国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物、其制備方法和用途

      文檔序號(hào):1255745閱讀:860來(lái)源:國(guó)知局
      蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物、其制備方法和用途
      【專利摘要】本發(fā)明屬于免疫學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其特征在于,所述蛋白與細(xì)胞通過(guò)雙功能交聯(lián)劑偶聯(lián)。本發(fā)明還涉及所述蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物的制備方法和用途。本發(fā)明的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物可用于預(yù)防或治療多種疾病,例如惡性腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等。
      【專利說(shuō)明】蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物、其制備方法和用途

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,涉及一種偶聯(lián)物,特別是蛋白與細(xì)胞的偶聯(lián)物,本發(fā)明還涉及所述蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物的制備方法和用途。

      【背景技術(shù)】
      [0002]腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫監(jiān)視功能的減退有關(guān),而某些感染可通過(guò)給予病原微生物疫苗而使感染得到有效的預(yù)防,對(duì)于自身免疫耐受被打破的自身免疫病則可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)或免疫耐受的誘導(dǎo)而重新恢復(fù)免疫耐受。所有這些免疫干預(yù)措施都與抗原或抗體有關(guān),而絕大多數(shù)抗原或抗體是蛋白質(zhì),因此,誘導(dǎo)對(duì)抗原蛋白的免疫反應(yīng)或免疫耐受或者充分利用抗體的靶向性是上述免疫干預(yù)措施的目的。
      [0003]如何將抗原蛋白高效地輸送到淋巴組織是實(shí)現(xiàn)上述免疫干預(yù)的關(guān)鍵。如果能將抗原蛋白有效牢固地偶聯(lián)到具有免疫功能的細(xì)胞表面,由于免疫細(xì)胞有向淋巴組織遷移定位的特性或者提呈抗原的特性,通過(guò)輸注免疫細(xì)胞即可把蛋白抗原有效地輸送到淋巴組織或更好的提呈?;蛘呖梢岳每贵w的靶向性將免疫效應(yīng)細(xì)胞錨定靶細(xì)胞,以提高免疫效應(yīng)細(xì)胞的殺傷效率。
      [0004]已有的偶聯(lián)蛋白到細(xì)胞膜上的方法是用碳化二亞胺乙烯(EthyleneCarbodiimide, E⑶I)將一種已知抗原通過(guò)使細(xì)胞固定將抗原偶聯(lián)到細(xì)胞表面(luo, etal.Proc Natl Acad Sci U S A.2008Sep23 ; 105 (38): 14527-32.; Smarr CB, etal.Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2responses in mouse models of allergy.J Immunol.2011Novl5; 187(10):5090-8.)。此方法制備的的細(xì)胞因被ECDI固定而死亡,根據(jù)上述文獻(xiàn)報(bào)道,輸注這種細(xì)胞只能引起抗原特異性免疫耐受而不能誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。
      [0005]因此,本領(lǐng)域亟需一種將蛋白偶聯(lián)到活細(xì)胞上的方法,以期更有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,用于感染、腫瘤等的預(yù)防或治療。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期、大量的實(shí)驗(yàn)研究,令人驚奇地發(fā)現(xiàn)利用雙功能交聯(lián)劑可以將蛋白與細(xì)胞偶聯(lián)在一起,并且保持蛋白和細(xì)胞的活性,由此完成了本發(fā)明。
      [0007]本發(fā)明第一方面涉及蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其為蛋白和細(xì)胞分別與連接接頭共價(jià)連接形成的偶聯(lián)物;優(yōu)選地,所述細(xì)胞在未偶聯(lián)時(shí),其表面分布著游離的巰基;優(yōu)選地,所述的連接接頭來(lái)源于雙功能交聯(lián)劑,所述雙功能交聯(lián)劑同時(shí)含有能與氨基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)和與巰基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)。
      [0008]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其中所述細(xì)胞為具有免疫功能的細(xì)胞;優(yōu)選地,所述細(xì)胞選自淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞中的至少一種。
      [0009]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為淋巴細(xì)胞,所述淋巴細(xì)胞例如為T(mén)淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞。
      [0010]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其中所述的連接接頭來(lái)源于雙功能交聯(lián)劑。
      [0011]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中,其中所述的雙功能交聯(lián)劑同時(shí)含有琥珀酰亞氨基和馬來(lái)酰亞氨基基團(tuán)。
      [0012]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中,只要是同時(shí)含有琥珀酰亞氨基和馬來(lái)酰亞氨基基團(tuán)的化合物均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明,在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中,其包括但不限于琥珀酰亞氨基4-(N-馬來(lái)酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧化物(SMCC),SMCC的長(zhǎng)鏈類(lèi)似物N —琥珀酰亞氨基一4 - (N 一馬來(lái)酰亞氨基甲基)一環(huán)己烷一 I 一羧基一(6 —酰氨基己酸酯)(LC - SMCC)、K 一馬來(lái)酰亞氨基i^一酸N—琥珀酰亞氨基酯(KMUA)、Y 一馬來(lái)酰亞氨基丁酸N—琥珀酰亞氨基酯(GMBS)、ε 一馬來(lái)酰亞氨基己酸N—羥基琥珀酰亞氨基酯(EMCS)、間一馬來(lái)酰亞氨基苯甲?;?N —羥基琥珀酰亞氨酯(MBS)、N- ( α 一馬來(lái)酰亞氨基乙酰氧基)一琥珀酰亞氨酯(AMAS)、琥珀酰亞氨基一 6 —( β —馬來(lái)酰亞氨基丙酰氨基)己酸酯(SMPH)或4 -(對(duì)一馬來(lái)酰亞氨基苯基)一丁酸N —琥珀酰亞氨基酯(SMPB)。
      [0013]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其中所述雙功能交聯(lián)劑的琥珀酰亞氨基與蛋白上的游離氨基反應(yīng)形成酰胺鍵,所述雙功能交聯(lián)劑的馬來(lái)酰亞氨基與細(xì)胞上的游離巰基反應(yīng)形成硫醚鍵。
      [0014]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其中所述的蛋白包括但不限于抗原蛋白(例如腫瘤相關(guān)抗原、感染性疾病相關(guān)抗原、自身免疫性疾病相關(guān)抗原)、抗原表位、抗體、激素、生長(zhǎng)因子、維生素、集落刺激因子。
      [0015]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述的蛋白為雪藍(lán)蛋白(KLH);在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述的蛋白為胰島素。
      [0016]本發(fā)明第二方面涉及蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物的制備方法,其包括以下步驟:
      [0017](I)將蛋白與雙功能交聯(lián)劑接觸,以使雙功能交聯(lián)劑的連接基團(tuán)與蛋白發(fā)生共價(jià)連接,得到第一混合物,該混合物包含結(jié)合了連接基團(tuán)的蛋白;
      [0018](2)任選地,還包括去除第一混合物中未連接的雙功能交聯(lián)劑的步驟,以得到純化的結(jié)合了連接基團(tuán)的蛋白;
      [0019](3)將步驟(I)或(2)獲得的結(jié)合了連接基團(tuán)的蛋白與細(xì)胞接觸,以使所述連接基團(tuán)與細(xì)胞發(fā)生共價(jià)連接,得到第二混合物,該混合物包含了分別與連接接頭共價(jià)連接的蛋白和細(xì)胞偶聯(lián)物,即蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物;
      [0020](4)任選地,還包括去除第二混合物中未與細(xì)胞連接的蛋白的步驟,以得到純化的包含有蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物的第二混合物;
      [0021]或者所述制備方法包括以下步驟:
      [0022](a)將細(xì)胞與雙功能交聯(lián)劑接觸,以使雙功能交聯(lián)劑的連接基團(tuán)與細(xì)胞發(fā)生共價(jià)連接,得到第一混合物,該混合物包含結(jié)合了連接基團(tuán)的細(xì)胞;
      [0023](b)任選地,還包括去除第一混合物中未連接的雙功能交聯(lián)劑的步驟,以得到純化的結(jié)合了連接基團(tuán)的細(xì)胞;
      [0024](C)將步驟(a)或(b)獲得的結(jié)合了連接基團(tuán)的細(xì)胞與蛋白接觸,以使所述連接基團(tuán)與蛋白發(fā)生共價(jià)連接,得到第二混合物,該混合物包含了分別與連接接頭共價(jià)連接的蛋白和細(xì)胞偶聯(lián)物,即蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物;
      [0025](d)任選地,還包括去除第二混合物中未與細(xì)胞連接的蛋白的步驟,以得到純化的包含有蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物的第二混合物;
      [0026]優(yōu)選地,所述細(xì)胞在未偶聯(lián)時(shí),其表面分布著游離的巰基;
      [0027]優(yōu)選地,所述的雙功能交聯(lián)劑同時(shí)含有能與氨基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)和與巰基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)。
      [0028]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的制備方法,其中所述細(xì)胞為具有免疫功能的細(xì)胞;優(yōu)選地,所述細(xì)胞選自淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞中的至少一種。
      [0029]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,其中所述的雙功能交聯(lián)劑同時(shí)含有琥珀酰亞氨基和馬來(lái)酰亞氨基基團(tuán)。只要是同時(shí)含有琥珀酰亞氨基和馬來(lái)酰亞氨基基團(tuán)的化合物均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
      [0030]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中,所述的雙功能交聯(lián)劑包括但不限于其中所述的雙功能交聯(lián)劑選自琥珀酰亞氨基4- (N-馬來(lái)酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧化物(SMCC),SMCC的長(zhǎng)鏈類(lèi)似物N —琥珀酰亞氨基一 4-(N 一馬來(lái)酰亞氨基甲基)一環(huán)己烷一 I 一羧基一(6 —酰氨基己酸酯KLC 一 SMCC)、K 一馬來(lái)酰亞氨基i^一酸N—琥珀酰亞氨基酯(KMUA)、Y —馬來(lái)酰亞氨基丁酸N—琥珀酰亞氨基酯(GMBS)、ε 一馬來(lái)酰亞氨基己酸N—羥基琥珀酰亞氨基酯(EMCS)、間一馬來(lái)酰亞氨基苯甲?;?N —羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、N- ( α 一馬來(lái)酰亞氨基乙酰氧基)一琥珀酰亞胺酯(AMAS)、琥珀酰亞氨基一 6 -( β 一馬來(lái)酰亞氨基丙酰氨基)己酸酯(SMPH)或4 一(對(duì)一馬來(lái)酰亞氨基苯基)一丁酸N—琥珀酰亞氨基酯(SMPB)。
      [0031]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的制備方法,其中所述雙功能交聯(lián)劑的琥珀酰亞氨基與蛋白上的游離氨基反應(yīng)形成酰胺鍵,所述雙功能交聯(lián)劑的馬來(lái)酰亞氨基與細(xì)胞上的游離巰基反應(yīng)形成硫醚鍵。
      [0032]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的制備方法,其中所述的蛋白包括但不限于抗原蛋白(例如腫瘤相關(guān)抗原、感染性疾病相關(guān)抗原、自身免疫性疾病相關(guān)抗原)、抗原表位、抗體、激素、生長(zhǎng)因子、維生素、集落刺激因子。
      [0033]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述的蛋白為雪藍(lán)蛋白(KLH);在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述的蛋白為胰島素。
      [0034]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的制備方法,其特征在于以下(I)?(4)項(xiàng)中的一項(xiàng)或多項(xiàng):
      [0035](I)所述接觸時(shí)的溫度為4?40°C,優(yōu)選6?37°C,更優(yōu)選15?25°C,例如為室溫;
      [0036](2)所述接觸的時(shí)間為10?60min,優(yōu)選20?50min,更優(yōu)選30?40min ;
      [0037](3)所述接觸發(fā)生在溶液中,所述溶液例如為生理鹽水或緩沖溶液,所述緩沖溶液例如為磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、酒石酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液;
      [0038](4)所述接觸時(shí)的pH值為4.0?9.0,優(yōu)選為6.0?8.0,優(yōu)選為6.5?7.5,更優(yōu)選為7.0?7.2。
      [0039]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述緩沖溶液為磷酸鹽溶液(PBS)。
      [0040]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述雙功能交聯(lián)劑溶解于二甲基亞砜。
      [0041 ] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物在制備藥物和/或疫苗中的用途,所述藥物和/或疫苗用于預(yù)防或治療以下疾病中的一項(xiàng)或多項(xiàng):
      [0042](I)與所述蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物中的蛋白相關(guān)的疾??;
      [0043](2)惡性腫瘤;
      [0044](3)病原微生物感染性疾病;
      [0045](4)自身免疫性疾病。
      [0046]以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳述。
      [0047]在本發(fā)明中,所述蛋白既可以為完整的大蛋白分子,也可以為具有某些功能例如表位功能的多肽,多肽的大小例如可以為8?100個(gè)氨基酸。其中,蛋白或多肽的氨基可以與雙功能交聯(lián)劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng),形成共價(jià)連接。
      [0048]在本發(fā)明中,所述蛋白包括但不限于抗原蛋白(例如腫瘤相關(guān)抗原、感染性疾病相關(guān)抗原、自身免疫性疾病相關(guān)抗原)、抗原表位、抗體、激素、生長(zhǎng)因子(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、EGF、TGF- α、VEGF 等)、維生素、集落刺激因子(例如 G-CSF、MCSF、GM-CSF 等)。
      [0049]當(dāng)所述蛋白為抗原蛋白或抗原表位時(shí),可以通過(guò)蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物中的細(xì)胞將抗原蛋白輸送到淋巴組織,以提高抗原蛋白的靶向性。
      [0050]當(dāng)所述蛋白為抗體、激素、生長(zhǎng)因子等時(shí),可以利用抗體等的靶向性,將具有殺傷性的細(xì)胞輸送到靶細(xì)胞,以提高對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。例如可以通過(guò)抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原的識(shí)別,將腫瘤特異性殺傷T細(xì)胞帶到腫瘤附近,提高殺傷T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷清除作用。
      [0051 ] 在本發(fā)明中,所述抗體為單克隆抗體。
      [0052]在本發(fā)明中,所述抗體既可以為完整的抗體分子,也可以為其抗原結(jié)合部分。
      [0053]在本發(fā)明中,所述細(xì)胞優(yōu)選為表面分布有游離巰基的細(xì)胞,所述巰基(-SH)可以與雙功能交聯(lián)劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng),形成共價(jià)連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知,表面分布有巰基的細(xì)胞包括:淋巴細(xì)胞(例如B細(xì)胞、T細(xì)胞)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等(Matthias T Stephan, James J Moon, Soong Ho Um, et al.Therapeuticcell engineering with surface-conjugatedsynthetic nanoparticles.NatureMedicine, 2010,16 (9),1035-1042)。這些細(xì)胞可來(lái)自于血液(例如外周血液),也可從組織中分離得到。
      [0054]在本發(fā)明中,所述細(xì)胞為活細(xì)胞或死細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)。
      [0055]在本發(fā)明中,所述細(xì)胞可以是單一類(lèi)型的細(xì)胞,也可以是含有多種細(xì)胞的混合物,例如可以是同時(shí)含有T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的混合物,或者還同時(shí)含有單核細(xì)胞或其他細(xì)胞組分。
      [0056]在本發(fā)明中,所述細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域公知,例如可以從外周血中分離,也可以從骨髓中分離,或者可以從組織中分離。
      [0057]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述細(xì)胞從脾臟中分離,所得到的脾細(xì)胞主要含有淋巴細(xì)胞。
      [0058]在本發(fā)明中,所述蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物中的連接接頭是雙功能交聯(lián)劑分別與蛋白和細(xì)胞發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后形成的連接基團(tuán)。
      [0059]在本發(fā)明中,所述雙功能交聯(lián)劑是指同時(shí)含有可以與蛋白偶聯(lián)(即形成共價(jià)連接)的基團(tuán),和與細(xì)胞偶聯(lián)(即形成共價(jià)連接)的基團(tuán)的化合物。
      [0060]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述能與氨基結(jié)合的基團(tuán)可以用于與蛋白偶聯(lián),所述能與巰基結(jié)合的基團(tuán)可以用于與細(xì)胞偶聯(lián)(見(jiàn)圖1)
      [0061]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述的雙功能交聯(lián)劑同時(shí)含有琥珀酰亞氨基和馬來(lái)酰亞氨基基團(tuán)。其中琥珀酰亞氨基用于和蛋白偶聯(lián),馬來(lái)酰亞氨基用于和細(xì)胞偶聯(lián)。
      [0062]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述雙功能交聯(lián)劑的琥珀酰亞氨基與蛋白上的游離氨基反應(yīng)形成酰胺鍵,所述雙功能交聯(lián)劑的馬來(lái)酰亞氨基與游離巰基反應(yīng)形成硫醚鍵(見(jiàn)圖1)。
      [0063]在本發(fā)明中,所述酰胺鍵是指-CO-NH-;在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述酰胺鍵是指SMCC的琥珀酰亞氨基與蛋白分子中的游離氨基通過(guò)“click”化學(xué)反應(yīng)形成的基團(tuán)。
      [0064]在本發(fā)明中,所述硫醚鍵是指R1-S-R2,其中R為有機(jī)基團(tuán);在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述硫醚鍵是指馬來(lái)酰亞氨基和細(xì)胞膜上游離巰基之間形成的共價(jià)鍵。
      [0065]本領(lǐng)域公知的但本發(fā)明未列舉的其它雙功能交聯(lián)劑例如同時(shí)含有琥珀酰亞氨基和馬來(lái)酰亞氨基基團(tuán)的交聯(lián)劑也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
      [0066]在本發(fā)明中,所述蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物的制備方法包括先將蛋白與雙功能交聯(lián)劑偶聯(lián)的步驟,以及將連接了雙功能交聯(lián)劑的蛋白與細(xì)胞偶聯(lián)的步驟,優(yōu)選地,在與細(xì)胞偶聯(lián)前還包括去除未連接的雙功能交聯(lián)劑的步驟,或者優(yōu)選地,在與細(xì)胞偶聯(lián)后還包括去除游離的連接了雙功能交聯(lián)劑的蛋白的步驟;或者
      [0067]其包括先將細(xì)胞與雙功能交聯(lián)劑偶聯(lián)的步驟,以及將連接了雙功能交聯(lián)劑的細(xì)胞與蛋白偶聯(lián)的步驟,優(yōu)選地,在與蛋白偶聯(lián)前還包括去除未連接的雙功能交聯(lián)劑的步驟,或者優(yōu)選地,在與蛋白偶聯(lián)后還包括去除未連接的蛋白的步驟。
      [0068]在本發(fā)明中,既可以先將蛋白與雙功能交聯(lián)劑偶聯(lián),再將連接了雙功能交聯(lián)劑的蛋白與細(xì)胞偶聯(lián),也可以先將細(xì)胞與雙功能交聯(lián)劑偶聯(lián),再將連接了雙功能交聯(lián)劑的細(xì)胞與蛋白偶聯(lián)。
      [0069]在本發(fā)明中,所述去除未連接的雙功能交聯(lián)劑的方法為本領(lǐng)域公知的方法,可以根據(jù)偶聯(lián)分子的大小選擇適合的方法,例如可以為切向流過(guò)濾法(TFF)、吸附色譜法例如高壓液相色譜法、吸附過(guò)濾法、選擇性沉淀法或透析法等。
      [0070]在本發(fā)明中,所述將細(xì)胞與游離的蛋白分離的方法為本領(lǐng)域公知,例如可通過(guò)離心的方法去除含有細(xì)胞的溶液中的蛋白。
      [0071]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,將雙功能交聯(lián)劑與蛋白或細(xì)胞進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí),均在溶液中進(jìn)行。反應(yīng)溶液可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員分別根據(jù)蛋白和細(xì)胞的性質(zhì)進(jìn)行選擇。在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述反應(yīng)在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述雙功能交聯(lián)劑溶解于二甲基亞砜。
      [0072]在本發(fā)明中,所述偶聯(lián)是指兩分子之間或分子與細(xì)胞之間通過(guò)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)連接。
      [0073]在本發(fā)明中,所述緩沖溶液是指由“弱酸及其共軛堿”或“弱堿及其共軛酸”所組成的緩沖對(duì)配制的,能夠在加入一定量其他物質(zhì)時(shí)減緩PH改變的溶液。
      [0074]在本發(fā)明中,所述與蛋白相關(guān)的疾病例如可以為與腫瘤抗原蛋白相關(guān)的腫瘤,或者與病原微生物已知表面特異的抗原蛋白相關(guān)的感染性疾病,或者與自身抗原蛋白相關(guān)的自身免疫性疾病,或者其它已知的與蛋白相關(guān)、通過(guò)激發(fā)對(duì)該蛋白的免疫反應(yīng)或引起對(duì)該蛋白的免疫耐受即可以用于預(yù)防或治療的疾病。
      [0075]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,抗原是癌癥抗原。如這里使用的“癌癥抗原”是與腫瘤或癌細(xì)胞表面相關(guān)的化合物,如肽或蛋白,而且在抗原遞呈細(xì)胞表面表達(dá)時(shí),其能引起免疫應(yīng)答。癌癥抗原可以通過(guò)制備癌細(xì)胞的粗提物,例如,如Cohen PA等(1994) Cancer Res54:1055-8中所述,通過(guò)部分純化抗原,通過(guò)重組技術(shù),或通過(guò)已知抗原的從頭合成,從癌細(xì)胞制備。癌癥抗原包括但不限于,重組表達(dá)的抗原,腫瘤或癌癥的免疫原性部分或全部。這些抗原可以分離的,或重組或通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何其它方法制備的。
      [0076]術(shù)語(yǔ)“癌癥抗原”和“腫瘤抗原”可以互換使用,而且指由癌細(xì)胞差示表達(dá)的抗原,并因此可以開(kāi)發(fā)以便用于靶向癌細(xì)胞。癌癥抗原是可能刺激明顯的腫瘤特異性免疫應(yīng)答的抗原。這些抗原的一些是由正常細(xì)胞編碼的,盡管未必表達(dá)。這些抗原可以表征為其在正常細(xì)胞中一般沉默的(即,不表達(dá))抗原,只在分化的某些階段表達(dá)的抗原,以及短暫表達(dá)的如胚胎和胎兒抗原。其它的癌癥抗原由突變體細(xì)胞基因編碼,如致癌基因(例如,激活的ras致癌基因),抑制基因(例如,突變體P53),源于內(nèi)部缺失或染色體易位的融合蛋白質(zhì)。其它的癌癥抗原還可以是由病毒基因編碼的,如RNA和DNA腫瘤病毒中攜帶的那些。腫瘤抗原的例子包括MAGE,MART-1/Me lan-A, gplOO, 二肽基肽酶IV(DPPIV),腺嘌呤核苷脫氨酶-結(jié)合蛋白(ADAbp),親環(huán)蛋白b,結(jié)腸直腸相關(guān)抗原(CRC)-C017-1A/GA733,癌胚抗原(CEA)和它的免疫原性抗原表位CAP-1和CAP-2,etv6, ami I,前列腺特異性抗原(PSA)和它的免疫原性抗原表位PSA-1,PSA-2,和PSA-3,前列腺特異性膜抗原(PSMA),T-細(xì)胞受體/□)3-ζ 鏈,腫瘤抗原的 MAGE 家族例如,MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5,MAGE-A6,MAGE-A7,MAGE-A8,MAGE-A9,MAGE-AlO,MAGE-AlI,MAGE-Al2, MAGE_Xp2(MAGE-B2),MAGE-Xp3(MAGE-B3),MAGE_Xp4(MAGE-B4),MAGE-Cl,MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5),腫瘤抗原的 GAGE 家族(例如,GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7,GAGE-8, GAGE-9),BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4,酪氨酸酶,p53, MUC 家族,HER2/neu,p2 Iras,RCASl,α -甲胎蛋白,E-桑椹粘著蛋白,α-連環(huán)蛋白,β-連環(huán)蛋白和Y-斑珠蛋白,pl20ctn, gpl00Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27,腺瘤的多發(fā)性息肉大腸桿菌蛋白(APC),鈣影蛋白,連接蛋白37,Ig-個(gè)體基因型,pl5,gp75,GM2和⑶2神經(jīng)節(jié)糖苷,病毒產(chǎn)物如人類(lèi)乳頭狀瘤病毒蛋白質(zhì),腫瘤抗原的Smad家族,lmp-1,PlA, EBV編碼的核抗原(EBNA)-1,腦糖原磷酸化酶,SSX-1, SSX-2 (H0M-MEL-40),SSX-1, SSX-4,SSX-5,SCP-1 和CT-7 以及 c-erbB-2。
      [0077]與這些腫瘤相關(guān)(而不是專門(mén)地)的癌癥或腫瘤和腫瘤抗原,包括急性淋巴母細(xì)胞性白血病(etv6 ;amll ;親環(huán)蛋白b), B細(xì)胞淋巴瘤(Ig-個(gè)體基因型),神經(jīng)膠質(zhì)瘤(E-桑椹粘著蛋白;α -連環(huán)蛋白;β -連環(huán)蛋白;Υ -斑珠蛋白;pl20ctn),膀胱癌(p21ras),膽癌癥(p21ras),乳腺癌(MUC 家族;HER2/neu ;c-erbB-2),宮頸癌(p53 ;p21ras),結(jié)腸癌(p21ras ;HER2/neu ;c-erbB-2 ;MUC家族),結(jié)腸直腸癌(結(jié)腸直腸相關(guān)的抗原(CRC)-C017-1A/GA733 ;APC),絨毛膜癌(CEA),上皮細(xì)胞癌癥(親環(huán)蛋白b),胃癌(HER2/neu ;c-erbB-2 ;ga733糖蛋白),肝細(xì)胞癌(α-胎兒球蛋白),霍奇金淋巴瘤(lmp-1 ;EBNA-1),肺癌(CEA;MAGE-3 ;NY-ES0_1),淋巴樣細(xì)胞起源的白血病(親環(huán)蛋白b),黑素瘤(P15蛋白,gp75,癌胚抗原,GM2和⑶2神經(jīng)節(jié)糖苷),骨髓瘤(MUC家族;p21ras),非小細(xì)胞肺癌(HER2/neu ;c-erbB-2),鼻咽癌(lmp-1 ;EBNA-1),卵巢癌(MUC 家族;HER2/neu ;c-erbB-2),前列腺癌(前列腺特異性抗原(PSA)和它的免疫原性抗原表位PSA-1,PSA-2,和 PSA-3 ;PSMA ;HER2/neu ; c-erbB-2),胰腺癌(p21ras ;MUC 家族;HER2/neu ; c-erbB-2 ;ga733糖蛋白),腎癌(HER2/neu ;c-erbB-2),宮頸和食管的鱗狀上皮細(xì)胞癌(病毒產(chǎn)物如人乳頭狀瘤病毒蛋白質(zhì)),睪丸癌(NY-ESO-1),T細(xì)胞白血病(HTLV-1抗原表位),以及黑素瘤(Melan-A/MART-1 ;cdc27 ;MAGE-3 ;p21ras ^plOOftie1117)。
      [0078]在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述惡性腫瘤包括,但不限于,皮膚基底細(xì)胞癌,膽道癌;膀胱癌;骨癌;腦和CNS癌;乳腺癌;宮頸癌;絨毛膜癌;結(jié)腸和直腸癌;結(jié)締組織癌;消化系統(tǒng)的癌癥;子宮內(nèi)膜的癌癥;食道癌;眼癌;頭部和頸部的癌癥;胃癌;上皮細(xì)胞內(nèi)的贅生物;腎癌;喉癌;白血病;肝癌;肺癌(例如小細(xì)胞和非小細(xì)胞);淋巴瘤包括霍奇金的和非霍奇金的淋巴瘤;黑素瘤;骨髓瘤;成神經(jīng)細(xì)胞瘤;口腔癌(例如,唇,舌,口腔和咽);卵巢癌;胰腺癌;前列腺癌;成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤;橫紋肌肉瘤;直腸癌;腎癌;呼吸系統(tǒng)的癌;肉瘤;皮膚癌;胃癌;睪丸癌;甲狀腺癌;子宮癌;泌尿系統(tǒng)的癌癥以及其它的癌和肉瘤。所述腫瘤相關(guān)抗原例如為肝癌的甲胎蛋白,黑色素瘤的酪氨酸酶相關(guān)蛋白2等。
      [0079]在本發(fā)明中,所述感染性疾病例如為細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)相關(guān)的感染性疾病。
      [0080]其中所述病毒包括,但不限于:逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如,人類(lèi)免疫缺陷性病毒,如HIV-1(也稱為HDTV-1II,LAVE或HTLV-1II/LAV,或HIV-1II ;以及其它的分離物,如HIV-LP ;細(xì)小核糖核酸病毒(例如骨髓灰白質(zhì)炎病毒,甲型肝炎病毒;腸道病毒,人柯薩奇病毒,鼻病毒,人腸道孤病毒)Aalciviridae (例如引起胃腸炎的菌株);披蓋病毒科(例如馬腦炎病毒,風(fēng)疹病毒);Flaviridae (例如登革熱病毒,腦炎病毒,黃熱病毒);冠狀病毒科(例如冠狀病毒);彈狀病毒科(例如水泡性口膜炎病毒,狂犬病病毒);纖絲病毒科(例如埃博拉病毒);副粘病毒科(例如副流感病毒,腮腺炎病毒,麻疹病毒,呼吸道合胞病毒);正粘病毒科(例如流感病毒);Bungaviridae(例如漢坦病素,寄生性野菰病毒,白蛉病毒和內(nèi)羅病毒);沙粒病毒科(出血熱病毒);呼腸孤病毒科(例如呼腸孤病毒,環(huán)狀病毒和輪狀病毒);雙核糖核酸病毒科;肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒);微小病毒科(細(xì)小病毒);乳多空病毒科(乳頭狀瘤病毒,多形瘤病毒);腺病毒科(大多數(shù)腺病毒);皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV) I和2,水痘帶狀皰疹病毒,巨細(xì)胞病毒(CMV),皰疹病毒;痘病毒科(天花病毒,牛痘病毒,痘病毒);和虹彩病毒科(例如非洲豬瘟病毒);以及未分類(lèi)的病毒(例如Δ肝炎因子(認(rèn)為是乙型肝炎病毒的缺陷隨體),非甲非乙型肝炎因子(I類(lèi)=內(nèi)部傳送;2類(lèi)=胃腸外傳送(即丙型肝炎);諾瓦克和相關(guān)病毒,以及星狀病毒)。
      [0081]所述細(xì)菌包括革蘭氏陰性與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,都用作脊椎動(dòng)物中的抗原。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括,但不限于,巴斯德菌屬,葡萄球菌屬和鏈球菌屬菌種。革蘭氏陰性細(xì)菌包括,但不限于,大腸桿菌,假單胞菌屬和沙門(mén)氏菌屬菌種。感染菌的具體實(shí)例包括,但不限于,幽門(mén)螺桿菌,布氏疏螺旋體,侵肺軍團(tuán)菌,分支桿菌屬數(shù)種(例如結(jié)核分支桿菌,鳥(niǎo)分支桿菌,胞內(nèi)分支桿菌,堪薩斯分支桿菌,戈登分支桿菌),金黃色葡萄球菌,淋病奈瑟氏菌,腦膜炎奈瑟氏球菌,單核細(xì)胞增生利斯特氏菌,釀膿鏈球菌(A組鏈球菌屬),無(wú)乳鏈球菌(B組鏈球菌屬),鏈球菌屬(viridans組),糞鏈球菌,牛鏈球菌,鏈球菌屬(厭氧種),肺炎鏈球菌,病原性的彎曲桿菌屬菌種,腸球菌菌種,流感嗜血桿菌,炭疽桿菌,白喉棒桿菌,棒狀桿菌屬菌種,紅斑丹毒絲菌,產(chǎn)氣莢膜梭菌,破傷風(fēng)桿菌,產(chǎn)氣腸桿菌,克雷白氏桿菌,多殺巴斯德氏菌,畸形菌體菌種,具核梭桿菌,念珠狀鏈桿菌,蒼白密螺旋體,雅司螺旋體,鉤端螺旋體屬,立克次氏體和伊氏放線菌。
      [0082]真菌的實(shí)例包括新型隱球菌,莢膜組織胞漿菌,粗球孢子菌,皮炎芽生菌,沙眼衣原體,白色假絲酵母。
      [0083]寄生蟲(chóng)例如包括瘧原蟲(chóng)屬數(shù)種如鐮狀瘧原蟲(chóng),三日瘧原蟲(chóng),卵形瘧原蟲(chóng),和間日瘧原蟲(chóng)以及龔地弓形蟲(chóng)。血液帶有的和/或組織寄生蟲(chóng)包括瘧原蟲(chóng)屬數(shù)種,果氏巴貝蟲(chóng),分歧巴貝蟲(chóng),熱帶利什曼蟲(chóng),利什曼原蟲(chóng)數(shù)種,巴西利什曼蟲(chóng),杜氏利什曼蟲(chóng),岡比亞錐蟲(chóng)和羅德西亞錐蟲(chóng)(非洲昏睡病),南美洲錐蟲(chóng)(恰加斯氏病)和龔地弓形蟲(chóng)。
      [0084]大部分感染性疾病相關(guān)蛋白抗原都已被闡述。如:乙型肝炎的表面抗原蛋白,艾滋病的HIV病毒相關(guān)蛋白,多數(shù)細(xì)菌的膜蛋白,真菌的菌壁蛋白,寄生蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程不同階段中的蟲(chóng)體蛋白等。
      [0085]在本發(fā)明中,所述自身免疫性疾病包括,但不限于,類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,強(qiáng)直性脊柱炎,變異性皮膚病,克羅恩氏病,多發(fā)性硬化,系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE),自身免疫腦脊髓炎,重癥肌無(wú)力(MG),橋本氏甲狀腺炎,古德帕斯徹氏綜合征,天皰瘡(例如,尋常天皰瘡),Grave氏病,自身免疫性溶血性貧血,自身免疫性血小板減少性紫癜,帶有抗膠原蛋白抗體的硬皮病,混合結(jié)締組織病,多肌炎,惡性貧血,自發(fā)的青銅色皮膚病,自身免疫相關(guān)的不育癥,血管球性腎炎(例如,新月形的血管球性腎炎,增生性的血管球性腎炎),大皰的類(lèi)天皰瘡,舍格倫氏綜合征,胰島素抵抗力和自身免疫糖尿病等。部分自身免疫病的疾病相關(guān)自身抗原已經(jīng)闡明,如:1型糖尿病的胰島beta細(xì)胞抗原,多發(fā)性硬化的神經(jīng)鞘膜細(xì)胞抗原,牛皮癬的Pso p27,類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的hsp90,克隆氏病的⑶ZDl和JP2等。
      [0086]在本發(fā)明中,可以根據(jù)細(xì)胞的用途來(lái)決定使用活細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。例如當(dāng)用于激發(fā)人體的免疫反應(yīng)以預(yù)防或治療腫瘤或感染性疾病時(shí),可以采用活細(xì)胞;當(dāng)用于引起對(duì)自身或外來(lái)抗原的免疫耐受以預(yù)防或治療自身免疫性疾病時(shí),可以采用凋亡細(xì)胞(因穩(wěn)態(tài)凋亡細(xì)胞具有誘導(dǎo)免疫耐受的特性)。
      [0087]所述制備凋亡細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域公知,例如可以采用紫外線照射偶聯(lián)有蛋白的細(xì)胞使細(xì)胞發(fā)生凋亡。
      [0088]在本發(fā)明中,當(dāng)用于上述用途時(shí),可以采用自體細(xì)胞或異體細(xì)胞。當(dāng)用于預(yù)防或治療自身免疫性疾病時(shí),優(yōu)選采用自體細(xì)胞。
      [0089]發(fā)明的有益效果
      [0090]本發(fā)明利用雙功能交聯(lián)劑將蛋白和細(xì)胞方便高效地聯(lián)結(jié)起來(lái),得到蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物??梢愿鶕?jù)所得到偶聯(lián)物中蛋白和細(xì)胞的性質(zhì)用于多種用途,例如可以利用細(xì)胞的靶向性或者抗原提呈作用,更好地發(fā)揮蛋白的免疫作用,同時(shí),用細(xì)胞攜帶的很小量的蛋白即可達(dá)到用大量游離可溶性蛋白直接免疫所得到的效果,避免了大量蛋白直接免疫所帶來(lái)的負(fù)作用。

      【專利附圖】

      【附圖說(shuō)明】
      [0091]圖1蛋白、細(xì)胞與SMCC偶聯(lián)示意圖。圖中protein指的是蛋白分子,cell指的是細(xì)胞。
      [0092]圖2KLH與SMCC偶聯(lián)后的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
      [0093]圖3KLH與SMCC反應(yīng)體系透析前后的高壓液相色譜分析圖;左邊的峰為KLH峰,右邊的峰為SMCC峰;其中左邊的峰三條曲線從上到下依次是SMCC+KLH透析前,SMCC+KLH透析后,SMCC,右邊的峰三條曲線從上到下依次是SMCC+KLH透析前,SMCC, SMCC+KLH透析后。左邊縱坐標(biāo)為紫外光的吸光度(AU),下方的橫坐標(biāo)是保留時(shí)間(Min Tenth),單位min,右邊縱坐標(biāo)為電導(dǎo)率(conductivity),單位為毫西門(mén)子/厘米(mS/cm),上方的橫坐標(biāo)為管號(hào)。
      [0094]圖4小鼠脾細(xì)胞表面巰基分布的流式細(xì)胞分析圖
      [0095]其中A為細(xì)胞未經(jīng)任何染色(陰性對(duì)照),B為未與SMCC-KLH偶聯(lián)的細(xì)胞經(jīng)連有熒光素的馬來(lái)亞酰胺染色(反映細(xì)胞表面巰基水平),C為與SMCC-KLH偶聯(lián)的細(xì)胞經(jīng)連有熒光素的馬來(lái)亞酰胺染色和抗一 KLH-PE染色(因SMCC占有了部分巰基,因此熒光素的馬來(lái)亞酰胺染色減弱)。
      [0096]圖5KLH-SMCC與脾細(xì)胞偶聯(lián)前后的細(xì)胞上清中蛋白含量(A)及偶聯(lián)前后SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(B)。
      [0097]圖6KLH-SMCC-脾細(xì)胞與KLH免疫動(dòng)物誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的比較流式細(xì)胞分析圖
      [0098]其中A為接受KLH-SMCC-脾細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞體外不接受任何刺激(只有培養(yǎng)液),B為接受KLH-SMCC-脾細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞體外接受無(wú)關(guān)蛋白-人白蛋白(ALB)刺激(陰性對(duì)照),C為接受KLH-SMCC-脾細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞在體外接受植物血凝素(PHA)的刺激(陽(yáng)性對(duì)照),D為接受KLH-SMCC-脾細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞體外接受KLH的刺激,E為接受KLH免疫的小鼠脾細(xì)胞體外不接受任何刺激,F(xiàn)為接受KLH免疫的小鼠脾細(xì)胞體外接受ALB刺激,G為接受KLH免疫的小鼠脾細(xì)胞體外接受PHA刺激,H為接受KLH免疫的小鼠脾細(xì)胞體外接受KLH刺激。
      [0099]圖7KLH-SMCC-脾細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)。
      [0100]圖8SMCC-胰島素偶聯(lián)脾細(xì)胞膜表面偶聯(lián)胰島素的免疫熒光測(cè)定;其中A為與胰島素孵育的脾細(xì)胞,B為與SMCC-胰島素孵育的脾細(xì)胞。

      【具體實(shí)施方式】
      [0101]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解,下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明,而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者,按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者,均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
      [0102]實(shí)施例1抗原與琥珀酰亞胺基4-[N_馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物(SMCC)的偶聯(lián)
      [0103]I)取工具抗原雪藍(lán)蛋白(KLH) (Thermoscientific公司,貨號(hào)77653),用PBS溶液配制成10mg/ml的溶液,取SMCC (Thermoscientific公司,美國(guó),貨號(hào)22360)用二甲基亞砜配制成1mM溶液。取0.3mlKLH溶液與30 μ I的上述SMCC溶液在3ml PBS的反應(yīng)體系中,室溫下共孵育30min,反應(yīng)后的蛋白接下來(lái)進(jìn)行SMCC連結(jié)效率的測(cè)定。
      [0104]2)蛋白電泳測(cè)定SMCC的連結(jié)效率:取上述反應(yīng)后的蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,對(duì)照為KLH蛋白,結(jié)果如圖2所示。可以看出,SMCC-KLH條帶所處位置的分子量較KLH顯著增大,SMCC-KLH條帶下面的拖尾現(xiàn)象是由于小部分KLH的氨基尚未被SMCC飽和,通過(guò)增大SMCC的濃度可改善此現(xiàn)象。
      [0105]3)游離SMCC的去除:SMCC是小分子物質(zhì),KLH-SMCC反應(yīng)體系中不可避免地存在游離SMCC,而游離SMCC會(huì)嚴(yán)重影響KLH-SMCC與細(xì)胞的偶聯(lián)。取步驟I)反應(yīng)后所得的溶液用2LPBS溶液進(jìn)行透析,室溫,過(guò)夜。透析后分別對(duì)透析前后的蛋白進(jìn)行高壓液相色譜分析,結(jié)果如圖3所示??梢钥闯?,經(jīng)過(guò)透析,SMCC峰基本消失,表明游離SMCC已基本去除。透析后的蛋白經(jīng)凍干后一 80°C保存。
      [0106]實(shí)施例2KLH-SMCC與小鼠脾細(xì)胞的偶聯(lián)
      [0107]I)脾細(xì)胞表面巰基的分布:
      [0108]首先制備脾細(xì)胞。取出Balb/c小鼠的新鮮脾臟,放入帶毛玻璃表面小器皿,然后用帶毛玻璃面的缽杵輕輕研磨,將脾臟制備成細(xì)胞勻漿。然后用紅細(xì)胞溶解液(美國(guó)BD公司生產(chǎn),貨號(hào):349202)將紅細(xì)胞溶解,獲得脾臟的單個(gè)核細(xì)胞。脾臟的單個(gè)核細(xì)胞(其中淋巴細(xì)胞占95%以上)經(jīng)PBS溶液洗滌后,重懸于PBS溶液中。用馬來(lái)酰胺熒光素試劑(Fluorescein-5maleimide,maleimide-FL,ANA Spec 公司,貨號(hào) 81405)對(duì)小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞表面的巰基分布進(jìn)行檢測(cè),具體方法為,maleimide-FL試劑(按廠家說(shuō)明書(shū))與脾細(xì)胞室溫下孵育30min,使馬來(lái)酰胺基團(tuán)與細(xì)胞膜上的巰基反應(yīng)。用PBS溶液洗細(xì)胞2次后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞膜表面巰基的密度,結(jié)果如圖4所示。
      [0109]2) KLH-SMCC與小鼠脾細(xì)胞的偶聯(lián)及檢測(cè):
      [0110]小鼠脾細(xì)胞(I X 17個(gè))與實(shí)施例1制備的KLH-SMCC按IxlO7脾細(xì)胞/ 0.2mlPBS /
      0.2mg KLH-SMCC (0.2mg指KLH的量)配比,室溫下相互作用30min,用PBS溶液洗細(xì)胞2次去除未與細(xì)胞結(jié)合的KLH-SMCC。然后,用ant1-KLH-PE (BD公司,美國(guó),貨號(hào)560720)和馬來(lái)酰胺熒光素染色分別檢測(cè)偶聯(lián)到細(xì)胞膜上的KLH和細(xì)胞表面游離的巰基,結(jié)果如圖4所示,表明KLH-SMCC能夠有效地與細(xì)胞偶聯(lián),得到KLH偶聯(lián)脾細(xì)胞(KLH-SMCC-脾細(xì)胞)。
      [0111]3)為了進(jìn)一步驗(yàn)證KLH是否偶聯(lián)到細(xì)胞上,取與細(xì)胞反應(yīng)前后的溶液進(jìn)行蛋白的ELISA含量測(cè)定(蛋白濃度測(cè)定試劑盒來(lái)自ThermoScientific公司,貨號(hào)23225),結(jié)果顯示,反應(yīng)后的蛋白量有少量減少,與細(xì)胞反應(yīng)前的上清中測(cè)到的KLH蛋白濃度是3.633 ± 0.088mg/ml,反應(yīng)后上清中測(cè)到的KLH蛋白濃度是3.50 ± 0.058mg/ml,表明KLH已偶聯(lián)到細(xì)胞上(圖5A)。偶聯(lián)到細(xì)胞上的蛋白量可按下式計(jì)算:((3.633-3.50) /3.633) X 0.2mg (反應(yīng)前溶液實(shí)際 SMCC-KLH 的含量)=0.0074mg,因此,連接到IX 17個(gè)脾細(xì)胞上的蛋白的量約為0.0074mg。取與細(xì)胞反應(yīng)前后的溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果與ELISA結(jié)果一致,如圖5B所示,反應(yīng)后的電泳條帶密度較反應(yīng)前區(qū)別不明顯,表明有少量蛋白偶聯(lián)到細(xì)胞上。
      [0112]實(shí)施例3KLH偶聯(lián)脾細(xì)胞的活性實(shí)驗(yàn)
      [0113]I) KLH偶聯(lián)脾細(xì)胞誘導(dǎo)的對(duì)KLH的免疫反應(yīng)
      [0114]取實(shí)施例2制備的KLH偶聯(lián)脾細(xì)胞(KLH-SMCC-脾細(xì)胞)1父107個(gè)(偶聯(lián)到細(xì)胞上的KLH的量約為0.0074mg),尾靜脈注射小鼠,對(duì)照采用0.4mg KLH,進(jìn)行腹腔注射,另一組對(duì)照采用IxlO7個(gè)未偶聯(lián)脾細(xì)胞進(jìn)行尾靜脈注射(每組3只Balb/c小鼠)。每周注射I次,注射兩次,第二次注射后I周處死小鼠,取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng)檢測(cè)。小鼠脾細(xì)胞用羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE,Invitrogen公司,貨號(hào)C34554)熒光染色,染色方法為采用ΙμΜ CFSE加入含有2χ107細(xì)胞的2ml細(xì)胞溶液中,37°C條件下染色lOmin,然后,1ml PBS溶液1200轉(zhuǎn)離心洗細(xì)胞兩次,然后重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中供隨后的細(xì)胞培養(yǎng)用。染色后的脾細(xì)胞(I X 16/孔)分別用KLH (10^/1111)、人白蛋白(六1^,10^/1111) (Baxten公司,貨號(hào)VNAM068)、ΡΗΑ(10μ g/ml) (Sigma公司,貨號(hào):L_8754)和含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)刺激培養(yǎng),4_5天后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞分裂增殖情況。細(xì)胞分裂次數(shù)越多,則CFSE在細(xì)胞上的熒光強(qiáng)度越低,因此,根據(jù)CFSE熒光強(qiáng)度可以判定細(xì)胞的增殖情況。如圖6所示,KLH偶聯(lián)脾細(xì)胞輸注誘導(dǎo)了很強(qiáng)的對(duì)KLH的免疫反應(yīng),雖然偶聯(lián)到細(xì)胞上的KLH的量很小,其免疫反應(yīng)強(qiáng)度甚至高于大量KLH蛋白免疫動(dòng)物所誘導(dǎo)的對(duì)KLH的免疫反應(yīng)。
      [0115]2)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
      [0116]用0.2mg KLH,實(shí)施例2制備的IxlO7個(gè)KLH-SMCC-脾細(xì)胞,IxlO7個(gè)脾細(xì)胞,0.2mgKLH孵育過(guò)的脾細(xì)胞(Cell-KLH,此組是為了觀察KLH與細(xì)胞自然粘附引起的免疫效應(yīng),孵育方法為IxlO7個(gè)脾細(xì)胞與0.2mgKLH在0.4ml的PBS溶液中室溫下反應(yīng)40min)免疫Balb/c小鼠(每組3只小鼠)。純KLH0.2mg和IxlO7個(gè)脾細(xì)胞分別采用腹腔和靜脈注射給小鼠,每周I次,共兩次。最后一次注射后I周將小鼠處死并分離脾細(xì)胞。脾細(xì)胞(IxlO6 /孔)在KLH(10 μ g/ml)的刺激下培養(yǎng)5天,最后16小時(shí),加入3H_TdR (0.25uCi/孔)培養(yǎng)(3H_TdR由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室提供,本實(shí)驗(yàn)委托中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室測(cè)定)。然后,液閃儀檢測(cè)3H-TdR的摻入量(cpm)。摻入量越多說(shuō)明細(xì)胞增殖越多。如圖7所示,接受KLH和KLH-SMCC-脾細(xì)胞處理的小鼠產(chǎn)生了強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng),KLH與細(xì)胞孵育但未經(jīng)SMCC偶聯(lián)的細(xì)胞只引起很低的T細(xì)胞反應(yīng),略高于接受未經(jīng)任何處理的細(xì)胞的小鼠(KLH組與之比較,p〈0.01,KLH-SMCC-脾細(xì)胞組與之比較,p〈0.01)。
      [0117]實(shí)施例4:胰島素偶聯(lián)脾細(xì)胞的膜結(jié)合胰島素的免疫熒光檢測(cè)。
      [0118]SMCC-胰島素的制備過(guò)程同實(shí)施例1中SMCC-KLH的制備。接著,按照實(shí)施例2的方法,用SMCC-胰島素與脾細(xì)胞孵育得到偶聯(lián)了胰島素的脾細(xì)胞。然后將細(xì)胞通過(guò)摔片機(jī)摔到載玻片上,通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞免疫熒光法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,具體過(guò)程參見(jiàn)胰島素?zé)晒馊旧噭┖姓f(shuō)明書(shū)(胰島素?zé)晒馊旧噭┖校琧osmob1公司,日本)。對(duì)照組為脾細(xì)胞與胰島素共孵育。從圖8可以看出,SMCC-胰島素已成功地偶聯(lián)到脾細(xì)胞上,而且強(qiáng)度較大,熒光呈環(huán)狀進(jìn)一步說(shuō)明胰島素偶聯(lián)到了細(xì)胞膜上。而對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有被染色,說(shuō)明陽(yáng)性染色為胰島素特異性染色而不是非特異性的背景染色。
      [0119]盡管本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述,本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的所有教導(dǎo),可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換,這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
      【權(quán)利要求】
      1.蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其為蛋白和細(xì)胞分別與連接接頭共價(jià)連接形成的偶聯(lián)物;優(yōu)選地,所述細(xì)胞在未偶聯(lián)時(shí),其表面分布著游離的巰基;優(yōu)選地,所述的連接接頭來(lái)源于雙功能交聯(lián)劑,所述雙功能交聯(lián)劑同時(shí)含有能與氨基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)和與巰基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)。
      2.權(quán)利要求1的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其中所述細(xì)胞為具有免疫功能的細(xì)胞;優(yōu)選地,所述細(xì)胞選自淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞中的至少一種。
      3.權(quán)利要求1或2的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其中所述的雙功能交聯(lián)劑同時(shí)含有琥珀酰亞氨基和馬來(lái)酰亞氨基基團(tuán)。
      4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其中所述的雙功能交聯(lián)劑選自琥珀酰亞氨基4- (N-馬來(lái)酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧化物(SMCC),SMCC的長(zhǎng)鏈類(lèi)似物N —琥珀酰亞氨基一 4 一(N —馬來(lái)酰亞氨基甲基)一環(huán)己烷一 I 一羧基一(6 —酰氨基己酸酯)(LC -SMCC), K 一馬來(lái)酰亞氨基i^一酸N—琥珀酰亞氨基酯(KMUA)、Y —馬來(lái)酰亞氨基丁酸N —琥珀酰亞氨基酯(GMBS)、ε 一馬來(lái)酰亞氨基己酸N—羥基琥珀酰亞氨基酯(EMCS)、間一馬來(lái)酰亞氨基苯甲?;?N—羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、N —( α 一馬來(lái)酰亞氨基乙酰氧基)一琥珀酰亞胺酯(AMAS)、琥珀酰亞氨基一 6 —( β —馬來(lái)酰亞氨基丙酰氨基)己酸酯(SMPH)或4 一(對(duì)一馬來(lái)酰亞氨基苯基)一丁酸N —琥珀酰亞氨基酯(SMPB)。
      5.權(quán)利要求3或4的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其中所述雙功能交聯(lián)劑的琥珀酰亞氨基與蛋白上的游離氨基反應(yīng)形成酰胺鍵,所述雙功能交聯(lián)劑的馬來(lái)酰亞氨基與細(xì)胞上的游離巰基反應(yīng)形成硫醚鍵。
      6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物,其中所述的蛋白選自抗原蛋白(例如腫瘤相關(guān)抗原、感染性疾病相關(guān)抗原、自身免疫性疾病相關(guān)抗原)、抗原表位、抗體、激素、生長(zhǎng)因子、維生素、集落刺激因子。
      7.蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物的制備方法,其包括以下步驟: (1)將蛋白與雙功能交聯(lián)劑接觸,以使雙功能交聯(lián)劑的連接基團(tuán)與蛋白發(fā)生共價(jià)連接,得到第一混合物,該混合物包含結(jié)合了連接基團(tuán)的蛋白; (2)任選地,還包括去除第一混合物中未連接的雙功能交聯(lián)劑的步驟,以得到純化的結(jié)合了連接基團(tuán)的蛋白; (3)將步驟(I)或(2)獲得的結(jié)合了連接基團(tuán)的蛋白與細(xì)胞接觸,以使所述連接基團(tuán)與細(xì)胞發(fā)生共價(jià)連接,得到第二混合物,該混合物包含了分別與連接接頭共價(jià)連接的蛋白和細(xì)胞偶聯(lián)物,即蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物; (4)任選地,還包括去除第二混合物中未與細(xì)胞連接的蛋白的步驟,以得到純化的包含有蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物的第二混合物; 或者,所述制備方法包括以下步驟: Ca)將細(xì)胞與雙功能交聯(lián)劑接觸,以使雙功能交聯(lián)劑的連接基團(tuán)與細(xì)胞發(fā)生共價(jià)連接,得到第一混合物,該混合物包含結(jié)合了連接基團(tuán)的細(xì)胞; (b)任選地,還包括去除第一混合物中未連接的雙功能交聯(lián)劑的步驟,以得到純化的結(jié)合了連接基團(tuán)的細(xì)胞; (c)將步驟(a)或(b)獲得的結(jié)合了連接基團(tuán)的細(xì)胞與蛋白接觸,以使所述連接基團(tuán)與蛋白發(fā)生共價(jià)連接,得到第二混合物,該混合物包含了分別與連接接頭共價(jià)連接的蛋白和細(xì)胞偶聯(lián)物,即蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物; Cd)任選地,還包括去除第二混合物中未與細(xì)胞連接的蛋白的步驟,以得到純化的包含有蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物的第二混合物; 優(yōu)選地,所述細(xì)胞在未偶聯(lián)時(shí),其表面分布著游離的巰基; 優(yōu)選地,所述的雙功能交聯(lián)劑同時(shí)含有能與氨基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)和與巰基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)。
      8.權(quán)利要求7的制備方法,其中所述細(xì)胞為具有免疫功能的細(xì)胞;優(yōu)選地,所述細(xì)胞選自淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞中的至少一種。
      9.權(quán)利要求7或8的制備方法,其中所述的雙功能交聯(lián)劑同時(shí)含有琥珀酰亞氨基和馬來(lái)酰亞氨基基團(tuán)。
      10.權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的制備方法,其中所述的雙功能交聯(lián)劑選自琥珀酰亞氨基4-(N-馬來(lái)酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧化物(SMCC),SMCC的長(zhǎng)鏈類(lèi)似物N —琥珀酰亞氨基一4 - (N 一馬來(lái)酰亞氨基甲基)一環(huán)己烷一 I 一羧基一(6 —酰氨基己酸酯)(LC - SMCC)、K 一馬來(lái)酰亞氨基i^一酸N—琥珀酰亞氨基酯(KMUA)、Y 一馬來(lái)酰亞氨基丁酸N—琥珀酰亞氨基酯(GMBS)、ε 一馬來(lái)酰亞氨基己酸N—羥基琥珀酰亞氨基酯(EMCS)、間一馬來(lái)酰亞氨基苯甲?;?N —羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、N - ( α 一馬來(lái)酰亞氨基乙酰氧基)一琥珀酰亞胺酯(AMAS)、琥珀酰亞氨基一 6 —( β —馬來(lái)酰亞氨基丙酰氨基)己酸酯(SMPH)或4 -(對(duì)一馬來(lái)酰亞氨基苯基)一丁酸N —琥珀酰亞氨基酯(SMPB)。
      11.權(quán)利要求9或10的制備方法,其中所述雙功能交聯(lián)劑的琥珀酰亞氨基與蛋白上的游離氨基反應(yīng)形成酰胺鍵,所述雙功能交聯(lián)劑的馬來(lái)酰亞氨基與細(xì)胞上的游離巰基反應(yīng)形成硫醚鍵。
      12.權(quán)利要求7-11任一項(xiàng)的制備方法,其中所述的蛋白選自抗原蛋白(例如腫瘤相關(guān)抗原、感染性疾病相關(guān)抗原、自身免疫性疾病相關(guān)抗原)、抗原表位、抗體、激素、生長(zhǎng)因子、維生素、集落刺激因子。
      13.權(quán)利要求7-12任一項(xiàng)的制備方法,其特征在于以下(I)?(4)項(xiàng)中的一項(xiàng)或多項(xiàng): (1)所述接觸時(shí)的溫度為4?40°C,優(yōu)選6?37°C,更優(yōu)選15?25°C,例如為室溫; (2)所述接觸的時(shí)間為10?60min,優(yōu)選20?50min,更優(yōu)選30?40min; (3)所述接觸發(fā)生在溶液中,所述溶液例如為生理鹽水或緩沖溶液,所述緩沖溶液例如為磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、酒石酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液; (4)所述接觸時(shí)的pH值為4.0?9.0,優(yōu)選為6.0?8.0,優(yōu)選為6.5?7.5,更優(yōu)選為7.0 ?7.2。
      14.權(quán)利要求1一 6任一項(xiàng)的蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物在制備藥物和/或疫苗中的用途,所述藥物和/或疫苗用于預(yù)防或治療以下疾病中的一項(xiàng)或多項(xiàng): (O與所述蛋白-細(xì)胞偶聯(lián)物中的蛋白相關(guān)的疾??; (2)惡性腫瘤; (3)病原微生物感染性疾?。? (4)自身免疫性疾病。
      【文檔編號(hào)】A61P37/02GK104232576SQ201310234603
      【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月14日
      【發(fā)明者】夏長(zhǎng)青, 郭軼先, 萬(wàn)歲桂 申請(qǐng)人:加思葆(北京)醫(yī)藥科技有限公司
      網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
      • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1