一種豬圓環(huán)病毒樣顆粒及其疫苗和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬圓環(huán)病毒樣顆粒(VLP)及其疫苗和制備方法，病毒樣顆粒由2型豬圓環(huán)病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白-核衣殼蛋白組成，可以激發(fā)細胞及體液免疫應答，可以作為病毒樣顆粒疫苗(VLP疫苗)免疫不同動物群，使用后可以安全、有效的防治PCV-2感染；VLP可以通過加入或不加佐劑制備成注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型，為不同種群的母豬、小豬、育肥豬安全、有效免疫防控PCV-2感染提供了理想的疫苗。
【專利說明】一種豬圓環(huán)病毒樣顆粒及其疫苗和制備方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種豬圓環(huán)病毒樣顆粒，特別涉及一種病毒樣顆粒疫苗及其疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是一種導致豬群免疫力下降的病毒,并與豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)、豬皮炎及腎病綜合癥(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome,F1DNS)、豬繁殖障礙(Porcine reproductive failure)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine Respiratory DiseaseSyndrome,PRDC)、豬增生性壞死性肺炎(Porcine Necrotizing Pneumonia,PNP)、豬先天性振顫(Porcine Congenital Tremor,CT)等多種疾病有著聯(lián)系。PCV是1974年在一種體外培養(yǎng)的豬腎細胞系PK-15中首次發(fā)現(xiàn)的，當時認為是一種細胞培養(yǎng)的污染物，因為其并不具有導致細胞病變等典型的病毒樣作用，所以稱為小病毒樣核酸污染物。隨后陸續(xù)有報道指出這種小病毒樣核酸污染物其實是一種病毒，這種病毒是一種小型無包膜的12面體病毒，核心包含一個單股環(huán)狀DNA基因組，不導致動物發(fā)病及傳代培養(yǎng)的細胞發(fā)生病變，并正式將其命名為豬圓環(huán)病毒。1994年Hines等人首先報道了在患有先天性振顫(CongenitalTremor)的仔豬中發(fā)現(xiàn)了 PCV樣病毒(PCV-1ikeVirus)，1995年Allan等人也在幾例豬的死產(chǎn)的(Stillborn)死胎中發(fā)現(xiàn)了 PCV的抗體，這將PCV與各種疾病聯(lián)系到了一起。之后對PCV的報道漸漸指向了一種分離自病豬而不是細胞培養(yǎng)物的“新型豬圓環(huán)病毒(NovelPCV) ”。隨著對這種新型PCV的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)從基因組到血清型都與傳統(tǒng)的PCV存在差異，隨之國際上將這種新型的、可以致病的豬圓環(huán)病毒命名為2型豬圓環(huán)病毒(PCV-2)，同時將細胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的非致病性豬圓環(huán)病毒命名為I型豬圓環(huán)病毒(PCV-1)。
[0003]在臨床中，PCV-2主要感染5-12周齡的小豬，病豬表現(xiàn)為生長緩慢、被毛粗亂、營養(yǎng)不良、呼吸困難、黃 膽、粘膜蒼白，可成為僵豬，嚴重可導致死亡。有證據(jù)表明，PCV-2的致病性主要是由于其對免疫系統(tǒng)的損傷造成的，研究發(fā)現(xiàn)，感染PCV-2的病豬淋巴細胞會發(fā)生明顯減少。Darwich等報道，患有豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥(PostweaningMultisystemic Wasting Syndrome, PMWS)的病豬出現(xiàn) CD3+、CD4+T 淋巴細胞減少，CD8+T淋巴細胞沒有發(fā)生明顯變化，而典型的由PCV-2感染而引起PMWS病癥的患豬出現(xiàn)了⑶8+T淋巴細胞的減少。而且有證據(jù)表明PCV-2在淋巴器官中的數(shù)量與患豬淋巴細胞的消耗以及外周血中IgM及⑶8+T淋巴細胞的減少有著直接的關(guān)系。Nielsen等人報道，患豬在PCV-2感染10天后淋巴細胞開始減少，在第14天時出現(xiàn)顯著下降，且這種下降會一直持續(xù)到患豬死亡。而且通過試驗證實，所有的T淋巴細胞亞群都會由于PCV-2的感染而出現(xiàn)數(shù)量上的減少。Sarli等人報道，PCV-2對淋巴細胞的消耗還包括樹突狀細胞和B淋巴細胞，同時Chianini等人根據(jù)B淋巴細胞及T淋巴細胞數(shù)量的下降程度，將其分為輕度損傷、中度損傷以及重度損傷，其中重度損傷可致淋巴細胞徹底消失。這充分說明了 PCV-2的感染可導致免疫機能下降，同時也為患豬由于PCV-2的感染并與其他病原體的并發(fā)感染而導致諸如PMWS—類疾病的發(fā)生提供了理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，PCV-2的感染通常伴隨豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PCV)、豬瘟病毒(CSFV)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、衣原體(Chlamydia spp.)、肺曲霉病(pulmonaryaspergillosis)、隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)等共同感染而引起疾病的發(fā)生。其中PCV-2感染作為主要病因的疾病是豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥(PostweaningMultisystemic Wasting Syndrome, PMWS)，在 PCV-2 感染的同時通常伴隨有 PRRSV 及 PPV的感染，而且在實驗室中PCV-2的單獨感染也可造成PMWS的典型癥狀。
[0004]PCV-2是一類無包膜、十二面體、包含一個單股環(huán)狀DNA基因組的、目前發(fā)現(xiàn)最小的病毒，直徑17nm，與雞貧血病毒(cAV)、鸚鵡喙羽病毒(PBFDAV)等共屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬。有證據(jù)表明PCV與來自植物的矮小病毒(Nano Virus)親緣關(guān)系非常接近，推測PCV是植物病毒侵染脊椎動物后發(fā)生重組與突變而發(fā)生的宿主遷移。PCV-2在pH3環(huán)境、氯仿處理及56-70°C內(nèi)都有活性。PCV-1基因組全長1759nt、PCV-2基因組全長1768nt，PCV_l編碼7個開放閱讀框(ORF)，PCV-2有11個潛在開放閱讀框(ORF)，編碼2_36kD的蛋白質(zhì)，但只有6個ORF得到證實。其中主要的ORF有三個，分別是0RF-1、0RF-2和0RF-3，0RF-1編碼復制酶(REP)，0RF-2編碼PCV-2的主要結(jié)構(gòu)蛋白(CAP)，同時也是主要免疫原性蛋白，0RF-3編碼蛋白與PCV-2介導的細胞凋亡有直接關(guān)系。另外，基于CAP蛋白核酸序列的生物信息學分析，可將PCV-2分為PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c三個亞型。有文獻報道，在中國發(fā)生的PCV-2感染主要集中在PCV-2b亞型，但FangWang等人報道，在中國還存在PCV-2a、PCV_2d、PCV-2e亞型的感染，而且PCV-2d、PCV-2e兩個亞型是2009年FangWang等人首次在中國發(fā)現(xiàn)的。
[0005]疫苗是防治PCV-2感染的有效手段，目前已經(jīng)面世的針對PCV-2的疫苗主要包括滅活疫苗CIRCOVACs、重組病毒疫苗Suvaxyn Pcv20ne Dose?、以及亞單位疫苗CIRCUMVENT*及Ingclvac CIRCOFLX*等，但都有相對不足之處。如滅活苗CTRCOVAC:*除去常規(guī)滅活苗的缺陷外，還存在PCV-2培養(yǎng)困`難，且耗費過大等問題。而重組病毒疫苗Suvaxyn Pcv20ne Dose?是將來自具有致病性PCV-2的Cap蛋白與來自非致病性PCV-1的其他蛋白重組而成的重組病毒，因為PCV-1仍然具有使淋巴細胞數(shù)量下降得特點，Opriessnig等人報道，免疫機能的下降會造成其他疫苗免疫的失敗，尤其在PRRSV疫苗的使用上體現(xiàn)的格外明顯，這使疫苗使用的不安全性大大增加，另外有報道顯示，重組病毒疫苗很容易被來自母源的抗體所綜合，而導致疫苗效果下降。另外亞單位疫苗雖然具有較高的安全性，但由于臨床多采用母豬免疫而利用母源抗體來預防仔豬感染，而母源抗體一般在5-8周將下降到很低，對于仔豬的保護效率還缺乏更多的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。在另一方面，目前商品化的疫苗所采用的佐劑仍不理想，如C1RC0V4CR采用礦物油佐劑、SuvaxynPcv20ne Dose*.采用SL-CD水質(zhì)佐劑、CIRCUMVENT和和丨ngelvac CmCOFLX*都采用水質(zhì)佐劑。眾所周知，用于豬喘氣病(MPS)疫苗中的礦物油佐劑可以激發(fā)PCV的復制，從而導致PCV-2感染而使病情加重并復雜化，同時2004年Resendes等人對目前常用佐劑都作了調(diào)查，結(jié)果明確指出，目前缺乏一種有效的佐劑以應用在PCV-2疫苗的開發(fā)上，且所應用的佐劑都不能有效的提高疫苗的效力。因此克服目前PCV-2活苗、滅活苗、以及基因工程疫苗的低安全性、低保護力等缺點，同時尋求新的佐劑、研發(fā)一種安全、高效、非復制的病毒疫苗，在能較好地保護PCV-2攻擊的同時，并能較好地避免共同感染和繼發(fā)感染的發(fā)生，是安全、有效免疫防控PCV-2的重大科學課題。
[0006]病毒樣顆粒(Virus-like pratical, VLP)是由病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白組成不含病毒核酸的病毒粒子空殼。由于VLP大小、結(jié)構(gòu)及表面抗原和多肽表位與真正的病毒幾乎沒有區(qū)別，因此能被宿主抗原提呈細胞所識別，引起免疫應答和效應，且無潛在的副作用。首先，與活苗及滅活苗相比，病毒樣顆粒疫苗沒有不安全因素；與亞單位疫苗相比，VLP是多個抗原蛋白組成，具有很強的免疫原性；與有良好口碑的病毒體(Virosome)相比，VLP既不是由活病毒制備而來，沒有潛在的危險性、也不需要大量的繁殖病毒，沒有安全性低、成本高以及制備周期長等不足；由此VLP疫苗被當今譽為病毒類疫苗發(fā)展的新里程碑。目前的乙肝VLP 疫苗(Recombivax HB, Merck)、乳頭瘤 VLP 疫苗(Gardi si I, Merck)和流感 VLP 疫苗已上市，戊型VLP疫苗等多個品種在臨床研究中。目前，未見有關(guān)PCV-2VLP疫苗的報道，因此急需一種可以組裝VLP的抗原，在與佐劑混合后能誘導實驗動物良好的免疫應答。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種豬圓環(huán)病毒的病毒樣顆粒；本發(fā)明的目的之二在于提供含病毒樣顆粒的疫苗；本發(fā)明的目的之三在于提供病毒樣顆粒的制備方法。
[0008]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為:
[0009]1.一種豬圓環(huán)病毒的病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒由豬圓環(huán)病毒的核衣殼蛋白組成。
[0010]優(yōu)選的，所述核衣殼蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1?15所不。
[0011]優(yōu)選的，所述核衣殼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.16?30所示。
[0012]2.含有所述病毒樣 顆粒的疫苗。
[0013]優(yōu)選的，所述疫苗為注射劑、滴鼻劑或飲水劑型。
[0014]更優(yōu)選的，所述疫苗的佐劑為納米鋁、氫氧化鋁或磷酸鋁、水凝膠、季胺化的殼聚糖或重組不耐熱性腸毒素中的一種或多種。
[0015]3.所述病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟:將編碼豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白的核苷酸構(gòu)建重組真核表達載體，然后將重組真核表達載體轉(zhuǎn)化表達細胞，培養(yǎng)后將培養(yǎng)物經(jīng)純化即得病毒樣顆粒。
[0016]更優(yōu)選的，所述真核表達載體為pET32a載體，p0PI3CAT載體，pCAGGS載體，pcDNA6/TR 載體或 pCMV-HA 載體。
[0017]更優(yōu)選的，所述表達細胞為UMNSAH/DF-1細胞，分離9_10齡禽成纖維細胞，PK-15細胞，VERO細胞，COS細胞，人二倍體細胞，BHK細胞，CHO細胞，MDCK細胞，H印-G2細胞，Tn5細胞或SF9Cell細胞。
[0018]最優(yōu)選的，培養(yǎng)物的純化方法為:收集細胞培養(yǎng)液，4°C、5000rmp條件下離心IOmin,取上清液于100000g、4°C條件下離心2小時,沉淀用HNE buffer懸浮，HNE buffer的組成為25mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl,5mM EDTA ;然后將懸液進行蔗糖梯度離心，鹿糖采用HNE buffer配制，體系采用0.3g/mL鹿糖3mL, 0.45g/mL鹿糖3mL, 1.37g/mL蔗糖lmL，然后與4°C、IOOOOOg條件下離心2h，收集中間層，并用折射儀測量密度；用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介質(zhì)進行凝膠層析純化,收集外水體積流穿峰；再采用DEAE-S印haroseFFTM介質(zhì)進行離子交換層析，平衡液為pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含0.2-0.5M氯化鈉、pH6.5-7.5的PBS，純化后液體即為病毒樣顆粒。
[0019]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒樣顆粒，由豬圓環(huán)病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白組成，也是主要表面抗原CAP，可以激發(fā)良好雙重的細胞及體液免疫應答；經(jīng)形成的VLP抗原加入或不加入佐劑制備的注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型免疫接種不同動物群體后，可安全、有效預防PCV-2感染，為不同種群母豬、小豬、育肥豬安全、有效免疫防控PCV-2感染提供了理想疫苗。
[0020]本發(fā)明進行了藥效實驗，分別通過注射、滴鼻、飲水等途徑免疫小豬與懷孕母豬產(chǎn)生好的體液免疫與細胞免疫應答及天然免疫與獲得性免疫應答以及黏膜免疫應答效果，免疫動物后，沒有發(fā)現(xiàn)免疫損傷或由疫苗接種而導致的發(fā)病跡象，具有安全性；本發(fā)明豬圓環(huán)病毒樣顆粒疫苗免疫無PCV-2免疫背景的小豬、母豬與育肥豬兩次，進一步通過PCV-2a、PCV-2b、PCV-2e、PCV_2d型毒株以及我國不同地區(qū)臨床分離的PCV-2野株攻毒，有95%以上的免疫保護效果；用本發(fā)明豬圓環(huán)病毒樣顆粒疫苗接種不同地區(qū)、種群的母豬、小豬，0，21天免疫兩次，分別采用注射、滴鼻、飲水劑型疫苗免疫，均顯示各地區(qū)、各種群母豬、小豬沒有出現(xiàn)由疫苗接種引發(fā)的發(fā)病現(xiàn)象，具有安全性。
[0021]將VLP與納米鋁混合后能較好地增強免疫源性，并不會導致PCV-2病毒復制的加劇，由此表明研發(fā)的豬圓環(huán)病毒樣顆粒疫苗在含有或不含有佐劑、特別含有新型納米鋁佐劑的情況下，對不同地區(qū)、種群的豬群都具有較好的免疫保護效果。
【具體實施方式】
[0022]對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0023]實施例1制備豬圓環(huán)病毒樣顆粒疫苗的表達載體
[0024]以來自 PCV-2b 的耵-耶、0)、0)15、8了0401、冊0402、1\104、2了0401、1\105、冊0601、CQ08、HuB08、LN08、HN08、SC07和JX0601亞型的CAP蛋白的核苷酸，其中BJ-HB亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；OT-TS亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；BJ0401亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；HB0402亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示；TJ04亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示；ZJ0401亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示；TJ05亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示；HB0601亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示；CQ08亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示；HuB08亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示；LN08亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示；HN08亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.13所示；SC07亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示；JX0601亞型的CAP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.15所示。根據(jù)序列比對顯示，來自不同亞型的核苷酸相似度高。
[0025]然后以5’ gctacgtctctctagattaagggttaagrggghh-3> 為上游引物，下劃線為 XbaI酶切位點；5’ -ctcgagctggccctgctccccgatcaccc3>為下游引物,下劃線為Xho I酶切位點，然后分別以含SEQ ID N0.1?SEQ ID N0.15序列的樣品為模板進行PCR擴增，獲產(chǎn)物酶切后連入pET32a表達載體中，獲得重組pET32a-CAP表達載體。
[0026]實施例2細胞培養(yǎng)及細胞批庫建立
[0027]以UMNSAH/DF-1細胞培養(yǎng)并建庫為例，UMNSAH/DF-1細胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)。培養(yǎng)基米用 DMEM 培養(yǎng)基(Dulbecco' s modified Eagle medium),培養(yǎng)基中添加 100U/mL 青霉素及 100 μ g/mL鏈霉素，然后加入體積分數(shù)為2-10%的胎牛血清，然后在細胞工廠或細胞發(fā)酵罐進行培養(yǎng)，建立細胞工作種子批庫，并對傳代后的外源因子、致瘤性及穩(wěn)定性等全面檢定，細胞使用代數(shù)控制在60代以內(nèi)，均符合疫苗生產(chǎn)介質(zhì)的要求。
[0028]本實施例中還可以使用其他動物細胞，如:PK-15細胞VERO細胞；@C0S細胞；④人二倍體細胞；?BHK細胞；?CH0細胞MDCK細胞H印-G2細胞等，也可以使用本領(lǐng)域常用的其他細胞。
[0029]實施例3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定高表達細胞系篩選與建庫
[0030]選用實施例2建立的UMNSAH/DF-1細胞為靶細胞，采用脂質(zhì)體法將實施例1構(gòu)建的重組PHWD2000-CAP表達載體轉(zhuǎn)染UMNSAH/DF-1細胞，然后篩選穩(wěn)定高表達PC VLP-2的細胞系。具體步驟如下:①在35mm孔中，加入pHWD2000-CAP表達載體1.Syg;②加入5 μ LOptiMEM配置的脂質(zhì)體，室溫孵育45min。然后加入到被OptiMEM潤洗過的宿主細胞中，孵育5h 離心去除載體-脂質(zhì)體混合物，并向細胞中加入DMEM進行培養(yǎng)；④PHWD2000-CAP重組載體在細胞系中表達，可自組裝PC VLP-2 ;⑤通過加壓篩選表達PCVLP-2的UMNSAH/DF-1細胞株。結(jié)果顯示，在UMNSAH/DF-1細胞10代內(nèi)篩選到穩(wěn)定高表達PC VLP-2的細胞株，經(jīng)細胞系穩(wěn)定表達與產(chǎn)量、VLP大小與結(jié)構(gòu)、外源因子與致瘤性、染色體完整性等傳代至40代沒有表型改變。由此，建立了穩(wěn)定高表達PCV-2VLP的UMNSAH/DF-1細胞系。進一步建立具有PCV-2VLP的三級細胞種子批庫，經(jīng)對全面檢定符合疫苗生產(chǎn)要求，放置液氮中保存?zhèn)溆谩?br> [0031]本實施例中制備穩(wěn)定高表PCV-2VLP的細胞系包括但不限于 ?①UMNSAH/DF-1細胞?’②PK-15細胞?’③VERO細胞；? COS細胞；?人二倍體細胞；? BHK細胞?’⑦CHO細胞；⑧MDCK細胞；@ H印-G2細胞。
[0032]實施例4PCVLP-2規(guī)?；a(chǎn)
[0033]取穩(wěn)定表達PCV-2VLP的UMNSAH/DF-1工作批庫細胞，用DMEM細胞培養(yǎng)液(不加入或加入10-2%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過20L細胞工廠或加入微載體30L細胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)生產(chǎn)使得細胞密度達到I X 107_8以上時，收集細胞培養(yǎng)PCV-2VLP疫苗原液。
[0034]本實施例中規(guī)?；a(chǎn)的PCV-2VLP細胞系包括但不限于:①UMNSAH/DF-1細胞?’②PK-15細胞VERO細胞；? COS細胞；?人二倍體細胞；? BHK細胞 '⑦CHO細胞；⑧MDCK細胞；⑨H印-G2細胞。
[0035]實施例5PCV-2VLP疫苗的純化
[0036]分別收集規(guī)模化生產(chǎn)的不同亞型的PCV-2VLP疫苗原液，4 °C 5000rmp離心lOmin，去除細胞及雜質(zhì)；取上清液100000g4°C離心2h，沉淀用I倍體積HNE buffer (25mMTris-HCl pH7.4,150mM NaCl, 5mM EDTA)懸浮；將懸液進行鹿糖梯度離心，鹿糖采用HNE buffer 配制，體系采用 0.3g/mL 鹿糖 3mL ；0.45g/mL 鹿糖 3mL ；1.37g/mL 鹿糖 ImL ；4 °C IOOOOOg離心2h ;收集中間層，并用折射儀測量密度；用pH6.5-7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介質(zhì)進行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰，雜蛋白去除可達95%以上；然后采用DEAE-S印haroseFFTM介質(zhì)進行離子交換層析，平衡液為pH6.5-7.5、含有0.05-0.15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含0.2-0.5M氯化鈉、ρΗ6.5-7.5的PBS，雜蛋白去除可達99%以上，液體為PC VLP-2疫苗原液。
[0037]疫苗原液的外觀為澄清液體，pH值為7.0-7.2，通過血平板進行雜菌鑒定結(jié)果為陰性，通過半流體和肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)進行支原體鑒定結(jié)果為陰性，通過PAGE-SDS電泳檢測結(jié)果顯示目的條帶清晰、無其他雜帶，采用Reed&Muench法計算抗血清中和效價均高于
I: 2800。
[0038]實施例6PCV-2VLP疫苗劑型配制
[0039]①注射劑型配制:分別將純化的PCV-2VLP疫苗原液不加佐劑，配制10 μ g/0.5mL的低劑量、20 μ g/1.0mL高劑量的無佐劑注射劑型；分別將純化PCV-2VLP疫苗原液加入氫氧化招或磷酸招配置PCV-2VLP濃度為15 μ g/mL,氫氧化招或磷酸招為lmg/mL的疫苗,或PCV-2VLP濃度為30 μ g/mL,氫氧化鋁或磷酸鋁濃度為2mg/mL的有佐劑注射型疫苗；分別將純化PCV-2VLP疫苗原液加入納米鋁佐劑，分別配制5.0 μ g/0.5mL低劑量、10 μ g/1.0mL高劑量的有佐劑注射型疫苗。將以上注射疫苗溶液裝入吸頂瓶，放2-8°C備用。
[0040]②噴鼻劑型配制:分別 將純化PCV-2VLP不加佐劑吸附，配制7.5 μ g/0.2mL低劑量、15 μ g/0.2mL高劑量的無佐劑噴鼻疫苗劑型；分別將純化的PCV-2VLP加入等體積季胺化殼聚糖水凝膠黏膜佐劑與傳遞系統(tǒng)，配制5.0 μ g/0.2mL、10 μ g/0.2mL有佐劑噴鼻疫苗劑型；分別將純化PCV-2VLP蛋白加入等體積季胺化殼聚糖水凝膠與10 μ g rLT黏膜佐劑及傳遞系統(tǒng)，配制4.0 μ g/0.2ml,8 μ g/0.2ml有佐劑噴鼻豬圓環(huán)病毒樣顆粒疫苗劑型。以上噴鼻疫苗溶液裝入定量噴鼻裝置，放2-8°C備用。
[0041]③飲水劑型配制:分別將純化PCV-2VLP10 μ g、20 μ g分別加入5%蔗糖(質(zhì)量)、0.2%維生素C(質(zhì)量)、0.1%谷維素(質(zhì)量)和0.1%脫脂奶粉(質(zhì)量)，用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH7.2，噴霧干燥，配制10 μ g/劑低劑量、20 μ g/劑高劑量的無佐劑舌下含片劑型；分別將純化PCV-2VLP蛋白7.5yg、15yg與15 μ g rLT分別加入5%蔗糖、0.2%維生素C、0.1 %谷維素和0.1 %脫脂奶粉，用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH7.2，噴霧干燥，配制7.5μ g/劑低劑量、15 μ g/劑高劑量的有佐劑豬圓環(huán)病毒樣顆粒疫苗飲水劑型；以上以上飲水疫苗裝入密封塑料袋內(nèi)，放2-8°C備用。
[0042]實驗例7PCV-2VLP疫苗檢定實驗
[0043]利用實施例6制備的PCV-2VLP疫苗注射劑、滴鼻劑、飲水劑型外觀見均，無異味和染菌；通過豚鼠、家兔試驗無熱原、異常毒性和急性毒性反應；通過3日齡乳鼠腦內(nèi)接種，以及3日齡小豬頸部肌肉注射試驗無發(fā)病現(xiàn)象；通過Lorry法測定蛋白含量均在劑量范圍；通過電鏡觀察VLP直徑約17nm，與天然病毒一致；ELISA測定DNA含量均在50EU以下；通過SDS-PAGE和WB檢測抗原蛋白成分存在；通過免疫Balb/C小鼠I次血清中和抗體效價在3200以上。
[0044]實驗例8PCV-2VLP疫苗對實驗豬體內(nèi)的免疫應答效果實驗[0045]利用實施例6制備的PCV-2VLP疫苗分別加入或不加入相應佐劑制備的注射、滴鼻、飲水疫苗劑型，并用PBS、鋁鹽、納米鋁、rLT為對照組，分別按各自途徑免疫3日齡小豬，以及后備母豬其免疫劑量按實施例6疫苗低劑量組，免疫兩次(0，21天)；末次免疫后14天采集各組小豬及母豬的外周血、分離血清和免疫細胞，采集脾淋巴細胞、肺和鼻腔灌洗液；通過ELISA法測定血清抗體效價在6400以上，采用MTT法測定中和抗體效價在3200以上，采用流失細胞儀、ELISP0T儀測定免疫細胞與血清重要細胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等動態(tài)變化使得TH2/Thl應答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗體效價在160以上。結(jié)果顯示，本發(fā)明PCV-2VLP疫苗不管是加入佐劑與沒有佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應答，且試驗組有佐劑組好于無佐劑組、高劑量好于低劑量組免疫應答效果，而對照組沒有產(chǎn)生雙重免疫應答；制備的PCV-2VLP疫苗不管是注射還是滴鼻、飲水劑型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應答，且注射劑型血清抗體效價高于滴鼻、飲水劑型，滴鼻、飲水劑型黏膜和細胞免疫效應好于注射劑型。
[0046]實驗例9PCV-2VLP疫苗對實驗豬體內(nèi)的免疫保護效果實驗
[0047]利用實施例6制備的PCV-2VLP疫苗分別加入或不加入相應佐劑制備的注射、滴鼻、飲水劑型為實驗組，并用PBS、鋁鹽、納米鋁、rLT、及PCV-2甲醛滅活病毒為對照組，分別按各自途徑免疫3日齡小豬、后備母豬，其免疫劑量按實施例6疫苗低劑量組，免疫兩次(0，21天)，末次免疫后14天各試驗組、對照組實驗豬用105_tlTCID5tl臨床分離PCV-2毒株分別頸部肌肉注射攻毒觀察保護效果。結(jié)果顯示，本發(fā)明PCV-2VLP疫苗均都能產(chǎn)生高水平的保護效果，免疫保護率在90%以上，而對照組PCV-2甲醛滅活病毒疫苗保護率達60%、其他各對照組保護率達為0%。由此制備的PCV-2VLP疫苗在小豬和母豬體內(nèi)具有高效的免疫保護效果。
[0048]實驗例10PCV-2VLP疫苗對懷孕母豬的免疫應答及免疫保護效果實驗
[0049]利用實施例6制備的PCV-2VLP疫苗分別加入或不加入相應佐劑制備的注射、滴鼻、飲水劑型，并用PB S、鋁鹽、納米鋁、rLT和PCV-2甲醛滅活病毒疫苗為對照組，分別按各自途徑免疫懷孕60天母豬，其免疫劑量按實施例6疫苗高劑量組，免疫兩次(0，21天)；當末次免疫后14天采集各組母豬的外周血、分離血清和免疫細胞。一部分母豬處死后采集脾淋巴細胞、肺和鼻腔灌洗液；通過ELISA法測定血清抗體效價在12800以上，采用MTT法測定中和抗體效價在6400以上，采用流失細胞儀、ELISP0T儀測定免疫細胞與血清重要細胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等動態(tài)變化使得TH2/Thl應答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗體效價在200以上。另一部分母豬繼續(xù)飼養(yǎng)，當母豬分娩后觀察沒有早產(chǎn)、流產(chǎn)、弱仔情況。結(jié)果顯示，本發(fā)明PCV-2VLP疫苗不管是加入佐劑與沒有佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應答，且試驗組有佐劑組好于無佐劑組、高劑量高于低劑量組免疫應答效果，而對照組沒有產(chǎn)生雙重免疫應答；本發(fā)明PCV-2VLP疫苗不管是注射還是滴鼻、飲水劑型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應答，且注射劑血清抗體效價高于滴鼻、飲水劑型，滴鼻、飲水劑型黏膜和細胞免疫效應好于注射劑型。由此制備的PCV-2VLP疫苗在懷孕母豬體內(nèi)具有好的免疫應答效果。
[0050]上述PCV-2VLP疫苗通過各自方法免疫配種前母豬，配種后21天進行2次免疫，在懷孕80天各試驗組、對照組懷孕母住用IO5 tlTCID5ci臨床分離PCV-2毒株分別頸部肌肉注射攻毒，待母豬自然生產(chǎn)后觀察保護效果。結(jié)果顯示，本發(fā)明PCV-2VLP疫苗均都能產(chǎn)生高水平的保護效果，免疫保護率在90%以上，而對照組PCV-2甲醛滅活病毒疫苗保護率達78%、其他各對照組保護率達為0%。由此制備的PCV-2VLP疫苗對懷孕母住具有高效的免疫保護效果。
[0051]實驗例11PCV-2VLP疫苗的安全性實驗
[0052](I)無菌、支原體試驗:將實施例6制備的PCV-2VLP疫苗分別接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，并以無菌生理鹽水做陰性對照，培養(yǎng)溫度為25°C、35°C。結(jié)果顯示，PCV-2VLP疫苗都未見細菌生長。分別將PCV-2VLP疫苗用半流體和肉湯培養(yǎng)基，37°C初代培養(yǎng)21天，次代培養(yǎng)21天，無菌生理鹽水做陰性對照，結(jié)果顯示PCV-2VLP疫苗無支原體生長；用DNA染色法將毒種接種Vero細胞培養(yǎng)3天，傳代一次，用二苯甲酰胺熒光染料染色。結(jié)果顯示，PCV-2VLP疫苗均無支原體生長。
[0053](2)溶血性試驗:選取體重為350g左右的豚鼠，采集新鮮豚鼠血lmL，用PBS洗滌3次，再將血細胞體積恢復并稀釋10倍。PBS稀釋PCV-2VLP疫苗(由實施例6制備)，分別為2倍、4倍、8倍，將豚鼠血細胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時后，評價血球溶解以目測或者上清濃度檢測為準，并在570nm處檢測吸光度。結(jié)果顯示，沒有發(fā)生血球破裂，無溶血現(xiàn)象。說明PCV-2VLP疫苗中的成分不能使紅細胞裂解。因此，PCV-2VLP疫苗均無溶血反應。
[0054](3)急性毒性試驗:取實施例6制備的PCV-2VLP疫苗0.5mL腹腔注射體重為12?18gBalb/C小鼠，每組10只，同時設(shè)PBS陰性對照組，連續(xù)2周觀察小鼠的活動狀態(tài)、體重變化和存活率。結(jié)果表明，實驗小鼠全部存活，沒有出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行動遲緩等不良癥狀，而體重呈現(xiàn)增加，由此證明PCV-2VLP疫苗在試驗的濃度下對動物是安全的，且14天后處死進行大體解剖檢查，未見臟器有病理改變。在體重為8?IOkg的Beagle狗體內(nèi)的急性毒性結(jié)果:取實施例6制備的PCV-2VLP疫苗肌肉注射15mL，每組10只，同時設(shè)PBS陰性對照組，連續(xù)2周觀察行為、體重 和存活率變化。結(jié)果可見，Beagle狗未見毒性反應，行為正常，沒有死亡，與對照組狗比較無差異，各狗體重有所增加，并處死大體解剖未見臟器有明顯的病理改變。因此，PCV-2VLP疫苗均無急性毒性反應，使用是安全的。
[0055](4)過敏試驗研究:取實施例6制備的PCV-2VLP疫苗皮下接種體重為250?350gHartley豚鼠，每個樣品接種豚鼠5只，每只接種0.5mL,隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳靜脈分別給予相同PCV-2VLP疫苗0.5mL，并用人血白蛋白和生理鹽水以同樣的方法分別接種3只豚鼠作為陽性、陰性對照。注射后30分鐘及3天觀察動物，陽性、陰性對照均成立，PCV-2VLP疫苗組豚鼠無死亡，且無鼻癢、噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過敏癥狀。因此，PCV-2VLP疫苗在動物體內(nèi)均無過敏反應。
[0056](5)兔熱源質(zhì)試驗:取預檢合格的體重為2?3kg家兔3只固定,30分鐘后測量體溫，共測2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大于0.2°C，各家兔2次平均溫度在38.6-39.50C。將實施例6制備的PCV-2VLP疫苗預熱至38°C，于第2次測溫后15分鐘內(nèi)，自家兔耳邊靜脈分別緩緩注入0.5mL/只。注射后每隔30分鐘測量體溫I次，連測6次。結(jié)果顯示:PCV-2VLP疫苗給予家兔個體升溫均未超過0.2°C，3只家兔升溫總和未超過0.4°C,沒有引起家兔的發(fā)熱反應。因此，制備的PCV-2VLP疫苗均無熱源質(zhì)。
[0057](6)免疫病理損傷試驗:由實施例8制備的PCV-2VLP疫苗通過小豬、母豬、種豬及育肥豬外周血抗體亞型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜堿性細胞及氣管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等檢測。試驗結(jié)果顯示，PCV-2VLP疫苗免疫接種在實驗乳豬、母豬、種豬及育肥豬體內(nèi)Th2/Thl免疫應答趨于平衡，沒有免疫器官損傷的跡象，因此具有安全性。
[0058]實驗例12:PCV-2VLP疫苗穩(wěn)定性實驗
[0059]將實施例6制備的PCV-2VLP疫苗，分別置于2_8°C、室溫(20-25°C )、37°C I周、2周、I個月、3個月、6個月、12個月、18個月和24個月，取樣觀察外觀、pH值、無菌、電鏡觀察粒徑、免疫動物觀察安全性。結(jié)果顯示:PCV-2VLP疫苗放置2-8°C 24個月內(nèi)均無變色分層等現(xiàn)象，PH值在7.0-7.2之間無變化，電鏡觀察粒徑大小保持一致，且注射或滴鼻給小鼠或?qū)嶒炟i表現(xiàn)正常；PCV-2VLP疫苗放置室溫25°C 3個月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性；PCV_2VLP疫苗放置室溫37°C I個月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性效果。由結(jié)果說明，PCV-2VLP疫苗放置2_8°C理化性質(zhì)、生物學性能穩(wěn)定，有效期至少24個月。
[0060]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種豬圓環(huán)病毒的病毒樣顆粒，其特征在于:所述病毒樣顆粒由豬圓環(huán)病毒的核衣殼蛋白組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒樣顆粒，其特征在于:所述核衣殼蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 ?15 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒樣顆粒，其特征在于:所述核衣殼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.16 ?30 所示。
4.含有權(quán)利要求1-3任一項所述病毒樣顆粒的疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗為注射劑、滴鼻劑或飲水劑型。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗的佐劑為納米鋁、氫氧化鋁或磷酸鋁、水凝膠、季胺化的殼聚糖或重組不耐熱性腸毒素中的一種或多種。
7.權(quán)利要求1-3任一項所述病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將編碼豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白的核苷酸構(gòu)建重組真核表達載體，然后將重組真核表達載體轉(zhuǎn)化表達細胞，培養(yǎng)后將培養(yǎng)物經(jīng)純化即得病毒樣顆粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述真核表達載體為pET32a載體，P0PI3CAT 載體，pCAGGS 載體，pcDNA6/TR 載體或 pCMV-HA 載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述表達細胞為UMNSAH/DF-1細胞，分離9-10齡禽成纖維細胞，PK-15細胞，VERO細胞，COS細胞，人二倍體細胞，BHK細胞，CHO細胞，MDCK細胞，H印-G2細胞，Tn5細胞或SF9Cell細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項所述的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)物的純化方法為:收集細胞培養(yǎng)液，4°C、5000rmp條件下離心lOmin，取上清液于100000g、4°C條件下離心2小時，沉淀用 HNE buffe r 懸浮，HNE buffer 的組成為 25mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl,5mM EDTA ;然后將懸液進行蔗糖梯度離心，蔗糖采用HNE buffer配制，體系采用0.3g/mL蔗糖3mL, 0.45g/mL鹿糖3mL, 1.37g/mL鹿糖ImL,然后與4°C、IOOOOOg條件下離心2h,收集中間層，并用折射儀測量密度；用PH6.5-7.5的PBS平衡S印harose6FFTM介質(zhì)進行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰；再采用DEAE-S印haroseFFTM介質(zhì)進行離子交換層析，平衡液為ρΗ6.5-7.5、含有0.05-0.15Μ氯化鈉的PBS，洗脫液為含0.2-0.5Μ氯化鈉、ρΗ6.5-7.5的PBS,純化后液體即為病毒樣顆粒。
【文檔編號】A61K39/12GK103436499SQ201310230557
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】李陽春, 曹政 申請人:重慶澳龍生物制品有限公司