Ctrp4蛋白質作為制備治療炎癥性疾病或自身免疫性疾病的藥物的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CTRP4蛋白質作為制備治療炎癥性疾病或自身免疫性疾病的藥物的應用。本發(fā)明的上述應用可以制備有效地治療炎癥性疾病或自身免疫性疾病的藥物。
【專利說明】CTRP4蛋白質作為制備治療炎癥性疾病或自身免疫性疾病 的藥物的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及人類CTRP4蛋白質的新應用,具體地本發(fā)明涉及CTRP4蛋白質作為制 備治療炎癥性疾病或自身免疫性疾病的藥物的應用。
【背景技術】
[0002] 本案 申請人:于2010年7月16日向中國專利局提交了發(fā)明名稱為"人類CTRP4基 因、其編碼的蛋白質及它們的應用"的發(fā)明專利申請,該申請于2012年2月1日公開,公開 號為CN102337268A。該專利申請公開了人類CTRP4基因、其編碼的蛋白質及它們的一部分 應用。
[0003] 本案發(fā)明人基于此,對CTRP4蛋白質的應用進行進一步研究。尤其?深入研究其 作為制備治療炎癥性疾病和自身免疫性疾病的藥物的應用。
[0004] LPS是革蘭氏陰性細菌外壁層特有的化學成分,主要有類脂A、核心多糖和0-抗 原三部分組成。機體固有免疫系統(tǒng)對LPS的識別具有兩套不同的反應體系,細胞膜表面模 式識別受體TLR4/MD2復合物可特異性識別被LPS結合蛋白(LPS binding protein,LBP) 和⑶14轉運至細胞膜表面的LPS,并向胞內傳遞跨膜信號,通過依賴MyD88和非依賴MyD88 途徑活化下游NFk B、MAPK和JNK等信號通路,產(chǎn)生固有免疫應答;體液固有免疫分支中 具有糖識別結構域的可溶性模式識別分子,如補體Clq、collectins (MBL、SP-A、SP-D)、 pentraxins (CRP、SAP、PTX3)和ficlins等,也可以有效識別并結合LPS,防止LPS繼續(xù)擴散 誘發(fā)LPS毒性并介導LPS的清除。
[0005] 內毒素休克(endotoxic shock)是由短時間大量LPS誘發(fā)嚴重的內毒素血癥所 致,給予足量的液體復蘇仍無法糾正持續(xù)性低血壓,并伴有器官低灌流狀態(tài)和血管微循環(huán) 障礙(DIC),最終大多死于多器官功能衰竭(multiple organ failure, M0F)。盡管現(xiàn)在的 抗生素治療和生命體征支持療法都得到長足的發(fā)展,但是內毒素血癥一旦發(fā)展為內毒素性 休克,死亡率還是高達20%?80%。大量文獻報道,固有免疫應答過強和后繼的適應性免疫 應答下降分別是內毒素性休克早期和晚期死亡的主要原因。而早期固有免疫應答過程開始 于機體模式識別受體與病原體的識別后誘發(fā)的級聯(lián)炎癥反應。
[0006] 補體成分在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著舉足輕重的作用?,F(xiàn)已知有三條不同的補體活 化途徑:經(jīng)典活化途徑、旁路活化途徑和凝集素活化途徑,涉及30多種蛋白質分子。Clq是 補體經(jīng)典活化途徑中的第一個成員,是由A、B和C三個亞基組成的異源18聚體。每個亞基 都是由N-端信號肽、可變區(qū)、膠原樣結構域(活化補體成分Clr等)和C-端C1Q球狀結構 域(識別免疫復合體等)組成。研究發(fā)現(xiàn),除了免疫復合物之外,C1Q球狀結構域還可以識別 許多其他性質的配體,如聚集的IgG、IgM、HIV-l中gp21多肽、β-淀粉樣蛋白、細菌細胞壁 成分LPS、凋亡細胞和急性時相反應蛋白等。由于C1Q球狀結構域的廣譜的配體識別域,補 體Clq分子表現(xiàn)出廣泛而多樣化的免疫調節(jié)功能,除了結合免疫復合體活化補體經(jīng)典途徑 之外,還具有調節(jié)凋亡細胞清除誘導免疫耐受、中和病毒、局限并清除細菌、介導吞噬和細 胞之間的粘附等[3CH32]。現(xiàn)有研究證實,補體Clq分子可直接與LPS結合,并可在多種細胞 中調節(jié)LPS誘導的細胞因子分泌。CTRPs超家族成員分子均具有C1Q球狀結構域,目前雖沒 有具體數(shù)據(jù)證明該家族中C1Q球狀結構域與LPS之間的相互作用,但是作為該家族分子的 種內同源分子脂聯(lián)素可通過其C1Q球狀結構域與LPS發(fā)生明顯的相互作用,并可體外抑制 LPS誘導的NF-κ B活化及細胞因子分泌,另外,CTRP3雖然不能直接和LPS結合,但可能與 LPS特異性受體復合物TLR4/MD2發(fā)生相互作用,阻斷LPS與TLR4/MD2的有效結合,發(fā)揮抵 抗LPS的生物學活性。
[0007] 現(xiàn)有技術已經(jīng)公開的CTRP4是具有兩個C1Q球狀結構域CTRPs超家族成員,其C1Q 球狀結構域與補體Clq分子高度同源。因此,為了深入探討CTRP4在固有免疫系統(tǒng)中的生 物學功能,我們將CTRP4與LPS之間的關系作為研究重點,以期發(fā)現(xiàn)CTRP4在固有免疫應答 中可能發(fā)揮的作用。
[0008] 炎癥是機體對損傷因子、因素產(chǎn)生的應激和防御反應。任何對機體有害的因素都 可以誘發(fā)炎癥反應,如生物及理化因素引起的感染,組織與細胞損傷等。炎癥反應是把雙刃 劍,適度的炎癥反應對機體清除病原感染,組織修復以及穩(wěn)態(tài)的維持具有積極意義,但是過 度的或者持續(xù)不可控的慢性炎癥反應會對機體造成嚴重的損害甚至危及生命,例如炎癥性 腸病和SARS。炎癥反應是多細胞和多因子共同參與的反應,其中,吞噬細胞是啟動炎癥反 應的重要細胞。吞噬細胞表面表達多種模式識別受體(甘露糖受體,葡聚糖受體,Toll樣受 體),能迅速識別入侵的外源性生物及內源性損傷信號,產(chǎn)生和釋放大量促炎細胞因子,例 如IL-6, TNF-α,IL-1 β,IL-8等,這些炎癥性細胞因子發(fā)揮多種功能,包括致炎,致熱,趨 化炎性細胞,激活適應性免疫細胞等作用。單核巨噬細胞、中性粒細胞、ΝΚ細胞、Τ細胞、Β 細胞,上皮細胞等都參與炎癥反應。因此,炎癥是多細胞多因素參與的復雜過程,在研究炎 癥的過程中利用動物模型能夠更好的模擬炎癥的真實性。
[0009] 轉基因小鼠是指通過實驗方法將特定外源基因導入早期胚胎細胞并整合至染色 體上,通過生殖細胞傳遞到子代,從而得到的小鼠。1980年Goden博士在實驗室通過把重組 基因注射到小鼠的受精卵中,獲得了第一只轉基因小鼠,這一技術為研究哺乳動物基因在 體內的表達調空功能創(chuàng)造了一個非常有力的手段。1982年,Palmiter,R. D等人把金屬硫蛋 白I的基因和大鼠的生長激素基因融合后,同樣應用顯微注射的方式注入到小鼠的受精卵 原核中,發(fā)現(xiàn)21只存活的小鼠中有6只體重大于同窩的小鼠,而這些轉基因動物的血清中 生長激素和肝臟中的融合基因的表達水平都是升高的,這一研究結果又使轉基因技術前進 了一步,提供了融合基因的轉基因方法,為研究遺傳性疾病的治療提供了良好的開端。1988 年之后,這種把外源性基因轉入到受精卵并且在機體內成功表達的模型已經(jīng)達到了空前的 規(guī)模,應用范圍擴展到了各種基因的功能研究,免疫系統(tǒng),哺乳系統(tǒng)的發(fā)育等各個環(huán)節(jié)。例 如,使用肺臟組織特異性的啟動子高表達IL-9時,IL-9轉基因小鼠出現(xiàn)了自發(fā)性肺部炎癥 反應;應用轉基因技術研究人類慢性乙型肝炎已相當普遍。
[0010] 近些年來,我們國家對于炎癥性腸?。↖BD=inflammatory bowel disease)的重視 程度在上升,而從世界范圍來看,我們對于炎癥性腸病的認識也因為免疫學的發(fā)展和對腸 道內菌群研究的深入得到了很大的發(fā)展?,F(xiàn)在關于炎癥性腸病的病因學研究認為,是因為 多種因素導致的,包括遺傳因素,環(huán)境因素,免疫系統(tǒng)的紊亂,還有腸道菌群的問題。
[0011] 另外,肺炎也是一種危害很大的炎癥性疾病,包括細菌性肺炎和病毒感染引起的 肺炎或者急性嚴重肺損傷。因此期待本發(fā)明的CTRP4蛋白質能夠在肺炎的治療中發(fā)揮有效 的作用。
[0012] 葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠急性結腸炎模型,是通過在飲用水中加入DSS幾 天,誘導出以血便,潰瘍,炎癥細胞浸潤,體重減輕,腹瀉等為特點的急性結腸炎,這種化學 藥物是以其對基底隱窩的腸上皮細胞的直接毒害發(fā)揮作用的,因此影響了黏膜屏障的完整 性。由于其癥狀、病理變化與人類潰瘍性結腸炎的臨床癥狀和病理變化類似,常被用于研究 此病的發(fā)病機理,并且可以通過連續(xù)幾個循環(huán)攝入DSS誘導慢性腸炎的發(fā)生。另外,與致癌 劑偶氮甲烷聯(lián)用,可以制備慢性炎癥到腫瘤的模型,對于臨床炎癥性腸病相關的結直腸癌 的機制研究也是非常重要的工具。
[0013] 此外,肥胖是21世紀人類面臨的最嚴峻的公共衛(wèi)生問題之一,隨著都市化生活方 式普及,肥胖人群日益增多,而我國快速的城鎮(zhèn)化建設則會加重這一現(xiàn)狀。衛(wèi)生部調查顯 示,我國肥胖超重者近3億,糖耐量受損者約1. 5億,糖尿病患者超過9000萬。糖尿病已成 為威脅我國人民健康的突出問題,同時對醫(yī)療保障體系和社會福利制度提出了嚴峻挑戰(zhàn)。
[0014] 20世紀90年代初已有人發(fā)現(xiàn)一些促炎細胞因子包括腫瘤壞死因子TNF-α、白細 胞介素、干擾素等在多種組織中影響葡萄糖濃度的穩(wěn)定性。近年來炎癥反應在糖尿病發(fā)生 發(fā)展中的作用及與其他糖尿病危險因素關系問題的研究受到越來越廣泛關注。2010年以 來,Cell、Nature、Science期刊連續(xù)發(fā)表十余篇專題報道,從遺傳因素、環(huán)境因素、基因信 號轉導、機體腸道菌群等多方面闡述了肥胖與糖尿病發(fā)生發(fā)展機制及調控現(xiàn)狀,并提出一 系列解決思路。肥胖和糖尿病常常同時存在,肥胖與糖尿病不僅是一個高血糖的疾病,也是 一種炎癥性疾病,而炎癥反應是連接它們之間的紐帶。肥胖患者體內存在慢性、低度炎性反 應,其脂肪組織中的T細胞和巨噬細胞明顯增加,二者通過影響前脂肪細胞和脂肪細胞的 功能導致炎性因子的上調。但是這與典型的炎性反應不同,肥胖患者體內雖然有許多炎性 介質升高,但沒有典型的紅、腫、熱、痛炎性反應。因此,有學者把這種反應稱為"代謝性炎性 反應"。促炎因子IL-UIL-6和TNFa等細胞因子不僅由免疫活性細胞產(chǎn)生,也可由脂肪和 肌肉細胞產(chǎn)生。不僅參與機體的炎癥反應過程,還是能量代謝平衡的重要調節(jié)因子。它們 能夠阻斷體內胰島素的生物學功能,使胰島素敏感性下降,導致胰島素抵抗的發(fā)生。人體總 IL-6的30%來自脂肪組織,所以肥胖者脂肪組織分泌的IL-6可明顯增加。長期過度分泌 IL-6可導致胰島β細胞分泌功能受損及產(chǎn)生胰島素抵抗。而高血糖又可促進胰島細胞分 泌IL-6,大量的IL-6可促進Β淋巴細胞分化,產(chǎn)生過量的IgG,該作用和其他細胞因子產(chǎn)生 的細胞毒作用結合,可引起胰島β細胞凋亡。TNF-a在胰島素抵抗的病理過程中起了重要 的作用,肥胖者脂肪細胞產(chǎn)生的過量的TNF-a抑制肌肉組織胰島素受體酪氨酸激酶活性, 降低胰島素作用。TNF-a還能降低PPAR mRNA的表達而減少PPAR的產(chǎn)生,PPAR在免疫細胞 和血管壁細胞中表達具有抗炎和促凋亡作用;TNF-a又可引起胰島內巨噬細胞活化釋放 IL-UIL-6等,因此,長期高濃度的炎癥因子刺激可導致胰島細胞分泌功能受損及產(chǎn)生胰島 素抵抗。對炎癥因子與肥胖和糖尿病之間關系的研究或許可以提供新的更有效的診斷、預 防和治療手段。
[0015] TLR4是一種重要的模式識別受體,在肥胖與高血糖的發(fā)生、發(fā)展中也起了重要作 用。它幾乎在所有人體細胞表達,并有實驗證實在胰島β細胞上也存在TLR4的表達,而 且TLR4的配體種類多樣,可以是細菌胞壁,內毒素,也可以是非細菌的配體,如飽和脂肪酸 (棕櫚酸)。細菌性炎癥免疫應答需要TLR4參與和活化;游離脂肪酸也能夠活化TLR4引起 炎癥免疫反應。營養(yǎng)過剩,肥胖,導致胰島素抵抗的發(fā)生需要TLR4的參與,TLR4激活后,其 胞漿區(qū)通過募集接頭蛋白MyD88引起下游轉錄因子NFKB,IRF3和MAP激酶的激活。通過 MyD88依賴的通路引起的NFKB和MAPKs的激活促炎癥因子釋放。
[0016] CTRP4是C1QTNF相關蛋白質家族成員。C1QTNF (CTRP)家族是一類新發(fā)現(xiàn)的主要 來自脂肪組織的脂肪細胞因子,以其高度保守的C端補體C1Q球狀結構域為特征而命名。發(fā) 明人初期的體外研究表明CTRP4在肝癌細胞系可以活化NFk B,上調IL-6的表達以及促進 STAT3的磷酸化,相關的文章發(fā)明人發(fā)表在CANCER LETTER上。繼續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),對髓系來 源的細胞CTRP4顯示了明顯的抗炎的作用;而不同的動物模型研究在體內也均顯示了抗炎 作用。根據(jù)已有報道,很多CTRP家族的成員均在脂代謝中發(fā)揮了很重要的作用,那么CTRP4 在脂代謝中起了什么作用呢? CTRP4會不會通過抑炎而抑制肥胖呢?之前的實驗已經(jīng)證 明,CTRP4能夠抑制TLR4與LPS的結合,從而可以抑制LPS引起的內毒素性休克。因此,我 們的假設是:CTRP4是通過抑制TLR4,抑制STAT3而抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生從而抑制肥胖 和胰島素抵抗,進而抑制了高血糖的發(fā)生。我們希望通過實驗驗證我們的假設。闡明CTRP4 的作用機制具有重要的理論意義與實用價值,理論上闡明它的作用機制對肥胖與糖尿病的 發(fā)病機制的研究將是一種重要貢獻;應用上,CTRP4是一種分泌蛋白,已經(jīng)證明其重組蛋白 具有生物學活性,因此CTRP4具有潛在的臨床應用價值。肥胖與代謝綜合征糖尿病不僅是 一個高血糖的疾病,也是一種炎癥性疾病,肥胖患者體內存在慢性、低度炎性反應。其脂肪 組織中的T細胞和巨噬細胞明顯增加,二者通過影響前脂肪細胞和脂肪細胞的功能導致炎 性反應因子的上調。但是這與典型的炎性反應不同,肥胖患者體內雖然有許多炎性反應介 質升高,但沒有典型的紅、腫、熱、痛炎性反應。因此,有學者把這種慢性炎性反應稱為"代謝 性炎性反應"。IL-UIL-6及TNF α可能均參與糖尿病發(fā)病,長期過度分泌的IL-1及TNF α 可導致胰島Β細胞分泌功能受損及產(chǎn)生胰島素抵抗。
[0017] 自身免疫病性疾病的病因之一在于機體無法清除自身所產(chǎn)生的凋亡細胞,本發(fā) 明已經(jīng)在體內外證明,CTRP4蛋白可以明確促進吞噬細胞對凋亡細胞的吞噬和清除,因此, CTRP4可以應用于治療自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物制備。
【發(fā)明內容】
[0018] 本發(fā)明的目的是提供CTRP4蛋白質在作為制備治療炎癥性疾病和自身免疫性疾 病的藥物中的應用。
[0019] 為此,本發(fā)明提供了一種CTRP4蛋白質作為制備治療炎癥性疾病的藥物的應用。 其中所述炎癥性疾病選自下列的一種或多種:LPS所引起的內毒素性休克;急、慢性結腸 炎;肺炎;肥胖和1?血糖。
[0020] 本發(fā)明也提供了 CTRP4蛋白質在作為制備促進巨噬細胞吞噬凋亡細胞的藥物的 應用。
[0021] 本發(fā)明也提供了 CTRP4蛋白質作為制備治療自身免疫性疾病的藥物的應用。
[0022] 本發(fā)明也提供了 CTRP4蛋白質作為制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物的應用。
[0023] 本發(fā)明的上述應用可以制備有效地治療炎癥性疾病和自身免疫性疾病的藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1是CTRP4F1代轉基因小鼠66號小鼠的PCR鑒定。
[0025] 圖2是CTRP4F2代CTRP4轉基因小鼠65號的鑒定。
[0026] 圖3是F2代純合子小鼠的鑒定。
[0027] 圖4是Western Blotting檢測純合子小鼠中各個CTRP4的表達。
[0028] 圖5是CTRP4_His融合蛋白與LPS之間的結合作用。
[0029] 其中 1 :PBS ;2 :1%BSA ;3 :煮沸 15 分鐘的 CTRP4(2ug/ml)(目的是為證明 CTRP4 的作用不是由于殘留的 LPS 所致);4 :VSTM-1-V2-HIS(1. 4ug/ml) ;5 :CTRP4(0. lug/ml) ;6 : CTRP4(0. 5ug/ml) ;7 :CTRP4(2ug/ml) ;8 :LPS(20ug/ml)+CTRP4(2ug/ml)。
[0030] 圖6是THP1細胞中TLR4的mRNA表達。
[0031] 圖7A-D是FITC-LPS與THP1細胞的結合。
[0032] 其中(A) CTRP4-His融合蛋白與FITC-LPS同時處理THP1細胞,CTRP4-His融合 蛋白的高、中、低劑量濃度分別為l〇〇ng/ml,lug/ml,10ug/ml ; (B) CTRP4-His融合蛋白與 FITC-LPS先37°C孵育30min再加入處理THP1細胞,CTRP4-His融合蛋白的高、中、低劑量濃 度分別為l〇〇ng/ml,lug/ml,10ug/ml ; (C)多粘菌素 B與FITC-LPS同時處理THP1細胞,多粘 菌素 B的高、中、低劑量濃度分別lug/ml,10ug/ml,100ug/ml ; (D)未標記的LPS與FITC-LPS 同時處理THP1細胞,游離LPS的高、中、低劑量濃度分別lug/ml,10ug/ml,100ug/ml?;业?峰代表陰性對照,黑線白底代表FITC-LPS組,彩色白底代表實驗組。
[0033] 圖8是CTRP4抑制LPS誘導的細胞因子表達。
[0034] 其中(A)lug/mlLPS或者lug/mlLPS與不同濃度CTRP4-His融合蛋白聯(lián)合處理 THP1細胞6小時后,IL-6、TNF- α和IL-10的mRNA水平的變化;(B) lug/mlLPS或者lug/ mlLPS與不同濃度CTRP4-His融合蛋白聯(lián)合處理THP1細胞6小時后,IL-6的蛋白水平的變 化;(C) lug/mlLPS或者lug/mlLPS與不同濃度CTRP4-His融合蛋白聯(lián)合處理THP1細胞后 細胞培養(yǎng)上清中TNF-α含量的時間變化廣代表P < 〇. 〇1,_代表P < 〇. 〇〇1。
[0035] 圖9是野生型小鼠和CTRP4轉基因小鼠誘導內毒素休克后的生存曲線。
[0036] 其中野生型C57BL/6小鼠(η=16)和CTRP4轉基因 C57BL/6小鼠(η=11)腹腔注射 30mg/kg來自菌株E. coli055: Β5的LPS誘導內毒素休克后,每2h觀察1次。數(shù)據(jù)來自2次 獨立實驗的聯(lián)合數(shù)據(jù),#代表P< 〇.〇1。
[0037] 圖10表示在急性結腸炎模型中CTRP4轉基因小鼠的結腸長度比對照組長。A圖為 模型構建后犧牲小鼠的結腸長度情況。B圖為A圖的統(tǒng)計圖。P=0. 0021
[0038] 圖11表示轉基因 CTRP4小鼠的腹瀉情況減輕。在DSS誘導的急性結腸炎模型中 CTRP4轉基因小鼠和陰性對照組小鼠腹瀉程度的比較,**代表P〈0. 01。
[0039] 圖12表示轉基因 CTRP4小鼠的血便情況減輕。在DSS誘導的急性結腸炎模型中 CTRP4轉基因小鼠和陰性對照組小鼠的血便評分情況。**代表P〈0. 01。
[0040] 圖13表示轉基因 CTRP4小鼠的體重變化情況。在DSS誘導的急性結腸炎模型中 轉基因 CTRP4小鼠和陰性對照組小鼠體重的比較。**代表P〈0. 01.
[0041] 圖14表示轉基因 CTRP4小鼠在結腸炎模型中結腸病理情況減輕。圖為代表性的 顯微鏡圖片,放大倍數(shù)為200倍。
[0042] 圖15表示通過組織學評分CTRP4轉基因小鼠在結腸炎模型中炎癥程度減輕。反 應腸炎嚴重程度的組織學評分顯示轉基因小鼠的評分比陰性對照組低。
[0043] 圖16表示轉基因 CTRP4小鼠在急性結腸炎模型中的生存率明顯提高。在葡聚糖 硫酸鈉誘導的急性結腸炎模型中轉基因 CTRP4小鼠和對照組小鼠的生存曲線橫坐標為DSS 誘導的天數(shù),縱坐標為小鼠的死亡百分比,CTRP4組n=8, WT組n=8. WT小鼠在第7、8、9、10 天每天死亡一只小鼠,而CTRP4小鼠在11天未見死亡。
[0044] 圖17表示CTRP4轉基因小鼠結腸中細胞因子TNF-α的表達量明顯降低。急性結 腸炎模型中結腸勻漿上清檢測TNF- a的數(shù)值,P=〇. 0026。
[0045] 圖18表示CTRP4轉基因小鼠的糖耐量實驗。CTRP4轉基因鼠糖耐量比野生型鼠有 明顯差異,轉基因鼠的血糖水平較野生鼠明顯降低。
[0046] 圖19和圖20表不商脂喂養(yǎng)的結果。
[0047] 圖21表示高脂喂養(yǎng)16周后,CTRP4基因鼠體重較野生鼠的體重明顯減低,具有統(tǒng) 計學意義。
[0048] 圖22表示CTRP4與凋亡細胞的識別。
[0049] 其中(A) Jurkat細胞凋亡狀態(tài)。Jurkat細胞UV照射1. 2min (早期凋亡)和5min (晚期凋亡),用AV-PI雙染方法流式細胞術分析凋亡狀態(tài);(B)、(C)活細胞、早期凋亡和晚 期凋亡Jurkat細胞與FITC-BSA、FITC-CTRP4室溫孵育30min后流式細胞術分析FITC熒光 強度。
[0050] 圖23A-B表示CTRP4可以與小鼠腹腔巨噬細胞結合。
[0051] 圖24A-B表示THP1細胞用PMA(10ng/ml)處理2天使其分化成巨噬細胞,用(5ug/ ml)FITC-CTRP4孵育60分鐘進行檢測。
[0052] 圖25A-D表示CTRP4促進體內凋亡細胞的清除。
【具體實施方式】
[0053] 實施例1 :制備:CTRP4轉基因小鼠
[0054] 真核細胞表達質粒pcDNA3. 1-Myc/HisB (-)(本論文中簡稱PO)B)購自Invitrogen 公司,制備PCAGGS-CTRP4轉基因質粒。具體過程如下:真核細胞表達質粒pcDNA3. 1-Myc/ HisB (-)(本論文中簡稱PCDB)購自Invitrogen公司,pCAGGS-CTRP4質粒的構建方案如圖所 示。其基本過程如下:設計包含Xhol酶切序列的CTRP4基因特異性引物,以pcDNA3. 1-Myc/ HisB(-)質粒為模板,克隆方案中,上下游引物具體序列分別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 :
[0055] PCR擴增得到的片段連同真核表達載體pcDNA3. 1-myc/his (-)B采用同樣的限制 性內切酶進行酶切。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離,切膠回收目的條帶?;厥盏?載體和PCR片段用T4DNA連接酶進行連接,16°C,12小時。將連接產(chǎn)物進行轉化。
[0056] 以下為轉化過程:緩慢抽吸50 μ 1感受態(tài)大腸桿菌XL1-BLUE到連接產(chǎn)物中,在冰 上放置30分鐘,在42°C水浴中熱激90秒鐘,迅速放到冰上,經(jīng)過5分鐘的恢復后,加入LB 的培養(yǎng)基400 μ 1,后37°C培養(yǎng)45分鐘讓細菌恢復狀態(tài)并表達抗性,離心8000rpm,2分鐘, 棄上清,留400 μ 1重懸,涂布于LA平皿上,30°C倒置培養(yǎng)過夜。挑取克隆擴增培養(yǎng),提取質 粒進行鑒定。鑒定是否有插入片段、插入片段的大小、片段插入的方向。對符合目的要求的 陽性克隆進行質粒測序,測序結果與NCBI標準數(shù)據(jù)庫中的CTRP40RF序列進行比對,準確 無誤后進行質粒大量提取,質粒線性化,定量除菌后通過商業(yè)付費委托給中國醫(yī)學科學院 醫(yī)學實驗動物研究所(地址:北京市朝陽區(qū)潘家園南里5號院,郵編:100021)制作轉基因小 鼠。由其提供合格的CTRP4轉基因小鼠。
[0057] 1.提取鼠尾基因組DNA
[0058] 1)在剪取鼠尾的前一天配制鼠尾裂解液(商購);
[0059] 2)編號并剪去小鼠的尾巴0. 5cm左右,放入EP管中;
[0060] 3)在每個EP管中加入上述的裂解液500ul并加入0. lmg/ml的蛋白酶 K (Proteinase K)放入55°C水浴鍋里過夜;
[0061] 4)第二天,加入300 μ 1飽和的NaCl (35. 2g NaCl定容至100ml),顛倒混勻6-8次, 冰浴15分鐘;
[0062] 5) 12000rpm,,室溫離心 15 分鐘;
[0063] 6)轉移400 μ 1上清液至另一新的離心管,加入700 μ 1的異丙醇,顛倒直至形成絮 狀沉淀;
[0064] 7) 12000rpm 室溫離心 15 分鐘;
[0065] 8)棄掉上清,加入lml70%乙醇洗滌沉淀,棄掉乙醇并晾干;
[0066] 9)根據(jù)得到的沉淀(S卩DNA)的量加入50ul,65°C的雙蒸水溶解。
[0067] 2.PCR鑒定CTRP4轉基因小鼠
[0068] (1)引物:根據(jù)pCAGGS載體的啟動子序列小雞β-肌動蛋白,使用中國醫(yī)學科學 院醫(yī)學實驗動物研究所設計的引物序列和擴增條件如下:
[0069]
【權利要求】
1. CTRP4蛋白質作為制備治療炎癥性疾病的藥物的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于:所述炎癥性疾病選自下列的一種或多種: LPS所引起的內毒素性休克;急、慢性結腸炎;肺炎;肥胖和高血糖。 3. CTRP4蛋白質作為制備促進巨噬細胞吞噬凋亡細胞的藥物的應用。 4. CTRP4蛋白質作為制備治療自身免疫性疾病的藥物的應用。
5. 根據(jù)權利要求4所述的應用,其特征在于:所述的自身免疫性疾病是系統(tǒng)性紅斑狼 瘡。
【文檔編號】A61P3/04GK104208658SQ201310213305
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月31日 優(yōu)先權日:2013年5月31日
【發(fā)明者】王露, 馬大龍, 馬壯, 那達翔, 王蘭蘭, 羅陽, 張穎妹 申請人:北京大學