專利名稱：一種沉默小鼠seps1基因的siRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種siRNA，具體而言涉及一種抑制s印Si基因表達(dá)的siRNA及其制備方法。
背景技術(shù)：
RNA 干擾(RNAinterference, RNAi)是由小干擾 RNA(smallinterferingRNAs，siRNAs)引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing, PTGS),廣泛存在于生物體中。RNA干擾技術(shù)可用于基因功能研究及生物遺傳改良等多方面用途。自2001年Tuschl等證明合成的雙鏈siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可實(shí)現(xiàn)靶基因特異沉默作用后，siRNA因其特異性、高效性以及作為基因治療藥物的巨大潛力而備受青睞。作為基因治療工具，siRNA與傳統(tǒng)反義藥物相比更加具有高效、特異等優(yōu)勢(shì)。此外，siRNA還可進(jìn)行多元化改造，如可以通過與細(xì)胞特異性啟動(dòng)子及可誘導(dǎo)系統(tǒng)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)組織特異性基因沉默，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。研究表明RNAi技術(shù)可大大縮短從鑒定靶基因到認(rèn)識(shí)其功能的時(shí)間，促進(jìn)了在藥物發(fā)現(xiàn)過程中對(duì)已知靶基因功能的高通量分析，還加快了對(duì)藥物特異性及其作用機(jī)制的評(píng)估，以便較快地篩選出候選藥物分子。siRNA的有效性和優(yōu)勢(shì)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥、代謝疾病(肥胖癥，高膽固醇血癥)、腫瘤、感染性疾病等的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)中已得到初步證實(shí)。siRNA技術(shù)是在不破壞或不引起遺傳物質(zhì)改變的情況下對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制的，因此可更完整地闡明該基因的功能。更重要的是，在人類疾病的治療方面，siRNA可與靶基因序列之間產(chǎn)生特異性結(jié)合，發(fā)揮最佳的治療效果，而且也 不會(huì)產(chǎn)生明顯的不良副作用?？梢灶A(yù)見，一旦siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性、有效性、靶向性等瓶頸問題得到解決，RNAi技術(shù)在臨床的應(yīng)用必將產(chǎn)生質(zhì)的飛躍。人類sepsl基因位于染色體15q26.3,包含6個(gè)外顯子，編碼一個(gè)有189個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。15號(hào)染色體的這個(gè)區(qū)域以前被認(rèn)為包含影響炎性疾病的數(shù)量性狀遺傳位點(diǎn)(quantitative trait loci QTLs),這些炎性疾病包括胰島素依賴型糖尿病,Alzheimer’ s病和腹部疾病。這樣，SEPSl有可能是炎癥相關(guān)疾病多樣性的功能因素和位置因素。近來的研究結(jié)果顯示SEPSl與炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生存在直接的聯(lián)系，可能在炎癥介導(dǎo)的疾病以及一些其他的免疫異常中起主要作用。許多常見疾病的發(fā)生機(jī)制都包含了免疫系統(tǒng)的激活，例如糖尿病，腫瘤和心血管疾病。新近的研究顯示炎癥反應(yīng)持續(xù)作用的結(jié)果是導(dǎo)致這些疾病的發(fā)生。細(xì)胞暴露于應(yīng)激條件下會(huì)激活免疫，由此導(dǎo)致循環(huán)中促炎癥因子水平升高，這與Selenoprotein SI (sepsl)基因下調(diào)相關(guān)。SEPSl在保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能完整性以抵御潛在的代謝應(yīng)激中的重要作用是最近才明確的。SEPSI被分類為一個(gè)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，參與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向溶酶體的清除，在溶酶體中通過蛋白酶體進(jìn)行遍蛋白化和降解。SEPSl也調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡并保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)免受氧化應(yīng)激的有害作用。功能受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)這些副作用的反應(yīng)是誘使一些基因表達(dá)，這將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF- κ B的活化。活化的NF- κ B進(jìn)入細(xì)胞核，激活那些編碼促炎性細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。sepsl在2002年被識(shí)別，Northern blot分析顯示sepslmRNA表達(dá)于肝臟，骨骼肌，脂肪組織，下丘腦，睪丸，心臟和腎臟。sepsl在3個(gè)主要胰島素靶組織中高表達(dá):肝臟，脂肪，和骨骼肌，提示其在調(diào)解胰島素活性和/或糖代謝中的可能作用。通過細(xì)胞裂解和免疫組織化學(xué)研究，Gao等人定位SEPSl蛋白在人類肝細(xì)胞的細(xì)胞膜和微粒體上。培養(yǎng)的肝腫瘤細(xì)胞中sepsl基因表達(dá)的過度會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，包括葡萄糖攝取下降，糖原合成減少，以及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)胰島素依賴性降低的弱化。慢性炎癥在許多常見疾病中都有病理作用并且受基因和環(huán)境因素的雙重影響。炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，促炎因子的高分泌或者是抗炎分子的減少這些進(jìn)化中的有利面，會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥狀態(tài)，例如肥胖，II型糖尿病和心血管疾病，給現(xiàn)代社會(huì)增加負(fù)擔(dān)。然而，上調(diào)sepsl基因可能是解決這些疾病的新希望。膿毒癥是最古老的疾病之一，近50年來發(fā)病率及病死率逐漸升高，有報(bào)道1979年 1999年間患病率增加了 300%，目前全世界每天約有1400人死于本癥。革蘭無關(guān)(G-)菌感染是引起膿毒癥的重要原因之一，G-菌外膜的活性成分內(nèi)毒素(endotoxin)即脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)與巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞膜上相應(yīng)受體作用后，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，最終激活核轉(zhuǎn)錄因子-KB(nuclear factor κ B, NF-κ B)，引起多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)(TNF、IL-1 β、IL-6等)的表達(dá)和釋放，導(dǎo)致血管通透性增加、體液滲出和淋巴細(xì)胞移行到炎癥部位。機(jī)體的這種防御反應(yīng)有利于清除病原菌，但如反應(yīng)過度，則會(huì)引發(fā)“炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)”或伴有免疫功能的嚴(yán)重抑制，即全身炎癥反應(yīng)綜合癥或代償性抗炎反應(yīng)綜合癥(compensatory ant1-1nflammatory reaction syndrome, CARS),表現(xiàn)為胺毒癥，膿毒性休克甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。由于sepsl基因?qū)Υ傺滓蜃哟嬖谥匾{(diào)控作用，因此本發(fā)明針對(duì)sepsl基因序列設(shè)計(jì)出2對(duì)siRNA，并經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)設(shè)計(jì)的siRNA對(duì)sepsl基因的沉默效果，結(jié)果顯示本發(fā)明設(shè)計(jì)的siRNAl能有效抑制s印Si基因的表達(dá)
發(fā)明內(nèi)容
`本發(fā)明設(shè)計(jì)了 2對(duì)沉默小鼠sepsl基因的siRNA序列，同時(shí)設(shè)計(jì)了 I對(duì)無關(guān)對(duì)照SiRNA0本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:應(yīng)用 http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx 及GENEBANK等免費(fèi)網(wǎng)絡(luò)資源，經(jīng)過篩選，設(shè)計(jì)三對(duì)siRNA。siRNAl和siRNA2都具有靶向s印si基因的功能，siRNA3為無關(guān)對(duì)照。siRNAl，正義鏈序列為 SEQ ID N0.1:5’ > AACAGGAAGGCCTCAGGAAGACCTGTCTC < 3’ ；反義鏈序列為SEQ ID N0.2:5’ > AATCTTCCTGAGGCCTTCCTGCCTGTCTC < 3’。siRNA2，正義鏈序列為 SEQ ID N0.3:5’ > AAGTTTGAGAATGCAGGAAGACCTGTCTC < 3’反義鏈序列為SEQ ID N0.4:5’ > AATCTTCCTGCATTCTCAAACCCTGTCTC < 3’siRNA3，正義鏈序列為 SEQ ID N0.5:
5’ > AACATCGCAGAGCTCGACAGCCCTGTCTC < 3’siRNA3,反義鏈序列為 SEQ ID N0.6:5’ > AAGCTGTCGAGCTCTGCGATGCCTGTCTC < 3’本發(fā)明公開了一種干擾小鼠sepsl基因的表達(dá)的試劑盒的組分，還公開了一種沉默小鼠sepsl基因的siRNA使用方法，所述使用方法包括以下步驟:I) siRNA的溶解:特異性靶向序列siRNAl及兩組對(duì)照siRNA2和siRNA3的正反義鏈各 40D (132 μ g),分別加入 132 μ I RNase Free water 稀釋溶解。2) siRNA退火復(fù)合:特異性靶向序列siRNAl及兩組對(duì)照siRNA2和siRNA3的正反義鏈各自等比例混合，100°c煮沸5min，逐漸自然冷卻至室溫。3)雙鏈siRNA的脂質(zhì)體包被:siRNAl雙鏈、siRNA2雙鏈、siRNA3雙鏈分別與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000輕柔緩慢地混合均勻，使用比例為I μ I Lipofectamine 2000:
0.5 μ gRNA。4)將上一步得到的siRNAl脂質(zhì)體復(fù)合物、兩組對(duì)照序列siRNA2和siRNA3脂質(zhì)體復(fù)合物分別加入生理鹽水稀釋，并將其分別注射到不同組實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)，每只動(dòng)物尾靜脈注射 10μ gRNA，共 0.3ml。本發(fā)明按照上述方法，進(jìn)行了小鼠體內(nèi)sepsl基因沉默實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示本發(fā)明設(shè)計(jì)的siRNAl靶向干擾小鼠sepsl基因的表達(dá)效果最好。siRNA進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞，雙鏈解開后反義鏈siRNA可和相應(yīng)蛋 白質(zhì)結(jié)合形成活化的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA inducedxilenceing complex, RISC), RISC進(jìn)而識(shí)別和其中siRNA具有完全互補(bǔ)序列的mRNA,特異地降解sepsl基因。本發(fā)明涉及的三組siRNA既可用于體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染，也可用于動(dòng)物注射構(gòu)建靶向抑制sepsl基因表達(dá)的動(dòng)物模型。注射方法上，為避免常用肝臟高壓注射可能帶來的潛在的臟器損傷，本發(fā)明采用小鼠尾靜脈注射方法。本發(fā)明的有益效果:siRNAl與siRNA2通過脂質(zhì)體包裝的方法對(duì)膿毒癥小鼠進(jìn)行尾靜脈注射，均可在注射后觀察到小鼠肝組織及肺組織蛋白水平的顯著下降。


圖1為s印si基因被干擾后膿毒癥小鼠肝組織SEPSl的蛋白表達(dá)。ACTIN為內(nèi)參對(duì)照。N組為膿毒癥組動(dòng)物注射無關(guān)對(duì)照siRNA3后所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6)，B組為膿毒癥組動(dòng)物注射同源對(duì)照siRNA2后所取樣本(siRNA序列為SEQID N0.3及SEQ ID N0.4)，A組為膿毒癥組動(dòng)物被注射siRNAl后所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.1 及 SEQ ID N0.2)。圖2為石蠟切片免疫組化檢測(cè)siRNA干擾膿毒癥小鼠12h及24h肝組織SEPSl蛋白表達(dá)。研究結(jié)果顯示棕黃色為SEPSl蛋白表達(dá)陽性部位。N組為膿毒癥組動(dòng)物注射無關(guān)對(duì)照siRNA3后所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6)，B組為膿毒癥組動(dòng)物注射同源對(duì)照siRNA2后所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.3及SEQ ID N0.4)，A組為膿毒癥組動(dòng)物被注射siRNAl后所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2)。圖3為石蠟切片免疫組化檢測(cè)siRNA干擾膿毒癥小鼠12h及24h肺組織SEPSl蛋白表達(dá)。研究結(jié)果顯示棕黃色為SEPSl蛋白表達(dá)陽性部位。N組為膿毒癥組動(dòng)物注射無關(guān)對(duì)照siRNA3后所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6)，B組為膿毒癥組動(dòng)物注射同源對(duì)照siRNA2后所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.3及SEQ ID N0.4)，A組為膿毒癥組動(dòng)物被注射siRNAl后所取樣本(siRNA序列為SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種沉默小鼠s印Si基因的siRNA的構(gòu)建在 http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx 網(wǎng)站提取從GENEBANK獲得s印si的全序列，并選擇起始核苷酸種類，GC含量范圍最后進(jìn)行blast比對(duì)。由此得到的候選序列再根據(jù)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步篩選合適的siRNA序列。較小的空間位阻和較為松散的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以使siRNA更容易與靶mRNA結(jié)合，是保證產(chǎn)生較強(qiáng)基因沉默效應(yīng)的關(guān)鍵。與siRNA對(duì)應(yīng)的mRNA靶序列形成復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的難易程度可由氫鍵系數(shù)進(jìn)行評(píng)定。氫鍵系數(shù)可由以下公式計(jì)算。
權(quán)利要求
1.一種沉默小鼠S印Si基因的siRNAl，其特征在于，SiRNAl其正義鏈序列為SEQ IDN0.1，反義鏈序列為SEQ ID N0.2。
2.—種干擾sepsl表達(dá)的試劑盒,包括權(quán)利要求1所述的siRNAl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，還包括無關(guān)對(duì)照序列siRNA3，所述的無關(guān)對(duì)照序列siRNA3其正義鏈序列為SEQ ID N0.5，反義鏈序列為SEQ ID N0.6。
4.一種小鼠s印Si基因沉默的方法，包括以下步驟: DsiRNA的溶解:將權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的siRNAl的正反義鏈各40D (132 μ g)，分別加入132 μ I RNase Free Water稀釋溶解，并將權(quán)利要求3所述的對(duì)照序列siRNA3的正反義鏈各40D (132 μ g)，分別加入132 μ I 無菌注射用水稀釋溶解。
2)siRNA退火復(fù)合:將權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的siRNAl正反義鏈各40D(132yg)等比例混合，同時(shí)將權(quán)利要求3中所述的對(duì)照序列siRNA3的正反義鏈等比例混合，100°C煮沸5min，逐漸自然冷卻至室溫，得到雙鏈siRNA。
3)雙鏈siRNA的脂質(zhì)體包被:將上一步制備的雙鏈siRNA分別與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000輕柔緩慢地混合均勻，使用比例為I μ I Lipofectamine 2000:0.5 μ gRNA。
4)將上一步得到的siRNAl脂質(zhì)體復(fù)合物和無關(guān)對(duì)照序列siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物分別加入生理鹽水稀釋，并將其分別注射到不同組實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)，每只動(dòng)物尾靜脈注射10μ gRNA，共 0.3ml ο
5.權(quán)利要求1所述的siRNAl或權(quán)利要求2-3中任意一項(xiàng)所述的試劑盒在制備沉默s印Si基因藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種沉默小鼠seps1基因的siRNA序列，及其使用方法。通過siRNA與脂質(zhì)體混合對(duì)膿毒癥小鼠進(jìn)行尾靜脈注射，可有效降低SEPS1蛋白在膿毒癥小鼠肝臟及肺組織中的表達(dá)水平。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103146705SQ20131009362
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者康紅軍 申請(qǐng)人:康紅軍