siRNA分子組合物及其在治療增生性瘢痕中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及siRNA分子組合物及其在治療增生性瘢痕中的用途。所述的siRNA分子組合物包含：核苷酸序列含有a）5′-ccccggaggugauuuccaucuacaa-3′，5’-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3’的siRNA分子，和核苷酸序列含有b）5′-gucuuuggucuggugccuggucuga-3′，5’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’的siRNA分子。本發(fā)明證實(shí)上述siRNA分子組合物可以促進(jìn)體外的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡，還對(duì)動(dòng)物模型中的增生性瘢痕具有良好的治療效果。
【專利說明】S i RNA分子組合物及其在治療增生性瘢痕中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因治療【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是siRNA分子在治療增生性瘢痕中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚是人體最大器官，具備防護(hù)、免疫、排泄等功能，其中最為重要的功能是防護(hù)、維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)皮膚的完整性受到較大破壞時(shí)，體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)不平衡，外界侵襲因子容易進(jìn)入體內(nèi)，直接威脅到個(gè)體的生存。在物種進(jìn)化的過程中，出現(xiàn)了創(chuàng)口的瘢痕愈合模式,這種愈合方式能最快地恢復(fù)皮膚的完整性,大大提高了物種的生存機(jī)率。因此,瘢痕是人體皮膚創(chuàng)口愈合不可或缺的產(chǎn)物。
[0003]但在創(chuàng)口愈合的過程中常常發(fā)生瘢痕的過度生長(zhǎng)，形成增生性瘢痕，影響功能和外觀。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，40%-70%的外科手術(shù)術(shù)后患者以及91%的燒傷患者愈合后形成增生性瘢痕，整形外科門診通常有超過半數(shù)的患者因瘢痕就診。目前對(duì)于增生性瘢痕的治療方法包括手術(shù)方法和非手術(shù)方法，但都存在一定的局限性。如何改善、治療增生性瘢痕，一直是整形外科醫(yī)生關(guān)注的課題，同時(shí)也是大眾關(guān)心的問題。
[0004]增生性瘢痕病因主要包括創(chuàng)口張力過大、感染等。增生性瘢痕形成的機(jī)制包括成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、成纖維細(xì)胞的增殖、過度血管化、細(xì)胞膠原分泌增加以及細(xì)胞外基質(zhì)過度堆積。在增生性瘢痕形成的機(jī)制研究中，對(duì)TGF-β (轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)的研究最多。在TGF-β的三個(gè)亞型中，TGF-β I與增生性瘢痕的形成關(guān)系最為密切，TGF-β I參與了成纖維細(xì)胞向肌 成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)細(xì)胞分泌膠原和組織血管化。已有諸多的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，抑制TGF-β I的表達(dá)可以減輕增生性瘢痕。C0X-2 (環(huán)氧合酶-2)是PGE (前列腺素Ε)的前體酶，PGE是炎癥反應(yīng)的重要因子，對(duì)血管新生有促進(jìn)作用。同時(shí)TGF-β I和C0X-2對(duì)于創(chuàng)口愈合過程當(dāng)中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換都有一定的促進(jìn)作用。目前關(guān)于C0X-2在治療增生性瘢痕中的研究較少，關(guān)于TGF-β I和C0X-2之間的作用也鮮有報(bào)道。
[0005]中國(guó)專利文獻(xiàn)CN201010260249.8，申請(qǐng)日2010.08.24，發(fā)明名稱為“促進(jìn)皮膚傷口無疤痕愈合的siRNA即應(yīng)用”，公開了促進(jìn)皮膚傷口無疤痕愈合的siRNA分子、靶向多個(gè)傷口無疤痕愈合相關(guān)基因的多個(gè)siRNA分子的雞尾酒組合、以siRNA分子或者其雞尾酒組合作為有效成分的藥物組合物，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及小鼠和豬皮膚創(chuàng)傷模型證明了該藥物組合物可以促進(jìn)因外傷、外科手術(shù)或糖尿病皮膚潰瘍等造成的皮膚傷口達(dá)到無疤痕愈合，其中siRNA分子可以靶向那些造成傷口病理性修復(fù)或不良反應(yīng)的基因，siRNA雙鏈有不同的長(zhǎng)度和不同的末端，可以靶向人、小鼠及豬細(xì)胞同一基因的同源序列，雞尾酒組合中的多個(gè)siRNA能同時(shí)抑制傷口炎癥和血管再生的各種相關(guān)基因，藥效更顯著，藥物組合物中組氨酸-賴氨酸聚合物、樹枝狀聚合物或脂質(zhì)體等藥物載體能以納米顆粒的形式增強(qiáng)siRNA導(dǎo)入皮膚組織。但是該文獻(xiàn)公開的是將siRNA應(yīng)用于創(chuàng)口在愈合過程中促進(jìn)愈合并減少疤痕形成，創(chuàng)口治療和已形成的瘢痕治療是完全不同的兩個(gè)概念，涉及不同的生理過程，而目前關(guān)于用siRNA來治療已形成的增生性瘢痕還未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種siRNA分子組合物。
[0007]本發(fā)明另一的目的是，提供上述SiRNA分子組合物的用途。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是: siRNA分子組合物,所述的siRNA分子組合物包含:
核苷酸序列含有 a) 5' -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3',
5，-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3，的 siRNA 分子，和 核苷酸序列含有 b) 5' -gucuuuggucuggugccuggucuga-3',
5，-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3，的 siRNA 分子。
[0009]優(yōu)選地，所述的siRNA分子組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0010]優(yōu)選地，所述的藥學(xué)上可接受的載體選自組氨酸和賴氨酸的聚合物。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
如上任一所述的siRNA分子組合物在制備治療增生性瘢痕的藥物中的用途。
[0012]所述的治療增生性瘢痕是指治療已形成的增生性瘢痕，優(yōu)選地，所述的治療增生性瘢痕是指消退已形成的增生性瘢痕或減小已形成的增生性瘢痕的體積。
[0013]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明應(yīng)用TGF-β I和C0X-2聯(lián)合`siRNA方法，對(duì)體外的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行TGF-β I和C0X-2表達(dá)的敲低，可以達(dá)到促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的效果；此外，在動(dòng)物模型中，證實(shí)TGF- β I和C0X-2聯(lián)合siRNA對(duì)增生性瘢痕的消退具有良好的治療效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是體外實(shí)驗(yàn)中瘢痕成纖維細(xì)胞的鏡下形態(tài)。
[0015]圖2是體外實(shí)驗(yàn)基因沉默效應(yīng)檢測(cè)中目的基因TGF- β 1、C0X-2mRMA表達(dá)情況。
[0016]圖3是體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖周期檢測(cè)結(jié)果。
[0017]圖4是體外實(shí)驗(yàn)基因沉默效應(yīng)檢測(cè)中相關(guān)目的基因a -SM, Col Ial、Col3almRMA表達(dá)情況。
[0018]圖5是體外實(shí)驗(yàn)a -SMA免疫熒光染色結(jié)果。
[0019]圖6是體外實(shí)驗(yàn)Annexin V/PI流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果。
[0020]圖7是體外實(shí)驗(yàn)瘢痕成纖維細(xì)胞的掃描電鏡圖。
[0021]圖8是體外實(shí)驗(yàn)瘢痕成纖維細(xì)胞的透射電鏡圖。
[0022]圖9是體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞上清羥脯氨酸含量檢測(cè)結(jié)果。
[0023]圖10是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人增生性瘢痕組織塊植入模型的瘢痕組織塊大體形態(tài)結(jié)果。
[0024]圖11是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人增生性瘢痕組織塊植入模型的瘢痕組織塊體積測(cè)量結(jié)果。
[0025]圖12是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人增生性瘢痕組織塊植入模型的瘢痕組織中目的基因TGF- β 1、C0X-2、α-SMA、Collal 的表達(dá)情況。
[0026]圖13是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人增生性瘢痕組織塊植入模型的瘢痕組織HE染色結(jié)果。
[0027]圖14是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人增生性瘢痕組織塊植入模型的瘢痕組織Masson三色染色結(jié)果O[0028]圖15是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人增生性瘢痕組織塊植入模型的瘢痕組織VEGF免疫組化染色結(jié)
果O
[0029]圖16是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人增生性瘢痕組織塊植入模型的瘢痕組織⑶31免疫組化染色結(jié)
果O
[0030]圖17是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人增生性瘢痕組織塊植入模型的瘢痕組織內(nèi)羥脯氨酸含量檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果。
[0031]圖18中左圖是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裸鼠背部植皮模型的瘢痕組織塊拍照結(jié)果，右圖是瘢痕組織塊體積測(cè)量結(jié)果。
[0032]圖19是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裸鼠背部植皮模型的瘢痕組織中目的基因TGF-β 1、C0X-2、a -SM, Collal的表達(dá)情況。
[0033]圖20是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裸鼠背部植皮模型的瘢痕組織HE染色結(jié)果。
[0034]圖21是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裸鼠背部植皮模型的瘢痕組織Masson三色染色結(jié)果。
[0035]圖22是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裸鼠背部植皮模型的瘢痕組織VEGF免疫組化染色結(jié)果。
[0036]圖23是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裸鼠背部植皮模型的瘢痕組織CD31免疫組化染色結(jié)果。
[0037]圖24是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裸鼠背部植皮模型的瘢痕組織內(nèi)羥脯氨酸含量檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0039]實(shí)施例1 I實(shí)驗(yàn)材料
1.1 SiRNA有效成分
TGF- β I siRNA 分子:正義鏈:5' -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3'，反義鏈:5，_uuguagauggaaaucaccuccgggg-3J ；
COX-2 siRNA 分子:正義鏈:5' -gucuuuggucuggugccuggucuga-3'，反義鏈 A’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’ ；
藥物載體:縮氨酸(HKP)，組氨酸和賴氨酸的聚合物；
STP705 (siRNA雞尾酒):將上述TGF-β I siRNA分子、COX-2 siRNA分子和HKP形成納米顆粒，其中TGF-βΙ siRNA分子、COX-2 siRNA分子拷貝數(shù)比例為1:1，兩種siRNA分子與HKP的重量比為1:4。治療時(shí)以20μ g/ml的siRNA濃度進(jìn)行局部病灶注射。
[0040]以上藥物由蘇州圣諾生物有限公司提供。
[0041]1.2 抗體
兔抗人 α _ 肌動(dòng)蛋白(α _SMA, alpha smooth muscle Actin)單克隆抗體(ab5694,Abeam, 1wa，USA)，免疫組化染色一抗稀釋比例1:200，免疫熒光染色一抗稀釋比例1:100 ；兔抗人I型主要組織相容性抗原(human MHC class I)單克隆抗體(cat.#1913-1,Epitomics, California, USA),免疫組化染色一抗稀釋比例1:250 ；
兔抗人CD31單克隆抗體(ab38264，Abeam, 1wa, USA)，免疫組化染色一抗稀釋比例
1:50ο ；
兔抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF，vascular endothelial growth factor)單克隆抗體(cat.#1909-1，Epitomics，California，USA)，免疫組化染色一抗稀釋比例 1: 50。[0042]1.3 Q-PCR 用引物
【權(quán)利要求】
1.SiRNA分子組合物，其特征在于，所述的SiRNA分子組合物包含: 核苷酸序列含有 a) 5' -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3', 5，-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3，的 siRNA 分子，和 核苷酸序列含有 b) 5' -gucuuuggucuggugccuggucuga-3', 5，-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3，的 siRNA 分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA分子組合物，其特征在于，所述的siRNA分子組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的siRNA分子組合物，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的載體選自組氨酸和賴氨酸的聚合物。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的siRNA分子組合物在制備治療增生性瘢痕的藥物中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的治療增生性瘢痕是指消退已形成的增生性瘢痕或減小已形成的增生性瘢痕的體積。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103642800SQ201310577630
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】周佳, 劉凱, 黃曉璐, 李青峰 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院