)中提及的疫苗組合物。取其余5只母豬作為陰性對 照組，并且用由比例為1:1 (V/V)的2 mL佐劑和鹽水溶液構(gòu)成的安 慰劑進行注射。疫苗接種組在21天后接受加強免疫。通過測量臨床三 聯(lián)征(溫度、心臟脈搏和呼吸頻率)來研究懷孕母豬，并且每周進行 抽血以用于抗CSFV的中和抗體的血液學(xué)和檢測。2個月后，通過肌內(nèi) 注射用1(TLDs。的同源CSFV "Margarita"毒林攻擊懷孕母豬。在攻擊 后第3和5天時從外周血淋巴細胞中分離病毒，以便檢測CSFV的存在。 攻擊后2周，處死母豬，并取出胎兒以用于病毒學(xué)、形態(tài)學(xué)和病理解 剖學(xué)分析。在該實驗期間，母豬可無限制地獲取水和食物。
該疫苗對于所有懷孕母豬是無害的，并且在免疫接種后的時期中 不存在流產(chǎn)或臨床改變。經(jīng)疫苗接種的動物發(fā)展出滴度為l:50-1: 51200的抗CSFV的特異性中和抗體。疫苗接種組的母豬在攻擊后仍是完全健康的。這些動物無一呈現(xiàn)發(fā)熱、白細胞減少癥、血小板增多
癥或任何其他CSF臨床征象。
通過形態(tài)測量法和病理解剖學(xué)進行的分析允許確定，來自已接種 疫苗的母豬的胎兒具有正常大小并且不呈現(xiàn)組織病理學(xué)損害。沒有從 在攻擊后提取的母豬血液樣品中獲得的白細胞中分離出CSFV。也沒有 從處死的胎兒的血液或器官中分離出CSFV。
安慰劑組的母豬在攻擊后具有發(fā)熱和白細胞減少癥。這些母豬之 一在攻擊后第8天流產(chǎn)，并且在攻擊后第9天被處死。在來自攻擊后 2周時處死的母豬的胎兒中和在流產(chǎn)出的胎兒中觀察到病理學(xué)征象， 如小尺寸、木乃伊化、脾腫大、腎和膀胱中的幾個瘀斑以及非化膿性 腦炎。在來自這個組的胎兒的所有器官和血液中分離出了 CSFV。用 E2his疫苗組合物對豬進行疫苗接種防止了 CSFV從母豬傳播給后代。
實施例10:在用E2his-CD154疫苗組合物進行接種疫苗的豬中的早期 保護試驗。
取每組6只豬的4個組(在與實施例8中相同的條件下)，并且 以下述量的抗原來施加疫苗組合物50jugE2his-CD154 (組D) 、 80 ia g E2his-CD154 (組E) 、 50y gE2his (組F)。組G作為安慰劑組。 將抗原配制在"油包水"乳狀液中，并且通過IM注射來接種2 mL， 安慰劑組用不含蛋白質(zhì)的佐劑進行接種。疫苗以單劑量進行施加。在 免疫接種后第8天時通過用105 LD5。 CSFV "Margarita"毒林進行IM 接種來攻擊動物。在實驗期間每天記錄臨床征象，并且每周進行抽血 以用于血液學(xué)和中和抗體的分析。此外，獲取在疫苗接種后第1、 3、 5和7天時的血液沖羊品，以通過、淋巴組織增生和"血清中的抗病毒活 性"測定法來評估細胞免疫應(yīng)答。
在疫苗接種后，觀察到正常的臨床征象，并且在接種部位處沒有 觀察到不利反應(yīng)。在用E2-CD154抗原進行疫苗接種的動物(組D和E) 中，在淋巴組織增生測定法中檢測到淋巴細胞對于植物凝集素促分裂 原的應(yīng)答與對于CSFV的應(yīng)答一樣均增加。這種應(yīng)答被針對CD4結(jié)構(gòu)域的Mab阻斷，這表明該免疫應(yīng)答由T輔助淋巴細胞介導(dǎo)。在該測定法 期間，來自組F和G (安慰劑)的動物的淋巴細胞樣品不響應(yīng)于用促 分裂原和用CSFV的刺激(圖8 )。
在組D和E中在用E2-CD154抗原進行疫苗接種后第3、 5和7天 時，在樣品中觀察到高干擾素a滴度。然而，在該實驗時間期間，在 用E2his抗原(組F)進行疫苗接種的動物中和在安慰劑組(G)中沒 有檢測到干擾素。在PK-15細胞中進行針對傳染性胃腸炎病毒的"抗 病毒活性測定法"。在組D和E中，獲得1: 512的抗病毒活性滴度； 然而，在來自用E2his進行免疫接種的豬的樣品中和在安慰劑組中沒 有檢測到抗病毒保護作用(圖9)。由這些實驗確定，與CD154分子 偶聯(lián)的E2抗原增強針對CSFV的細胞免疫應(yīng)答，這與CD154的免疫刺 激活性相關(guān)。
實施例11:在用單劑量的包含E2his和E2his-CD154的疫苗組合物進 行疫苗接種的豬中，中和抗體動力學(xué)的比較。
取每組6只豬的3個組，其體重為大約20 kg，在血清學(xué)上對于 CSFV而言是陰性的，來自無CSF疾病或疫苗接種史(3年前)的獸群。 每日無限制地給動物供應(yīng)水和食物。
在組H中，每只動物用50|ag E2his-CD154進行疫苗接種；在組 I中，用50/ag E2his進行疫苗接種；和組J作為安慰劑組。將抗原 配制在"油包水"乳狀液中，并且通過IM注射來接種2 mL，安慰劑 組用不含蛋白質(zhì)的佐劑進行接種。施加單劑量，并且在免疫接種后5 周期間通過過氧化物酶聯(lián)中和測定法(NPLA )來測量中和抗體的水平。
在用E2-CD154和E2his進行疫苗接種的組(H和I )中，從免疫 接種第2周開始檢測中和抗體，測得滴度超過1: 50 (被視為具有保護 性)。在試驗期間在來自安慰劑組的動物中未檢測到抗體。在免疫接 種后第2周時，來自組H (E2-CD154抗原)的動物的中和抗體滴度高 于來自用E2his抗原進行免疫接種的組。那些結(jié)果暗示，在組H的動 物中具有更高的體液應(yīng)答的刺激(圖10)。
22可以得出結(jié)論，當(dāng)與E2his疫苗組合物相比較時，以50ug劑量 水平的E2his-CD154疫苗組合物是安全的、具有免疫原性的并且在已 接種疫苗的豬中誘導(dǎo)早期體液應(yīng)答。
實施例12:在用包含可分泌E2his-CD154的疫苗組合物進行接種疫苗 的懷孕母豬中的垂直保護試驗。
選擇具有與在實施例8中所使用的那些相同的健康條件和來源的 IO只母豬。斷奶后，通過激素處理來誘導(dǎo)發(fā)情周期，并且在3天后對 所有母豬進行授精。同時地，5只母豬的一個組通過IM途徑在頸中注 射2 mL來用E2his-CD154疫苗組合物進行免疫接種(80 ja g/動物；在 實施例10中對于組E所使用的組合物)。其余5只豬的一個組用佐劑
(作為安慰劑)來進行免疫接種。通過測量臨床三聯(lián)征(溫度、心臟 脈搏和呼吸頻率)來研究懷孕母豬，并且每周進行抽血以用于抗CSFV 的中和抗體的血液學(xué)和檢測。在懷孕2個月時，用105 LDs。的CSFV
"Margarita"毒林來攻擊動物。通過在攻擊后第3和5天時抽血液來 分析病毒血癥。2周后，處死母豬，并取出胎兒以用于病毒學(xué)、形態(tài) 學(xué)和病理解剖學(xué)分析。在該實驗期間，母豬可無限制地獲取水和食物。
在免疫接種后沒有觀察到流產(chǎn)情況或其他CSF臨床征象。因此， 以單次免疫接種的E2his-CD154疫苗組合物在懷孕母豬中是安全的。 經(jīng)疫苗接種的動物形成1: 50 - 1: 16 000的針對CSFV的特異性中和抗 體滴度。
在攻擊后，在經(jīng)疫苗接種的母豬的組中沒有觀察到發(fā)熱、白細胞 減少癥或血小板增多癥。在這個組中，通過形態(tài)測量法和病理解剖學(xué) 分析測定，胎兒具有正常大小并且沒有組織病理學(xué)損害。在攻擊后獲 取的血液樣品中，從經(jīng)疫苗接種的母豬的白細胞中未分離出CSFV，也 沒有從處死的胎兒的血液或器官中分離出CSFV。
安慰劑組的母豬在攻擊后具有發(fā)熱、白細胞減少癥和食欲缺乏。 來自這個組的胎兒具有減少的大小，并且顯示出與CSF相符的組織病理 學(xué)損害，如脾腫大、腎和膀胱中的瘀斑、腸中的壞死灶、在內(nèi)臟器官中的幾處出血和非化膿性腦炎。從來自這個組的胎兒的所有器官和血
液中分離出CSFV。用以所評估的時間表施加的E2his-CD154疫苗組合物 對懷孕母豬進行接種疫苗，阻止了CSFV從母豬傳播給后代。
權(quán)利要求
1. 針對典型性豬瘟病毒(CSFV)的嵌合疫苗抗原，其特征在于，所述嵌合疫苗抗原包含CSFV的病毒包膜的E2糖蛋白的細胞外區(qū)段和充當(dāng)分子佐劑的免疫系統(tǒng)刺激性蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合疫苗抗原，其中所述免疫系統(tǒng)刺激性蛋 白質(zhì)是oc千擾素，或CD154分子的細胞外區(qū)段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的嵌合疫苗抗原，其中所述ot干擾素或CD154 分子的細胞外區(qū)段可以來自任何哺乳動物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的嵌合疫苗抗原，其特征在于，所述嵌合疫苗 抗原實質(zhì)上包含CSFV的E2糖蛋白的細胞外區(qū)段(Seq. ID. No. l)和 豬CD154分子的細胞外區(qū)段(Seq. ID. No. 2)的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合疫苗抗原，其經(jīng)由重組方法、合成方法 或者通過化學(xué)綴合來獲得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合疫苗抗原，其從經(jīng)基因改造的哺乳動物 的乳中獲得。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的嵌合疫苗抗原，其通過乳腺的直接遺傳轉(zhuǎn)化 而從非轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳中獲得。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的嵌合疫苗抗原，其中乳腺的直接遺傳轉(zhuǎn)化通 過使用腺病毒栽體來進行。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6的嵌合疫苗抗原，其從轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳中 獲得。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5的嵌合疫苗抗原，其從經(jīng)基因改造的酵母中獲得。
11. 能夠產(chǎn)生針對CSFV的保護性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其特征 在于，所述疫苗組合物包含權(quán)利要求1 - 10中所描述的嵌合抗原。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll的疫苗組合物，其可以通過全身或粘膜途徑施 用于動物。
全文摘要
本發(fā)明描述了針對引起典型性豬瘟的病毒(CSFV)的嵌合疫苗抗原。所述疫苗抗原基于與刺激細胞和體液免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)分子相偶聯(lián)的病毒亞單位。所述嵌合抗原可以在保證嵌合分子(其構(gòu)成了本發(fā)明的基礎(chǔ))的正確三維折疊的表達系統(tǒng)中產(chǎn)生。包含所述嵌合抗原的疫苗組合物在經(jīng)疫苗接種的豬中誘導(dǎo)誘導(dǎo)早期且強有力的免疫應(yīng)答，其中賦予針對CSFV的完全保護。此外，所產(chǎn)生的疫苗組合物阻止病毒從母豬傳播給其后代。所述嵌合抗原以及所得的疫苗組合物可以作為用于在豬中的預(yù)防用途的疫苗而應(yīng)用于動物健康領(lǐng)域。
文檔編號C07K14/705GK101426525SQ200780014628
公開日2009年5月6日 申請日期2007年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日
發(fā)明者C·G·博洛托諾德羅, J·R·托萊多阿隆索, M·I·巴雷拉巴列, M·P·羅德里格斯莫爾托, M·T·弗里亞斯勒普羅, N·E·菲格羅亞拜萊, O·桑切斯拉莫斯, Y·普列托卡拉塔拉 申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心;國家動植物保健中心