抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料及其應用，通過如下步驟制備得到：采用光化學固定法在聚合物培養(yǎng)板上接枝帶電荷的電性材料，得光固定電性材料；再通過在光固定電性材料上共接枝TNF-a和IGF，經(jīng)紫外照射，得共固定的電性生物材料；所述帶電荷的電性材料為帶負電荷的聚丙烯酸（PAAc），電中性的聚乙烯乙二醇（PEG），帶正電的聚丙烯胺（PAAm）。本發(fā)明制備的共固定電性生物材料不僅可以提高人肝細胞HSC的存活率，而且可以有效抑制HSC細胞的衰老。
【專利說明】抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料及其應用【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物材料【技術領域】，更具體地，涉及抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料及其應用。
【背景技術】
[0002]肝臟是人體的重要器官，是人體的物質(zhì)代謝中心，它具有代謝、排毒、循環(huán)調(diào)控等功能。然而，肝癌、急性肝功能衰竭(比如脂肪肝、肝硬化、肝炎)等疾病每年導致大量的死亡，對人體健康構成了嚴重的威脅。由于肝臟是人體獨一無二的器官，無法進行自體移植；而異體移植，會造成組織免疫排斥反應，抗排斥治療失敗將意味著前功盡棄；并且受到器官供給來源的限制，肝供體奇缺，難以滿足臨床的需求。所以尋求一種理想的器官組織替代或修復用品，是臨床醫(yī)學和材料研究者們的共同追求，而肝組織工程為這一設想的實現(xiàn)提供了可能。
[0003]然而，肝臟是大型的體內(nèi)器官，很難在體外生長。此外，由于肝細胞各種各樣的功能以及其對氧氣的高需求，且良好的介質(zhì)傳遞過程對于肝細胞的存活亦很重要。因而，肝組織工程研究還有許多問題等待解決。
[0004]肝組織工程研究主要圍繞種子細胞、細胞外基質(zhì)材料即支架材料以及組織和器官的構建與再生展開，而肝臟組織工程的發(fā)展在很大程度上依賴于種子細胞，數(shù)量充足且不會引起機體免疫排斥反應的種子細胞是形成新生組織的必要條件。而種子細胞的體外培養(yǎng)會隨著傳代的增加而衰老，即細胞在體外培養(yǎng)過程中，經(jīng)一段時間會逐漸老化，喪失其特有的功能，從而難以獲得組織工程所需的大量細胞。這對肝組織工程的構建產(chǎn)生不利影響，因此，研究延緩和防止種子細胞老化是人體組織工程中迫切需要解決的問題。
[0005]在延緩肝細胞衰老的生物材料的研究方面，目前還尚未見相關報導。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中在研究延緩肝細胞衰老的生物材料方面的不足，提供了三種抗肝細胞衰老的生物材料的制備方法。
[0007]本發(fā)明同時提供了上述生物材料的應用。
[0008]本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術方案是:抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，通過如下步驟制備得到:采用光化學固定法在聚合物培養(yǎng)板上接枝帶電荷的電性材料，得光固定電性材料；再通過在光固定電性材料上接枝共固定的TNF-a和IGF，經(jīng)紫外照射，得共固定的電性生物材料；
所述帶電荷的電性材料為帶負電荷的聚丙烯酸(PAA c )，電中性的聚乙烯乙二醇(PEG),帶正電的聚丙烯胺(PAAm)。
[0009]優(yōu)選的，所述聚合物培養(yǎng)板為聚苯乙烯培養(yǎng)板。
[0010]本發(fā)明在光固定電性材料上接枝共固定的TNF-a和IGF，是通過在光固定電性材料中同時加入TNF-a和IGF反應獲得，其中TNF_a和IGF的質(zhì)量比例可以為1:2~2:1，優(yōu)選為 1:1。
[0011]將生長因子TNF-a和IGF與生物材料結合，可實現(xiàn)生長因子逐步釋放，從而保證生長因子的效用能夠得到有效的發(fā)揮；有效地克服了將生長因子加入到細胞培養(yǎng)體系之內(nèi)，生長因子因具備多向調(diào)節(jié)的功能，而致使大劑量的給藥不易掌控細胞分化的一個方向，并且也不能維持其持續(xù)性的不足。肝臟再生的啟動與終止均需細胞因子參與，腫瘤壞死因子(TNF)，能刺激血管壁組成細胞的生長遷移和成熟，還可與肝素類物質(zhì)結合，而胰島素類生長因子(IGF)雖不能直接促進肝細胞分裂，但在其它生長因子協(xié)同下可增強肝細胞增殖。
[0012]所述帶負電荷的聚丙烯酸制備光固定電性材料的步驟如下:
Cl)將3.0-9.0mmol 1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(WSC)、
0.5-1.5mmol PAAc及0.05-0.15mmol 4-疊氮苯胺鹽酸鹽溶解在80_150ml去離子水中；
(2)調(diào)節(jié)步驟(1)所得溶液的pH為6-8，2-6°C攪拌24_72h，經(jīng)無縫纖維素管，用超純水透析，得疊氮苯基修飾的衍生物；
(3)避光環(huán)境下，將步驟(2)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強度對距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進行清洗處理后，得光固定電性材料AzPhPAAc。
[0013]作為一種優(yōu)選方案，采用所述帶負電荷的聚丙烯酸制備光固定電性材料的步驟如下:
取6.0mmol 1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(WSC)、1.0mmol PAAc以及0.1mmol 4-疊氮苯胺鹽`酸鹽溶解在IlOml去離子水中；溶液的PH用NAOH或HCL調(diào)成7.0，在4°C攪拌48h之后，反應液通過無縫的纖維素管(cutoff MW，12000)用超純水透析，直至洗液中的疊氮苯基的含量用紫外分光光度計檢測不出，得疊氮苯基修飾的衍生物，單層的聚合物冰凍干燥；避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板中(10 μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5M J/cm2的強度從15cm的距離處照射紫外60秒，將培養(yǎng)板分別置于PH=4的溶液、PH=IO的溶液和超純水中，用超聲波除去未反應的聚合物，洗完之后，板用70%的乙醇水溶液消毒，得光固定電性材料 AzPhPAAc。
[0014]所述電中性的聚乙烯乙二醇制備光固定電性材料步驟如下:
(1)將80-120mg二氨基PEG和75_85mg N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺在氯仿中攪拌過夜，產(chǎn)物經(jīng)氯仿/脫水乙醚洗滌，得疊氮苯基修飾的衍生物；
(2)避光環(huán)境下，將步驟(1)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強度對距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進行清洗處理后，得光固定電性材料AzPhPEG ；
所述PEG和N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為100:80-90。
[0015]作為一種優(yōu)選的方案，采用所述電中性的聚乙烯乙二醇制備光固定電性材料步驟如下:
將IOOmg 二氨基PEG和81mg N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺在氯仿中攪拌過夜反應，獲得產(chǎn)物通過氯仿/脫水乙醚純化三次，直到洗脫液中的4-疊氮琥珀酰亞胺用紫外分光光度計檢測不出，得疊氮苯基修飾的衍生物；避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板中(10 μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5MJ/cm2的強度從15cm的距離處照射紫外60秒，照好的板分別放入稀釋的鹽酸(PH=4)中，堿性溶液(PH=IO)中,和超純水中,然后用超聲波完全除去未反應的聚合物,洗完之后,板用70%的乙醇水溶液消毒，得光固定電性材料AzPhPEG。
[0016]所述帶正電的聚丙烯胺制備光固定電性材料的步驟如下 :
(1)在溶解10-15g二環(huán)己基碳二亞胺(DCCI)的四氫呋喃(THF)溶液40-60 ml中，滴入溶解5-10g羥基琥珀硫亞胺的100-200 ml THF溶液及5_10g 4-疊氮苯甲酸，冰浴攪拌3-5h，反應溶液自然回暖室溫，持續(xù)攪拌過夜，得白色液體；
(2)取步驟(1)所得白色液體過濾，剩余黃色余渣用異丙基乙醇/異丙基醚中結晶；
(3)在10-20ml ML，PH為6-8的聚丙烯酰胺水溶液中，冰浴攪拌，加入5-10g 4-疊氮琥珀酰亞胺的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，2-6°C攪拌24-72h，溶液超濾，洗滌，得疊氮苯基修飾的衍生物；
(4)避光環(huán)境下，將步驟(3)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強度對距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進行清洗處理后，得光固定電性材料AzPhPAAm。
[0017]優(yōu)選的，二環(huán)己基碳二亞胺的THF溶液中二環(huán)己基碳二亞胺和THF的質(zhì)量比為3:10。
[0018]優(yōu)選的，羥基琥珀硫亞胺的THF溶液，羥基琥珀硫亞胺和THF的質(zhì)量比為7:125，所述4-疊氮苯甲酸的添加量為8-12g。
[0019]作為一種優(yōu)選的方案，采用所述帶正電的聚丙烯胺制備光固定電性材料的步驟如下:
在溶解有13.3gDCCI的50ml THF溶液中，滴入溶解有7.43g羥基琥珀硫亞氨的150mlTHF溶液以及9.57g 4-疊氮苯甲酸，此過程冰浴攪拌；3h后，反應溶液慢慢的回暖室溫，持續(xù)攪拌過夜；形成的白色液體進行過濾，留下來的黃色的余渣用異丙基乙醇/異丙基醚中結晶；再將IOml溶解有30mg PAAm的水溶液，pH為7.0，在冰浴攪拌時加入20ml溶解有8.4mg 4-疊氮琥珀酰亞胺的DMF溶液，在4°攪拌24h之后，溶液超濾，用5mlDMF/H20溶液洗兩次，然后用5ml的超純水，直到洗脫液中的4-疊氮琥珀酰亞胺用紫外分光光度計檢測不出，得疊氮苯基修飾的衍生物；避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板中(10μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5MJ/cm2的強度從15cm的距離處照射紫外60秒，照好的板分別放入稀釋的鹽酸(PH=4)中，堿性溶液(PH=IO)中,和超純水中,然后用超聲波完全除去未反應的聚合物,洗完之后,板用70%的乙醇水溶液消毒，得光固定電性材料AzPhPAAm。
[0020]所述共固定的TNF-a和IGF的制備步驟如下:
(1)配制DMF/PBS溶液，體積比為3-5:1，PH為6.0-8.0 ；
(2)避光環(huán)境下，把胰島素類生長因子IGF和腫瘤壞死因子TNF-a分別與疊氮苯胺鹽酸鹽按1:80-100的比例，溶解于DMF/PBS溶液，2_6°C冰浴攪拌24_72h ；
(3)將步驟(2)所得溶液2-6°C超濾離心24-72h，轉速為3000-5000rpm/min，冷凍干燥，得光固定的TNF-a和IGF。
[0021]作為一種優(yōu)選方案，所述共固定TNF-a和IGF的制備步驟如下:
避光環(huán)境下，取45 μ g IGF與40 μ g TNF-a，分別加入20ml含60 μ g N-琥珀亞酰胺的二甲基酰胺DMF/PBS (pH7.4，體積比為4:1)溶液中，在4°C (冰浴)的條件下加入磁力攪拌子，在磁力攪拌器內(nèi)反應48h使其充分反應。合成結束后，分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II, IOKNa),在4000rpm/min的轉速下,超濾離心6h以純化疊氮苯基衍生物,冷凍干燥備用。使用前，用無菌的PBS把其配置成Ing/μ I的濃度,分裝至無菌EP管，用錫紙包裹并寫上標簽。
[0022]所述共固定的電性生物材料的制備步驟如下:
(O取三種光固定有電性生物材料的聚合物培養(yǎng)板，避光環(huán)境下，分別加入l_5ng/ul光固定的TNF-a的PBS溶液10_20ul以及l(fā)_5ng/ul光固定的IGF的PBS溶液10_20ul ；
(2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入2-6°C冰箱冷凍干燥；
(3)冷凍干燥后普通的紫 外線照射10-30min；
(4)將照射完紫外線的聚合物培養(yǎng)板用PBS洗滌5-10次，每次20-40min。
[0023]共固定的電性生物材料在抗肝細胞衰老方面的應用。
[0024]所述共固定的電性材料在抗肝細胞衰老方面的應用，所述共固定的電性生物材料，采用光化學固定法在聚合物培養(yǎng)板上接枝帶電荷的電性材料，得光固定電性材料，再通過在光固定電性材料上接枝共固定的共固定TNF-a和IGF，經(jīng)紫外照射制備得到。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
1、將生長因子TNF-a和IGF與生物材料結合，實現(xiàn)生長因子逐步釋放，從而保證生長因子的效用能夠得到有效的發(fā)揮，有效地克服了將生長因子加入到細胞培養(yǎng)體系之內(nèi)，生長因子因具備多向調(diào)節(jié)的功能，而致使大劑量的給藥不易掌控細胞分化的一個方向，并且也不能維持其持續(xù)性的不足；
2、采用光化學修飾法有效避免了使用其它表面改性方法時涂層的物理和生物學性質(zhì)損失、生物材料表面活性和其它表面性能降低的缺陷；
3、采用光化學修飾法對聚合物細胞培養(yǎng)板進行表面修飾，引入各種不同電性的功能基團，保證了引入的基團在長時間的細胞培養(yǎng)過程中維持穩(wěn)定性；
4、電性生物材料上的抗細胞衰老研究能夠為三維支架上的抗細胞衰老研究奠定一定的實驗基礎，對推動肝組織工程的發(fā)展具有重大意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為光固定生長因子IGF和TNF-a于三種電性材料上的原子力表征圖；
圖2為PAAc電性材料上的生長因子劑量對HSC細胞存活率的影響圖；
圖3為PEG電性材料上的生長因子劑量對HSC細胞存活率的影響圖；
圖4為PAAm電性材料上的生長因子劑量對HSC細胞存活率的影響圖；
圖5為三種電性材料空白組HSC細胞的衰老試劑盒β -半乳糖苷酶檢測圖；
圖6為三種電性材料游離組和共固定組HSC細胞的衰老試劑盒β -半乳糖苷酶檢測檢測圖；
圖7為三種電性材料空白組HSC細胞的流式周期檢測圖；
圖8為三種電性材料游離組和共固定組HSC細胞的流式周期檢測圖；
圖9為三種電性材料流式細胞儀檢測空白組的HSC細胞中Ρ53蛋白表達量；
圖10為三種電性材料流式細胞儀檢測游離組和共固定組的HSC細胞中Ρ53蛋白表達量;
圖11為三種電性材料流式細胞儀檢測空白組的HSC細胞中Rb蛋白表達量；
圖12為三種電性材料流式細胞儀檢測游離組和共固定組的HSC細胞中P53蛋白表達量。
[0027]
【具體實施方式】
[0028]下面結合附圖和具體實施例，對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0029]實施例1光固定電性材料AzPhPAAc-Pst的制備
取6.0mmol 1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(WSC)、1.0mmol PAAc以及0.1mmol 4-疊氮苯胺鹽酸鹽溶解在IlOml去離子水中；溶液的PH用NAOH或HCL調(diào)成7.0，在4°C攪拌48h之后，反應液通過無縫的纖維素管(cutoff MW，12000)用超純水透析，直至洗液中的疊氮苯基的含量用紫外分光光度計檢測不出，得疊氮苯基修飾的衍生物AzPhPAAc，單層的聚合物冰凍干燥。避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯(PSt)培養(yǎng)板中(ΙΟμΙ每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5M J/cm2的強度從15cm的距離處照射紫外60秒，將培養(yǎng)板分別置于PH=4的溶液、PH=IO的溶液和超純水中，用超聲波除去未反應的聚合物，洗完之后，板用70%的乙醇水溶液消毒，得共固定電性材料AzPhPAAc-Pst。
[0030]實施例2光固定電性材料AzPhPEG-Pst的制備
將IOOmg 二氨基PEG和81m`g N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺在氯仿中攪拌過夜反應，獲得產(chǎn)物通過氯仿/脫水乙醚純化三次，直到洗脫液中的4-疊氮琥珀酰亞胺用紫外分光光度計檢測不出，得疊氮苯基修飾的衍生物AzPhPEG。避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板(PSt板)中(10 μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5MJ/cm2的強度從15cm的距離處照射紫外60秒，將培養(yǎng)板分別置于PH=4的溶液、PH=IO的溶液和超純水中，用超聲波除去未反應的聚合物，洗完之后，板用70%的乙醇水溶液消毒，得共固定電性材料AzPhPEG-Pst。
[0031]實施例3光固定電性材料AzPhPAAm-Pst的制備
在溶解有13.3gDCCI的50ml THF溶液中，滴入溶解有13.3g羥基琥珀硫亞氨的150mlTHF溶液以及9.57g 4-疊氮苯甲酸，此過程冰浴攪拌；3h后，反應溶液慢慢的回暖室溫，持續(xù)攪拌過夜；形成的白色液體進行過濾，留下來的黃色的余渣用異丙基乙醇/異丙基醚中結晶；再將IOml溶解有30mg PAAm的水溶液，pH為7.0，在冰浴攪拌時加入20ml溶解有8.4mg 4-疊氮琥珀酰亞胺的DMF溶液，在4°攪拌24h之后，溶液超濾，用5mlDMF/H20溶液洗兩次，然后用5ml的超純水，直到洗脫液中的4-疊氮琥珀酰亞胺用紫外分光光度計檢測不出，得疊氮苯基修飾的衍生物AzPhPAAm。避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板(PSt板)中(10μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5MJ/cm2的強度從15cm的距離處照射紫外60秒，將培養(yǎng)板分別置于PH=4的溶液、PH=IO的溶液和超純水中，用超聲波除去未反應的聚合物，洗完之后，板用70%的乙醇水溶液消毒，得共固定電性材料AzPhPAAm-Pst。
[0032]實施例4光固定TNF-a和IGF的制備避光環(huán)境下，取45 μ g IGF與40 μ g TNF-α，分別加入20ml含60 μ g N-琥珀亞酰胺的二甲基酰胺DMF/PBS (pH7.4，體積比為4:1)溶液中，在4°C (冰浴)的條件下加入磁力攪拌子，在磁力攪拌器內(nèi)反應48h使其充分反應。合成結束后，分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II, IOKNa),在4000rpm/min的轉速下,超濾離心6h以純化疊氮苯基衍生物,冷凍干燥備用。使用前，用無菌的PBS把其配置成Ing/μ I的濃度,分裝至無菌EP管，用錫紙包裹并寫上標簽。
[0033]實施例5共固定生長因子的電性生物材料AzPhPAAc-PSt-1GF/TNF-a的制備，其相應的表征見附圖1中的al。
[0034](I)避光環(huán)境下，取光固定電性生物材料PAAc的PSt板(AzPhPAAc-PSt)，分別加入lng/ul光固定腫瘤壞死因子(TNF-a)的PBS溶液IOul以及l(fā)ng/ul光固定的類胰島素生長因子(IGF)的PBS溶液IOul。
[0035](2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入4°C冰箱冷凍干燥。
[0036](3)冷凍干燥后普通的紫外線照射20min。
[0037](4)將照射完紫外線的PSt板用PBS洗滌10次，每次30min。
[0038]實施例6共固定生長因子的電性生物材料AzPhPEG-PSt-1GF/TNF-a的制備，其相應的表征見附圖1中的bl。
[0039](I)避光環(huán)境下，取光固定電性生物材料PEG的PSt板(AzPhPEG-PSt)，分別加入lng/ul光固定腫瘤壞死因子(TNF-a)的PBS溶液IOul以及l(fā)ng/ul光固定的類胰島素生長因子(IGF)的PBS溶液IOul。
[0040](2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入4°C冰箱冷凍干燥。
[0041](3)冷凍干燥后普通的紫外線照射20min。
[0042](4)將照射完紫外線的PSt板用PBS洗滌10次，每次30min。
[0043]實施例7共固定生長因子的電性生物材料AzPhPAAm-PSt-1GF/TNF-a的制備，其相應的表征見圖1中的Cl。
[0044](I)避光環(huán)境下，取光固定電性生物材料PAAm的PSt板(AzPhPAAm-PSt)，分別加入lng/ul光固定腫瘤壞死 因子(TNF-a)的PBS溶液IOul以及l(fā)ng/ul光固定的類胰島素生長因子(IGF)的PBS溶液IOul。
[0045](2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入4°C冰箱冷凍干燥。
[0046](3)冷凍干燥后普通的紫外線照射20min。
[0047](4)將照射完紫外線的PSt板用PBS洗滌10次，每次30min，。
[0048]實施例8 PAAc電性材料上的生長因子劑量對人肝星狀細胞HSC的影響
游離TNF-a和IGF的制備:用PBS㈠溶液分別溶解45 μ g IGF與40 μ g TNF- α，并調(diào)整至lng/μ I的濃度，使用一次性過濾膜分別進行過濾滅菌，分裝至EP管，待用。
[0049]共固定TNF-a和IGF的PAAc電性材料制備依據(jù)實施例5的操作步驟。
[0050]用70 %的乙醇溶液對已共固定生長因子的PAAc的24孔電性材料板(AzPhPAAc-PSt-1GF/TNF-a)進行滅菌(浸泡30min)，然后用無菌水反復沖洗3_4遍。設置空白組合游離組，空白組為不加生長因子的光固定電性生物材料，游離組為加入lng/μ I游離IGF和lng/μ I游離TNF-a各IOul ;每孔都加入Iml含IXlO5 cell/ml的細胞懸液，各作12個平行孔，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此外，還設置不同的生長因子濃度，細胞計數(shù)法分析其上細胞的生長情況。
[0051]圖2是使用細胞計數(shù)法觀察光固定聚丙烯酸PAAc電性材料上不同的劑量梯度(TNF-a設定為IOng劑量，IGF的劑量梯度為10ng、30ng、50ng、70ng、90ng)的生長因子的游離組和共固定組對HSC細胞生長的影響，還設置了不加生長因子的CK空白組。分析圖2可知，在PAAc電性材料上接枝共固定的生長因子后，人肝星狀細胞HSC的細胞存活率最高，在此電性材料上加入游離的生長因子之后，HSC的細胞存活率次之，而空白組的細胞存活率最低。在共固定組的五個劑量梯度中，TFN-a與IGF的劑量分別為IOng和70ng時，細胞的存活率最高，而TNF-a與IGF的劑量分別為IOng和IOng細胞的存活率僅接其后。由數(shù)據(jù)亦可知，在PAAc電性材料上加入的游離生長因子的劑量與其上HSC細胞的存活率成正比。
[0052]實施例9 PEG電性材料上的生長因子劑量對人肝星狀細胞HSC的影響
游離TNF-a和IGF的制備參照實施例8的相關步驟，共固定TNF_a和IGF的制備依據(jù)實施例6的操作步驟進行。
[0053]共固定TNF-a和IGF的PEG電性材料制備依據(jù)實施例6的操作步驟。
[0054]用70 %的乙醇溶液對已共固定生長因子的PEG的24孔電性材料板(AzPhPEG-PSt-1GF/TNF-a)進行滅菌(浸泡30min)，然后用無菌水反復沖洗3_4遍。設置空白組合游離組，空白組為不加生長因子的光固定電性生物材料，游離組為加入lng/μ I游離IGF和Ing/ μ I游離TNF-a各IOul ;每孔都加入Iml含IXlO5 cell/ml的細胞懸液，各作12個平行孔，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此外，還設置不同的生長因子濃度，細胞計數(shù)法分析其上細胞的生長情況。
[0055]圖3使用的是光固定聚乙烯乙二醇電性材料，由圖可知其上接枝共固定的生長因子后，人肝星狀細胞HSC的細`胞存活率最高，游離組次之，空白組最低。在共固定組的五個劑量梯度中，TNF-a與IGF的劑量分別為IOng和IOng時，細胞的存活率最高，且共固定組中IGF的劑量按梯度增加時，HSC細胞的存活率反而降低。加入游離生長因子劑量為TNF-a10ng，IGF 30ng時，HSC細胞的存活率為游離組的最高值，游離組的其他四個濃度梯度對于HSC細胞的存活率影響不大。
[0056]實施例10 PAAm電性材料上的生長因子劑量對人肝星狀細胞HSC的影響
游離TNF-a和IGF的制備參照實施例8的相關步驟，共固定TNF_a和IGF的制備依據(jù)實施例7的操作步驟進行。
[0057]用70 %的乙醇溶液對已共固定生長因子的PAAm的24孔電性材料板(AzPhPAAm-PSt-1GF/TNF-a)進行滅菌(浸泡30min)，然后用無菌水反復沖洗3_4遍。設置空白組合游離組，空白組為不加生長因子的光固定電性生物材料，游離組為加入lng/μ I游離IGF和Ing/ μ I游離TNF-a各IOul ;每孔都加入Iml含IXlO5 cell/ml的細胞懸液，各作12個平行孔，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此外，還設置不同的生長因子濃度，細胞計數(shù)法分析其上細胞的生長情況。
[0058]圖4所用的材料是光固定聚丙烯胺PAAm由圖可知其上接枝共固定的生長因子后，HSC的細胞存活率最高，游離組次之，空白組最低。且固定組與游離組、空白組存在顯著性差異。在共固定組中，當TNF-a與IGF的劑量分別為IOng和50ng時，人肝星狀細胞HSC的存活率最高。但是TNF-a與IGF均為IOng劑量時，細胞存活率與最高值亦十分接近。在共游離組中，當TNF-a與IGF的劑量分別為IOng和50ng，HSC的細胞存活率最高。[0059]實施例11三種電性生物材料上HSC細胞的衰老試劑盒β -半乳糖苷酶檢測
β半乳糖苷酶活性檢測指標是檢測衰老的黃金指標，因為衰老細胞的典型生化特征為pH依賴的β半乳糖苷酶(β -galactosidase)表達活性增強,顯示陽性結果，顏色為藍綠色。這種由衰老引起的半乳糖苷酶活性增強的現(xiàn)象被稱為SA- β ~gal (senescence-associated β - galactosidase)。通常，SA-β-gal 在 pH 值為 4時表達較高，但在衰老細胞中，在pH值為6時，SA-13_gal表達明顯增強。鑒于不同因素引起的衰老細胞都呈現(xiàn)SA-β -gal陽性特征，現(xiàn)在已經(jīng)把SA-β -gal作為細胞衰老的一個重要生物標記，成為鑒別衰老細胞的黃金標準。
[0060]使用衰老試劑盒β -半乳糖苷酶檢測人肝星狀細胞HSC在三種不同電性的生物材料(分別為帶正電荷的聚丙烯酸PAAc、中性電荷的聚乙烯乙二醇PEG以及帶負電荷的聚丙烯胺PAAm)上空白組的衰老情況，如圖5所示。圖5中所示的空白組HSC細胞，既不加入腫瘤壞死因子a，亦不加入胰島素類生長因子。第一排顯示的為聚丙烯酸PAAc電性材料的衰老結果，第二排顯示的為聚乙烯乙二醇PEG電性材料的衰老結果，第三排顯示的為聚丙烯胺PAAm電性材料的衰老結果。
[0061]圖5是加入游離狀態(tài)生長因子的HSC細胞衰老情況(如左列所示)以及共固定生長因子上HSC細胞的衰老情況(如右列所示)，劑量分別為20ng/well的游離組TNF_a/IGF與20ng/well的共固定TNF_a/IGF，三種電性材料的排列順序同圖5。
[0062]由圖5和圖6的顯微鏡所拍攝的細胞圖片可知，空白組的三種電性材料都出現(xiàn)了不同程度的衰老情況:其中，接種在帶正電荷的PAAm (聚丙烯胺)電性材料上的細胞衰老情況最嚴重；而游離組的半乳糖苷酶染色也出現(xiàn)了陽性結果，但細胞衰老情況得到部分緩解；固定組的細胞衰老情況得到最大程度的緩解，幾乎沒有染成藍綠色的陽性結果出現(xiàn)。固定組的帶負電荷PAAc (聚丙烯酸)電性材料上接種的細胞幾乎沒有出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，試劑盒染色沒有顯示陽性結果；而固定組的PAAm電性材料上的細胞生長也較好，相對于空白組而言，此種電性材料的抑制衰老作用是三種材料中最顯著的。
[0063]實施例12三種電性生物材料上HSC細胞的流式周期檢測
衰老的細胞的周期阻滯在Gl期，不能進入S期，即生長狀態(tài)良好的細胞，其周期中S期含量應該較高。因而可以通過檢測HSC細胞的流式周期來評估本發(fā)明的電性生物材料對HSC細胞的抑制衰老的作用。本實施例中，對三種電性材料分別依次設立三個組別，即空白組、游離組及固定組?？瞻捉M是指不加入TNF-a，亦不加入IGF ;游離組是指加入的是游離的生長因子，其制備按照實施例9的相關操作進行；共固定組分別按照實施例5-7的步驟來制備。
[0064]圖7為流式檢測接種在不同電性生物材料空白組上HSC細胞的細胞周期的數(shù)據(jù)，圖8為流式檢測接種在不同電性生物材料游離組和共固定組上HSC細胞的細胞周期的數(shù)據(jù)。結合圖7和圖8可以看出，三種電性材料的空白組S期含量都很低，其中PEG電性材料僅5.2% ;而三種電性材料的游離組S期含量比空白組高，其中PAAm達到23.3% ;三種電性材料的固定組S期含量是三組之中最高的，最高值高達27.3% ;且單獨分析任何一種電性材料，其空白組、游離組、固定組的S期含量都是依次增加的。因而可以證明，三種電性材料的固定組相對空白、游離組有著最強的抑制衰老作用。
[0065]實施例13三種電性生物材料上HSC細胞內(nèi)P53及Rb蛋白表達量P53蛋白和Rb蛋白是衰老正相關蛋白，在人類衰老機制研究中，人們認識到在人體細胞遭受損害后，人體會產(chǎn)生一種應急蛋白一P53蛋白，從而抑制癌細胞產(chǎn)生，防止癌癥，但是與此同時，卻會促使衰老細胞的產(chǎn)生，導致機體衰老。P53蛋白能抑制細胞生長周期停留于G1/S的節(jié)律點上，以達成DNA損壞辨識；若能將細胞于此節(jié)律點上停留夠久，DNA修護蛋白將有更充裕的時間修復DNA損壞部位，并繼續(xù)細胞的生長周期。Rb基因即成視網(wǎng)膜細胞瘤基因，為視網(wǎng)膜母細胞瘤易感基因，這種基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是一種轉錄因子，其可控制驅(qū)使細胞進入分裂過程的重要基因表達。
[0066] 圖9是使用流式細胞儀檢測三種不同電性的生物材料空白組接種的人肝星狀細胞HSC的P53蛋白表達量數(shù)據(jù)，圖10是使用流式細胞儀檢測三種不同電性的生物材料游離組和共固定組接種的人肝星狀細胞HSC的P53蛋白表達量數(shù)據(jù)；圖11為使用流式細胞儀檢測三種不同電性的生物材料空白組接種的人肝星狀細胞HSC的Rb蛋白表達量數(shù)據(jù)，圖12為使用流式細胞儀檢測三種不同電性的生物材料游離組和共固定組接種的人肝星狀細胞HSC的Rb蛋白表達量數(shù)據(jù)；空白組、游離組及共固定組根據(jù)生長因子的加入方式及數(shù)量進行具體分組，詳見實施例13。由圖9-12可以知道，不論是哪種電性材料，無論是帶何種電荷，其空白組的P53蛋白表達量以及Rb蛋白表達量都是很高的，也即三種電性材料的空白組細胞的衰老情況十分嚴重；而游離組P53蛋白以及Rb蛋白表達量相對空白組有所下降，衰老現(xiàn)象得到一定程度的緩解；三種電性材料的固定組的蛋白表達量(用熒光值顯示)是三組之中最低的，其中PAAm電性材料的P53蛋白表達量由空白組的平均熒光值3108降低至固定組的平均熒光值125 6，該電性材料的Rb蛋白表達量由空白組的平均熒光值141降低至固定組的平均熒光值74 ;同時由于P53蛋白和Rb蛋白都是衰老正相關蛋白，可知固定組的細胞衰老情況得到了最大程度的緩解。
【權利要求】
1.抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，通過如下步驟制備得到:采用光化學固定法在聚合物培養(yǎng)板上接枝帶電荷的電性材料，得光固定電性材料；再通過在光固定電性材料上共接枝TNF-a和IGF，經(jīng)紫外照射，得共固定的電性生物材料； 所述帶電荷的電性材料為帶負電荷的聚丙烯酸，電中性的聚乙烯乙二醇或帶正電的聚丙烯胺。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述聚合物培養(yǎng)板為聚苯乙烯培養(yǎng)板。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述帶負電荷的聚丙烯酸制備光固定電性材料的步驟如下: (1)將3.0-9.0mmol 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、0.5-1.5mmol聚丙烯酸及0.05-0.15mmol 4-疊氮苯胺鹽酸鹽溶解在80_150ml去離子水中； (2)調(diào)節(jié)步驟(1)所得溶液的pH為6.0-8.0，2-6°C攪拌24_72h，經(jīng)超純水透析，得疊氮苯基修飾的衍生物； (3 )避光環(huán)境下，將步驟(2 )所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強度對距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進行清洗處理后，得所述光固定電性材料。
4.根據(jù)權利要求1所述的抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述電中性的聚乙烯乙二醇制備光固定電性材料步驟如下: (1)將80-120mg二氨基PEG和75_85mg N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺在氯仿中攪拌過夜，產(chǎn)物經(jīng)氯仿/脫水乙醚洗滌，得疊氮苯基修飾的衍生物； (2)避光環(huán)境下，將步驟(1)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強度對距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進行清洗處理后，得所述光固定電性材料； 所述PEG和N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為100: 80-90。
5.根據(jù)權利要求1所述的抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，采用所述帶正電的聚丙烯胺制備光固定電性材料的步驟如下: (1)在溶解10-15g二環(huán)己基碳二亞胺的四氫呋喃溶液40-60 ml中，滴入溶解5_10g輕基琥珀硫亞胺的100-200 ml四氫呋喃溶液及5-10g 4-疊氮苯甲酸，冰浴攪拌3_5h，反應溶液自然回暖室溫，持續(xù)攪拌過夜，得白色液體； (2)取步驟(1)所得白色液體過濾，剩余黃色余渣用異丙基乙醇/異丙基醚中結晶； (3)在10-20ml, PH為6_8的聚丙烯酰胺水溶液中，冰浴攪拌，加入5-10g 4-疊氮琥珀酰亞胺的二甲基甲酰胺溶液，2-6°C攪拌24-72h，溶液超濾，洗滌，得疊氮苯基修飾的衍生物； (4)避光環(huán)境下，將步驟(3)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強度對距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進行清洗處理后，得光固定電性材料AzPhPAAm。
6.根據(jù)權利要求1所述的抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述光固定的TNF-a和IGF的制備步驟如下: (I)配制DMF/PBS溶液，體積比為3-5:1，PH為6.0-8.0 ；(2)避光環(huán)境下，把胰島素類生長因子IGF和腫瘤壞死因子TNF-a分別與疊氮苯胺鹽酸鹽按1:80-100的比例，溶解于DMF/PBS溶液，2_6°C冰浴攪拌24_72h ； (3)將步驟(2)所得溶液2-6°C超濾離心24-72h，轉速為3000-5000rpm/min，冷凍干燥，得光固定的TNF-a和IGF。
7. 根據(jù)權利要求1所述的抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述共固定的電性生物材料的制備步驟如下: (O取三種光固定有電性生物材料的聚合物培養(yǎng)板，避光環(huán)境下，分別加入l_5ng/ul光固定的TNF-a的PBS溶液10_20ul以及l(fā)_5ng/ul光固定的IGF的PBS溶液10_20ul ； (2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入2-6°C冰箱冷凍干燥； (3)冷凍干燥后普通的紫外線照射10-30min； (4)將照射完紫外線的聚合物培養(yǎng)板用PBS洗滌。
8.根據(jù)權利要求5所述的抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述步驟(I)中溶解二環(huán)己基碳二亞胺的四氫呋喃溶液，二環(huán)己基碳二亞胺和四氫呋喃的質(zhì)量比為 3:10。
9.根據(jù)權利要求5所述的抗肝細胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述步驟(I)中溶解有羥基琥珀硫亞胺的四氫呋喃溶液，羥基琥珀硫亞胺和四氫呋喃的質(zhì)量比為7:125，所述4-疊氮苯甲酸的添加量為8-12g。
10.根據(jù)權利要求1所述共固定電性生物材料在抗肝細胞衰老制劑方面的應用。
【文檔編號】A61L27/54GK103524772SQ201310483848
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權日:2013年10月16日
【發(fā)明者】關燕清, 劉俊明, 張琳, 吳麗芳 申請人:華南師范大學