microRNA-552在預(yù)防和治療酒精性肝病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了microRNA-552在制備預(yù)防和/或治療酒精性肝病的藥物中的用途。本發(fā)明中，采用microRNA-552在體外酒精肝模型中下調(diào)CYP2E1的表達(dá)，可以顯著的改善酒精導(dǎo)致的肝臟損傷。
【專利說明】microRNA-552在預(yù)防和治療酒精性肝病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及microRNA-552在制備預(yù)防和/或治療酒精性肝病的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]酒精性肝病(Alcoholic liver diseases, ALD)指長(zhǎng)期過量飲酒所致的一種肝臟疾病，包括脂肪肝、酒精性肝炎和肝細(xì)胞癌等。嗜酒者中，約10%~20%可發(fā)展為酒精性肝病。酒精性肝病的發(fā)病機(jī)理比較復(fù)雜，近年的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450氧化還原酶(Cytochrome P450 oxidoreductase, CYP450)中的一個(gè)亞型 CYP2E1 在 ALD 的發(fā)病中起到關(guān)鍵的作用。CYP2E1的表達(dá)升高會(huì)加重酒精引起的肝臟損傷，誘發(fā)脂肪肝發(fā)生，在ALD相關(guān)的肝細(xì)胞癌中也起到關(guān)鍵的作用。因此，以CYP2E1為靶點(diǎn)，下調(diào)CYP2E1的表達(dá)對(duì)ALD相關(guān)疾病或腫瘤的預(yù)防和治療具有重要的意義。
[0003]微小RNA(microRNA，miRNA)是細(xì)胞內(nèi)源產(chǎn)生調(diào)芐基因表達(dá)的小分子非編碼RNA，其調(diào)節(jié)的效應(yīng)通常是抑制基因表達(dá)。MicroRNA (miRNA)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)若干基因的表達(dá)，它們參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝等幾乎所有生命過程，在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、造血系統(tǒng)疾病、糖尿病及各種腫瘤的病理過程中也發(fā)揮重要作用。研究表明，肝臟特異表達(dá)的miR-122可作為丙型肝炎的治療靶點(diǎn)，目前針對(duì)miR-122的鎖核酸嵌合體作為藥物已處于臨床試驗(yàn)階段。已知miRNA的祀位點(diǎn)大多位于mRNA的3’ -非翻譯區(qū)(3’ untranslatedregion, 3’ -UTR),功能性的單鏈(mature miRNA,成熟miRNA)被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-1nduced silencing complex, RISC)中，與祀 mRNA 結(jié)合,通過 mRNA 剪切、mRNA 去腺苷或抑制翻譯等方式在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)。這種調(diào)節(jié)方式依賴于miRNA種子區(qū)序列(2~7nt)與靶mRNA3’ -非翻譯區(qū)序列的互補(bǔ)配對(duì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]CYP2E1在酒精肝相關(guān)的疾病中表達(dá)顯著上調(diào)，CYP2E1的表達(dá)上調(diào)與酒精引起的肝細(xì)胞凋亡壞死，氧化損傷，炎癥以及酒精引起的蛋白，DNA加合物生成密切相關(guān)。已經(jīng)有多項(xiàng)重要臨床報(bào)道與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明CYP2E1在酒精引起肝臟損傷中起到關(guān)鍵作用(參考文獻(xiàn)1-5);也有多項(xiàng)臨床，體外實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明下調(diào)CYP2E1的表達(dá)可以明顯改善酒精引起肝臟相關(guān)的疾病(參考文獻(xiàn)6-9)，因此，本發(fā)明中，選擇酒精肝體外模型，使用酒精誘導(dǎo)CYP2E1的上調(diào)，篩選能明顯下調(diào)CYP2E1表達(dá)的microRNA具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義。
[0005]本發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了一種可以下調(diào)CYP2E1蛋白表達(dá)的HiiCT0RNA，該microRNA尤其可以下調(diào)被酒精誘導(dǎo)的CYP2E1的蛋白表達(dá)。
[0006]因此，本發(fā)明的目的是提供microRNA-552在制備用于預(yù)防和/或治療酒精性肝病的藥物中的用途。 [0007]本發(fā)明中，所述microRNA-552能夠下調(diào)CYP2E1的蛋白表達(dá)，特別是，能夠下調(diào)被酒精誘導(dǎo)的CYP2E1的蛋白表達(dá)。[0008]本發(fā)明中，所述microRNA-552的核苷酸序列如下:5’-AACAGGUGACUGGUUAGACAA-3’ (SEQ ID NO:1)。本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述酒精性肝病包括，但不限于，脂肪肝、酒精性肝炎和肝細(xì)胞癌等。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或治療酒精性肝病的方法，包括向需要治療的對(duì)象施用治療有效量的microRNA-552。
[0010]本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“有效量”可指為實(shí)現(xiàn)預(yù)期的效果所需的劑量和時(shí)段的有效的量。此有效量可能因某些因子而產(chǎn)生不同的變化，如疾病的種類或治療時(shí)疾病的病癥、被施用的特定標(biāo)的器官的構(gòu)造、病人個(gè)體大小、或疾病或癥狀的嚴(yán)重性。本領(lǐng)域具有通常知識(shí)者不需要過度實(shí)驗(yàn)即可憑經(jīng)驗(yàn)決定特定化合物的有效量。
[0011]本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述酒精性肝病包括，但不限于，脂肪肝、酒精性肝炎和肝細(xì)胞
>rg.寺。
[0012]本發(fā)明人在前期工作中發(fā)現(xiàn)microRNA-552 (miR-552)可以結(jié)合到CYP2E1基因的3’ UTR區(qū)域(圖1C)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞中，miR-552可劑量依賴地引起CYP2E1蛋白水平表達(dá)下降(圖1B)。miR-552可引起CYP2ElmRNA 3’-非翻譯區(qū)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的熒光素酶活性降低，突變種子序列區(qū)后此作用逆轉(zhuǎn)(圖1C和1D)。上述結(jié)果說明，miR-552確實(shí)可以通過與CYP2E1的3’ -非翻譯區(qū)的特定位點(diǎn)結(jié)合，從而起到顯著下調(diào)CYP2E1蛋白表達(dá)的作用。
[0013]本發(fā)明人隨后采用Fa2N4與!fep3B-l這兩種肝臟細(xì)胞系，用酒精誘導(dǎo)CYP2E1的表達(dá)，建立酒精性肝 病的體外模型。在這一細(xì)胞模型中，給予microRNA-552，發(fā)現(xiàn)microRNA-552在兩種細(xì)胞模型中，均可以顯著下調(diào)被酒精誘導(dǎo)表達(dá)的CYP2E1的蛋白的表達(dá)量(圖2)。
[0014]本發(fā)明人在前期工作中發(fā)現(xiàn)microRNA-552與CYP2E13’非翻譯區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，使用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，將3’非翻譯區(qū)上的結(jié)合位點(diǎn)突變，然后將野生型與突變型的3’非翻譯區(qū)分別插入螢光素酶載體(psiCHECK2)，將分別攜帶野生型與突變型的載體分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，加入microRNA-552模擬物，檢測(cè)3’非翻譯區(qū)microRNA結(jié)合位點(diǎn)突變對(duì)螢光素酶活性的影響，確認(rèn)microRNA與目的基因3’非翻譯區(qū)的結(jié)合位點(diǎn),最終確定該microRNA-552是否是通過CYP2E1的3’ -非翻譯區(qū)的特定位點(diǎn)結(jié)合，從而起到顯著下調(diào)CYP2E1蛋白表達(dá)的作用。
[0015]本發(fā)明中所建立的酒精性肝病體外模型，是在科研領(lǐng)域比較常用的模型。
[0016]因此，本發(fā)明中，采用microRNA-552在體外酒精肝模型中下調(diào)CYP2E1的表達(dá)，可以顯著的改善酒精導(dǎo)致的肝臟損傷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，其僅僅是對(duì)本發(fā)明的描述而不是限定。
[0018]圖1為顯示microRNA-552通過結(jié)合于CYP2E1的3’非翻譯區(qū)下調(diào)CYP2E1蛋白表達(dá)的圖。其中:
[0019](A):PLC/PRF/5細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-552后檢測(cè)CYP2E1表達(dá)的蛋白印跡圖。GAPDH作為上樣量對(duì)照。圖中數(shù)字為miciORNA的名字，nc是指陰性對(duì)照。[0020](B):顯示CYP2E1蛋白表達(dá)隨miR-552濃度升高而依賴性下調(diào)的圖。歸一化CYP2E1蛋白表達(dá)水平:使用ImageQuant Solutions軟件對(duì)CYP2E1與內(nèi)參基因GAPDH的條帶進(jìn)行灰度檢測(cè)，然后依據(jù)GAPDH的灰度值，以nc為1，對(duì)CYP2E1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理，從而得到歸一化CYP2E1蛋白表達(dá)水平。*，ρ〈0.05 ;**，ρ〈0.01。
[0021](C):顯示CYP2ElmRNA3’-UTR區(qū)與miR-552種子序列區(qū)部分互補(bǔ)配對(duì)的圖。小寫字母代表CYP2ElmRNA3’ -UTR區(qū)中miR-552可能的結(jié)合位點(diǎn)突變后的核苷酸序列。
[0022](D):顯示熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-552抑制CYP2E13’ -UTR活性，而對(duì)miR-552可能的結(jié)合位點(diǎn)突變了的3’ -UTR不能發(fā)揮抑制作用。**，p〈0.01。
[0023]圖2為顯示microRNA-552在酒精性肝病體外模型中下調(diào)CYP2E1蛋白表達(dá)的圖。其中:
[0024](A):Fa2N4細(xì)胞中先加入酒精誘導(dǎo)CYP2E1的表達(dá)，然后轉(zhuǎn)染microRNA-552，檢測(cè)CYP2E1表達(dá)的蛋白印跡圖。β-actin作為上樣量對(duì)照。nc是指陰性對(duì)照。
[0025](B):Hep3B-l細(xì)胞中先加入酒精誘導(dǎo)CYP2E1的表達(dá)，然后轉(zhuǎn)染microRNA-552模擬物，檢測(cè)CYP2E1表達(dá)的蛋白印跡圖。β-actin作為上樣量對(duì)照。nc是指陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0026]在下文中，將通過示例性提出的實(shí)施例來更加詳細(xì)地描述本發(fā)明，然而，本發(fā)明的范圍并不限于實(shí)施例。 [0027]實(shí)施例中所使用的試劑、儀器:
[0028]人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5細(xì)胞，Hep3B_l細(xì)胞:中科院上海生命科學(xué)院生化與細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)；
[0029]人源Fa2N4細(xì)胞:購(gòu)于LONZA
[0030]microRNA-552:上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司
[0031]所用質(zhì)粒(psiCHECK2)購(gòu)自Promega ；
[0032]螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒:購(gòu)于Promega ；
[0033]轉(zhuǎn)染試劑:Iipofectamine2000 購(gòu)于 Invitrogen ；
[0034]各種細(xì)胞培養(yǎng)液:購(gòu)于Invitrogen ；
[0035]蛋白免疫印跡儀器:購(gòu)于BioRad ；
[0036]基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?購(gòu)于Merck ；
[0037]CYP2E1蛋白印跡檢測(cè)用抗體:購(gòu)于Millipore ；
[0038]除特別指定外，本發(fā)明中所使用的方法均為本領(lǐng)域中的常規(guī)方法。
[0039]實(shí)施例1酒精肝體外模型的建立
[0040]體外酒精肝模型可以在短時(shí)間(24-48小時(shí))內(nèi)建立，具有成本低、適合快速篩選治療藥物的優(yōu)勢(shì)。在模型的建立中，常使用一定濃度的酒精長(zhǎng)期(48-72小時(shí))處理肝臟細(xì)胞系，從而建立體外酒精肝模型(參考文獻(xiàn)6、10)。本發(fā)明人選擇了 Fa2N4與Hep3B_l兩種細(xì)胞。Fa2N4是制藥工業(yè)中常用來篩選藥物對(duì)細(xì)胞色素P450酶表達(dá)影響的細(xì)胞系統(tǒng)，對(duì)外源的藥物與化合物有很好的敏感性(參考文獻(xiàn)11-13)。Hep3B-l則是研究中最常用的肝臟腫瘤細(xì)胞系。
[0041]在貼壁培養(yǎng)的上述細(xì)胞系中分別加入50mM酒精，處理48小時(shí)，檢測(cè)CYP2E1的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，CYP2E1的表達(dá)水平有顯著的升高(圖2)。
[0042]實(shí)施例2microRNA-552 (miR-552)的制備與使用
[0043]前期工作中發(fā)現(xiàn)microRNA-552可以結(jié)合在CYP2E1的3’非翻譯區(qū)，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司按上文核苷酸序列，采用化學(xué)合成的方法合成純化microRNA-552，并在人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-552，用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CYP2E1的蛋白表達(dá)變化，如圖1所示，miR-552可劑量依賴地引起CYP2E1蛋白水平表達(dá)下降(圖1A和圖1B)。螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)則顯示miR-552確實(shí)通過結(jié)合于CYP2E1的3’非翻譯區(qū)起作用(圖1C和圖1D)。
[0044]實(shí)施例3在人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5細(xì)胞中檢測(cè)miR-552對(duì)CYP2E1蛋白表達(dá)水平的抑制作用
[0045]人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5細(xì)胞在37攝氏度，5% 二氧化碳的環(huán)境下，貼壁培養(yǎng)于RMPI1640培養(yǎng)基中，同時(shí)添加10%的胎牛血清以及適當(dāng)濃度的青鏈霉素溶液。
[0046]在人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染25ηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、200nM的miR-552，用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CYP2E1的蛋白表達(dá)變化。如圖1A和IB所示，miR-552可劑量依賴地引起CYP2E1蛋白水平表達(dá)下降。
[0047]實(shí)施例4CYP2E1-3’非翻譯區(qū)-螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體以及突變體的建立與使用
[0048]本發(fā)明人使用了來自于Promega的psiCHECK2螢光素酶載體，使用特異的克隆引物PCR后獲得CYP2E1基因的3’非翻譯區(qū)序列(詳見表1)，然后在psiCHECK2的多克隆區(qū)域插入CYP2E1基因的3’非翻譯區(qū)序列，得到插入了 CYP2E1-3’非翻譯區(qū)的psiCHECK2載體，將此載體與microRNA-552同時(shí)轉(zhuǎn)入PLC/PRF/5細(xì)胞中，觀察microRNA-552對(duì)螢光素酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)microRNA-552可以顯著下調(diào)細(xì)胞中螢光素酶活性(圖1D)。
[0049]使用定點(diǎn)基因突變技術(shù)，將CYP2E1-3’非翻譯區(qū)與microRNA-552結(jié)合的區(qū)域突變(圖1C)，得到CYP2E1-3’非翻譯區(qū)突變序列，將此序列插入psiCHECK2載體，然后將得到的載體與microRNA-552同時(shí)轉(zhuǎn)入PLC/PRF/5細(xì)胞中，觀察microRNA-552對(duì)螢光素酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)miciORNA-552不能下調(diào)細(xì)胞中的螢光素酶活性(圖1D)。
[0050]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明microRNA-552確實(shí)是通過結(jié)合在CYP2E1-3’非翻譯區(qū)上，從而產(chǎn)生下調(diào)CYP2E1蛋白的作用。
[0051][表1]核酸序列
[0052]
【權(quán)利要求】
1.microRNA-552在制備用于預(yù)防和/或治療酒精性肝病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述microRNA-552能夠下調(diào)CYP2E1的蛋白表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述miciORNA-552能夠下調(diào)被酒精誘導(dǎo)的CYP2E1的蛋白表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述microRNA-552的核苷酸序列如SEQID NO:1所述。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的用途，其中，所述酒精性肝病包括脂肪肝、酒精性肝炎和肝細(xì)胞癌。
6.一種預(yù)防和/或治療酒精性肝病的方法，包括向需要治療的對(duì)象施用治療有效量的microRNA-552ο
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104001186SQ201310060524
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月26日
【發(fā)明者】苗玲玲, 任進(jìn), 戚新明, 王以政, 馮晨晨, 宮麗昆, 欒洋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所