專利名稱：使用酶的銀耳提取物制備方法及含有它的記憶增進用組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用酶的銀耳提取物制備方法及含有它的記憶增進用組合物，具體地說，涉及通過酶處理使收率得到提高的銀耳提取物的制備方法及包含它的記憶增進用食品組合物及藥學組合物。
背景技術：
神經生長因子(Nerve growth factor, NGF)在中樞神經系統中起到保護神經細胞免受損傷的作用(J. Neurosci. Aug ；6 (8) ；2155-62 ； 1986)，對維持成熟的神經元起重要作用(Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 46 ；384-391 ； 1960)。因此可以說，為使神經細胞在正常狀態(tài)下生存、生長、分化，必須需要如神經生長因子的多種生長因子，上述神經生長因子能夠預防和治療癡呆，無現有治療劑所具有的副作用，預期能夠有效地發(fā)揮作用。然而上述神經生長因子由于分子量大，不能通過腦內的血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)，在實際臨床中難以取得預期的治療效果。因此實際上需要誘導內源性神經生長因子的合成，或者開發(fā)出發(fā)揮神經生長因子類似作用的物質。實際上，由天然物中探尋上述物質的研究正在進行中，并且本發(fā)明者也以此為線索報道了銀耳提取物中的神經生長活性(kim et al.； Biol Pharm Bull. ；30 (4) ；708-714 ;2007)。銀耳(Tremella fuciformis)屬于所謂的膠質菇(jelly mushroom)，形成凝膠形態(tài)的子實體(fruit body)。銀耳(Tremel lales)目(order)及銀耳(Tremel laceae)科 (family)所屬的銀耳(Tremella fuciformis)可用作食用菇。主要在夏季滋生于闊葉樹的腐木。在包含韓國、日本等在內的全世界范圍廣泛分布。此外，銀耳的子實體作為常用食品，在中國是作為強壯劑應用于臨床的傳統藥物(Li，S. S. Chinese medicinal herbs ； Georgetown Press San Francisc)。其子實體成袋狀，放大并相互融合形成帶有水波狀皺紋的塊。呈淺黃色或黃色，偶見橙黃色，表面為彎曲的水波狀但卻平滑，在其整個表面產生子實體。尺寸通常為直徑6cm、高3-4mm，但濕氣較多時也可以生長得更大些。本發(fā)明者在先前的報道中發(fā)現了銀耳提取物具有神經細胞恢復及損傷抑制作用， 完成了含有銀耳提取物的記憶增進用組合物的相關發(fā)明。然而在依照現有報道中的銀耳提取物的制備方法的情況下，存在著生產收率不高、難以應用于產品的困難。因此與現有的提取物進行比較，實際上需要研究出具有同等的或得到提高的記憶增進作用的同時，收率得到顯著提高的銀耳提取物的制備方法。

發(fā)明內容
要解決的技術問題為此，本發(fā)明者在可提高銀耳提取物制備收率的方法的研究過程中，在酸性條件下熱水加壓提取后進行酶處理時，發(fā)現了銀耳提取物的收率顯著提高。因此，本發(fā)明中在酸性條件下熱水加壓提取后，增加了酶處理工程，完成了收率得到提高的銀耳提取物的制備方法。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種由(a)在酸性條件下對銀耳進行熱水加壓提取的步驟；及(b)對所述的熱水提取物進行酶處理的步驟組成的銀耳提取物的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種依照所述的制備方法制備出的銀耳提取物。本發(fā)明的又一目的在于，提供一種含有所述的銀耳提取物的記憶增進用食品組合物。本發(fā)明的又一目的在于，提供一種含有所述的銀耳提取物的記憶力障礙疾病預防及治療用藥學組合物。技術方案為實現上述本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種由(a)在酸性條件下對銀耳進行加壓熱水提取的步驟；及(b)對所述的熱水提取物進行酶處理的步驟組成的銀耳提取物的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種依照所述的制備方法制備出的銀耳提取物。本發(fā)明的又一目的在于，提供一種含有所述的銀耳提取物的記憶增進用食品組合物。本發(fā)明的又一目的在于，提供一種含有所述的銀耳提取物的記憶力障礙疾病預防及治療用藥學組合物。以下對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明涉及由(a)在酸性條件下對銀耳進行熱水加壓提取的步驟；及(b)對所述的熱水提取物進行酶處理的步驟組成的，與傳統的提取方法相比收率顯著提高的銀耳提取物的制備方法。所述的各步驟具體說明如下。步驟(a)是在酸性條件下熱水加壓提取銀耳的步驟。銀耳(Tremella fuciformis)屬于銀耳科，夏季和秋季多生于闊葉樹腐木。成白色，如明膠的半透明狀，含有蛋白質、脂肪、碳水化合物、粗纖維、無機鹽類等，已知具有恢復疲勞、免疫增進、降血糖及抗腫瘤作用，對便秘、腹瀉、胃炎有效，此外還具有產后調理作用。本發(fā)明中銀耳具有增進記憶及神經細胞恢復作用。本發(fā)明的銀耳提取物的特征在于，在熱水提取時，在酸性條件下進行提取。本步驟中，為了使銀耳更加易于提取而使用經過微粉的銀耳。本發(fā)明中銀耳可使用干品或直接使用鮮品。為使所述的銀耳更加易于提取，可使用粉末或粉碎后使用，優(yōu)選經過微粉的銀耳。盡管粉碎時不受限制，但以使用錘式粉碎機(Hammer mill)為佳，對粒度大小不設限制，但以75至85目(mesh)為佳。本發(fā)明實施例中，在經過微粉的銀耳中加入相當于所述的銀耳的質量的40至60倍的水作為提取溶劑，調節(jié)溶劑的pH至酸性。這是為了在制備銀耳提取物時，降低銀耳中溶出的凝膠成分引起的粘性。粘性低的提取物與粘性高的提取物相比，具有溶解性及產品適用性得到提高，易于加工的優(yōu)點。盡管所述的酸性條件不受限制，但以pH 2. 5至pH 3. 5為佳，pH 2. 7至pH 3. 2更佳。盡管為調節(jié)PH可添加到所述的溶劑中的酸不受限制，但可以是枸櫞酸、冰醋酸、蘋果酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸及富馬酸等。盡管所述的熱水提取中的提取溫度不受限制，但以110°C至130°C為宜，120°C至 125°C更佳。此外，提取時間以15至25分鐘為佳，18至22分鐘更佳。
步驟(b)是所述的熱水提取物的酶處理步驟。本發(fā)明的特征在于，利用酶處理銀耳的熱水提取物，使提取物的收率提高。酶處理時，酶作用于組成銀耳子實體的多糖體，切斷它們之間的結合，從而降低銀耳提取物制備時產生的特有的粘性，減少后續(xù)制備工程中可能產生的損失，具有最終提高生產收率的作用。盡管本發(fā)明中可使用的酶不受限制，但可以是纖維素酶(cellulase)、果膠酶(pectinase)、木素降解酶(Iigniase)、葡聚糖酶(glucanase)及半纖維素酶 (hemicellulase)，以使用纖維素酶為佳。纖維素酶主要是由霉菌、細菌及原生動物產生的酶，起分解纖維素的作用。本發(fā)明中的纖維素酶切斷組成銀耳子實體的多糖體之間的結合， 降低提取物的粘性，具有提高生產收率的作用。本步驟中，所述的酶處理以在酶的最佳活性條件下處理為佳。酶的最佳活性條件是酶的作用表現出最大活性的條件，是指溫度、PH及壓力等環(huán)境。本發(fā)明中，在pH 2.5至 PH 6.0及40°C至60°C下進行所述的酶處理。此外，本發(fā)明中酶的最佳活性條件不限于特定范圍，可根據處理酶設定該酶的最佳條件。即，作為本發(fā)明中可使用的酶的最佳活性條件， 果膠酶在PH 2. 5至pH 6. 0、45°C至55°C下，木素降解酶在pH 2. 5至pH 6. 0、45°C至55°C 下，葡聚糖酶在PH 4. 5至pH 6. 0、50°C至60°C下，半纖維素酶在pH 4. 5至pH 5. 0、50°C至 60°C下具有最佳活性。特別是在本發(fā)明一實施例中，使用纖維素酶作為酶，在纖維素酶處理前，將PH設置在pH 4. 5至pH 5. 0，將溫度設置在50°C至60°C。作為用于調節(jié)所述的pH的物質，盡管不限于此，但可以選擇氧化鎂、碳酸氫鈉、碳酸鎂、沉降碳酸鈣、合成水滑石、硅酸鋁鎂、偏硅酸鋁鎂、硅酸鎂、合成硅酸鋁、無水磷酸氫鈣、磷酸氫鈣、干燥氫氧化鋁凝膠、氫氧化鎂、氫氧化鋁鎂、氫氧化鋁凝膠、氫氧化鋁-碳酸氫鈉共浸生成物、氫氧化鋁-碳酸鎂混合物干燥凝膠、氫氧化鋁-碳酸鎂-碳酸鈣共浸生成物、金烏鰂骨、石決明及氨基乙酸中的一者使用。本發(fā)明一實施例中為進行pH調節(jié)使用碳酸氫鈉。本步驟中盡管酶處理不限于此，但以處理10小時至15小時，優(yōu)選12小時至14小時為佳。此外，本發(fā)明可以包含使所述的步驟(b)中處理的酶失活的步驟。本發(fā)明中為提高收率進行的酶處理，如上所述僅進行一定時間，并在此后使酶失活。這是為了消除可能因酶引起的副作用的過程，酶因熱發(fā)生變性而失活，因此以加熱使其失活為佳。本發(fā)明一實施例中，為使纖維素酶失活，在100°C下加熱10分鐘。本發(fā)明中，在制備所述的銀耳提取物之后，還可以包含去除不溶性的銀耳殘留物的過程。在去除銀耳殘留物時經過使用凝聚劑使殘留物沉降的過程，“凝聚劑”是指用于使懸浮在液體中的幾個固體顆粒聚集形成略大的塊而添加在液體中的藥品。凝聚后液體中的顆粒通常其沉降速度加快，因此其用于促進漂浮物的沉降?？捎米魉龅哪蹌┑奈镔|不受限制，可以使用聚合氯化鋁、硫酸鋁、藻酸鈉、聚合硫基硅酸鋁、聚合羥基氯化硅酸鋁、硫酸亞鐵、氯化亞鐵(液體)、聚胺、聚合羥基氯化硫酸鋁、硅藻土或沸石，以使用硅藻土或沸石為佳。本發(fā)明一實施例中，使用硅藻土使銀耳的殘留物沉降，使過濾更加容易。此外，本發(fā)明中添加凝聚物質使銀耳的殘留物沉降后，還包括了利用壓濾機將其過濾的過程。此外，本發(fā)明中為了使依照所述的制備方法制備的銀耳提取物更加易于使用，還可以包含將其濃縮的過程。濃縮時，盡管不限于此，可以使用連續(xù)式濃縮器。此外，本發(fā)明中還涉及依照所述的制備方法制備的銀耳提取物。本發(fā)明中的銀耳提取物可以直接使用，也可以根據需要干燥使用。所述的干燥時，盡管不限于此，但可以使用冷凍干燥法或熱風干燥法，并且在熱風干燥時，可添加業(yè)界公知的賦形劑。此外，本發(fā)明中還涉及包含所述的銀耳提取物的記憶增進用食品組合物?！坝洃浽鲞M”是指促進老化引起的阿爾茨海默病或其它內因、外因因素引起的受損神經細胞的活性，提高記憶力。本發(fā)明中的記憶增進是指，可以通過抑制神經細胞的損傷及恢復受損神經細胞實現的，神經生長因子的作用。已知本發(fā)明的銀耳提取物，是誘導神經生長因子的合成，或起與其相似作用的，帶有神經生長活性的物質。所述的本發(fā)明的食品組合物，包括了功能性食品(functional food)、營養(yǎng)補充劑 (nutritional supplement)、健康食品(health food)及食品添力口劑(food additives)等所有形態(tài)。所述的有形的食品組合物，可通過業(yè)界公知的普通方法制成多種形態(tài)。舉例來說， 作為健康食品，盡管不限于此，可將銀耳提取物液體化、顆?；?、膠囊化及粉末化后攝取，制成茶、果汁及飲料形態(tài)飲用。此外，可將銀耳提取物與已知具有神經細胞恢復、神經細胞損傷抑制及記憶增進作用的公知的活性成分一同混合，制成組合物形態(tài)。此外，作為功能性食品，盡管不限于此，可添加銀耳提取物制造飲料(含酒精飲料)、水果及其加工食品(如水果罐頭、果醬等)、魚類、肉類及其加工食品(如火腿等)、面包類及面類(如烏冬面、蕎麥面、方便面、意大利面、通心粉等)、果汁、各種飲料、餅干、飴糖、乳制品(如黃油、奶酪等)、 使用植物油脂、人造奶油、植物性蛋白、冷凍食品、各種調味料(如黃醬、醬油、沙司等)等。 此外，為了以食品添加劑的形態(tài)使用銀耳提取物，可制成粉末或濃縮液形態(tài)使用。本發(fā)明的食品組合物中，銀耳提取物的優(yōu)選的含量不限于此，但添加量通常在最終制成食品中占到0. 1至5重量％。本發(fā)明提取物的含量以健康及衛(wèi)生為目的，或者以調節(jié)健康為目的，在長時間攝取的情況下，可以在所述的范圍以下，有效成分在安全性方面不存在任何問題，因此確定也可以使用所述的范圍以上的量。此外，含有本發(fā)明的銀耳提取物作為有效成分的食品組合物，已知尤其具有神經細胞恢復、神經細胞損傷抑制及增進記憶的作用，能夠與活性成分一同混合，制成健康食品形態(tài)。此外，本發(fā)明中涉及包含所述的銀耳提取物的記憶力障礙疾病預防及治療用藥學組合物。本發(fā)明中的記憶力障礙疾病，是指表現出記憶力低下或減退癥狀的疾病。例如， 所述的疾病可以包括阿爾茨海默病(Alzheimer' s disease)、癡呆(dementia)、健忘癥 (amnesia)、輕度認知障礙、亨廷頓氏病及帕金森病。本發(fā)明中的藥學組合物，可以單獨含有本發(fā)明的組合物，或者還可以另外含有一種以上的藥學上容許的載體、賦形劑或稀釋劑。上述的“藥學上容許”是指生理學容許，并且在給予人體時通常不引起過敏反應或與其類似的反應的組合物。本發(fā)明中的記憶增進用藥學組合物能夠以任意方法給予哺乳動物。例如，可通過經口或非經口方式給藥。非經口給藥方法盡管不限于此，但可以是經皮給藥、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射或腹腔注射。本發(fā)明藥學組合物如上所述，可根據給藥途徑制劑化，制成經口給藥用或非經口給藥用制劑。在經口給藥制劑的情況下，本發(fā)明的組合物可利用業(yè)界公知的方法劑型化，制成粉末、顆粒、片劑、丸劑、糖衣片劑、膠囊劑、液劑、凝膠劑、糖漿劑、糊劑、懸濁液等。例如，口服制劑可將活性成分與固體賦形劑混合，之后將其粉碎，添加適宜的輔料，之后加工成顆?；旌衔?，從而得到片劑或糖衣片劑。適宜的賦形劑例如可以包括包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、 山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇及麥芽糖醇等的糖類，包含玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉及土豆淀粉等的淀粉類，包含纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及羥丙甲纖維素等的纖維素類，如明膠、聚乙烯吡咯烷酮等的填充劑。此外，還可以根據情況添加交聯聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂、藻酸或藻酸鈉等崩解劑。另外，本發(fā)明藥學組合物中，還可以額外包含抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑及防腐劑等。在非經口給藥用制劑的情況下，可利用業(yè)界公知的方法劑型化，制成注射劑、乳劑，洗劑，外用軟膏劑、油劑、保濕劑、凝膠劑、氣溶膠及鼻腔吸入劑的形態(tài)。上述劑型記錄在所有制藥化學中普遍公知的處方文獻(Remington，s Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87 : Blaug, Seymour)中。本發(fā)明的組合物的總有效量可以單一劑量(single dose)給予患者，也可以通過以多次給藥(multiple dose)方式長時間給藥的分步治療法(fractionated treatment protocol)給予患者。本發(fā)明藥學組合物根據記憶增進程度的需要，可以改變有效成分的含量。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的體積容量，以每日患者體重每kg約0. 01 μ g至1，OOOmg為佳，以0. 1 μ g至IOOmg為最佳。然而所述的組合物的濃度，不僅要考慮到藥學組合物的給藥途徑和治療次數，還要考慮到患者的年齡、體重、健康狀態(tài)、性別、疾病重癥度、飲食及排泄率等多種因素，以確定患者的有效給藥量，因此在考慮上述幾點時，具有該領域普通知識的技術人員，可根據所述的組合物作為記憶增進劑的特定用途，決定合適的有效給藥量。本發(fā)明中的藥學組合物并不特別受限于表現本發(fā)明的作用的劑型、給藥途徑及給藥方法。因此，本發(fā)明中的銀耳提取物可用于使記憶力得到增強，或者記憶力障礙疾病的預防或治療中。即，含有本發(fā)明中的銀耳提取物的組合物，可用于增強正常人的記憶力或者預防記憶力障礙疾病，也可以用于具有記憶力障礙疾病的患者的治療。所述的銀耳提取物是對人體幾乎不表現出毒性，非常安全的物質，因此可制成藥學組合物或食品組合物等形態(tài)。有益效果如上所述，本發(fā)明中，涉及使用酶的銀耳提取物的制備方法，及包含它的記憶增進用組合物，具體地說，涉及通過酶處理使收率得到提高的銀耳提取物的制備方法，及包含它的神經細胞恢復、抑制神經細胞損傷及記憶增進用食品組合物及藥學組合物。


圖1所示為本發(fā)明的銀耳提取物的制備過程的一實施例。圖2所示為以PCia1細胞株的神經軸突的生長程度示意的本發(fā)明的銀耳提取物的神經生長活性作用，圖2(A)所示為對照組，圖2(B)所示為神經生長因子處理組，圖2(C)所示為本發(fā)明的銀耳提取物處理組，圖2(D)所示為現有方法的銀耳提取物處理組。
具體實施例方式以下參照實施例對本發(fā)明進行詳細說明。但，以下實施例僅用于揭示本發(fā)明，本發(fā)明的內容并不限于以下實施例。<實施例1>通過纖維素酶的處理制備銀耳提取物將銀耳40kg細致粉碎，添加相當于銀耳質量50倍的水。在其中添加4kg的枸櫞酸，使PH達到3.0，之后升高溫度，在121°C下進行20分鐘的提取。在其中加入碳酸鉀^g， 使PH達到4. 5至5. 0。降低提取液的溫度至55°C，加入纖維素酶4kg，攪拌12hr以上，同時進行酶反應。之后為使酶失活，以100°C再加熱10分鐘。為了去除提取物內的不溶性物質， 加入硅藻土，以壓濾機(韓國過濾器(株))過濾，之后在連續(xù)式濃縮器(韓特(株))中濃縮至8糖度。確認將其冷凍干燥得到的銀耳提取物的含量。所述的過程如圖1所示。另外，為了比較所述的提取方法和收率，還通過傳統的熱水提取方法制備出銀耳提取物，確認了提取物的制備收率。將40kg的銀耳細致粉碎，添加相當于銀耳質量50倍的水，在90至100°C下進行熱水提取。之后過濾去除銀耳殘留物，之后將其濃縮。之后確認了通過冷凍干燥得到的銀耳提取物的含量。其結果如表1所示，使用傳統的熱水提取方法的銀耳提取物的收率僅為約5%，使用本發(fā)明的提取方法的收率約為81. 5%，可知收率提高了 15倍以上。表1
提取方法生產收率(以固形份為準)酶處理熱水提取方法(本發(fā)明)81. 5%熱水提取方法5%<實施例2>神經細胞分化促進作用(Neuritogenic Effect)測定將所述的實施例1中制備的本發(fā)明銀耳提取物(銀耳提取物1)和依照傳統提取方法制備的銀耳提取物(銀耳提取物2、粗制成1 μ g/mL的濃度，對未分化的PCl^1細胞 (subclone of PC12 cells isolated by Dr. Hatanaka，Rat)進行處理，在 37°C、5% C02 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后利用0. 戊二醛(glutaraldehyde)溶液固定細胞，利用影響分析儀(Image analyzer) (Leica,Germany)測定延伸的神經細胞突起的長度。各實驗組任意選定五部分，依次測定該部位中最長的10個神經細胞突起。測得的神經突起的長度通過 ANOVA test 禾口 T-test (Yamazaki et al. ；Biol. Pharm. Bull. ；vol. 19 ；page 791—795; 1996)驗證其有義性。其結果如表2所示，作為對照組使用的PBS處理組的平均神經突起長度為 95. 38士5. 08μπι，本發(fā)明的銀耳提取物(銀耳提取物1)處理組中的平均神經突起的長度為 107士3. 63 μ m,與對照組PBS處理組進行比較時，表現出有意義的高神經生長活性作用，確認了類似于以傳統方法制備的銀耳提取物(銀耳提取物幻的水平。由此可以確認，通過本發(fā)明能夠以高收率制備神經生長活性作用優(yōu)秀的銀耳提取物。所述的實驗結果在表2中一
并不意。表2
權利要求
1.一種銀耳提取物的制備方法，其特征在于包括(a)在酸性條件下對銀耳進行加壓熱水提取的步驟；及(b)對所述(a)步驟的熱水提取物進行酶處理的步驟。
2.根據權利要求1所述的銀耳提取物的制備方法，其特征在于所述的酸性條件為PH 2. 5 至 pH 3. 5。
3.根據權利要求1所述的銀耳提取物的制備方法，其特征在于所述的熱水提取時的溫度為110°C至130°C。
4.根據權利要求1所述的銀耳提取物的制備方法，其特征在于所述的酶選自由纖維素酶、果膠酶、木素降解酶、葡聚糖酶及半纖維素酶組成的群。
5.根據權利要求1所述的銀耳提取物的制備方法，其特征在于所述的酶處理在PH 2. 5至pH 6. 0及40°C至60°C下進行處理。
6.根據權利要求1至5之一的制備方法制備的銀耳提取物。
7.含有根據權利要求6所述的銀耳提取物作為有效成分的記憶增進用食品組合物。
8.含有根據權利要求6所述的銀耳提取物作為有效成分的記憶力障礙疾病預防及治療用藥學組合物。
9.根據權利要求8所述的記憶力障礙疾病預防及治療用藥學組合物，其特征在于 所述的疾病包括選自阿爾茨海默病(Alzheimer' s disease)、癡呆(dementia)、健忘癥 (amnesia)、輕度認知障礙(mild cognitive impairment)、亨廷頓氏病及帕金森病組成的
全文摘要
本發(fā)明涉及使用酶的銀耳提取物的制備方法及包含它的記憶增進用組合物，具體地說，涉及通過酶處理使制備收率得到提高的銀耳提取物的制備方法及包含它的神經細胞恢復、神經細胞損傷抑制及記憶增進用食品組合物及藥學組合物。
文檔編號A61P25/14GK102397301SQ201110247120
公開日2012年4月4日 申請日期2011年8月24日 優(yōu)先權日2010年9月13日
發(fā)明者南承佑, 呂翼鉉, 姜正一, 崔雄基, 樸金珠, 金泰碩 申請人:圃美多健康食品有限公司, 圃美多控股有限公司