專利名稱：酶法提取人參皂苷的方法及所得到的人參皂苷提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用生物酶技術(shù)從人參中提取人參皂苷的方法以及所提取得到的人參皂苷提取物。
背景技術(shù)：
人參(Panax ginseng C.A.Mey)是五加科(Araliaceae)植物人參的干燥根,俗稱人銜、鬼蓋、地精、孩兒參等，是我國(guó)名貴的藥材，已有數(shù)千年的藥用歷史。人參性平、味甘、微苦且微溫，具有大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津止渴，安神益智之功效。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)人參的有效成分進(jìn)行了藥理研究、臨床觀察和流行病學(xué)檢查，結(jié)果表明人參具有改善微循環(huán)、提高組織抗缺氧能力、抑制血小板聚集、抗腫瘤、抗衰老、抗福射、抗疲勞等多種生物活性。
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人參的化學(xué)成分主要有三萜類人參皂苷、有機(jī)酸及酯類、維生素類、多糖類等，其中人參皂苷是其最主要活性成·分。按照人參皂苷的結(jié)構(gòu)類型(羥基的數(shù)量不同)、糖基的數(shù)量和位置，可將目前已分離鑒定出的60余種單體皂苷化合物分為3組:(a) oleanolic酸型，即齊墩果酸(Oleanolic acid)類,如人參阜苷Ro,主要有抗炎、抗血小板釋放等作用；(b) 20 (S)-原人參萜二醇(PD)型，如人參皂苷 RaARbrRbyRbRcURgyRtVRso 其中人參皂苷Rb1、Rb2表現(xiàn)出具有中樞神經(jīng)抑制、降低細(xì)胞內(nèi)鈣、抗氧化、清除自由基和改善心肌缺血再灌注損傷等作用，原人參二醇組皂苷無(wú)溶血活性；(C) 20 (S)-原人參萜三醇(PT)型，如人參皂苷Re、Rf、RgpRgyRh115其中人參皂苷Rg1表現(xiàn)出具有中樞神經(jīng)興奮、促智、促進(jìn)蛋白質(zhì)及DNA和RNA的合成等作用；人參皂苷Re是抗心律失常有效成分，具有可抑制嗎啡誘發(fā)小鼠產(chǎn)生的耐藥性等作用；人參皂苷Rg2具有可抑制兔血小板釋放反應(yīng)等作用。中醫(yī)使用人參已有幾千年的歷史。目前臨床上以人參為主藥的中成藥有數(shù)十種。在研究人參制劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同提取工藝對(duì)提取物中人參有效成分人參皂苷、人參二醇含量影響較大。傳統(tǒng)人參采用粉末入藥或滲漏提取，目前多采用不同濃度乙醇回流提取，亦有用滲漏工藝，或是采用微波提取、大孔樹(shù)脂處理等工藝。例如，CN101862361A公開(kāi)了一種從人參中提取人參皂苷的方法，其中是用乙醇溶液浸泡并加入表面活性劑后用微波加熱提取人參皂苷，以提高提取率。然而，現(xiàn)有的這些從人參中提取人參皂苷的方法，仍存在操作繁瑣、提取時(shí)間長(zhǎng)、效率較低、對(duì)有效成分提取不充分、浪費(fèi)藥材等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種酶法提取人參皂苷的方法，以對(duì)人參皂苷進(jìn)行更充分提取，提聞提取效率。本發(fā)明的另一目的在于提供一種按照所述的方法制備得到的人參皂苷提取物，該提取物中含有多種人參皂苷成分。
一方面，本發(fā)明提供了一種酶法提取人參皂苷的方法，其中，是采用了酶工程與傳統(tǒng)中藥提取技術(shù)的結(jié)合，對(duì)人參進(jìn)行處理，提取其中的人參皂苷。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明提供的酶法提取人參皂苷的方法，包括對(duì)植物藥材人參進(jìn)行酶提取和醇提取的步驟，其中:酶提取步驟:以添加酶制劑的水溶液作為酶提取液，對(duì)粉碎或切片后的人參進(jìn)行浸潰提取，所述的酶制劑為纖維素酶、果膠酶或其混合物，提取條件:30°c 50°C酶解0.5小時(shí) 6小時(shí)(可輔以適當(dāng)攪拌，也可以不攪拌)；醇提取步驟:向酶解后的人參溶液中加入乙醇(不需要進(jìn)行滅酶處理，直接加入乙醇即可)，配成30% 60%體積濃度的乙醇提取液，50°C 90°C加熱回流2小時(shí) 10小時(shí)；殘?jiān)孟嗤瑵舛鹊囊掖家涸俅位亓魈崛 4小時(shí)(這里所述的相同濃度是指再次回流提取液的乙醇濃度與第一次乙醇提取液的濃度基本相同)，合并提取液。本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法，在酶提取步驟中，加入了特定的酶制劑，對(duì)天然原料藥人參進(jìn)行酶解，可以水解植物中的纖維素、果膠質(zhì)等，破碎植物細(xì)胞壁，將纖維素等轉(zhuǎn)變成小分子的可溶性糖類，有利于細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出，使有效成分提取更加完善，而且，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)該酶提取步驟，還可以有效避免傳統(tǒng)醇提取過(guò)程中產(chǎn)生的沉淀現(xiàn)象，既改善了藥液澄清度，又增加了營(yíng)養(yǎng)成分的含量。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法中，所述酶制劑的添加量為藥材重量(除特別注明外，本發(fā)明中所述藥材量均是以干人參藥材量計(jì))的
0.5%0 5%0。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法中，所述的酶制劑為纖維素酶與果膠酶的混合物，纖維素酶與果膠酶的質(zhì)量比為1:1 1: 2。本發(fā)明中所述的各試劑包括纖維素酶、 果膠酶等均可商購(gòu)獲得。優(yōu)選地，所述纖維素酶活力大于等于I萬(wàn)u/g，所述果膠酶活力大于等于3萬(wàn)u/g。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法中，所述酶提取步驟中，添加酶制劑的水溶液的量為藥材量的3 7倍重量。本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法中，考慮到成份的極性和溫度的影響，對(duì)酶提取液進(jìn)一步采用了乙醇加熱回流的方法進(jìn)行循環(huán)處理，之后過(guò)濾，得提取液。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法中，所述醇提取步驟中，控制醇提取液為30% 60%體積濃度的乙醇。更具體地，優(yōu)選同時(shí)控制乙醇提取液的量(首次醇提時(shí)的量)為藥材量的5 10倍重量。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，可控制二次醇提時(shí)乙醇提取液的量(再次回流的乙醇提取液的量)為藥材量的6 10倍重量；二次醇提時(shí)的溫度優(yōu)選與首次醇提時(shí)相同；更優(yōu)選地，二次醇提時(shí)乙醇用量與首次醇提時(shí)相同。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法還可包括:在酶提取步驟前，對(duì)植物藥材人參進(jìn)行前處理:稱取植物藥材人參，加水浸泡過(guò)夜，使人參變軟，切碎或切成薄片。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法還包括:對(duì)醇提取后得到的醇提取液進(jìn)行濃縮干燥，得到人參皂苷濃縮提取液或人參皂苷提取浸膏；或者，更進(jìn)一步將濃縮提取液或提取浸膏濃縮干燥(優(yōu)選于50°C 60°C下旋蒸法減壓濃縮，60°C以下真空干燥)得人參皂苷提取物黑褐色粉末。濃縮過(guò)程中回收乙醇，重復(fù)利用，以進(jìn)一步降低成本。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法中，所述對(duì)醇提取液進(jìn)行濃縮干燥的操作條件是:50°C 60°C旋蒸法減壓濃縮，60°C以下真空干燥。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提出的酶法提取人參皂苷的方法包括有人參藥材的前處理、酶處理、醇提和濃縮干燥的步驟，具體操作如下:(1)稱取人參藥材，加蒸餾水浸泡過(guò)夜，人參藥材泡軟后切成薄片；(2)在上述試樣中加3 7倍重量的蒸餾水作為提取液，并加入纖維素酶、果膠酶或其混合的復(fù)合酶，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?0 50°C溫度下酶解0.5 6小時(shí)；其中，所述的酶制劑按藥材重量的0.5%o _5%。加至水提取液中，在特定溫度下進(jìn)行恒溫酶解，以充分溶解人參藥材中的纖維素等成分，其中纖維素酶與果膠酶的質(zhì)量比為1:1 1: 2;本發(fā)明要求各酶制劑的規(guī)格:纖維素酶活力不低于I萬(wàn)u/g，果膠酶活力不低于3萬(wàn)u/g ；(3)將酶解后的人參溶液中加入乙醇，配成原藥材重量5 10倍量的乙醇液，且控制該乙醇液中乙醇體積濃度30% 60%，50 90°C加熱回流2 10小時(shí)，殘?jiān)儆孟嗤瑵舛鹊囊掖家涸俅位亓魈崛 4小時(shí)，合并提取液；(4)將所得的醇提取液旋蒸法減壓濃縮成稠膏狀，濃縮過(guò)程中回收乙醇，濃縮后為避免破壞氨基酸成分，采用60°C下真空干燥，所得干燥粉末，即為人參皂苷提取物粉末。采用比色法測(cè)定本發(fā)明的方法提取人參皂苷的得率，與單純的熱醇回流提取法相比較，本發(fā)明的提取率提高30%以上。另一方面，本發(fā)明還提供了按照本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法制備得到的人參皂苷提取物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的人參皂苷提取物，可以是濃縮提取液形式，也可以是所述的浸膏或粉末形式。綜上所述，本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的方法具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明采用生物酶技術(shù)與傳統(tǒng)的中藥提取技術(shù)相結(jié)合，由于生物酶的高效性和專一性，溶解人參藥材中的纖維素和果膠質(zhì)等物質(zhì)，使有效成分更加充分的提取出，再結(jié)合采用乙醇加熱回流的方法進(jìn)行提取，提取出的皂苷成分更充分全面，提取率高；并且，本發(fā)明的方法中，酶解條件溫和，操作簡(jiǎn)單，主要溶劑為水和乙醇，乙醇提取后可回收利用，從而減少溶劑消耗，使生產(chǎn)成本降低。


圖1為本發(fā)明的酶法提取人參皂苷的工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合附圖并參照下列實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1請(qǐng)參見(jiàn)圖1所示的提取工藝流程，本實(shí)施例的酶法提取人參皂苷的工藝主要按照如下操作進(jìn)行:稱取人參藥材100g，浸泡過(guò)夜，切成薄片，加水400mL，加纖維素酶50mg，果膠酶100mg，45°C反應(yīng)I小時(shí)，再向酶解提取液中加200mL95%體積濃度的乙醇，配成乙醇提取液，55°C回流3小時(shí)，過(guò)濾得提取液；殘?jiān)?00mL相同濃度的乙醇液，55°C回流2小時(shí)，過(guò)濾得提取液，合并兩次醇提液。將提取液在50°C減壓濃縮成浸膏狀，在濃縮過(guò)程中回收乙醇，最后將浸膏在60°C以下進(jìn)一步真空干燥所得粉末即為人參皂苷提取物。本實(shí)施例的人參皂苷提取物為黑棕色粉末。用比色法測(cè)定本實(shí)施例的酶法提取的人參皂苷，與單純的熱醇回流法相比較，提取的人參皂苷得率提高46.7%。實(shí)施例2稱取人參藥材IOOg,浸泡過(guò)夜,切成薄片，加水400mL,加纖維素酶75mg,果膠酶75mg，45°C反應(yīng)I小時(shí)，再向提取液中加200mL95%體積濃度的乙醇，配成乙醇提取液，55°C回流3小時(shí)，過(guò)濾得提取液；殘?jiān)?00mL相同濃度的乙醇液，550C回流2小時(shí)，過(guò)濾得提取液，合并兩次醇提液。將提取液在50°C減壓濃縮成浸膏狀，在濃縮過(guò)程中回收乙醇，最后將浸膏在60°C以下進(jìn)一步真空干燥所得粉末即為本實(shí)施例的人參皂苷提取物。用比色法測(cè)定酶法提取的人參皂苷較單純的熱醇回流法提取的人參皂苷得率提高47.6%。實(shí)施例3稱取人參藥材100g，浸泡過(guò)夜，切成薄片，加水400mL，加纖維素酶150mg，45°C反應(yīng)I小時(shí)，再加200mL體積濃度95%的乙醇配成乙醇液，55°C回流3小時(shí)，過(guò)濾得提取液；殘?jiān)覵OOmL相同濃度的乙醇液，55°C回流2小時(shí)，過(guò)濾得提取液，合并兩次醇提液。將提取液在50°C減壓濃縮成浸膏狀，在濃縮過(guò)程中回收乙醇，最后將浸膏在60°C以下進(jìn)一步真空干燥所得浸膏即為人參皂 苷提取物。用比色法測(cè)定酶法提取的人參皂苷較單純的熱醇回流法提取的人參皂苷得率提高32.3%。一、提取方法與分組稱取人參藥材IOOg各四份，浸泡過(guò)夜，切成薄片，加水400mL，分別加入(I)纖維素酶150mg ；⑵纖維素酶50mg，果膠酶IOOmg ； (3)纖維素酶75mg，果膠酶75mg ； (4)不加酶；45°C反應(yīng)I小時(shí)，再向提取液中加200mL加95%體積濃度的乙醇，配成乙醇提取液，55°C回流3小時(shí)，過(guò)濾得提取液；殘?jiān)?00mL相同濃度的乙醇液，55°C回流2小時(shí)，過(guò)濾得提取液，合并兩次醇提液，濃縮至200mL，作為待測(cè)提取液。用比色法測(cè)定該酶法提取的人參皂苷待測(cè)提取液中的人參皂苷含量。二、比色法檢測(cè)各實(shí)施例的人參皂苷提取物采用比色法測(cè)定人參皂苷含量的方法，來(lái)測(cè)定提取液中人參皂苷(以Rgl作為指標(biāo))的含量。(I)試液配制:8%香草醛-甲醇溶液:稱取香草醛2g于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。77% H2SO4溶液:量取78.6ml濃硫酸于含20ml水的IOOml量瓶中，再加水稀釋至刻度。(2)樣品配制:供試品溶液:分別將人參酶法提取樣品200mL和人參空白提取樣品稀釋定容至500ml，再各取5ml于IOml量瓶中，用50 %乙醇稀釋至IOml，得到人參空白提取樣品溶液和人參酶法提取樣品溶液。對(duì)照品溶液:取3mg人參皂苷Rgl于IOml量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度。
(3)測(cè)定:取4支具塞刻度試管，分別加0.5ml50%乙醇，用于校準(zhǔn)，0.5ml人參皂苷Rgl標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于對(duì)照，和上述配制的人參空白提取樣品溶液0.5ml，人參酶法提取樣品溶液
0.5ml，再將這4支試管置于冰水浴中，各加8 %香草醛-甲醇溶液0.5ml，再加5ml77 % H2SO4溶液，搖勻，于60°C水浴中放置10分鐘，迅速取出放于冰水浴中，冷卻10分鐘，各加入5ml甲醇溶液，搖勻，于544nm處測(cè)光吸收值。由比爾-朗伯定律數(shù)學(xué)表達(dá)式:A = lg(l/T) = Kbc,
權(quán)利要求
1.一種酶法提取人參皂苷的方法，該方法包括對(duì)植物藥材人參進(jìn)行酶提取和醇提取的步驟，其中: 酶提取步驟:以添加酶制劑的水溶液作為酶提取液，對(duì)粉碎或切片后的人參進(jìn)行浸潰提取，所述的酶制劑為纖維素酶、果膠酶或其混合物，提取條件:30°c 50°C酶解0.5小時(shí) 6小時(shí)； 醇提取步驟:向酶解后的人參溶液中加入乙醇，配成30% 60%體積濃度的乙醇提取液，50°C 90°C加熱回流2小時(shí) 10小時(shí)；殘?jiān)孟嗤瑵舛鹊囊掖家涸俅位亓魈崛 4小時(shí)，合并提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法提取人參皂苷的方法，其中，所述酶制劑的添加量為藥材重量的0.5%。 5%o。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法提取人參皂苷的方法，其中，所述的酶制劑為纖維素酶與果膠酶的混合物，纖維素酶與果膠酶的質(zhì)量比為1:1 1: 2;優(yōu)選地，所述纖維素酶活力大于等于I萬(wàn)u/g，所述果膠酶活力大于等于3萬(wàn)u/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法提取人參皂苷的方法，其中，所述酶提取步驟中，添加酶制劑的水溶液的量為藥材量的3 7倍重量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法提取人參皂苷的方法，其中，所述醇提取步驟中，乙醇提取液的量控制為藥材量的5 10倍重量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法提取人參皂苷的方法，該方法還包括: 在酶提取步驟前，對(duì)植物藥材人參進(jìn)行前處理:稱取植物藥材人參，加水浸泡過(guò)夜，使人參變軟，切碎或切成薄片。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法提取人參皂苷的方法，該方法還包括: 對(duì)醇提取后得到的醇提取液進(jìn)行濃縮干燥，得到人參皂苷濃縮提取液或人參皂苷提取浸膏或人參阜苷提取物粉末。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的酶法提取人參皂苷的方法，其中，所述對(duì)醇提取液進(jìn)行濃縮干燥的操作條件是:50°C 60°C旋蒸法減壓濃縮，60°C以下真空干燥。
9.按照權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述的酶法提取人參皂苷的方法制備得到的人參皂苷提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的人參皂苷提取物，該人參皂苷提取物為人參皂苷濃縮提取液或人參阜苷提取浸膏或人參阜苷提取物粉末。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種酶法提取人參皂苷的方法及所得到的人參皂苷提取物。所述的方法包括對(duì)植物藥材人參進(jìn)行酶提取和醇提取的步驟，其中，酶提取步驟以添加酶制劑的水溶液作為酶提取液，對(duì)粉碎或切片后的人參進(jìn)行浸漬提取，所述的酶制劑為纖維素酶、果膠酶或其混合物，提取條件30℃～50℃酶解0.5小時(shí)～6小時(shí)；醇提取步驟向酶解后的人參溶液中加入乙醇，配成30％～60％體積濃度的乙醇提取液，50℃～90℃加熱回流2小時(shí)～10小時(shí)；殘?jiān)孟嗤瑵舛鹊囊掖家涸俅位亓魈崛?～4小時(shí)，合并提取液。利用本發(fā)明的方法得到的人參皂苷提取物有效成分含量高，相對(duì)單純的乙醇加熱回流，提取率提高30％以上，且本發(fā)明的提取條件溫和，操作簡(jiǎn)單，成本較低。
文檔編號(hào)A61K36/258GK103142669SQ201310072500
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者陳勇 申請(qǐng)人:安徽豐潤(rùn)生物技術(shù)有限公司, 陳勇