一種包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體、其制備方法以及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體及其制備方法和用途。本發(fā)明中包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體，由治療性抗體和脂質(zhì)體成分組成，以脂質(zhì)體為載體，包含長循環(huán)輔料。脂質(zhì)體是以磷脂、膽固醇和長循環(huán)脂質(zhì)體輔料為材料制成。本發(fā)明的長循環(huán)脂質(zhì)體能夠長時(shí)間、穩(wěn)定的釋放抗體活性成分，使玻璃體腔內(nèi)的藥物存在時(shí)間較單純注射抗體延長3倍，注射后能夠長期有效的治療眼內(nèi)炎癥，減輕視網(wǎng)膜的損傷。能減少給藥次數(shù)，降低治療的風(fēng)險(xiǎn)，提高對(duì)眼部疾病的療效，同時(shí)減少全身不良反應(yīng)，具有新的臨床實(shí)用價(jià)值。
【專利說明】一種包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體、其制備方法以及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體、制備方法以 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自身免疫性眼科炎癥性疾病由于其病因復(fù)雜、治療效果不一、往往伴有副作用等 現(xiàn)狀，是目前眼科疾病的難題之一。例如，葡萄膜視網(wǎng)膜炎就是一類復(fù)雜的自身免疫性眼科 炎癥性疾病，它多發(fā)生于青壯年，常反復(fù)發(fā)作，易導(dǎo)致盲目，且多為不可治盲，因此在致盲眼 病中占有重要地位。葡萄膜視網(wǎng)膜炎的治療一直是眼科的難題。研究表明，腫瘤壞死因子 a (TNF-a )是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的促炎癥細(xì)胞因子，在人體正常的免疫功能和多數(shù)自身 免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。很多研究表明，TNF-a在強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎等的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。在葡萄膜視網(wǎng)膜 炎的研究中發(fā)現(xiàn)，活化的炎癥細(xì)胞分泌TNF-a，而TNF-a又促進(jìn)炎癥細(xì)胞進(jìn)一步活化，力口 速趨化因子和粘附分子的合成，促進(jìn)中性粒細(xì)胞在眼內(nèi)聚集，T淋巴細(xì)胞增生活躍，從而引 起眼組織的免疫病理損傷。
[0003] TNF-a是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于中心位置的細(xì)胞因子，所以，中和TNF- a可以改善 機(jī)體的炎癥狀態(tài)，有效的治療疾病?？鼓[瘤壞死因子a單克隆抗體（Infliximab單抗）是 一種新型的生物單抗制劑，其商品名為類克（Remicade)，是人/鼠嵌合的抗TNF-a IgGl K 同型鏈單克隆抗體（75%為人源化，25%為鼠源化），它與巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的細(xì)胞膜表面 TNF-a高親和結(jié)合，通過經(jīng)典的補(bǔ)體激活途徑和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC 作用）導(dǎo)致細(xì)胞溶解，從而使TNF-a喪失生物活性。另外Infliximab還可以和可溶性的 TNF-a結(jié)合，從而抑制TNF-a與其受體的相互作用。目前Infliximab主要用在治療類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、克羅恩病以及自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎等疾病，自2007年9月 上市以來，以其良好的臨床療效，成為各大醫(yī)院治療這類疾病的有效用藥。
[0004] 在Infliximab顯示良好治療前景的同時(shí)，其不良反應(yīng)也日益受到關(guān)注。在國外的 臨床研究報(bào)告中，該藥常見的副作用是呼吸困難、上下呼吸道感染，其次是皮膚及其附屬器 的副作用。歐洲藥物評(píng)估機(jī)構(gòu)報(bào)告該藥物主要的皮膚及附屬器不良反應(yīng)包括：皮疹、瘙癢、 蕁麻疹、多汗、皮膚干燥、遲發(fā)過敏性反應(yīng)性皮炎伴嚴(yán)重脫發(fā)等。
[0005] 鑒于Infliximab全身用藥的不良反應(yīng)常見，對(duì)于眼內(nèi)炎癥性病變，可以采用玻璃 體腔內(nèi)注射的方法，既增加了眼內(nèi)局部藥物的濃度，同時(shí)又不會(huì)產(chǎn)生明顯的全身副作用。研 究表明，玻璃體腔內(nèi)注射Infliximab可以有效的治療眼內(nèi)炎癥，且不會(huì)造成毒性反應(yīng)。但 是，由于眼內(nèi)的炎癥往往是慢性反復(fù)發(fā)作的，一次性給藥后，在短期內(nèi)玻璃體的藥物濃度就 會(huì)下降，不能長期控制炎癥；而且，在眼內(nèi)炎癥的過程中，血-眼屏障被破壞，血液中的成分 進(jìn)入眼內(nèi)，炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子聚集，加速藥物的清除。因此，要長期有效的控制炎癥，往往 需要重復(fù)注射。但是，反復(fù)進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)注藥會(huì)增加手術(shù)帶來的風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥。而且， 一次性給藥會(huì)造成眼內(nèi)的藥物濃度的即刻增高，增加藥物對(duì)眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的副作用，影響療效。 因此，有必要進(jìn)行長效的新型制劑的研究，以延長有效成分在眼內(nèi)的滯留時(shí)間，保持玻璃體 內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定的藥物濃度，提高治療效果，降低副作用，同時(shí)減輕重復(fù)注射帶來的風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā) 癥。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體制劑。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述脂質(zhì)體制劑的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述脂質(zhì)體制劑在制備抗眼內(nèi)炎癥藥劑中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的一種包載治療性抗體的脂質(zhì)體，以抗腫瘤壞死因子a單克隆抗體 (Infliximab)為治療藥物舉例，由磷脂、膽固醇、長循環(huán)輔料等附加劑共同組成。本發(fā)明基 于眼內(nèi)炎癥的免疫病理學(xué)特性，以拮抗炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵性的細(xì)胞因子的特異性抗體為 治療藥物，以長循環(huán)脂質(zhì)體為載體，制備一種高效、穩(wěn)定、緩釋的抗體脂質(zhì)體。
[0010] 本發(fā)明中所述的長循環(huán)脂質(zhì)體一種包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體，由抗體和脂質(zhì)體組 成。
[0011] 其中，脂質(zhì)體為載體，抗體為包封的治療性抗體，所述的脂質(zhì)體是以磷脂、膽固醇 和長循環(huán)脂質(zhì)體輔料為材料制成。
[0012] 所述的治療性抗體可以選自抗IL-17單克隆抗體、抗IFN-Y單克隆抗體、抗IL-2 單克隆抗體、抗Infliximab單克隆抗體或者抗VEGF單克隆抗體；抗體與磷脂的比值為5? IOOu g抗體=Iumol磷脂；磷脂與膽固醇的摩爾比為1. 2?4:1 ;長循環(huán)脂質(zhì)體輔料占脂質(zhì) 體摩爾量的3%?17%。
[0013] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的治療性抗體為Infliximab單抗。
[0014] 本發(fā)明中所述的磷脂可以是大豆卵磷脂（SPC)、蛋黃卵磷脂（EPC)、二棕櫚酰磷脂 酰膽堿（DPPC)等。
[0015] 本發(fā)明中所述的長循環(huán)脂質(zhì)體輔料包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2(DSPE-PEG-Nh2)等。
[0016] 另一方面，本發(fā)明還提供了包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，包括步驟：
[0017] 1)以磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂或二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷 脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2為原料，采用薄膜水化法制備長循環(huán)脂質(zhì)體；
[0018] 2)加入含標(biāo)記染料的PBS溶液IOml超聲水化，振蕩，并用0. 22微米的聚碳酸酯膜 反復(fù)擠壓后得到標(biāo)記的包載抗體的脂質(zhì)體顆粒。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述的標(biāo)記染料為羅丹明。
[0020] 具體而言，經(jīng)過長期測(cè)試選擇了脂質(zhì)體，又通過反復(fù)試驗(yàn)優(yōu)化條件，本發(fā)明最終獲 得了高性能的Infliximab長循環(huán)脂質(zhì)體。其制備方法包括步驟：
[0021] 1?制備Infliximab長循環(huán)脂質(zhì)體
[0022] 采用薄膜水化法制備包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體。稱取大豆卵磷脂，蛋黃卵磷脂或 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2 (DSPE-PEG-Nh2)(磷 脂與膽固醇的摩爾比為1. 2?4:1 ;DSPE-PEG-NH2占脂質(zhì)摩爾量的3%?17%)，共溶于氯仿 或三氯甲烷/甲醇中作為油相，在梨形瓶中80?120r ^irT1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，然后 加入含抗體（Infliximab、抗IL-17單克隆抗體、抗IFN- Y單克隆抗體、抗IL-2單克隆抗體 或抗VEGF抗體）的PBS溶液（0. 3?2mg/mL)超聲水化，并用0. 22微米的聚碳酸酯膜反復(fù) 擠壓后得載抗體的脂質(zhì)體納米粒。
[0023] 2.制備羅丹明標(biāo)記的Infliximab長循環(huán)脂質(zhì)體
[0024] 取大豆卵磷脂，蛋黃卵磷脂或二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、DSPE-PEG-NH2 (磷脂 與膽固醇的摩爾比為1. 2?4:1 ;DSPE-PEG-NH2占脂質(zhì)摩爾量的3%?17%)，共溶于氯仿或 三氯甲烷/甲醇中作為油相，在梨形瓶中80?120r ? min-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，然后 加入含羅丹明123的PBS溶液IOml超聲水化，振蕩，并用0. 22微米的聚碳酸酯膜反復(fù)擠壓 后得載抗體的脂質(zhì)體納米粒。
[0025] 3. Infliximab長循環(huán)脂質(zhì)體的表征
[0026] 電鏡照片顯示，本發(fā)明制備的Infliximab長循環(huán)脂質(zhì)體形態(tài)呈球形，大小均勻， 外觀圓整，分散性好(如圖1所示）；
[0027] Infliximab長循環(huán)脂質(zhì)體平均粒徑為351. 3±58nm (如表1所示）；
[0028] Infliximab長循環(huán)脂質(zhì)體包封率：采用紫外分光光度法測(cè)定Infliximab長循環(huán) 脂質(zhì)體對(duì)Infliximab的包封率為90. 65±2. 68% ;
[0029] Infl iximab長循環(huán)脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察：將載抗體脂質(zhì)體混懸液于溫度 (25±2) °C、濕度（60±10)%條件下放置保存，1天、15天、30天、60天、90天后，其平均粒 徑、分散指數(shù)、表面電位、磷脂含量變化(膽固醇滲漏率）和抗體滲漏率無顯著性變化（P > 0. 05)，樣品放置穩(wěn)定（如表2所不）。
[0030] 體外釋放試驗(yàn)結(jié)果表明，Infliximab長循環(huán)脂質(zhì)體中的抗體在180小時(shí)內(nèi)累計(jì)釋 放百分率小于70%，表明長循環(huán)脂質(zhì)體可顯著減慢藥物的體外釋放。
[0031] 包封率和載藥率的測(cè)定方法：取0. 5ml載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體，15000r/min離心 分離30min，取上清用紫外分光光度法測(cè)定抗體含量。
[0032] 其中包封率采用如下公式計(jì)算：
[0033]
【權(quán)利要求】
1. 一種包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于，由抗體和脂質(zhì)體組成； 其中，抗體為包封的治療性抗體，脂質(zhì)體為載體；所述的脂質(zhì)體是以磷脂、膽固醇和長 循環(huán)脂質(zhì)體輔料為材料制成； 所述的治療性抗體選自抗IL-17單克隆抗體、抗IFN- Y單克隆抗體、抗IL-2單克隆抗 體、抗Infliximab單克隆抗體或者抗VEGF單克隆抗體；抗體與磷脂的比值為5?100 y g 抗體：1 y mol磷脂； 磷脂與膽固醇的摩爾比為1.2?4:1 ; 長循環(huán)脂質(zhì)體輔料占脂質(zhì)體摩爾量的3%?17%。
2. 按照權(quán)利要求1所述的包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于，所述的磷脂選自大 豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂或二棕櫚酰磷脂酰膽堿。
3. 按照權(quán)利要求1所述的包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于，所述的長循環(huán)脂質(zhì) 體輔料是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-nh2。
4. 按照權(quán)利要求1所述的包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于，所述的治療性抗體 為 Infliximab 單抗。
5. 按照權(quán)利要求1所述的包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于，所述的包載抗體的 長循環(huán)脂質(zhì)體的平均粒徑為351. 3 ±58nm。
6. 按照權(quán)利要求1所述的包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體，其特征在于，包載抗體的長循環(huán) 脂質(zhì)體對(duì)抗體活性成分的包封率為：90. 65±2. 68%。
7. 權(quán)利要求1所述的包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括步驟： 1) 以磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂或二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰 乙醇胺-聚乙二醇-NH2為原料，采用薄膜水化法制備長循環(huán)脂質(zhì)體； 2) 加入含標(biāo)記染料的PBS溶液，超聲水化，振蕩，并用聚碳酸酯膜反復(fù)擠壓后得到標(biāo)記 的包載抗體的脂質(zhì)體顆粒。
8. 按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的標(biāo)記染料為羅丹明。
9. 權(quán)利要求1的所述的包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體的用途，其特征在于，其用途是所述 的包載抗體的長循環(huán)脂質(zhì)體在制備治療眼部疾病藥劑中的應(yīng)用。
10. 按照權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述的眼部疾病是眼內(nèi)炎、葡萄膜炎、視 網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜血管炎或者眼部新生血管性疾病。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK104415331SQ201310374570
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月25日
【發(fā)明者】張銳, 錢江 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院