專利名稱：一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗及其制備方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗及其制備方法和其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，該病以免疫抑制和斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭為特征，病豬主要表現(xiàn)生長發(fā)育不良、貧血、呼吸困難、腹瀉、衰弱、增重遲緩、淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀。自1991年在加拿大豬群中爆發(fā)PMWS以來，PMWS已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。PCV2不但可以引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)的衰竭，還能夠使感染豬的免疫功能受到損害，導(dǎo)致機體抵抗力下降，引起繼發(fā)感染，加重病情。此外，PCV2還與母豬繁殖障礙、增生性壞死性肺炎、豬皮炎腎 病綜合征和豬呼吸道疾病綜合征等病癥相關(guān)。近年來，我國豬群也有PMWS流行，所造成的危害十分嚴(yán)重。疫苗免疫是控制PCV2感染及其相關(guān)疾病的重要手段。目前，國內(nèi)生產(chǎn)的疫苗為全病毒滅活疫苗，如文獻(xiàn)CN101240264A公開了一種全病毒滅活疫苗，但PCV2在體外細(xì)胞內(nèi)增殖能力弱，培養(yǎng)難度較大，病毒最終滴度低，提供的病毒抗原含量有限，制備高質(zhì)量PCV2疫苗需要濃縮病毒抗原，這將直接導(dǎo)致疫苗生產(chǎn)成本高昂，不能滿足動物疫苗質(zhì)優(yōu)價廉的實際要求。文獻(xiàn)CN101180406A、CN101884787A和CN101358182A均公開了用重組桿狀病毒表達(dá)PCV2 0RF2基因編碼的Cap蛋白，并將其用于制備PCV2疫苗，其中，所描述的重組桿狀病毒都只含有一個啟動子，且未優(yōu)化其生產(chǎn)工藝條件，致使生產(chǎn)獲得的病毒蛋白產(chǎn)率及質(zhì)量均較低，且所表達(dá)的目的基因有其它多余序列(如6XHis標(biāo)簽、分泌性信號肽等)的修飾，不利于表達(dá)的外源蛋白形成病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs),這些重組桿狀病毒構(gòu)建技術(shù)策略存在表達(dá)的目的蛋白免疫原性部分喪失的缺陷。此外，由于該亞單位疫苗的佐劑和免疫刺激物等因素影響，其實踐中的免疫效果并不佳。因此，急需研制一種產(chǎn)率更高、免疫原性及免疫效果更佳的PCV2亞單位疫苗及其制備方法和其所制備的疫苗組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，所述載體是分別在pFastBacDual轉(zhuǎn)移載體的PlO啟動子和Ppolh啟動子(多角體蛋白啟動子)之后各插入一個拷貝的PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2是完整的、未經(jīng)修飾的PCV2b 0RF2。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2分別通過BamHI/Hind III 和 Kpn I/Xho I 雙酶切插入 pFastBac Dual 轉(zhuǎn)移載體中。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體為pFastBacDual_20RF2。本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗生產(chǎn)用毒株的制備方法，包括如下步驟
(I)獲得本發(fā)明所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual_20RF2 ；(2)同源重組，產(chǎn)生重組桿狀病毒DNA ；(3)包裝，產(chǎn)生表達(dá)PCV2衣殼蛋白的重組桿狀病毒。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的同源重組是將步驟(I)所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化進(jìn)含穿梭載體Bacmid的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DHlOBac中，產(chǎn)生重組桿狀
病毒DNA。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的包裝是將步驟(2)產(chǎn)生的重組桿狀病毒DNA感染sf9細(xì)胞，包裝出重組桿狀病毒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組桿狀病毒，由本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗生產(chǎn)用毒株的制備方法制得。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述重組桿狀病毒為rBac_20RF2。本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的制備方法，包括如下步驟(I)獲得本發(fā)明制備的重組桿狀病毒；(2)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，接種步驟(I)的重組桿狀病毒；(3)滅活病毒；(4)分離純化重組PCV2 Cap蛋白；(5)用純化的重組PCV2 Cap蛋白制備亞單位疫苗。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的步驟(2)包括利用生物反應(yīng)器無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)sf9細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，按感染復(fù)數(shù)(MOI)為O. 001-10的量接種步驟(I)所述的重組桿狀病毒后，繼續(xù)培養(yǎng)，使PCV2 Cap蛋白在sf9細(xì)胞中高效表達(dá)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述生物反應(yīng)器的培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定為pH6. 0-6. 5，溫度25-30°C，溶氧30_80%，攪拌速度50_250rpm，優(yōu)選所述生物反應(yīng)器的培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定為PH6. 2，溫度27°C，溶氧50%，攪拌速度100_180rpm。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(2)包括將細(xì)胞經(jīng)過5L-50L培養(yǎng)體積逐級放大培養(yǎng)后，于50L生物反應(yīng)器培養(yǎng)并接種所述重組桿狀病毒；或者，將細(xì)胞經(jīng)過5L-50L-500L培養(yǎng)體積逐級放大培養(yǎng)后，于500L生物反應(yīng)器培養(yǎng)并接種所述重組桿狀病毒。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(2 )采用批式培養(yǎng)方法、分批補料培養(yǎng)方法、半連續(xù)灌注培養(yǎng)方法或連續(xù)灌注培養(yǎng)方法的任一種或其組合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(2)采用分批補料培養(yǎng)方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(3)包括向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入二乙烯亞胺(BEI)滅活劑滅活所述的重組桿狀病毒，并可選的，在滅活結(jié)束后使用硫代硫酸鈉中和過量的BEI。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(4)包括收集步驟(3)滅活后的細(xì)胞培養(yǎng)物，通過離心或中空纖維過濾除去細(xì)胞碎片，得到含有PCV2 Cap蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(5)包括對步驟(4)純化的重組PCV2Cap蛋白進(jìn)行定量，加入佐劑，制備疫苗。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的亞單位疫苗包括不低于8 μ g/ml的重組PCV2Cap 蛋白。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的亞單位疫苗還包括適量的防腐劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的亞單位疫苗還包括免疫刺激復(fù)合物或QuilA皂苷的任一種，優(yōu)選所述免疫刺激復(fù)合物由Quil A皂苷、膽固醇和磷脂組成，其中，Quil A阜苷膽固醇磷脂的質(zhì)量比為1:1:1。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的亞單位疫苗還包括適量的佐劑。 在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述佐劑選自水性佐劑、油性佐劑、納米佐劑或緩釋佐劑的任一種或其組合，優(yōu)選所述的水性佐劑選自氫氧化鋁膠佐劑，賽比克Gel OlST佐劑或Carbopol 971P NF佐劑的任一種或其組合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，每頭份所述的亞單位疫苗包括不低于8yg/ml 的 PCV2 Cap 蛋白，10% (v/v)的賽比克 Gel 01 ST 佐劑、O. 1% 的 Carbopol 971P NF 佐劑、lmg/ml的氫氧化招膠佐劑的任一種,組成為50 μ g/ml Quil A阜苷、50 μ g/ml膽固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激復(fù)合物或50 μ g/ml Quil A皂苷的任一種，按疫苗最終體積計，含量不聞于O. 01%的硫柳萊。本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗，利用本發(fā)明所述重組桿狀病毒制備得到。本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗，由本發(fā)明所述的制備方法制備得到。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，每頭份所述的亞單位疫苗包括不低于Syg/ml 的 PCV2 Cap 蛋白，50 μ g/ml Quil A 皂苷。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，每頭份所述疫苗組合物的組成包括不低于8 μ g/ml 的 PCV2 Cap 蛋白，10% (v/v)的賽比克 Gel 01 ST 佐劑、O. 1% 的 Carbopol 971PNF佐劑、lmg/ml的氫氧化招膠佐劑的任一種,組成為50 μ g/ml Quil A阜苷、50 μ g/ml膽固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激復(fù)合物或50 μ g/ml Quil A皂苷的任一種，按疫苗最終體積計，含量不聞于O. 01%的硫柳萊。本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體在制備PCV2重組Cap蛋白或PCV2亞單位疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明所述的重組桿狀病毒在制備PCV2重組Cap蛋白或PCV2亞單位疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的PCV2重組Cap蛋白或PCV2亞單位疫苗用于預(yù)防由豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)感染引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。為了清楚表述本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明對下述術(shù)語進(jìn)行如下界定本發(fā)明所述的免疫刺激復(fù)合物由Quil A皂苷、膽固醇和磷脂組成，其中，Quil A皂苷膽固醇磷脂的質(zhì)量比為1:1:1，該復(fù)合物能形成一種具有較高活性的脂質(zhì)小泡，又是一種全新的抗原遞呈系統(tǒng)，對機體有免疫增強作用，具有佐劑和抗原遞呈的雙重功能，可產(chǎn)生“全面”免疫應(yīng)答的效力，并長期增強特異性抗體應(yīng)答。本發(fā)明所述的“每頭份”是指每頭豬每次免疫的劑量。本發(fā)明所述的賽比克Gel 01 ST佐劑(購自法國S印pic公司)，主要含有高分子的丙烯酸酯聚合物。本發(fā)明所述的Carbopol 971P NF佐劑(購自美國Noveon公司)，主要含有丙烯酸鍵合烯丙基蔗糖。除非另有說明，本發(fā)明所述的百分比為液體與液體之間的百分比時為體積/體積百分比，當(dāng)百分比為液體與固體之間的百分比時為體積/重量百分比，當(dāng)百分比為固體與液體之間的百分比時為重量/體積百分比，其余為重量/重量百分比。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下述優(yōu)點I、經(jīng)試驗驗證，本發(fā)明采用中國流行的PCV2b亞型的編碼Cap蛋白的基因序列可針對性地用于預(yù)防中國流行的豬圓環(huán)病毒??；2、本發(fā)明所述重組桿狀病毒含有雙啟動子(多角體蛋白啟動子和PlO啟動子)，可表達(dá)雙拷貝的Cap蛋白編碼基因，顯著提高了蛋白的表達(dá)效率；并且，插入的外源基因所表達(dá)的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒樣顆粒(VLPs)，提高了表達(dá)蛋白的免疫原性，且生產(chǎn)的抗原含量高；3、本發(fā)明的制備方法利用生物反應(yīng)器、大規(guī)模無血清懸浮培養(yǎng)sf9昆蟲細(xì)胞，并將其用于制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗，顯著提高了豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的病毒蛋白產(chǎn)率及質(zhì)量，所制得的疫苗組合物具有免疫效果穩(wěn)定、持久、安全性高等優(yōu)點；4、本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗具有良好的安全性和免疫效力，能夠?qū)ωi抵抗圓環(huán)病毒2型感染提供良好的免疫保護(hù)；5、本發(fā)明提供的應(yīng)用生物反應(yīng)器豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的制備方法，具有設(shè)備占地面積小、生產(chǎn)規(guī)模大、生產(chǎn)效率高，并可實現(xiàn)生產(chǎn)自動化控制和工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。


圖I本發(fā)明的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建流程圖。圖2本發(fā)明的重組桿狀病毒構(gòu)建流程圖。圖3單拷貝、雙拷貝重組bacmid PCR鑒定圖。
其中圖3A :雙拷貝重組bacmid鑒定；1、陰性對照；2、3、marker ;4、PUC M13F/R引物鑒定結(jié)果。圖4本發(fā)明的PCV2亞單位疫苗制備工藝流程圖。圖5本發(fā)明表達(dá)的Cap蛋白形成病毒樣顆粒(VLPs)電鏡圖片。
具體實施例方式以下將結(jié)合實施例具體說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限定本發(fā)明的實質(zhì)。實施例I重組桿狀病毒的構(gòu)建使用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組桿狀病毒，根據(jù)GENBANK公布的基因序列(NCBI登陸號EU340257. I)設(shè)計以下引物
PlTCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGP2 GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCP3 TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCGP4 GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC以PCV2b株病毒0RF2序列為模板(該模板根據(jù)已公布的PCV2b 0RF2序列登陸號EU340257. I合成獲得)，P1，P2擴增PCV2 0RF2基因，并將該基因克隆入pMD_19T載體中，獲得重組載體PMD-19T-0RF2-1，以PCV2b株病毒0RF2序列為模板，P3，P4擴增PCV20RF2基因，并將該基因克隆入PMD-19T載體中，獲得重組載體pMD-19T-0RF2-2。通過BamH I和Hind III雙酶切pMD_19T-0RF2_l，將0RF2基因克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual中，構(gòu)建載體pFastBac Dual_0RF2 ；通過Kpn I和Xho I雙酶切PMD-19T-0RF2-2,將0RF2基因克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual_0RF2中，構(gòu)建包含雙拷 貝0RF2基因的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual_20RF2，將該重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac，獲得插入雙拷貝0RF2基因的重組質(zhì)粒bacmid-20RF2 (PUC M13 F/R引物鑒定bacmid結(jié)果見圖3A)，將該重組質(zhì)粒bacmid_20RF2轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞Sf9中，獲得重組桿狀病毒rBac-20RF2 (0RF2序列如SEQ ID NO 1所述)，擴增重組桿狀病毒rBac_20RF2作為種毒備用。將重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual_0RF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac，獲得插入單拷貝0RF2基因的重組質(zhì)粒bacmid-0RF2，將該重組質(zhì)粒bacmid_0RF2轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞Sf9中，獲得重組桿狀病毒rBac-0RF2(0RF2序列如SEQ ID NO : I所述)，擴增重組桿狀病毒rBac_0RF2備用(PUC M13 F/R引物鑒定bacmid結(jié)果見圖3B)。實施例2昆蟲細(xì)胞的生物反應(yīng)器無血清懸浮培養(yǎng)及Cap蛋白的表達(dá)定量在IOOOml搖瓶中無菌培養(yǎng)Sf9昆蟲細(xì)胞3_4天，待濃度長到3_5X 106cells/ml，活力大于95%時，將細(xì)胞接種到5L的生物反應(yīng)器中，接種濃度為3-8X105cells/ml。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到3-5X106cells/ml時，將細(xì)胞接種到50L生物反應(yīng)器中，待細(xì)胞長至濃度為3-5X106cells/ml，接種到500L生物反應(yīng)器中，待細(xì)胞濃度達(dá)到2_8X 106cells/ml時，接種重組病毒rBac-20RF2或rBac-0RF2，感染復(fù)數(shù)(MOI)為O. 001-10，反應(yīng)器培養(yǎng)條件為pH6. 0-6. 5、溫度25-27°C、溶氧30_80%、攪拌速度100_180rpm。考慮到細(xì)胞培養(yǎng)的最適條件，優(yōu)選的PH6. 2、細(xì)胞培養(yǎng)階段溫度設(shè)定27°C、溶氧50%、攪拌速度100-180rpm。在感染之后繼續(xù)培養(yǎng)5-9天后，加入終濃度為5mmol/L的BEI，37°C作用24h后，加lmol/L Na2S2O3至終濃度5mmol/L終止滅活。通過離心或中空纖維過濾的方法收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，置2-8°C保存疫苗原液。制備的疫苗抗原中所含的Cap蛋白通過ELISA定量檢測。用包被緩沖液稀釋純化的捕獲抗體兔抗PCV2-Cap蛋白多抗至合適濃度，每孔100μ 1，4°C過夜，PBST洗滌三次，1%BSA封閉I小時。加入不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品(通過CsCl密度梯度離心純化的形成病毒樣顆粒VLPs的Cap蛋白)和梯度稀釋待檢樣品，37°C孵育I小時，PBST洗三次。每孔加入檢測抗體-抗PCV2 Cap蛋白的單克隆抗體，37°C孵育I小時，PBST洗三次。每孔加入二抗-HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育I小時，PBST洗三次。TMB顯色10分鐘，2MH2S04終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待檢樣品中Cap蛋白的量。使用三種不同MOI (0. 01、0. 1、1)接種兩種不同的病毒，分別于接種后7-11天取
樣定量分析培養(yǎng)上清中的目的蛋白含量，結(jié)果見表I。
表I不同感染復(fù)數(shù)接種兩種病毒蛋白表達(dá)量(μ g/ml)分析
權(quán)利要求
1.一種重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，所述載體是分別在pFastBac Dual轉(zhuǎn)移載體的PlO啟動子和Ppolh啟動子(多角體蛋白啟動子)之后各插入一個拷貝的PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2，優(yōu)選所述的PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2是完整的、未經(jīng)修飾的PCV2b 0RF2，更優(yōu)選所述PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2分別通過BamH I/Hind III和Kpn I/Xho I雙酶切插A pFastBac Dual轉(zhuǎn)移載體中。
2.如權(quán)利要求I所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO :I所示。
3.如權(quán)利要求1-2任一項所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體為pFastBac Dual_20RF2。
4.一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗生產(chǎn)用毒株的制備方法，包括如下步驟 (O獲得如權(quán)利要求1-5任一項所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體； (2)同源重組，產(chǎn)生重組桿狀病毒DNA； (3)包裝，產(chǎn)生表達(dá)PCV2衣殼蛋白的重組桿狀病毒。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的同源重組是將步驟(I)所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化進(jìn)含穿梭載體Bacmid的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DHlOBac中，產(chǎn)生重組桿狀病毒DNA。
6.如權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的包裝是將步驟(2)產(chǎn)生的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，包裝出重組桿狀病毒。
7.—種重組桿狀病毒，由權(quán)利要求4-6任一項所述的方法制備得到，優(yōu)選所述重組桿狀病毒為rBac_20RF2。
8.一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的制備方法，包括如下步驟 (1)獲得權(quán)利要求9所述的重組桿狀病毒； (2)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，接種步驟(I)的重組桿狀病毒； (3)滅活病毒； (4)分離純化重組PCV2Cap蛋白； (5)用純化的重組PCV2Cap蛋白制備亞單位疫苗。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)包括利用生物反應(yīng)器無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)Sf9細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，按感染復(fù)數(shù)(MOI)為O. 001-10的量接種步驟(I)所述的重組桿狀病毒后，繼續(xù)培養(yǎng)，使PCV2 Cap蛋白在sf9細(xì)胞中高效表達(dá)。
10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，生物反應(yīng)器的培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定為PH6. 0-6. 5、溫度25-30°C、溶氧30_80%、攪拌速度50_250rpm，優(yōu)選生物反應(yīng)器的培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定為PH6. 2，溫度27°C，溶氧50%，攪拌速度100_180rpm。
11.如權(quán)利要求8-10任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)包括將細(xì)胞經(jīng)過5L-50L培養(yǎng)體積逐級放大培養(yǎng)后，于50L生物反應(yīng)器培養(yǎng)并接種所述重組桿狀病毒；或者，將細(xì)胞經(jīng)過5L-50L-500L培養(yǎng)體積逐級放大的培養(yǎng)后，于500L生物反應(yīng)器培養(yǎng)并接種所述重組桿狀病毒。
12.如權(quán)利要求8-11任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)采用批式培養(yǎng)方法、分批補料培養(yǎng)方法、半連續(xù)灌注培養(yǎng)方法或連續(xù)灌注培養(yǎng)方法的任一種或其組合進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選為分批補料培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。
13.如權(quán)利要求8-12任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)包括向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入BEI滅活劑滅活所述的重組桿狀病毒，并在滅活結(jié)束后使用硫代硫酸鈉中和過量的BEI。
14.如權(quán)利要求8-13任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)包括收集步驟(3)滅活后的細(xì)胞培養(yǎng)物，通過離心或中空纖維過濾除去細(xì)胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清。
15.如權(quán)利要求8-14任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)包括對步驟(4)純化的重組PCV2Cap蛋白進(jìn)行定量，加入佐劑，制備疫苗。
16.如權(quán)利要求8-15任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的亞單位疫苗包括不低于8 μ g/ml的重組PCV2 Cap蛋白，優(yōu)選所述的亞單位疫苗還包括適量的防腐劑。
17.如權(quán)利要求8-16任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的亞單位疫苗還包括免疫刺激復(fù)合物或Quil A皂苷的任一種，其中，所述免疫刺激復(fù)合物由Quil A皂苷、膽固醇和磷脂組成，其中，Quil A皂苷膽固醇磷脂的質(zhì)量比為1:1:1 ;優(yōu)選所述的亞單位疫苗還包括適量的佐劑，更優(yōu)選所述佐劑選自水性佐劑、油性佐劑、納米佐劑或緩釋佐劑的任一種或其組合，還優(yōu)選所述的水性佐劑選自氫氧化鋁膠佐劑、賽比克Gel OlST佐劑或Carbopol 971P NF佐劑的任一種或其組合。
18.如權(quán)利要求8-17任一項所述的制備方法，其特征在于，每頭份所述的亞單位疫苗包括不低于8 μ g/ml的PCV2 Cap蛋白，10% (v/v)的賽比克Gel 01 ST佐劑、O. 1%的Carbopol 971P NF佐劑、lmg/ml的氫氧化招膠佐劑的任一種，組成為50yg/ml QuilA阜苷、50 μ g/ml膽固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激復(fù)合物或50 μ g/ml Quil A皂苷的任一種，按疫苗最終體積計，含量不高于O. 01%的硫柳汞。
19.一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗，利用權(quán)利要求7所述重組桿狀病毒制得，或者如權(quán)利要求8-18任一項所述的方法制備得到。
20.如權(quán)利要求19所述的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗，其特征在于，每頭份所述疫苗組合物的組成包括，不低于8 μ g/ml的PCV2 Cap蛋白，10% (v/v)的賽比克Gel 01 ST佐齊[J、0. 1%的Carbopol 971P NF佐劑、lmg/ml的氫氧化招膠佐劑的任一種，組成為50 μ g/mlQuil A皂苷、50 μ g/ml膽固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激復(fù)合物或50 μ g/mlQuiI A皂苷的任一種，按疫苗最終體積計，含量不高于O. 01%的硫柳汞。
21.權(quán)利要求1-3任一項所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體或者權(quán)利要求7所述重組桿狀病毒在制備PCV2重組Cap蛋白或PCV2亞單位疫苗中的應(yīng)用，優(yōu)選所述的PCV2重組Cap蛋白或PCV2亞單位疫苗用于預(yù)防由豬圓環(huán)病毒2型感染引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗及其制備方法和其應(yīng)用，所述重組桿狀病毒含有雙啟動子(多角體蛋白啟動子和P10啟動子)，可表達(dá)雙拷貝的Cap蛋白編碼基因，顯著提高了蛋白的表達(dá)效率。并且，插入的外源基因所表達(dá)的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒樣顆粒(VLPs)，提高了表達(dá)蛋白的免疫原性，且生產(chǎn)的抗原含量高。本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗，顯著提高了豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的蛋白產(chǎn)率及質(zhì)量，所制得的疫苗組合物具有免疫效果穩(wěn)定、持久、安全性高等優(yōu)點。
文檔編號A61K39/12GK102925486SQ20121027050
公開日2013年2月13日 申請日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者朱薇, 熊媛媛, 漆世華, 張萍, 秦紅剛, 李偉, 廖園園, 謝紅玲, 溫文生, 王楨楨, 靖志強, 吳玉石, 韓興, 劉潔 申請人:武漢中博生物股份有限公司