植物乳桿菌在制備具有保肝護(hù)肝功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了植物乳桿菌在制備具有保肝護(hù)肝功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述植物乳桿菌為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)C88，其保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 209254。所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。所述產(chǎn)品的主要功能為：降低急性肝損傷引起的機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸道屏障功能的完整性，有效緩解急性肝損傷病癥。本發(fā)明是以日常攝入植物乳桿菌C88或其菌制劑，代替藥品保護(hù)肝損傷。本發(fā)明提供的植物乳桿菌C88可以作為功能性益生菌應(yīng)用于食品、保健品和藥品領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
植物乳桿菌在制備具有保肝護(hù)肝功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物乳桿菌在制備具有保肝護(hù)肝功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酒精性肝病是指長(zhǎng)期或過(guò)量攝入酒精而導(dǎo)致肝臟損害性的一系列病變。機(jī)體攝入 大量酒精后，會(huì)抑制三羧循環(huán)并減弱脂肪酸氧化從而影響脂肪代謝，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi) 沉積。同時(shí)，攝入的酒精能夠改變肝臟和腸道的結(jié)構(gòu)，引起肝臟的敏感度增加和腸道滲透性 增加，進(jìn)而導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)刺激肝巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，導(dǎo)致 脂肪肝發(fā)生炎癥、壞死和纖維化?，F(xiàn)有的措施對(duì)肝損傷的治療與預(yù)防作用并不明顯，一些藥 物服用后會(huì)對(duì)腎臟產(chǎn)生副作用。由于發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前缺乏被FDA批準(zhǔn)專門用于預(yù) 防、治療酒精性肝病和急性肝損傷的藥物。
[0003] 益生菌在改善腸道功能、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體免疫力、抗氧化和降膽固醇等方 面發(fā)揮重要作用。最近的研究表明，某些益生菌通過(guò)減輕氧化應(yīng)激、改善腸道通透性和調(diào)節(jié) 腸道菌群等途徑改善肝損傷癥狀，具有保肝作用。植物乳桿菌C88是從傳統(tǒng)發(fā)酵食品奶豆腐 中分離獲得一株具有潛在益生特性的乳桿菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供植物乳桿菌在制備具有保肝護(hù)肝功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供了植物乳桿菌的一種新用途，即植物乳桿菌在制備用于預(yù)防和/或治 療肝損傷的產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述植物乳桿菌為植物乳桿菌（LactobaciIlus plantarum) C88,其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 209254。
[0006] 所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。
[0007] 所述肝損傷為急性肝損傷。所述急性肝損傷具體可為脂多糖和D-半乳糖胺引發(fā)放 入急性肝損傷。所述急性肝損傷具體可為小鼠急性肝損傷。所述小鼠具體可為ICR小鼠。
[0008] 本發(fā)明還保護(hù)植物乳桿菌在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述植物乳桿菌為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)C88,其保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2〇9254;
[0009] 所述產(chǎn)品的功能為如下(al)至(a32)中的至少一項(xiàng)：
[0010] (al)降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量；
[0011] (a2)降低血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量；
[0012] (a3)降低血清中抗腫瘤壞死因子-α的含量；
[0013] (a4)降低血清中白介素-6的含量；
[0014] (a5)降低血清中白介素-12的含量；
[0015] (a6)降低血清中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量；
[0016] (a7)提尚血清中超氧化物歧化酶的含量；
[0017] (a8)降低肝臟中細(xì)胞色素 CYP2E1的活性水平；
[0018] (a9)降低肝臟中NF-kBP65的入核量；
[0019] (al〇)提高肝臟中Nrf2蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)含量；
[0020] (all)降低肝臟中MAPK(p38)的磷酸化水平；
[0021] (al2)降低小腸低氧誘導(dǎo)因子-Ia的水平；
[0022] (al3)提高小腸中緊密連接蛋白水平；
[0023] (al4)提尚小腸中閉鎖蛋白水平；
[0024 ] (a 15)降低肝臟中Keap 1蛋白的水平；
[0025] (al6)升高肝臟中IkB蛋白的水平；
[0026] (al7)改善低度炎癥狀態(tài)；
[0027] (al8)促進(jìn)抗炎作用；
[0028] (al9)降低肝損傷患者血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量；
[0029] (a20)降低肝損傷患者血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量；
[0030] (a21)降低肝損傷患者血清中抗腫瘤壞死因子-α的含量；
[0031] (a22)降低肝損傷患者血清中白介素 -6的含量；
[0032] (a23)降低肝損傷患者血清中白介素-12的含量；
[0033] (a24)降低肝損傷患者血清中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量；
[0034] (a25)提高肝損傷患者血清中超氧化物歧化酶的含量；
[0035] (a26)降低肝損傷患者肝臟中細(xì)胞色素 CYP2E1的活性水平；
[0036] (a27)降低肝損傷患者肝臟中NF-kBP65的入核量；
[0037] (a28)提高肝損傷患者肝臟中Nrf 2蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)含量；
[0038] (a29)降低肝損傷患者肝臟中MAPK(p38)的磷酸化水平；
[0039] (a30)降低肝損傷患者小腸低氧誘導(dǎo)因子-Ia的水平；
[0040] (a31)提高肝損傷患者小腸中緊密連接蛋白水平；
[0041] (a32)提高肝損傷患者小腸中閉鎖蛋白水平；
[0042] (a33)降低肝損傷患者肝臟中Keapl蛋白的水平；
[0043] (a34)升高肝損傷患者肝臟中IkB蛋白的水平；
[0044] (a35)改善肝損傷患者的低度炎癥狀態(tài)；
[0045] (a36)促進(jìn)肝損傷患者體內(nèi)的抗炎作用。
[0046] 所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。
[0047] 所述肝損傷為急性肝損傷。所述急性肝損傷具體可為脂多糖和D-半乳糖胺引發(fā)放 入急性肝損傷。所述急性肝損傷具體可為小鼠急性肝損傷。所述小鼠具體可為ICR小鼠。
[0048] 本發(fā)明還保護(hù)一種用于預(yù)防和/或治療肝損傷的產(chǎn)品，其活性成分為植物乳桿菌； 所述植物乳桿菌為植物乳桿菌(Lactoba
[0049] cillus plantarum)C88,其保藏編號(hào)為CCTCC N0:M 209254。
[0050] 所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。
[0051] 所述肝損傷為急性肝損傷。所述急性肝損傷具體可為脂多糖和D-半乳糖胺引發(fā)放 入急性肝損傷。所述急性肝損傷具體可為小鼠急性肝損傷。所述小鼠具體可為ICR小鼠。 [0052]本發(fā)明還保護(hù)一種用于預(yù)防和/或治療肝損傷的產(chǎn)品，其活性成分為植物乳桿菌； 所述植物乳桿菌為植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum)C88,其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 209254；
[0053]所述產(chǎn)品的功能為如下(al)至(a32)中的至少一項(xiàng)：
[0054] (al)降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量；
[0055] (a2)降低血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量；
[0056] (a3)降低血清中抗腫瘤壞死因子-α的含量；
[0057] (a4)降低血清中白介素 -6的含量；
[0058] (a5)降低血清中白介素-12的含量；
[0059] (a6)降低血清中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量；
[0060] (a7)提高血清中超氧化物歧化酶的含量；
[0061 ] (a8)降低肝臟中細(xì)胞色素 CYP2E1的活性水平；
[0062] (a9)降低肝臟中NF-kBP65的入核量；
[0063] (alO)提高肝臟中Nrf2蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)含量；
[0064] (al 1)降低肝臟中MAPK (p38)的磷酸化水平；
[0065] (al2)降低小腸低氧誘導(dǎo)因子-Ia的水平；
[0066] (al3)提高小腸中緊密連接蛋白水平；
[0067] (al4)提尚小腸中閉鎖蛋白水平；
[0068 ] (a 15)降低肝臟中Keap 1蛋白的水平；
[0069] (al6)升高肝臟中IkB蛋白的水平；
[0070] (al7)改善低度炎癥狀態(tài)；
[0071] (al8)促進(jìn)抗炎作用；
[0072] (al9)降低肝損傷患者血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量；
[0073] (a20)降低肝損傷患者血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量；
[0074] (a21)降低肝損傷患者血清中抗腫瘤壞死因子-α的含量；
[0075] (a22)降低肝損傷患者血清中白介素-6的含量；
[0076] (a23)降低肝損傷患者血清中白介素-12的含量；
[0077] (a24)降低肝損傷患者血清中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量；
[0078] (a25)提高肝損傷患者血清中超氧化物歧化酶的含量；
[0079] (a26)降低肝損傷患者肝臟中細(xì)胞色素 CYP2E1的活性水平；
[0080] (a27)降低肝損傷患者肝臟中NF-kBP65的入核量；
[0081 ] (a28)提高肝損傷患者肝臟中Nrf2蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)含量；
[0082] (a29)降低肝損傷患者肝臟中MAPK(p38)的磷酸化水平；
[0083] (a30)降低肝損傷患者小腸低氧誘導(dǎo)因子-Ia的水平；
[0084] (a31)提高肝損傷患者小腸中緊密連接蛋白水平；
[0085] (a32)提高肝損傷患者小腸中閉鎖蛋白水平；
[0086] (a33)降低肝損傷患者肝臟中Keapl蛋白的水平；
[0087] (a34)升高肝損傷患者肝臟中IkB蛋白的水平；
[0088] (a35)改善肝損傷患者的低度炎癥狀態(tài)；
[0089] (a36)促進(jìn)肝損傷患者體內(nèi)的抗炎作用。
[0090]所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。
[0091]所述肝損傷為急性肝損傷。所述急性肝損傷具體可為脂多糖和D-半乳糖胺引發(fā)放 入急性肝損傷。所述急性肝損傷具體可為小鼠急性肝損傷。所述小鼠具體可為ICR小鼠。
[0092] 以上任一所述食品可為但不限于:含有所述植物乳桿菌的發(fā)酵果蔬、含有所述植 物乳桿菌的發(fā)酵乳、含有所述植物乳桿菌的乳酪、含有所述植物乳桿菌的含乳飲料、含有所 述植物乳桿菌的乳粉或含有所述植物乳桿菌的其它食品。所述食品具體可為功能性食品， 例如功能性酸奶、功能性菌劑等。
[0093] 以上任一所述藥品可為但不限于如下劑型:膠囊、粉劑、片劑。所述藥品還可包括 其他藥學(xué)上可以接受的賦形劑或稀釋劑。制備粉劑的方法可為冷凍干燥或其它工藝。
[0094] 所述植物乳桿菌的建議劑量如下:每天1次，單次劑量為2 X IO8CFU~2 X 101()CFU。
[0095] 本發(fā)明中通過(guò)脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)建立小鼠急性肝損傷模型，驗(yàn)證了植物乳 桿菌C88對(duì)急性肝損傷模型小鼠的保護(hù)作用。與模型組相比，植物乳桿菌C88能降低LPS/D-GaLN誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、抗腫瘤壞死因子-a(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)以及過(guò)氧化脂質(zhì)（LPO)含量，提高超氧化物歧化酶 (5卯61'(?丨(16(1丨81]1此386,300)活性。植物乳桿菌088提高了肝組織中1'1奸2蛋白細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn) 含量，降低了肝組織中NF-kB (Re I A/p65)入核的量，降低了肝組織中細(xì)胞色素 CYP2E1的活性 水平，降低了肝組織中P38磷酸化水平，降低了小腸組織中低氧誘導(dǎo)因子-Ia(Hifla)的水 平，提高了小腸組織中緊密連接蛋白（Occludin)和閉鎖蛋白（Z0-1)的水平。植物乳桿菌C88 對(duì)LPS/D-GaLN誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用機(jī)理應(yīng)為:抑制NF-kB入核量，促進(jìn)Nrf 2蛋白入核，激 活A(yù)RE和提高小腸 HiHa表達(dá)，增強(qiáng)腸道屏障，最終提高機(jī)體抗氧化、抗炎能力。所述產(chǎn)品的 主要功能為：降低急性肝損傷引起的機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸道屏障功能的完整 性，有效緩解急性肝損傷病癥。
[0096] 本發(fā)明公開(kāi)了植物乳桿菌C88對(duì)急性酒精肝損傷的保護(hù)作用，并證明了植物乳桿 菌C88通過(guò)以下機(jī)制治療急性酒精性肝損傷：（1)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，抑制肝細(xì)胞炎癥發(fā)應(yīng)； (2)增強(qiáng)腸道屏障功能，促進(jìn)黏膜免疫系統(tǒng)的調(diào)制作用來(lái)改善肝損傷;調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)， 降低內(nèi)毒素水平，抑制肝臟炎癥反應(yīng)；（3)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力，降低氧化損傷，有效改善肝 功能。
[0097] 本發(fā)明是以日常攝入植物乳桿菌C88或其菌制劑，代替藥品保護(hù)肝損傷。本發(fā)明提 供的植物乳桿菌C88可以作為功能性益生菌應(yīng)用于食品、保健品和藥品領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng) 用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0098] 圖1為植物乳桿菌C88對(duì)小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響。植物乳桿 菌C88對(duì)小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響;*表示與模型組相比差異顯著(P〈 0.05); **表示與肝損傷模型組相比差異極顯著(P〈0.01)。
[0099] 圖2為植物乳桿菌C88對(duì)小鼠血清LPO和SOD活性的影響；*表示與模型組相比差異 顯著(P〈0.05);**表示與模型組相比差異極顯著(P〈0.01)。
[0100]圖3為肝臟HE染色切片（Olympus BX50X200)。
[0101]圖4為植物乳桿菌C88對(duì)小鼠 Nrf2、NF-KB和腸道屏障的影響;*表示與模型組相比 差異顯著(P〈〇.05);**表示與模型組相比差異極顯著(P〈0.01)。
【具體實(shí)施方式】
[0102] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。實(shí)施例中的Western blot中，使用一體式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiScope5600曝光并 計(jì)算灰度值。
[0103] 清潔級(jí)雄性ICR小鼠：長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司?；A(chǔ)飼料:江蘇省協(xié)同醫(yī)藥 生物工程有限責(zé)任公司。
[0104] 脂多糖(LPS)購(gòu)自Sigma公司（產(chǎn)品編號(hào)L2880) 半乳糖胺(D-GlaN)購(gòu)自Sigma公 司（產(chǎn)品編號(hào)G0500)。注射脂多糖和D-半乳糖胺的作用為引發(fā)急性肝損傷，從而建立急性肝 損傷模型。
[0105] 采用南京建成小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)C009)檢測(cè)小鼠血清中 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase ,ALT)的含量。采用南京建成小鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)檢測(cè)試劑盒(CO 10)檢測(cè)小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase ,AST)的含 量。采用上海朗頓小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)酶聯(lián)免疫試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)BP-E11004)檢測(cè)小鼠 血清中過(guò)氧化脂質(zhì)/乳過(guò)氧化物酶(Lipid PerOxide，LP0)的含量。采用上海朗頓小鼠超氧 化物歧化酶(SOD)酶聯(lián)免疫試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)BP-E20348)檢測(cè)小鼠血清中超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase，S0D)的含量。采用上海朗頓小鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫試劑盒 (產(chǎn)品編號(hào)ΒΡ-Ε20220)檢測(cè)血清中的抗腫瘤壞死因子_a(Tumor Necrosis Factora，TNF_a) 含量。采用上海朗頓小鼠白細(xì)胞介素 -6酶聯(lián)免疫試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)BP-E20012)檢測(cè)血清中 的白細(xì)胞介素 -6(InterleUkin-6，IL-6)含量。采用上海朗頓小鼠白細(xì)胞介素 -12酶聯(lián)免疫 試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)BP-E20750)檢測(cè)血清中的白細(xì)胞介素 -12(Interleukin-12，IL-12)含量。 采用康為世紀(jì)生物科技公司核質(zhì)蛋白提取試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)CW0199S)提取小鼠肝臟、小腸 中的核質(zhì)蛋白。采用康為世紀(jì)生物科技公司RIPA蛋白提取試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)CW2334S)提取 小鼠肝臟、小腸中的蛋白。
[0106] 實(shí)施例1、植物乳桿菌C88的獲得
[0107] 菌株C88,自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品奶豆腐中分離獲得，經(jīng)API50CHL生化反應(yīng)和 16srDNA序列擴(kuò)增比對(duì)鑒定為植物乳桿菌(Lactobaci Ilus plantarum)，命名為植物乳桿菌 C88〇
[0108] 植物乳桿菌(1^〇1：(^&(3；[11118口1&1^&1'11111)088已于2009年11月5日保藏于中國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱CCTCC，地址：武漢市武昌珞珈山，武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏號(hào)為 CCTCC NO:M 209254。
[0109] 植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)C88已于2010年1月15日申請(qǐng)專利并獲得 授權(quán)。申請(qǐng)?zhí)枮?01010034128.1。授權(quán)公告號(hào)為CN 101864375B，授權(quán)公告日為2011年11月 02日。
[0110] 實(shí)施例2、植物乳桿菌C88對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用 一、分組處理方式
[0112]試驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)雄性ICR小鼠（6周齡，體重18~22g)。
[0113] 取試驗(yàn)動(dòng)物，第1周進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)，然后隨機(jī)分為4組(每組15只），處理如下：
[0114] 正常對(duì)照組(C組）：第2周至第4周連續(xù)灌胃生理鹽水(每天灌胃1次，單次灌胃體積 為每千克體重給予12mL生理鹽水），末次灌胃后禁食12h，然后一次性腹腔注射無(wú)菌生理鹽 水(注射劑量為"每千克體重30mg無(wú)菌生理鹽水"；
[0115] 模型組(M組）：第2周至第4周連續(xù)灌胃生理鹽水(方式同正常對(duì)照組），末次灌胃后 禁食12h，然后一次性腹腔注射LPS和D-GlaN(注射劑量為"每千克體重50yg LPS和30〇11^〇-GlaN" ；50yg LPS和300mgD-GlaN溶解于 12mL無(wú)菌PBS緩沖液）；
[0116] 低劑量實(shí)驗(yàn)組(L組）：第2周至第4周連續(xù)灌胃植物乳桿菌菌液(每天灌胃1次，單次 灌胃劑量為"每只試驗(yàn)動(dòng)物給予2 X IO8CFU植物乳桿菌C88"，單次灌胃體積為"每千克體重 每次給予12mL菌液"；菌液的制備方法:用PBS緩沖液懸浮植物乳桿菌C88)，末次灌胃后禁食 12h，然后一次性腹腔注射LPS和D-GlaN(方式同模型組）；
[0117] 高劑量實(shí)驗(yàn)組(H組）：第2周至第4周連續(xù)灌胃植物乳桿菌菌液(每天灌胃1次，單次 灌胃劑量為"每只試驗(yàn)動(dòng)物2 X IO1t3CFU植物乳桿菌C88"，單次灌胃體積為"每千克體重每次 給予12mL菌液"；菌液的制備方法:用PBS緩沖液懸浮植物乳桿菌C88)，末次灌胃后禁食12h， 然后一次性腹腔注射LPS和D-GlaN(方式同模型組）；
[0118]培養(yǎng)條件：自由飲食飲水，12h光暗循環(huán)，動(dòng)物房溫度23 ± 2 °C，相對(duì)濕度50 % 土 5%；
[0119] 以上步驟中，從適應(yīng)性培養(yǎng)開(kāi)始計(jì)天數(shù)，第1周即試驗(yàn)第1-7天，第2周至第4周即試 驗(yàn)第8-28天，以此類推。急性肝損傷模型的建立在第五周即第29天。
[0120] 二、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及肝臟抗氧化指標(biāo)含量的測(cè)定
[0121] 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(試驗(yàn)第29天），取各組小鼠，摘眼球取血，室溫凝固60min后3000r/min 離心15min，收集上清(血清）。檢測(cè)小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO) 和超氧化物歧化酶(S0D)的含量。
[0122] 谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清 中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性顯著升高(P〈〇.〇5)，表明腹腔注射LPS/D-GaLN引起了急 性肝損傷。與模型組相比，低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活 性顯著降低(P〈〇. 05)，表明預(yù)先灌胃植物乳桿菌C88能夠顯著降低LPS/D-GaLN引起的血清 轉(zhuǎn)氨酶的增加，表明植物乳桿菌C88具有減輕肝損傷的作用。
[0123] 血清中過(guò)氧化脂質(zhì)和超氧化物歧化酶的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。與正常對(duì)照組相比，模型 組小鼠血清中過(guò)氧化脂質(zhì)含量顯著升高。與模型組相比，低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組的 過(guò)氧化脂質(zhì)含量顯著降低(P〈〇.05)。與模型組相比，低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組的超氧 化物歧化酶活性顯著提高(P〈〇. 01)。
[0124] 三、血清炎癥因子測(cè)定
[0125] 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(試驗(yàn)第29天），取各組小鼠，摘眼球取血，室溫凝固60min后3000r/min 離心15min，收集上清(血清）。檢測(cè)小鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-12的含量。
[0126] 結(jié)果見(jiàn)表ULPS/D-GaLN能夠引起小鼠的炎癥反應(yīng)。模型組的炎癥因子如TNF-a、 IL-6、IL-12的含量與對(duì)照組相比顯著升高(P〈0.01)。但是，在LPS/D-GaLN注射前給予植物 乳桿菌C88能夠顯著抑制小鼠血清中如TNF-a、IL-6、IL-12等炎癥因子的分泌(P〈0.05)。
[0127] 表1植物乳桿菌C88對(duì)小鼠血清TNF-a、IL-6、IL-12分泌的影響
[0129] 注:*表示與模型組相比差異顯著(P〈0.05);**表示與模型組相比數(shù)據(jù)間差異極顯 著(Ρ〈0·01)〇
[0130] 四、肝組織HE切片
[0131] 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(試驗(yàn)第29天），取血后，取小鼠肝臟置于中性福爾馬林固定液固定，經(jīng) 脫水、包埋、切片后，石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精水化，蘇木素染色4min，l%鹽酸酒精分化 20s，稀氨水返藍(lán)30s，伊紅染色lmin，脫水、透明、中性樹膠封片，光學(xué)倒置顯微鏡進(jìn)行病理 學(xué)觀察并拍照。
[0132] 照片見(jiàn)圖3。模型組小鼠肝臟組織受損嚴(yán)重，肝索結(jié)構(gòu)不明顯肝細(xì)胞排列不規(guī)則， 可見(jiàn)大多數(shù)肝細(xì)胞腫脹，中央靜脈周圍可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死(箭頭所示），細(xì)胞核偏離中心，胞漿出 現(xiàn)氣球樣變，因此急性內(nèi)毒素肝損傷造模成功。正常對(duì)照組的肝細(xì)胞排列規(guī)整，肝索結(jié)構(gòu)清 晰，細(xì)胞核呈圓形染色較深處于細(xì)胞中央，核質(zhì)分布清晰均勻，肝組織沒(méi)有炎癥細(xì)胞也沒(méi)有 壞死。低劑量實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，胞漿氣球樣變的現(xiàn)象減少，有細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象(箭頭 所示）。高劑量實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的好轉(zhuǎn)，但胞漿疏松透亮，細(xì)胞核清晰完整，細(xì)胞完整性明顯 好轉(zhuǎn)。結(jié)果表明，植物乳桿菌C88具有減輕肝損傷的作用。
[0133] 五、RT-PCR和Western blot檢測(cè)相關(guān)基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平
[0134] 1、肝組織Nrf 2、NF-κΒ基因表達(dá)水平
[0135] 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(試驗(yàn)第29天），取肝臟，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用β-actin為內(nèi) 參基因，檢測(cè)肝組織中Nrf 2基因和NF-kBP65基因的相對(duì)表達(dá)水平。
[0136] 用于檢測(cè)Nrf2基因的引物如下：
[0137] 上游引物：5'-厶0：1^0^611^^丁6厶(：1'1'-3'；
[0138] 下游引物：5 ' -GGCGACTTTATTCTTACCTCT-3。
[0139] 用于檢測(cè)NF-kBP65基因的引物如下：
[0140] 上游引物：5'-八1'(^61'11'0：0：11^1'(：1'1'1'-3'；
[0141] 下游引物：5 ' -GTCTTGGTGGTATCTGTGCT-3 ' ；
[0142] 用于檢測(cè)β-actin基因的引物如下：
[0143] 上游引物：5'-丁0(^61^〇^6丁厶丁6〇：1'(^6-3'；
[0144] 下游引物：5 ' -TTGATGTCACGCACGATTTCC-3 '。
[0145] PCR反應(yīng)體系（20yL):SYBR GreenI12.5yL，cDNA 2yL，上下游引物各lyL，補(bǔ)充 (IdH2O 至 20yL。
[0146] PCR反應(yīng)采用Rotor Gene 3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：95°C60s; 95 °C 15s、60 °C 60s，45 個(gè)循環(huán)。
[0147] 將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用UVroGS-8000型凝膠成像系統(tǒng)成像，并用 密度掃描儀分析PCR產(chǎn)物條帶。
[0148] Nr f 2基因的相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果如圖4A所示，LPS/D-GaLN能引起肝臟中Nr f 2基因表 達(dá)水平降低(P〈〇.〇5)，植物乳桿菌C88能夠顯著逆轉(zhuǎn)LPS/D-GaLN引起的Nrf2基因表達(dá)水平 降低(P〈0.01)，并呈劑量依賴關(guān)系。
[0149] NF-kBP65基因的相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果如圖4B所示。LPS/D-GaLN注射能引起NF-κ Bp65基因表達(dá)顯著上調(diào)(P〈0.05)，但是提前給予植物乳桿菌C88能夠顯著抑制LPS/D-GaLN 引起的NF-kB p65基因表達(dá)上調(diào)(P〈0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
[0150] 2、植物乳桿菌C88對(duì)肝臟抗氧化、抗炎能力和腸道屏障的影響
[0151] 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(試驗(yàn)第29天），取肝臟或小腸，提取總蛋白和核質(zhì)蛋白。
[0152] 取肝組織總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)Nrf2蛋白、Keapl蛋白和β-actin蛋白的 水平。取肝組織核質(zhì)蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)Nrf2蛋白的水平。用于檢測(cè)Nrf2蛋白的一 抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)bs-1074R)。用于檢測(cè)Keapl蛋白的一抗購(gòu) 自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)bs-4900R)。用于檢測(cè)β-actin蛋白的一抗購(gòu)自 北京博奧森生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)bs-0061R)。結(jié)果如圖4C所示，LPS/D-GaLN刺激引 起Nrf 2入核量的降低和Keapl的含量升高，但是提前灌胃植物乳桿菌C88能夠顯著提高Nrf2 核轉(zhuǎn)運(yùn)量和降低Keapl的蛋白水平。
[0153] 取肝組織總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)NF_KBp65蛋白、IkB蛋白和β-actin蛋白 的水平。取肝組織核質(zhì)蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)NF-kBP65蛋白的水平。用于檢測(cè)NF-κ Bp65蛋白的一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)bs-20159R)。用于檢測(cè)IkB蛋 白的一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)10268-1-AP)。用于檢測(cè)β-actin蛋白 的一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)bs-0061R)。結(jié)果如圖4D所示，LPS/D-GaLN能引起小鼠肝臟NF-kB P65入核量升高和降低IkB蛋白的水平，而提前給予植物乳桿菌 C88能夠抑制NF-kBP65入核量和升高IkB蛋白含量。
[0154] 取肝組織總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)CYP2E1蛋白的水平。用于檢測(cè)CYP2E1蛋 白的一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)bs-4562R)。結(jié)果如圖4E所示，LPS/ D-GaLN的刺激能夠提高小鼠肝臟CYP2E1蛋白水平和活性，但提前給予植物乳桿菌C88顯著 抑制了 LPS/D-GaLN誘導(dǎo)的CYP2E1蛋白水平的增加。
[0155] 取肝組織總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)MAPK(p38)蛋白的水平。用于檢測(cè)MAPK (P38)蛋白的一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)66234)。結(jié)果如圖4F所示， LPS/D-GaLN誘導(dǎo)能促進(jìn)p38的磷酸化，但是提前給予植物乳桿菌C88能夠顯著降低p38的磷 酸化。
[0156] 取小腸組織總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。用于檢測(cè)HIF-Ia蛋 白的一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)20960-1-AP)。用于檢測(cè)Z0-1蛋白的一 抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)bs-9888R)。用于檢測(cè)Occludin蛋白的一抗 購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)b S-1011R)。結(jié)果如圖4G所示，LPS/D-GaLN的 刺激能顯著提高腸道HIF-Ia蛋白的水平，并且降低Z0-1蛋白和Occludin蛋白的水平，然而 提前給予植物乳桿菌C88能夠顯著抑制HIF-Ia蛋白的升高，并顯著增加了Z0-1蛋白和 Occludin蛋白的水平。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 植物乳桿菌在制備用于預(yù)防和/或治療肝損傷的產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述植物乳桿菌為 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)C88,其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 209254。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。3. 如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述肝損傷為急性肝損傷。4. 植物乳桿菌在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述植物乳桿菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)C88,其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 209254; 所述產(chǎn)品的功能為如下(al)至(a32)中的至少一項(xiàng)： (al)降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量； (a2)降低血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量； (a3)降低血清中抗腫瘤壞死因子-α的含量； (a4)降低血清中白介素-6的含量； (a5)降低血清中白介素-12的含量； (a6)降低血清中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量； (a7)提高血清中超氧化物歧化酶的含量； (a8)降低肝臟中細(xì)胞色素 CYP2E1的活性水平； (a9)降低肝臟中NF-kBP65的入核量； (alO)提高肝臟中Nrf2蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)含量； (al 1)降低肝臟中MAPK (p38)的磷酸化水平； (al2)降低小腸低氧誘導(dǎo)因子-Ια的水平； (al3)提高小腸中緊密連接蛋白水平； (al4)提高小腸中閉鎖蛋白水平； (al5)降低肝臟中Keapl蛋白的水平； (al6)升高肝臟中ΙκΒ蛋白的水平； (al7)改善低度炎癥狀態(tài)； (al8)促進(jìn)抗炎作用； (al9)降低肝損傷患者血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量； (a20)降低肝損傷患者血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量； (a21)降低肝損傷患者血清中抗腫瘤壞死因子-α的含量； (a22)降低肝損傷患者血清中白介素-6的含量； (a23)降低肝損傷患者血清中白介素-12的含量； (a24)降低肝損傷患者血清中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量； (a25)提高肝損傷患者血清中超氧化物歧化酶的含量； (a26)降低肝損傷患者肝臟中細(xì)胞色素 CYP2E1的活性水平； (a27)降低肝損傷患者肝臟中NF-kBP65的入核量； (a28)提高肝損傷患者肝臟中Nrf 2蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)含量； (a29)降低肝損傷患者肝臟中MAPK(p38)的磷酸化水平； (a30)降低肝損傷患者小腸低氧誘導(dǎo)因子-Ια的水平； (a31)提高肝損傷患者小腸中緊密連接蛋白水平； (a32)提高肝損傷患者小腸中閉鎖蛋白水平； (a33)降低肝損傷患者肝臟中Keapl蛋白的水平； (a34)升高肝損傷患者肝臟中ΙκΒ蛋白的水平； (a35)改善肝損傷患者的低度炎癥狀態(tài)； (a36)促進(jìn)肝損傷患者體內(nèi)的抗炎作用。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。6. 如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述肝損傷為急性肝損傷。7. -種用于預(yù)防和/或治療肝損傷的產(chǎn)品，其活性成分為植物乳桿菌;所述植物乳桿菌 為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)C88,其保藏編號(hào)為CCTCC N0:M209254。8. -種用于預(yù)防和/或治療肝損傷的產(chǎn)品，其活性成分為植物乳桿菌;所述植物乳桿菌 為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)C88,其保藏編號(hào)為CCTCC N0:M209254; 所述產(chǎn)品的功能為如下(al)至(a32)中的至少一項(xiàng)： (al)降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量； (a2)降低血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量； (a3)降低血清中抗腫瘤壞死因子-α的含量； (a4)降低血清中白介素-6的含量； (a5)降低血清中白介素-12的含量； (a6)降低血清中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量； (a7)提高血清中超氧化物歧化酶的含量； (a8)降低肝臟中細(xì)胞色素 CYP2E1的活性水平； (a9)降低肝臟中NF-kBP65的入核量； (alO)提高肝臟中Nrf2蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)含量； (al 1)降低肝臟中MAPK (p38)的磷酸化水平； (al2)降低小腸低氧誘導(dǎo)因子-Ια的水平； (al3)提高小腸中緊密連接蛋白水平； (al4)提高小腸中閉鎖蛋白水平； (al5)降低肝臟中Keapl蛋白的水平； (al6)升高肝臟中ΙκΒ蛋白的水平； (al7)改善低度炎癥狀態(tài)； (al8)促進(jìn)抗炎作用； (al9)降低肝損傷患者血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量； (a20)降低肝損傷患者血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量； (a21)降低肝損傷患者血清中抗腫瘤壞死因子-α的含量； (a22)降低肝損傷患者血清中白介素-6的含量； (a23)降低肝損傷患者血清中白介素-12的含量； (a24)降低肝損傷患者血清中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量； (a25)提高肝損傷患者血清中超氧化物歧化酶的含量； (a26)降低肝損傷患者肝臟中細(xì)胞色素 CYP2E1的活性水平； (a27)降低肝損傷患者肝臟中NF-kBP65的入核量； (a28)提高肝損傷患者肝臟中Nrf 2蛋白的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)含量； (a29)降低肝損傷患者肝臟中MAPK(p38)的磷酸化水平； (a30)降低肝損傷患者小腸低氧誘導(dǎo)因子-Ια的水平； (a31)提高肝損傷患者小腸中緊密連接蛋白水平； (a32)提高肝損傷患者小腸中閉鎖蛋白水平； (a33)降低肝損傷患者肝臟中Keapl蛋白的水平； (a34)升高肝損傷患者肝臟中ΙκΒ蛋白的水平； (a35)改善肝損傷患者的低度炎癥狀態(tài)； (a36)促進(jìn)肝損傷患者體內(nèi)的抗炎作用。9. 如權(quán)利要求7或8所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。10. 如權(quán)利要求7或8或9所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述肝損傷為急性肝損傷。
【文檔編號(hào)】A61K35/747GK106074623SQ201610532582
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月7日
【發(fā)明人】李盛鈺, 段翠翠, 高磊, 趙玉娟, 牛春華, 欒暢, 趙文博
【申請(qǐng)人】吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院