專利名稱：一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組腺病毒，具體地說涉及一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，還涉及該病毒的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
肝癌發(fā)病率與死亡率在我國一直居高不下，是危害我國人群健康的主要腫瘤，但目前尚無特效治療方法。如能研制有效的肝癌生物治療制劑，不僅對探索肝癌治療具有重要意義，而且具有明顯的社會和經(jīng)濟效益。
腫瘤的發(fā)生發(fā)展往往是多基因協(xié)同作用的結(jié)果，僅靠恢復(fù)1個或幾個抑癌基因功能的基因治療方法一般難以奏效，美國伯明翰阿拉巴馬大學(xué)的Miller和Curiel于1996年在《Gene Therapy》雜志上發(fā)表了一篇社論，首先提出了使用腫瘤選擇復(fù)制性腺病毒(tumor selective replication Adenovirus，TSRA，亦稱特異性溶瘤腺病毒selectively oncolytic Adenovirus)治療腫瘤的新策略，這種重組腺病毒一旦感染腫瘤細胞即可在細胞內(nèi)復(fù)制增殖并裂解腫瘤細胞，細胞裂解后釋放的病毒顆?？稍俅胃腥酒渌[瘤細胞，直到將全部腫瘤細胞殺滅。但該病毒在正常細胞內(nèi)不能增殖，對正常細胞損害不大。作為這種策略的實踐，Khuri等于2000年使用E1b55缺失的復(fù)制性重組腺病毒ONYX-015(d11520)選擇性裂解P53-腫瘤細胞，獲得可喜成績。該研究小組在2000年8月的《自然醫(yī)學(xué)》雜志上報道在30名患有頭頸部癌的病人身上試用了選擇性攻擊P53缺陷的腫瘤細胞的腺病毒突變體ONYX-015并聯(lián)合常規(guī)化療，使25名患者的腫瘤縮小，其中8名患者的腫瘤完全消失。基因療法領(lǐng)域的先驅(qū)南加州大學(xué)的威廉.安德森評論說這項成果非常令人振奮，因為這是首次在數(shù)量較多病人參與的二期臨床試驗中取得大量的腫瘤消失且不復(fù)發(fā)的結(jié)果。ONYX-015也已用于肝癌的基因治療研究，盡管普遍認為ONYX-015僅對p53-肝癌細胞有裂解作用，但也有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ONYX-015能在p53+肝癌細胞系如HepG2內(nèi)復(fù)制，p53狀態(tài)與ONYX-015的復(fù)制缺乏相關(guān)性。最近幾年腺病毒突變體ONYX-015等多種增殖病毒已進入臨床試驗，為腫瘤的治療開辟了一個新的研究領(lǐng)域。
選擇復(fù)制性腺病毒之所以有很好療效，主要是因為腺病毒能自主復(fù)制，呈對數(shù)增殖，使其治療劑量成萬倍地放大。腺病毒溶瘤療法中，選擇復(fù)制性腺病毒能主動地尋找靶細胞，在靶細胞內(nèi)進行復(fù)制，將癌細胞裂解殺滅。
AdE1區(qū)基因是腺病毒的復(fù)制啟動基因，包括E1a和E1b兩部分，它的表達與否直接關(guān)系到腺病毒能否復(fù)制。因此如果把整個腺病毒比作一部機器，那么E1區(qū)就是這部機器的總開關(guān)，其作用至關(guān)重要。在腺病毒感染后的最初2.5小時內(nèi)，只有E1a基因被轉(zhuǎn)錄、翻譯，此蛋白可激活對腺病毒復(fù)制必需的各種細胞基因和病毒基因的表達。以前所用的復(fù)制缺陷型腺病毒正是剔除了這段序列。而在選擇復(fù)制性腺病毒中正是保留和利用這一基因區(qū)，將其置于腫瘤組織或細胞特異的調(diào)控序列控制之下，或利用腫瘤細胞內(nèi)特有的信號傳導(dǎo)途徑，使病毒復(fù)制并達到特異裂解殺滅癌細胞的目的。
腫瘤的基因療法需要面對的一個首要問題是靶向性或特異性。人們?yōu)榱颂禺愋缘貧[瘤細胞，根據(jù)腫瘤細胞的生物學(xué)特性，細胞表面的受體分子的分布以及胞內(nèi)基因表達的特殊性，設(shè)計了一些靶向的方法。如多用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的逆病毒載體，即是利用了其特異整合于分裂細胞的性質(zhì)，將目的基因?qū)胝诜至训哪[瘤細胞。而腺病毒突變體ONYX-015則是利用了腫瘤細胞內(nèi)突變的p53基因產(chǎn)物不能阻止細胞進入復(fù)制期而可允許其同時增殖復(fù)制，最后導(dǎo)致癌細胞裂解。目前，研究者們普遍采用一個靈活而具有廣泛意義的方法，即選用腫瘤特異性調(diào)控元件(啟動子和增強子)以驅(qū)動目的基因表達于特定的靶細胞。此法已用于肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤、黑色素瘤等實體瘤的實驗研究。腺病毒溶瘤療法也同樣面對靶向性或特異性問題，特異性溶瘤腺病毒的構(gòu)建大多也采用腫瘤特異性調(diào)控元件(啟動子和增強子)來驅(qū)動腺病毒于特定的靶細胞內(nèi)復(fù)制。
理論上，可以通過調(diào)控腺病毒復(fù)制的各個環(huán)節(jié)來構(gòu)建TSRAd；實際上近年來的研究表明，主要的策略就三種一是剔除(全部或部分)腺病毒在腫瘤細胞中復(fù)制時多余的基因，而這些基因在正常細胞中卻必不可少，如通過與p53或Rb結(jié)合而激活細胞周期的基因；第二種策略則是用腫瘤特異的啟動子替換掉天然的病毒啟動子以控制病毒復(fù)制基因的表達；三是改造腺病毒纖毛蛋白，使其特異地感染腫瘤并在其中復(fù)制。
在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的肝癌自殺基因療法研究中，用血管內(nèi)皮生長因子VEGF上游的缺氧應(yīng)答元件HRE與AFP核心啟動子AF0.3構(gòu)成的雜合啟動子HREAF，可指導(dǎo)自殺基因HSV tk在幾乎所有產(chǎn)生或不產(chǎn)生AFP的(如HLF)肝癌細胞系中特異性高表達，增強子HRE在缺氧條件下選擇性地激活了不產(chǎn)生AFP的肝癌細胞中的痕量AFP啟動子活性。因此，雜合啟動子HREAF大大拓展了AFP啟動子在肝癌靶向性或特異性基因治療中的應(yīng)用范圍。不過在此逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的肝癌自殺基因療法中，由于存在“旁觀者效應(yīng)”，肝臟干細胞還是難免會被波及，肝儲備能力會受到影響。
經(jīng)檢索，目前僅見國外有構(gòu)建含AFP甲胎蛋白及HRE缺氧應(yīng)答元件的逆病毒載體，以及不帶有肝癌靶向性的E1區(qū)缺失的腺病毒載體，尚未見到構(gòu)建肝癌靶向性可復(fù)制性溶瘤腺病毒進行肝癌基因治療的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝癌靶向性的溶瘤腺病毒，以及該腺病毒的制備方法及用途。
本發(fā)明的肝癌靶向性溶瘤腺病毒包含缺氧應(yīng)答元件HRE和AFP核心啟動子AF0.3來構(gòu)建的肝癌靶向性的雜合啟動子HREAF，以及腺病毒E1區(qū)復(fù)制啟動基因，腺病毒E1區(qū)復(fù)制啟動基因位于肝癌靶向性雜合啟動子的下游。
本發(fā)明采用穿梭質(zhì)粒構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒，再經(jīng)同源重組構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)純化、酶切，轉(zhuǎn)染細胞，包裝出目的重組腺病毒顆粒。
本發(fā)明的肝癌靶向性溶瘤腺病毒的制備方法包括以下步驟1、克隆HRE和AF0.3及構(gòu)建雜合啟動子HREAF(1)設(shè)計缺氧應(yīng)答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的PCR引物，以人肝細胞癌細胞基因組DNA為模板，進行PCR擴增。
(2)將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T easy載體，構(gòu)建質(zhì)粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3。
(3)進行PCR及酶切鑒定及測序鑒定。
(4)雜合啟動子HREAF的構(gòu)建。將HRE與AF0.3進行PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物并純化、酶切后，在體外連接，得雜合啟動子HREAF。
2、構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55重組腺病毒所需的細菌同源重組系統(tǒng)包括E.coli BJ5183(Stratagene公司產(chǎn)品)和穿梭質(zhì)粒pShuttle、pShuttle-CMV以及腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1。pShuttle可供插入包含調(diào)控序列至polyA加尾信號的完整基因，pShuttle-CMV則可供插入僅含翻譯起始密碼至終止密碼的編碼序列。但在本發(fā)明中，需要在穿梭載體中插入不同來源的調(diào)控序列HREAF、編碼序列AdE1或AdE1Δ55，并且需要為其提供polyA加尾信號。因此本發(fā)明中將要構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55均不能在pShuttle或pShuttle-CMV的基礎(chǔ)上直接構(gòu)建，需先對其進行改構(gòu)，本發(fā)明選擇在pShuttle中插入polyA加尾信號。改構(gòu)路線如圖3所示。
(1)設(shè)計穿梭質(zhì)粒構(gòu)建所需引物。
(2)重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1的構(gòu)建及鑒定。將腺病毒穿梭載體pShuttle和pShuttle-CMV分別進行酶切，連接酶切片段并轉(zhuǎn)化，獲得在pShuttle中插入了SV40加尾信號序列的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-R；將pShuttle-R和HREAF的PCR產(chǎn)物分別進行酶切，連接酶切片段并轉(zhuǎn)化，獲得在pShuttle-R中插入了調(diào)控序列HREAF的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF；將pShuttle-HREAF和AdE1的PCR產(chǎn)物分別進行雙酶切，連接酶切片段并轉(zhuǎn)化，獲得在pShuttle-HREAF中插入了腺病毒AdE1基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1，采用PCR及酶切方法進行鑒定。
(3)pShuttle-HREAF-E1Δ55的構(gòu)建及鑒定由于腺病毒的包裝能力有限，為了構(gòu)建出腺病毒衣殼能包裝得下的肝癌特異性溶瘤腺病毒，本發(fā)明構(gòu)建了pShuttle-HREAF-E1Δ55。pShuttle-HREAF-E1Δ55的構(gòu)建路線與pShuttle-HREAF-E1相似。
將pShuttle-HREAF和缺失E1b55的AdE1Δ55基因的PCR產(chǎn)物分別進行酶切，連接酶切片段并轉(zhuǎn)化，獲得重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1Δ55，采用PCR及酶切方法進行鑒定。
3、生產(chǎn)重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55(1)采用AdEasy XL adenoviral vector system(Stratagene公司產(chǎn)品)生產(chǎn)重組腺病毒的原理，該系統(tǒng)中骨架質(zhì)粒pAdEasy-1長33.5kb，已剔除了E1區(qū)和E3區(qū)，含有氨芐青霉素抗性基因；已克隆入外源目的基因的穿梭質(zhì)粒如pShuttl-HREAF-E1和pShuttl-HREAF-E1Δ55分別長10.45kb和9.3kb，均含有卡那霉素抗性基因。骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒均含有pBR322復(fù)制起始位點，可在細菌中復(fù)制擴增。
將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒進行線性化，與pAdEasy-1一起轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌進行同源重組，經(jīng)抗生素抗性選擇，再經(jīng)體外酶切鑒定。鑒定后的重組腺病毒質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化至重組缺陷型菌株大量擴增。純化后的重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)酶切，暴露出左右反向重復(fù)序列(ITR)后轉(zhuǎn)染細胞，包裝出目的重組腺病毒顆粒。
(2)細菌中重組腺病毒質(zhì)粒的產(chǎn)生和鑒定將穿梭質(zhì)粒pShuttl-HREAF-E1和pShuttl-HREAF-E1Δ55線性化，分別與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1一起轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，抗生素平板選擇培養(yǎng)，只有具備卡那霉素抗性的重組質(zhì)粒pAdhafE1或pAdhafE1Δ55可被選擇。分別挑出pAdhafE1克隆及pAdhafE1Δ55克隆，抽提質(zhì)粒，進行酶切鑒定。
(3)哺乳動物細胞中產(chǎn)生腺病毒發(fā)明人選擇重組質(zhì)粒pAdhafE1Δ55來進行重組腺病毒AdhafE1Δ55的包裝生產(chǎn)。將重組質(zhì)粒pAdhafE1Δ55大量擴增、純化，經(jīng)酶切，暴露出左右ITR后轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞(如293細胞)，進行重組腺病毒顆粒AdhafE1Δ55的包裝。待細胞出現(xiàn)完全病變，回收細胞，提取重組腺病毒基因組DNA，作為模板，進行PCR鑒定，同時設(shè)立陰性對照。
4、AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷作用(1)形態(tài)學(xué)觀察AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷將人肝癌細胞和肺癌細胞鋪板，以低劑量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分別攻擊，缺氧條件下培養(yǎng)，觀察細胞生長情況。
(2)MTT實驗檢測AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷將人肝癌細胞和肺癌細胞鋪板，以低劑量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分別攻擊，缺氧誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)。分別測定各孔細胞的光吸收值，繪制細胞生長曲線，并對各腫瘤細胞在各時間點上進行AdhafE1Δ55感染與否之間的生存狀況比較，以及對各腫瘤細胞之間在各時間點上進行生存率的比較。
(3)RT-PCR檢測E1a的表達以AdhafE1Δ55分別感染人肝癌細胞和肺癌細胞，培養(yǎng)收集細胞，提取總RNA，用RT-PCR檢測E1a的表達。
腫瘤的進展需要建立新生血管為其供應(yīng)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，具備血管形成能力也就成為腫瘤生長的前提條件。在促進腫瘤新生血管生成的眾多因素中，VEGF扮演了極其重要的角色，其表達是在缺氧條件下通過存在于其基因5’端上游的HRE來誘導(dǎo)的。HRE于缺氧條件下誘導(dǎo)目的基因增強表達，存在組織或細胞特異性，其組織或細胞特異性是由與其緊鄰的啟動子所限定。肝癌被認為是高血管分布的腫瘤，不過仍發(fā)現(xiàn)它比相應(yīng)的非腫瘤組織表達更高水平的VEGF。Ido等觀察由HRE和AF0.3雜合而成的啟動子HREAF介導(dǎo)的肝癌特異性，亦證明增強子HRE在缺氧條件下誘導(dǎo)的目的基因的增強表達可被啟動子AF0.3限定于肝癌細胞內(nèi)(Ido A，Uto H，Moriuchi A，et al.Genetherapy targeting tor hepatocellular carcinomaselective and enhanced suicidegene expression regulated by a hypoxia-inducible enhancer linked to a humanα-fetoprotein promoter.Cancer Research，2001；613016-3021)。
根據(jù)肝癌高表達VEGF的特點及雜合啟動子HREAF所介導(dǎo)目的基因表達的高效、嚴謹?shù)母伟┨禺愋?，如果將HREAF用于指導(dǎo)溶瘤腺病毒在肝癌細胞內(nèi)特異復(fù)制并裂解之，則會因特異性溶瘤腺病毒具有的“復(fù)制與裂解的一一對應(yīng)關(guān)系”特點，而至少在理論上可避免對肝儲備能力的影響，盡可能地達到特異殺傷肝癌細胞的要求。因為肝臟再生過程則呈有序適度特征，氧供充足，不同于在肝炎、肝硬化等組織中會由缺氧條件及多種細胞因子和生長因子而介導(dǎo)VEGF的表達，亦不同于在實體瘤中會因瘤體增長過快及無序新生血供而導(dǎo)致主要由缺氧條件介導(dǎo)VEGF表達。
本發(fā)明采用選擇復(fù)制性腺病毒溶瘤策略進行肝癌基因治療，為了解決肝癌基因治療中的靶向性或特異性問題，并盡量針對所有AFP產(chǎn)量不等的肝癌，發(fā)明人構(gòu)建了雜合啟動子HREAF指導(dǎo)的肝癌靶向性溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55，并進行了初步的體外肝癌細胞特異殺傷研究，取得了預(yù)期的對肝癌細胞的特異殺傷結(jié)果。利用本發(fā)明的重組腺病毒，可以制備用于治療肝癌的藥物。本發(fā)明的重組腺病毒可作為肝癌生物治療的選擇之一，為肝癌患者帶來福音。
本發(fā)明的創(chuàng)新點在于用可復(fù)制性溶瘤腺病毒代替逆病毒，通過腺病毒本身的復(fù)制達到裂解靶細胞的目的，與復(fù)制缺陷型腺病毒相比，本發(fā)明保留和利用了腺病毒復(fù)制啟動基因AdE1基因，使病毒復(fù)制并達到特異裂解殺滅癌細胞的目的。并具有以下優(yōu)點1，靶細胞不一定在復(fù)制分裂期即可被殺傷，效率高。2，腺病毒不插入靶細胞核基因組，無致突變作用。3，一過性作用，安全性高。


圖1為pGEM-HREAF結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為雜合啟動子HREAF構(gòu)建示意圖。
圖3為重組質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1構(gòu)建示意圖。
圖4為重組質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1Δ55構(gòu)建示意圖。
圖5為AdEasy XL adenoviral vector system生產(chǎn)重組腺病毒示意圖。
圖6為重組腺病毒質(zhì)粒pAdhafE1的酶切鑒定，其中1，3為酶切前，2，4為PacI酶切后，5為DNA markerλ-Hind III圖7為質(zhì)粒pAdhafE1Δ55電泳圖，其中1，2，3，5，6，7為質(zhì)粒pAdhafE1Δ55，4為DNA markerλ-Hind III圖8為PacI酶切鑒定pAdhafE1Δ55圖，其中1，2，3，5，6，7為pAdhafE1Δ55的PacI酶切產(chǎn)物，4為DNA markerλ-Hind III圖9為細胞病變效應(yīng)圖，圖中a為病變孔細胞，b為對照孔細胞。
圖10為重組腺病毒AdhafE1Δ55的基因組DNA，其中1為DNA Markerλ-HindIII digest，2為293細胞中包裝出的AdhafE1Δ55，3為HepG2細胞中包裝出的AdhafE1Δ55。
圖11為重組腺病毒AdhafE1Δ55的PCR鑒定電泳圖，其中1為DNA Marker DL20002為以293細胞中包裝出的重組腺病毒基因組DNA為模板PCR擴增HREAF3為以HepG2細胞中包裝出的重組腺病毒基因組DNA為模板PCR擴增HREAF4為陰性對照圖12為AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷作用圖，其中a為Be17402細胞/AdhafE1Δ55，b為對照Be17402細胞，c為HepG2細胞/AdhafE1Δ55，d為對照HepG2細胞，
e為PLA801C/AdhafE1Δ55，f為對照PLA801C。
圖13為肝癌細胞感染AdhafE1Δ55后的生存曲線圖。
圖14為RT-PCR方法檢測AdhafE1Δ55感染肝癌細胞后E1a的特異表達圖，其中1，2，3分別為HepG2、Bel7402和PLA801C細胞的G3PDH RT-PCR產(chǎn)物4為DNA Marker DL2000，5，6，7分別為HepG2、Bel7402和PLA801C細胞的E1a RT-PCR。
具體實施例方式
實施例一 克隆HRE和AF0.3及構(gòu)建雜合啟動子HREAF1、從Genbank中查出人血管內(nèi)皮生長因子VEGF上游缺氧應(yīng)答元件HRE及人α-甲胎蛋白核心啟動子AF0.3的序列，并進行內(nèi)部酶切位點的分析(1)含缺氧應(yīng)答元件HRE序列為見GenBank data accession no.M63971，序列中SacI與PstI之間(1188-1572)約380bpDNA片段即為缺氧應(yīng)答元件HRE。
(2)含α-甲胎蛋白核心啟動子AF0.3序列為見GenBank data accessionno.L34019，序列中723～981之間的259bpDNA片段即為AFP核心啟動子AF0.3。設(shè)計出缺氧應(yīng)答元件HR、AFP核心啟動子AF0.3的PCR引物，缺氧應(yīng)答元件HRE引物上游引物見序列表中序列1，下游引物見序列表中序列2。在其上游引物中插入HindIII位點，便于隨后插入增強子序列，下游引物中插入BamHI位點，以利于后續(xù)的連接、克隆操作。預(yù)期擴增產(chǎn)物約560bp。
AFP核心啟動子AF0.3引物上游引物見序列表中序列3，下游引物見序列表中序列4。在其上游引物中插入BamHI位點，便于隨后插入增強子序列，下游引物中插入HindIII位點，以利于后續(xù)的連接、克隆操作。預(yù)期擴增產(chǎn)物約310bp。
3、缺氧應(yīng)答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的PCR擴增以人肝細胞癌HepG2細胞(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)基因組DNA為模板，分別用設(shè)計的引物進行HRE和AF0.3的高保真PCR擴增，電泳觀察，可見分別有約310bp和560bp的擴增條帶，且為主要產(chǎn)物，與預(yù)期的結(jié)果一致。
4、將缺氧應(yīng)答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T easy載體，構(gòu)建質(zhì)粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3。
將HRE和AF0.3的上述PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用Taq DNA聚合酶加A尾，然后與T載體相連，轉(zhuǎn)化JM109宿主菌(Stratagene公司產(chǎn)品)，鋪于含X-gal、IPTG、Amp的瓊脂平皿中，結(jié)果長出許多藍色和白色菌落。白色菌落即為侯選克隆。
5、缺氧應(yīng)答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的PCR及酶切鑒定各挑白色克隆，熱裂解法制備質(zhì)粒作模板，用特異引物分別進行HRE和AF0.3的PCR擴增，電泳觀察，可見挑取的克隆均能擴增出約310bp和560bp的目的片段。提取質(zhì)粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3，進行BamHI+HindIII雙酶切鑒定，可見質(zhì)粒pGEM-HRE可酶切出約560bp的目的片段，pGEM-AF0.3可酶切出約310bp的目的片段。
結(jié)合以上對質(zhì)粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3的PCR及酶切鑒定結(jié)果，表明克隆入pGEM-T easy載體的缺氧應(yīng)答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3的酶切位點及大小正確，送pGEM-AF0.3和pGEM-HRE質(zhì)粒到上海生工公司測序。
6、測序鑒定缺氧應(yīng)答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3已測序部分與文獻報道一致，在兩端已分別加入了HindIII和BamHI酶切位點，可確定質(zhì)粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3中外源DNA片段HRE和AF0.3的插入方向。
7、雜合啟動子HREAF的構(gòu)建將HRE與AF0.3進行PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物并純化、酶切后，在體外進行連接，得雜合啟動子HREAF，將此連接產(chǎn)物克隆至pGEM-T easy載體，如圖1所不，經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定正確。
為了便于HREAF的構(gòu)建，另設(shè)計了一條AF0.3下游引物，帶入了SphI位點，如序列表中序列14所示。雜合啟動子HREAF的構(gòu)建路線如圖2所示，預(yù)期可得約700bp的連接產(chǎn)物HREAF。
以HREAF連接產(chǎn)物作為模板，以HRE上游引物與AF0.3下游引物配對，進行PCR擴增，結(jié)果與預(yù)期一致。
根據(jù)對HRE和AF0.3序列酶切位點的分析以及HREAF的構(gòu)建路線，可預(yù)期在連接產(chǎn)物HREAF中應(yīng)有兩個SacI位點，相距約445bp。因此對HREAFPCR產(chǎn)物純化回收后，用SacI進行單酶切，結(jié)果如預(yù)期所料，酶切出了HREAF序列中部的445bp特異片段及兩端分別約200bp和50bp的條帶。
將HREAF PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用Taq DNA聚合酶加A尾，然后與T載體相連，轉(zhuǎn)化JM109宿主菌，鋪于含X-gal、IPTG、Amp的瓊脂平皿中，結(jié)果長出許多藍色和白色菌落。白色菌落即為侯選克隆。挑白色克隆，熱裂解法制備質(zhì)粒作模板，用特異引物分別進行HREAF的PCR擴增，電泳觀察，可見擴增出約700bp的目的片段。
小提質(zhì)粒pGEM-HREAF進行EcoR I單酶切鑒定，結(jié)果酶切出約700bp的目的片段。
結(jié)合以上對HREAF連接產(chǎn)物和質(zhì)粒pGEM-HREAF的PCR及酶切鑒定結(jié)果，表明克隆入pGEM-T easy載體的雜合啟動子HREAF的酶切位點及大小正確，送pGEM-HREAF質(zhì)粒到晶泰生物技術(shù)公司采用T7通用引物進行測序測定，HREAF測序結(jié)果如序列表中序列5所示，其中的缺氧應(yīng)答元件HRE、AFP核心啟動子AF0.3分別與文獻報道一致，符合預(yù)期構(gòu)建設(shè)想，可確定質(zhì)粒pGEM-HREAF中外源DNA片段HREAF的插入方向分別如圖所示。
實施例二 腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55的構(gòu)建1、設(shè)計穿梭質(zhì)粒構(gòu)建所需引物依據(jù)文獻中報道的缺氧應(yīng)答元件HRE(GenBank data accession no.M63971)、AFP核心啟動子AF0.3(GenBank data accession no.L34019)、腺病毒E1a和E1b(GenBank data accession no.X02996)及穿梭質(zhì)粒pShuttle多克隆位點(MCS)兩端的序列(Stratagene公司網(wǎng)站www.stratagene.com)，分別設(shè)計引物，并視載體構(gòu)建的需要，在其5’端或3’端分別加入不同的限制性內(nèi)切酶位點，用于各構(gòu)建元件的PCR擴增，引物由賽百勝公司合成。
HREAF引物上游引物如序列表中序列6所示，加入KpnI位點，下游引物如序列表中序列7所示，加入XhoI位點，預(yù)期擴增目的產(chǎn)物約為720bp；E1a引物上游引物如序列表中序列8所示，加入XhoI位點，下游引物如序列表中序列9所示，預(yù)期擴增目的產(chǎn)物為1000bp(在RT-PCR中，可能會擴增出約1000bp、880bp或740bp的cDNA條帶)；E1b引物下游引物如序列表中序列10所示，加入EcoRV位點。與E1a上游引物配對，預(yù)期擴增目的產(chǎn)物為2950bp，為全長AdE1；E1bΔ55引物下游引物如序列表中序列11所示，加入EcoR V位點。與E1a上游引物配對，預(yù)期擴增目的產(chǎn)物為1720bp，為缺失E1b55的AdE1Δ55基因；pShuttle MCS兩端引物上游引物如序列表中序列12所示，下游引物如序列表中序列13所示，預(yù)期擴增目的產(chǎn)物大小據(jù)插入片段的大小而定；各次PCR反應(yīng)條件根據(jù)引物搭配使用情況及目的產(chǎn)物大小而定。
2、重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1的構(gòu)建將腺病毒穿梭載體pShuttle和pShuttle-CMV分別進行Xho I和EcoR I雙酶切，分別回收純化pShuttle來源的大片段和pShuttle-CMV來源的小片段，T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞JM109，篩選陽性克隆子，經(jīng)PCR及酶切鑒定，獲得在pShuttle中插入了SV40加尾信號序列的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-R。將pShuttle-R和HREAF的PCR產(chǎn)物分別進行Xho I和Kpn I雙酶切，乙醇沉淀后如上述方法進行連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，獲得在pShuttle-R中插入了調(diào)控序列HREAF的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF。將pShuttle-HREAF和AdE1的PCR產(chǎn)物分別進行Xho I和EcoR V雙酶切，乙醇沉淀后如上述方法進行連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，獲得在pShuttle-HREAF中插入了腺病毒AdE1基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1。對上述構(gòu)建的各質(zhì)粒分別進行PCR和酶切鑒定。
3、pShuttle-HREAF-E1的構(gòu)建及鑒定將上述各質(zhì)粒作為模板，以pShuttle MCS兩端引物對插入片段進行PCR鑒定，可見pShuttle改構(gòu)前MSC兩端之間僅有約150bp長，改構(gòu)后的pShuttle-R由于插入了約230bp長的SV40加尾信號序列，MSC兩端之間距離變?yōu)榧s380bp長；插入HREAF后，間距進一步變?yōu)榧s1080bp；當(dāng)插入了E1后，間距最終變?yōu)榧s4000bp。以pShuttle-HREAF-E1為模板，分別以特異引物對擴增HREAF、E1及HREAF-E1，可得預(yù)期大小分別約為700bp、2950bp及3650bp的特異外源片段。
當(dāng)以Kpn I和EcoR V雙酶切上述各質(zhì)粒時，在pShuttle-HREAF能得到與外源目的片段HREAF和pShuttle酶切片段大小相同的兩條帶；但由于E1內(nèi)部有KpnI限制性內(nèi)切酶位點，故在pShuttle-HREAF-E1得到了三條帶，僅其中一條與pShuttle酶切片段大小相同；但如果改用XhoI和EcoR V雙酶切，則在pShuttle-HREAF-E1能得到與外源目的片段E1和pShuttle-HREAF的XhoI和EcoRV雙酶切片段大小相同的兩條帶。
以上PCR及酶切鑒定結(jié)果表明pShuttle-R、pShuttle-HREAF及pShuttle-HREAF-E1構(gòu)建正確。
4、pShuttle-HREAF-E1Δ55的構(gòu)建及鑒定pShuttle-HREAF-E1Δ55的構(gòu)建路線與pShuttle-HREAF-E1相似，只是把pShuttle-HREAF-E1構(gòu)建示意圖(見圖3)中的E1 PCR產(chǎn)物換成E1Δ55PCR產(chǎn)物，最后構(gòu)建成的穿梭質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖見圖4。
將pShuttle-HREAF和缺失E1b55的AdE1Δ55基因的PCR產(chǎn)物分別進行XhoI和EcoR V雙酶切，乙醇沉淀后如上述方法進行連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，獲得在pShuttle-HREAF中插入了腺病毒AdE1Δ55基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1Δ55。
pShuttle-HREAF-E1Δ55經(jīng)過PCR及酶切鑒定后，將此質(zhì)粒作為模板，以pShuttle MCS兩端引物對全部插入片段進行PCR鑒定，可見在插入了E1Δ55后，間距最終變?yōu)榧s2800bp。以特異引物E1a-up+E1bΔ55-down引物對PCR擴增E1Δ55，可得預(yù)期大小約為1720bp的特異外源片段。用XhoI和EcoR V雙酶切pShuttle-HREAF-E1Δ55，能酶切出與外源目的片段E1Δ55片段大小相同的特異條帶。PCR及酶切鑒定結(jié)果說明pShuttle-HREAF-E1Δ55構(gòu)建正確。
實施例三 制備重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ551、采用AdEasy XL adenoviral vector system生產(chǎn)重組腺病毒(圖5)穿梭質(zhì)粒構(gòu)建好后，用PmeI將其線性化，與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1一起轉(zhuǎn)化BJ5183(Stratagene公司產(chǎn)品)感受態(tài)細菌。二質(zhì)粒在菌體內(nèi)同源重組，重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)卡那霉素抗性選擇，再經(jīng)體外PacI酶切鑒定。重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切后應(yīng)產(chǎn)生一條約30kb的大片段，和一條3.0kb(重組發(fā)生在左臂)或4.5kb(重組發(fā)生在pBR322復(fù)制起始位點)的小片段。未經(jīng)PacI酶切的重組腺病毒質(zhì)粒，在0.8％瓊脂糖凝膠電泳條帶上表現(xiàn)為頂部靠近上樣孔處的模糊條帶，經(jīng)常還會有一條剛好在23kb DNA marker下面的小條帶。
鑒定后的重組腺病毒質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化至重組缺陷型菌株如JM109內(nèi)大量擴增。純化后的重組腺病毒質(zhì)粒即可經(jīng)PacI酶切，暴露出左右ITR后經(jīng)由Lipofectamine 2000(Invitragen公司)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細胞(Stratagene公司產(chǎn)品)，包裝出目的重組腺病毒顆粒。
2、細菌中重組腺病毒質(zhì)粒的產(chǎn)生和鑒定穿梭質(zhì)粒pShuttl-HREAF-E1和pShuttl-HREAF-E1Δ55分別用PmeI將其線性化，分別與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1一起轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細菌，鋪于卡那霉素抗性LB平板上選擇培養(yǎng)。在該受體菌中兩者的同源序列之間同源重組，重組后的質(zhì)粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55具備卡那霉素抗性，因此只有都具備卡那霉素抗性的穿梭質(zhì)粒pShuttl-HREAF-E1或pShuttl-HREAF-E1Δ55及重組質(zhì)粒pAdhafE1或pAdhafE1Δ55可被選擇。挑出pAdhafE1及pAdhafE1Δ55克隆，抽提質(zhì)粒，并用PacI酶切后，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶大小鑒定pAdhafE1重組子見圖6和pAdhafE1Δ55重組子見圖7，圖8?？梢砸姷轿唇?jīng)PacI酶切的重組腺病毒質(zhì)粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55，在0.8％瓊脂糖凝膠電泳條帶上表現(xiàn)為頂部靠近上樣孔處的模糊條帶，和一條剛好在23kb DNA marker下面的小條帶。經(jīng)PacI酶切后，2個pAdhafE1重組子和4個pAdhafE1Δ55重組子均產(chǎn)生了一條約30kb的大片段和一條4.5kb(重組發(fā)生在pBR322復(fù)制起始位點)的小片段；另有2個pAdhafE1Δ55重組子產(chǎn)生了3.0kb(重組發(fā)生在左臂)的小片段，表明已在BJ5183細菌內(nèi)成功地重組出了肝癌特異性溶瘤腺病毒質(zhì)粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55。
3、哺乳動物細胞中產(chǎn)生腺病毒發(fā)明人選擇重組質(zhì)粒pAdhafE1Δ55來進行重組腺病毒AdhafE1Δ55的包裝生產(chǎn)。
將重組質(zhì)粒pAdhafE1Δ55大量擴增、純化，經(jīng)PacI酶切，暴露出左右ITR后經(jīng)由Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細胞，進行重組腺病毒顆粒AdhafE1Δ55的包裝；或轉(zhuǎn)染HepG2細胞，在缺氧誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下(1％O2，5％CO2和94％N2，37℃)進行重組腺病毒顆粒AdhafE1Δ55的包裝。
轉(zhuǎn)染后第7～8天，可見細胞出現(xiàn)病變，如圖9所示。
隨后病變區(qū)域逐漸擴大，直至完全病變。將細胞回收，凍融三次，釋放病毒，再分別接種于293細胞或HepG2細胞中，2天后細胞出現(xiàn)完全病變。將細胞回收，凍融三次，釋放病毒，離心取上清，提取重組腺病毒基因組DNA見圖10，作為PCR反應(yīng)的模板，以雜合啟動子HREAF的上下游引物對(HRE-up+AF0.3-down)進行PCR鑒定，同時設(shè)立以哺乳動物細胞基因組DNA為模板的陰性對照，結(jié)果如圖11所示。
雖然雜合啟動子HREAF片段中的兩個組成部分在哺乳動物細胞基因組DNA中均存在，但正常的哺乳動物細胞基因組DNA中并無HREAF這一雜合片段，因此可以確認在293細胞或HepG2細胞中包裝出的重組腺病毒即為AdhafE1Δ55。
快速CPE法測定重組腺病毒AdhafE1Δ55滴度約為2～3×106pfu/ml。
實施例四 AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷作用使用上面實施例中經(jīng)肝癌細胞HepG2包裝出的溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55進行體外細胞水平的肝癌細胞特異殺傷試驗。
1、形態(tài)學(xué)觀察AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷將5×104/孔人肝癌細胞系HepG2、Bel7402(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，國家ATCC細胞庫)和肺癌細胞系PLA801C(國家ATCC細胞庫保存)鋪于6孔板，以1×104pfu低劑量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分別攻擊，缺氧誘導(dǎo)條件下(1％O2，5％CO2和94％N2，37℃)培養(yǎng)。結(jié)果，6天后HepG2、Bel7402細胞大部死亡，而PLA801C細胞則未受影響，生長正常。結(jié)果如圖12所示。
2、MTT實驗檢測AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷將1～2×103/孔人肝癌細胞系HepG2、Bel7402和肺癌細胞系PLA801C鋪于96孔板，以1×104pfu低劑量溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55分別攻擊，缺氧誘導(dǎo)條件下(1％O2，5％CO2和94％N2，37℃)培養(yǎng)。分別于24h、48h、72h及84h測定各孔細胞的光吸收值，繪制細胞生長曲線見圖13，并對各腫瘤細胞在各時間點上進行AdhafE1/55感染與否之間的生存狀況比較，以及對各腫瘤細胞之間在各時間點上進行生存率的比較(表1)。結(jié)合圖13和表1可以發(fā)現(xiàn)，人肝癌細胞系HepG2、Bel7402在感染AdhafE1Δ55 72h后，無論是相對于未感染AdhafE1Δ55的同種肝癌細胞，還是相對于也感染AdhafE1Δ55的肺癌細胞PLA801C，其存活細胞數(shù)均已顯著下降(P＜0.05)，而感染與未感染AdhafE1Δ55的肺癌細胞PLA801C之間在各時間點上的存活細胞數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)上的差別(P＞0.05)。MTT實驗的結(jié)果說明重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55可特異裂解、殺傷肝癌細胞HepG2和Bel7402。
表1 感染AdhafE1Δ55后腫瘤細胞生存狀況差異的t檢驗不同時間點生存率腫瘤細胞24h 48h 72h 84hHepG2-t/c 0.005551 0.088404 0.008462 0.000591Bel7402-t/c 0.002158 0.456552 0.012585 0.000114PLA801C-t/c 0.315335 0.98704 0.052304 0.737263HepG2--PLA801C 0.832517 0.061966 0.003758 0.002493Bel7402--PLA801C0.949824 0.522942 0.026352 0.003916HepG2--Bel7402 0.239669 0.216064 0.795694 0.280477(P值＜0.05為差異顯著)3、RT-PCR檢測E1a的表達以1×106pfu AdhafE1Δ55分別感染HepG2、Bel7402和PLA801C，缺氧誘導(dǎo)(1％O2，5％CO2和94％N2，37℃)培養(yǎng)3小時后，收集細胞，提取細胞總RNA，用RT-PCR檢測E1a的表達。結(jié)果在肝癌細胞HepG2和Bel7402檢測到了大小約為1000bp的E1a cDNA，說明AdhafE1Δ55在HepG2和Bel7402中表達了E1a，而在PLA801C中沒有表達見圖14。這個結(jié)果提示，在形態(tài)學(xué)觀察和MTT生化實驗中觀察到的AdhafE1Δ55對人肝癌細胞HepG2和Be17402的特異殺傷是由于該病毒在HepG2和Bel7402細胞中選擇性復(fù)制引起的。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其制備方法及用途<130>
<160>14<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>29<212>DNA<213>
<400>1ctcaagctta gctatgagtc tgggcttgg 29<210>2<211>29<212>DNA<213>
<400>2ctcggatcct ttgggactgg agttgcttc 29<210>3<211>31<212>DNA<213>
<400>3ctcggatcct ctgcaactta gggacaagtc a31<210>4<211>28<212>DNA<213>
<400>4ctcaagcttg ttattggcag tggtggaa28<210>5<211>900<212>DNA<213>
<400>5gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg cccacgtcgc atgctcccgg ccgccatggc 60ggccgggaat tcgattctca agcttagcta tgagtctggg cttgggctga tagaagcctt120
ggcccctggc ctggtgggag ctctgggcag ctggcctaca gacgttcctt agtgctggcg180ggtaggtttg aatcatcacg caggccctgg acctccaccc gcccccacca gccccctggc240ctcagttccc tggcaacatc tggggttggg ggggcagcag gaacaagggc ctctgtctgc300ccagctgcct ccccctttgg gttttgccag actccacagt gcatacgtgg gctccaacag360gtcctcttcc ctcccagtca ctgactaacc ccggaaccac acagcttccc gttctcagct420ccacaaactt ggtgccaaat tcttctcccc tgggaagcat ccctggacac ttcccaaagg480accccagtca ctccagcctg ttggctgccg ctcactttga tgtcatttgt tatatttgca540aaataaaata agtttgcaag tttttttttt ctgccccaaa gagctctgtg tccttgaaca600taaaatacaa ataaccgcta tgctgttaat tattggcaaa tgtcccattt tcaacctaag660gaaataccat aaagtaacag atataccaac aaaaggttac tagttaacag gcattgcctg720aaaagagtat aaaagaattt cagcatgatt ttccatattg tgcttccacc actgccaata780acgcatgcga ggagaatcac tagtgaattc gcggccgcct gcaggtcgac catatgggag840agctcccaac gcgttggatg catagcttga gtattctata gtgtcaccta aatagcttgg900<210>6<211>30<212>DNA<213>
<400>6ctcaggtacc agctatgagt ctgggcttgg 30<210>7<211>29<212>DNA<213>
<400>7ctcactcgag gttattggca gtggtggaa 29<210>8<211>28<212>DNA<213>
<400>8ctcactcgag aaaatgagac atattatc28<210>9<211>22<212>DNA<213>
<400>9ctcttatggc ctggggcgtt ta22<210>10<211>29<212>DNA<213>
<400>10ctcagatatc tcaatctgta tcttcatcg 29<210>11<211>30<212>DNA<213>
<400>11ctcagatatc ggatacagtt cagccacctg30<210>12<211>25<212>DNA<213>
<400>12gaagtgaaat ctgaataatt ttgtg 25<210>13<211>22<212>DNA<213>
<400>13caaaactaca taggaccccc ac22<210>14<211>28<212>DNA<213>
<400>14ctcgcatgcg ttattggcag tggtggaa 28
權(quán)利要求
1.一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其特征在于包含由缺氧應(yīng)答元件HRE與AFP核心啟動子AF0.3構(gòu)成的肝癌靶向性雜合啟動子和腺病毒E1區(qū)復(fù)制啟動基因，所說的腺病毒E1區(qū)復(fù)制啟動基因位于肝癌靶向性雜合啟動子的下游。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于所說的肝癌靶向性雜合啟動子具有序列表中序列7所示的核苷酸序列。
3.制備權(quán)利要求1或2所述的腺病毒的方法，其特征在于包括以下步驟(1)克隆HRE和AF0.3及構(gòu)建雜合啟動子HREAF；(2)構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55；(3)生產(chǎn)重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55；(4)AdhafE1Δ55對人肝癌細胞的特異殺傷作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于克隆HRE和AF0.3及構(gòu)建雜合啟動子HREAF包括以下步驟(1)設(shè)計引物，進行PCR擴增；(2)構(gòu)建質(zhì)粒pGEM-HRE和pGEM-AF0.3，并鑒定；(3)雜合啟動子HREAF的構(gòu)建。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-HREAF-E1和pShuttle-HREAF-E1Δ55包括以下步驟(1)設(shè)計穿梭質(zhì)粒構(gòu)建所需引物；(2)制備pShuttle-R；(3)制備pShuttle-HREAF；(4)制備pShuttle-HREAF-E1；(5)制備pShuttle-HREAF-E1Δ55。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于生產(chǎn)重組溶瘤腺病毒AdhafE1Δ55包括如下步驟(1)將權(quán)利要求5構(gòu)建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒線性化，經(jīng)同源重組制備重組腺病毒質(zhì)粒，酶切后轉(zhuǎn)染細胞，包裝出目的重組腺病毒顆粒；(2)細菌中重組腺病毒質(zhì)粒的產(chǎn)生和鑒定將權(quán)利要求5構(gòu)建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒線性化，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，抗生素平板選擇重組質(zhì)粒pAdhafE1和pAdhafE1Δ55；(3)哺乳動物細胞中產(chǎn)生腺病毒將重組質(zhì)粒擴增、純化，酶切后轉(zhuǎn)染細胞，包裝重組腺病毒顆粒。
7.權(quán)利要求1或2所述的重組腺病毒在制備肝癌治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其制備方法及用途。本發(fā)明的腺病毒是利用缺氧應(yīng)答元件HRE和AFP核心啟動子AF0.3來構(gòu)建雜合啟動子，構(gòu)建保留有E1復(fù)制啟動區(qū)基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒，再經(jīng)過同源重組構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細胞，包裝出目的重組腺病毒顆粒。本發(fā)明的腺病毒具有肝癌靶向性，能在肝癌細胞內(nèi)自我復(fù)制，達到裂解癌細胞的目的。具有高效、無致突變作用、安全性高的優(yōu)點，可用于制備肝癌的治療藥物。
文檔編號C12N15/11GK1603404SQ0312649
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者陸應(yīng)鱗, 陳澤建, 杜芝燕, 徐丁堯, 藺會云, 徐元基, 王妍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所