一種絞股藍(lán)總苷的提取方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種絞股藍(lán)總苷的提取方法，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得含量有很大提高，本發(fā)明還提供了提供絞股藍(lán)總苷在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用和制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種絞股藍(lán)總苷的提取方法及應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及中藥提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種絞股藍(lán)總苷的提取方法及應(yīng)用。【背景技術(shù)】[0002]絞股藍(lán)為多年生宿根植物，廣泛分布于亞熱帶和北亞熱帶地區(qū)。性寒、味甘，有益氣，安神，降血壓之功效，主要成分是絞股藍(lán)總苷。[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有絞股藍(lán)總苷在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用報(bào)道，而目前的提取方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]發(fā)明目的:為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種絞股藍(lán)總苷的提取方法。[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供絞股藍(lán)總苷在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用和制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用。[0006]技術(shù)方案:本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的:[0007]—種絞股藍(lán)總苷的提取方法，取絞股藍(lán)，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_501:，0)2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間150_180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集 5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得絞股藍(lán)總苷提取物。[0008]上述絞股藍(lán)總苷的提取方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。[0009]上述絞股藍(lán)總苷的提取方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C， CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時(shí)間160min。[0010]上述絞股藍(lán)總苷的提取方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。[0011]上述絞股藍(lán)總苷在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，絞股藍(lán)總苷的提取步驟為:取絞股藍(lán)，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間150-180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得絞股藍(lán)總苷提取物。[0012]上述絞股藍(lán)總苷在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，絞股藍(lán)總苷的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間160min， 所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。[0013]上述絞股藍(lán)總苷在制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，絞股藍(lán)總苷的提取步驟為: 取絞股藍(lán)，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa,溫度30-50 °C, CO2流量l_3ml/g生藥.min,萃取時(shí)間 150-180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得絞股藍(lán)總苷提取物。[0014]上述絞股藍(lán)總苷在制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，絞股藍(lán)總苷的提取方法中所述 CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力 20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。[0015]現(xiàn)有技術(shù)中，絞股藍(lán)總苷采用醇提的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，本發(fā)明制備的絞股藍(lán)總苷中人參皂苷Rbl得率增加，含量高，純度達(dá) 1-3%，現(xiàn)有技術(shù)未發(fā)現(xiàn)其在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用和制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，表明本品有希望做成這樣的藥物。【具體實(shí)施方式】[0016]以下通過(guò)實(shí)施例形式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明范圍。[0017]實(shí)施例1[0018]取絞股藍(lán)lOOOg，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥.min，萃取時(shí)間 150min，得超臨界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率 400W,萃取2次，每次4分鐘，每次加入的70%乙醇量為2000g，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得絞股藍(lán)總苷提取物，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定人參皂苷Rbl的含量為1.26%。[0019]實(shí)施例2[0020]取絞股藍(lán)lOOOg，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間 180min，得超臨界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率 600W,萃取2次，每次8分鐘，每次加入的70%乙醇量為2000g，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得絞股藍(lán)總苷提取物，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定人參皂苷Rbl的含量為2.31%。[0021]實(shí)施例3[0022]取絞股藍(lán)lOOOg，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間160min，得超臨界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率 500W,萃取2次，每次6分鐘，每次加入的70%乙醇量為2000g，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得絞股藍(lán)總苷提取物，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定人參皂苷Rbl的含量為1.52%。[0023]上述實(shí)施例中絞股藍(lán)為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyIIum(Thunb.) Mak.的全草。[0024]實(shí)施例4:絞股藍(lán)總苷抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料[0025]1實(shí)驗(yàn)材料[0026]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株[0027]小鼠前列腺癌細(xì)胞(RM-1)，南京正亮醫(yī)藥科技有限公司實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)， DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。[0028]1.2實(shí)驗(yàn)藥物[0029]研究藥物:本發(fā)明絞股藍(lán)總苷:按實(shí)施例3方法制備。[0030]藥液儲(chǔ)液:稱取1OOmg絞股藍(lán)總苷，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0.2 μm濾器過(guò)濾， 500μIdoff管分裝，-20°C存儲(chǔ)，同時(shí)0.2μm濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。[0031]1.3實(shí)驗(yàn)試劑[0032]DMEM (GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419)；NaHC03 (上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號(hào):2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號(hào):2009/10); Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0 公司批號(hào):2010242);Str 印 tomycin Su I fat e( AMRE SCO 公司批號(hào):2010382);無(wú)水乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司批號(hào):080310182);MTT(Biosharp批號(hào):0793) ; PBS (實(shí)驗(yàn)室自配)；1.4實(shí)驗(yàn)器材[0033]萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào):DM1L);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD 公司型號(hào):SPECTRA MAX190) ；C02培養(yǎng)箱(FORMA型號(hào):3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào):SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào):S/N020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào): DHG9123A);冰箱(西門(mén)子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào):ΚΑ-1000) ;0.2μπι濾器(MILLIP0RE型號(hào):SLGP033RB) ;IOcm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。[0034]2實(shí)驗(yàn)方法[0035]1) RM-1 細(xì)胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm 培養(yǎng)皿)， 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X 104個(gè)/ml。[0036]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。[0037]3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%-70%，加入得生片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。[0038]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。[0039]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。[0040]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。[0041]7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:[0042]細(xì)胞增值抑制率(％)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)/對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。[0043]3統(tǒng)計(jì)處理[0044]采用Microsoft Excel2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以 mean+ S.D.表不。[0045]4實(shí)驗(yàn)結(jié)果[0046]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)RM-1細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01 )，當(dāng)劑量達(dá)到 15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(Ρ〈0.001)。[0047]表1絞股藍(lán)總苷對(duì)RM-1細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土SD)
【權(quán)利要求】
1.一種絞股藍(lán)總苷的提取方法，其特征在于取絞股藍(lán)，加入到CO2超臨界萃取器中， 乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度 30-50°C, CO2流量l-3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間150_180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W,萃取2次,每次4-8分鐘,每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50% 乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得絞股藍(lán)總苷提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種絞股藍(lán)總苷的提取方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種絞股藍(lán)總苷的提取方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時(shí)間160min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種絞股藍(lán)總苷的提取方法，其特征在于所述微波萃取功率 500W,每次萃取6分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種絞股藍(lán)總苷在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于絞股藍(lán)總苷的提取步驟為:取絞股藍(lán)，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度 30-50°C, CO2流量l-3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間150_180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W,萃取2次,每次4-8分鐘,每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50% 乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得絞股藍(lán)總苷提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種絞股藍(lán)總苷在制備抑制小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于絞股藍(lán)總苷的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，C02流量2ml/g 生藥.min，萃取時(shí)間160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種絞股藍(lán)總苷在制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，其特征在于絞股藍(lán)總苷的提取步驟為:取絞股藍(lán)，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間150-180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得絞股藍(lán)總苷提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種絞股藍(lán)總苷在制備增加骨密度藥物中的應(yīng)用，其特征在于絞股藍(lán)總苷的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%， 所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間 160min,所述微`波萃取功率500W,每次萃取6分鐘。
【文檔編號(hào)】A61P19/08GK103494864SQ201310470936
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
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