本申請(qǐng)屬于聯(lián)合疫苗領(lǐng)域，聯(lián)合疫苗即包含來(lái)自多于一種病原體的免疫原的混合物的疫苗，從而給予所述疫苗能夠使對(duì)象同時(shí)免疫抵抗多于一種病原體。具體而言，本發(fā)明涉及包含無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)莢膜糖和載體蛋白的聯(lián)合疫苗。

背景技術(shù)：
單一劑量中含有來(lái)自多于一種病原性生物體的抗原的疫苗被稱為“多價(jià)”疫苗或“聯(lián)合”疫苗。在歐洲和美國(guó)，多種聯(lián)合疫苗已經(jīng)被批準(zhǔn)用于人體，包括針對(duì)白喉、破傷風(fēng)和百日咳的多價(jià)疫苗("DTP"疫苗)以及針對(duì)麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹的多價(jià)疫苗("MMR"疫苗)。聯(lián)合疫苗給患者提供的益處在于減少注射次數(shù)，從而帶來(lái)順應(yīng)性提高的臨床優(yōu)勢(shì)(例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)1的第29章)。無(wú)乳鏈球菌(B組鏈球菌，GBS)是溶血性帶莢膜革蘭氏陽(yáng)性微生物，寄居在25-30％健康女性的生殖道。GBS導(dǎo)致攜帶該細(xì)菌的母親所產(chǎn)嬰兒的新生兒感染，并且是新生兒敗血癥和腦膜炎的主要原因。該病原體被越來(lái)越多地鑒定為成人(尤其是那些具有潛在疾病的人以及老年人)中的重要病因。針對(duì)無(wú)乳鏈球菌的偶聯(lián)疫苗已在例如參考文獻(xiàn)2～10的文件中有所描述。已顯示針對(duì)各GBS血清型Ia、Ib、II、III和V的偶聯(lián)疫苗在人體中安全且具有免疫原性[11]。參考文獻(xiàn)12也公開了多種含GBS偶聯(lián)物的疫苗。本發(fā)明的目的是提供另外且改進(jìn)的聯(lián)合疫苗，用以保護(hù)抵抗無(wú)乳鏈球菌以及白喉?xiàng)U菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、破傷風(fēng)桿菌(Clostridiumtetani)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)和脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)中的一種或多種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明基于對(duì)如下聯(lián)合疫苗的研究，所述聯(lián)合疫苗包含GBS偶聯(lián)物和選自下組的一種或多種抗原：a)細(xì)胞或非細(xì)胞百日咳抗原，b)破傷風(fēng)類毒素，c)白喉類毒素，和d)失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)這些聯(lián)合疫苗引發(fā)針對(duì)對(duì)應(yīng)抗原的特定抗體效價(jià)，而在所用不同抗原之間幾乎沒(méi)有或沒(méi)有免疫學(xué)干擾。因此，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，其包含一種或多種GBS偶聯(lián)物和選自下組的一種或多種抗原：a)細(xì)胞或非細(xì)胞百日咳抗原，b)破傷風(fēng)類毒素，c)白喉類毒素和d)失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原，其中各GBS偶聯(lián)物是偶聯(lián)至載體蛋白的B組鏈球菌莢膜糖。本發(fā)明還提供用于使患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述患者本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟。本發(fā)明還提供一種制備本發(fā)明的免疫原性組合物的方法，所述方法包括將第一組分和第二組分混合，第一組分含有一種或多種GBS偶聯(lián)物的，第二組分含有選自下組的一種或多種抗原：a)細(xì)胞或非細(xì)胞百日咳抗原，b)破傷風(fēng)類毒素，c)白喉類毒素，和d)失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。本發(fā)明還提供一種制備本發(fā)明的免疫原性組合物的試劑盒，所述試劑盒包含第一組分和第二組分，第一組分含有一種或多種GBS偶聯(lián)物，第二組分含有選自下組的一種或多種抗原：a)細(xì)胞或非細(xì)胞百日咳抗原，b)破傷風(fēng)類毒素，c)白喉類毒素，和d)失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原；其中所述兩種組分在分開的容器中。GBS偶聯(lián)物莢膜糖本發(fā)明是基于無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的莢膜糖。所述莢膜糖共價(jià)連接到GBS的肽聚糖骨架上，并且與B組抗原不同，B組抗原是連接到肽聚糖骨架上的另一種糖。所述GBS莢膜糖在化學(xué)上相關(guān)，但是抗原性上非常不同。所有GBS莢膜糖共有以下三糖核心：β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp各種GBS血清型的區(qū)別在于修飾其核心的方式。例如，血清型Ia和III的區(qū)別在于，核心中采用GlcNAc(Ia)或Gal(III)來(lái)連接連續(xù)的三糖核心。血清型Ia和Ib的核心中都具有與GlcNAc相連的[α-D-NeupNAc(2→3)β-D-Galp-(1→]二糖，只是連接鍵是1→4(Ia)或1→3(Ib)。GBS-相關(guān)疾病主要是由血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII引起，超過(guò)85％是由以下五種血清型引起的：Ia、Ib、III和V。本發(fā)明通常使用來(lái)自這四種血清型中一種或多種的糖，特別是來(lái)自血清型Ia、Ib和III中的一種或多種。這四種血清型各自的莢膜糖包含：(a)末端N-乙?；?神經(jīng)氨酸(NeuNAc)殘基(一般稱為唾液酸)，在所有情況下2→3連接至半乳糖殘基；和(b)三糖核心內(nèi)的N-乙酰基-葡糖胺殘基(GlcNAc)。所有四種糖包含所述三糖核心中的半乳糖殘基，但是血清型Ia、Ib、II和III也包含各重復(fù)單位中的其他半乳糖殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含一種GBS偶聯(lián)物。例如，所述GBS偶聯(lián)物可以是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物。所述GBS偶聯(lián)物可以是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物。所述GBS偶聯(lián)物可以是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物。所述GBS偶聯(lián)物可以是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物。所述GBS偶聯(lián)物可以是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物。所述免疫原性組合物可以包含多于一種GBS偶聯(lián)物。下面描述包含兩種、三種、四種或五種GBS偶聯(lián)物的本發(fā)明實(shí)施方式。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在第二個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在第三個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在第四個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在第五個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在第六個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在其它個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在其它實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在其它實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在其它實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。通常而言，本發(fā)明的免疫原性組合物包含三種GBS偶聯(lián)物。通常而言，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在一個(gè)可選實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。采用相同方式，所述免疫原性組合物可以包含四種GBS偶聯(lián)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第四GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第四GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第四GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第四GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第四GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。采用相同方式，所述免疫原性組合物可以包含五種GBS偶聯(lián)物。例如，第一GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第二GBS偶聯(lián)物是GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，第三GBS偶聯(lián)物是GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，而第四GBS偶聯(lián)物是GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物，且第五GBS偶聯(lián)物是GBS血清型II的莢膜糖與載體蛋白的偶聯(lián)物。通常而言，上述免疫原性組合物不包含具體提到的那些以外的任何GBS偶聯(lián)物，特別是含有特定提到的那些以外的GBS血清型的莢膜糖的GBS偶聯(lián)物。然而，在一些實(shí)施方式中，所述組合物可以包含其他GBS偶聯(lián)物，包括含有其他GBS血清型的莢膜糖的GBS偶聯(lián)物。例如，所述組合物可以包含GBS血清型VI的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的GBS偶聯(lián)物。在另一種可能中，所述組合物可包含GBS血清型VIII的莢膜糖與載體蛋白的GBS偶聯(lián)物。本發(fā)明所用的糖可以是其天然形式，也可以是經(jīng)修飾的形式。例如，糖可以比天然莢膜糖短，或可被化學(xué)修飾。具體而言，本發(fā)明使用的所述血清型V莢膜糖可以如參考文獻(xiàn)13和14所述進(jìn)行修飾。例如，本發(fā)明特定設(shè)想采用如參考文獻(xiàn)13和14所述的實(shí)質(zhì)脫唾液酸化的血清型V莢膜糖。脫唾液酸化的GBS血清型V莢膜糖可通過(guò)以下方式制備：在溫和酸性條件下(例如0.1M硫酸，80℃持續(xù)60分鐘)處理純化的GBS血清型V莢膜糖或者用神經(jīng)氨酸酶處理，如參考文獻(xiàn)13所述。一種優(yōu)選的制備脫唾液酸化GBS血清型V莢膜糖的方法是將純化的糖用1M乙酸在81℃+/-3℃處理2小時(shí)。因此，本發(fā)明所用的糖可以是如天然發(fā)現(xiàn)的基本全長(zhǎng)莢膜多糖，或可短于天然長(zhǎng)度?？山饩廴L(zhǎng)多糖以提供用于本發(fā)明的較短片段，例如，通過(guò)在溫和酸中水解、通過(guò)加熱、通過(guò)尺寸層析等。已有報(bào)道稱，鏈長(zhǎng)影響GBS糖在兔子中的免疫原性[5]。特別地，本發(fā)明使用的所述血清型II和/或III莢膜糖可以如參考文獻(xiàn)15和16所述進(jìn)行解聚。這些文獻(xiàn)描述了通過(guò)溫和去氨基切割為含還原末端2,5-脫水-D-甘露糖殘基的抗原片段來(lái)部分解聚II型和III型莢膜糖。簡(jiǎn)單說(shuō)，使所述莢膜糖溶解于0.5NNaOH中，隨后加熱到70℃約1-4小時(shí)。該孵育時(shí)長(zhǎng)控制解聚程度，所述解聚程度可由標(biāo)準(zhǔn)方法(如由參考文獻(xiàn)15所述的HPLC)測(cè)定。所述樣品在冰水浴中冷卻，然后加入冰醋酸將pH調(diào)到4。然后，部分N-脫?；漠a(chǎn)物通過(guò)加入5％(wt/vol)NaNO2在4℃攪拌2小時(shí)來(lái)脫氨。如參考文獻(xiàn)[12]所述，新形成的2,5-脫水-D-甘露糖殘基的游離醛可以用于與載體蛋白偶聯(lián)。已經(jīng)報(bào)道了血清型III莢膜糖由內(nèi)-β-半乳糖苷酶的來(lái)解聚[參考文獻(xiàn)2和5-7]，這包含采用所述解聚材料來(lái)與破傷風(fēng)類毒素載體形成偶聯(lián)物。GBS血清型III和VIII的莢膜多糖的臭氧分解也已經(jīng)用于解聚[17]。優(yōu)選使用MW>30kDa的糖，并且可采用基本全長(zhǎng)的莢膜多糖。就血清型Ia而言，優(yōu)選采用MW為150-400kDa，尤其是300-350kDa的多糖。通常而言，采用MW約為330kDa的血清型Ia的糖。對(duì)血清型Ib而言，優(yōu)選采用MW為150-400kDa，特別是250-300kDa的多糖。通常而言，采用MW約為280kDa的血清型Ib的糖。對(duì)血清型III而言，優(yōu)選使用MW為50-200kDa，特別是100-150kDa的多糖。.通常而言，采用MW約為140kDa的血清型III的糖。對(duì)血清型V而言，也優(yōu)選采用MW為50-200kDa，特別是150-200kDa的多糖。通常而言，采用MW約為180kDa的血清型V的糖。這些分子量可通過(guò)凝膠過(guò)濾相對(duì)于葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，如購(gòu)自PSS公司(PolymerStandardService)的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定[18]。所述糖可相對(duì)于與天然情況下發(fā)現(xiàn)的莢膜糖有化學(xué)修飾。例如，糖可被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙?；?部分或全部)、N-丙酸酯化(部分或全部)等。去乙?；稍谂悸?lián)之前、期間或之后進(jìn)行，但優(yōu)選在偶聯(lián)前進(jìn)行。根據(jù)具體的糖，去乙酰化可能會(huì)影響或不影響免疫原性。參考文獻(xiàn)19討論了各種血清型中GBS糖上O-乙酰化的關(guān)聯(lián)，且在一些實(shí)施方式中，第7、8和/或9位的唾液酸殘基的O-乙?；谂悸?lián)前、期間和之后都保留，例如通過(guò)保護(hù)/去保護(hù)、通過(guò)再乙酰化等。然而，本發(fā)明所用的GBS糖通常在第7、8和/或9位處基本沒(méi)有唾液酸殘基的O-乙?；＞唧w而言，如果GBS糖通過(guò)參考文獻(xiàn)[12]中所述的堿提取方式純化，那么通常會(huì)喪失O乙?；?參考文獻(xiàn)19)?？捎贸Ｒ?guī)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)去乙?；鹊挠绊憽Ｇv膜糖可通過(guò)已知技術(shù)例如本文引用的參考文獻(xiàn)(如參考文獻(xiàn)3和20)所述來(lái)純化。典型的方法包括堿提取、離心、過(guò)濾、RNA酶/DNA酶處理、蛋白酶處理、濃縮、尺寸排阻層析、超濾、陰離子交換層析和進(jìn)一步超濾。也使用酶變?nèi)芫靥幚鞧BS細(xì)胞，酶變?nèi)芫丶羟屑?xì)菌細(xì)胞壁以釋放所述細(xì)胞壁的成分。作為替代，可使用參考文獻(xiàn)21所述的純化過(guò)程。這涉及堿提取、乙醇/CaCl2處理、CTAB沉淀和再溶。參考文獻(xiàn)22中記載了另一種替代方法。本發(fā)明不限于純化自天然來(lái)源的糖，然而，可通過(guò)其它方法如全合成或部分合成獲得所述糖。上述免疫原性組合物可以包含任何合適量的莢膜糖/單位劑量。在各劑量?jī)?nèi)，個(gè)體糖抗原的量通常是0.1-50μg(以糖質(zhì)量計(jì))，具體是1-50μg或0.5-25μg，更具體是2.5-7.5μg，如約1μg、約2.5μg、約5μg、約10μg、約15μg、約20μg或約25μg。在各劑量?jī)?nèi)，GBS莢膜糖的總量通?！?0μg(以糖質(zhì)量計(jì))，如≤60μg。具體而言，所述總量可以是≤40μg(如≤30μg)或≤20μg(如≤15μg)。當(dāng)所述免疫原性組合物包含如下組分時(shí)，這些總量特別有效：i)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；和iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物。每單位劑量的莢膜糖總量減小可能有利于降低可能的毒性。因此，本發(fā)明通常采用≤20μg，如≤15μg、≤7.5μg或≤1.5μg的總量?？梢赃M(jìn)一步使每個(gè)單位劑量的莢膜糖的量最小化。具體而言，合適量的莢膜糖可以是0.1-5μg/單位劑量。因此，各GBS莢膜糖通?？梢?.1-5μg，如0.5、2.5或5μg/單位劑量的量存在。例如，各GBS莢膜糖可以0.5-5μg、1-4μg、2-3μg或約2.5μg/單位劑量的量存在。當(dāng)所述免疫原性組合物包含如下組分時(shí)，這些量通常是特別有效的：i)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；和iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物。在所述免疫原性組合物包含多于一種GBS偶聯(lián)物的上述實(shí)施方式中，給定的莢膜糖質(zhì)量與其他莢膜糖質(zhì)量的比率可以變化。例如，當(dāng)免疫原性組合物包含GBS血清型Ia、Ib和III莢膜糖時(shí)，GBS血清型Ia、Ib和III莢膜糖的質(zhì)量比是1:1:1。偶聯(lián)本發(fā)明采用的GBS偶聯(lián)物是與載體蛋白偶聯(lián)的GBS血清型Ia、Ib、II、III或V的莢膜糖。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)物”指通過(guò)使兩個(gè)部分共價(jià)結(jié)合以形成單一結(jié)構(gòu)來(lái)形成的化合物，其中第一部分是抗原，尤其是多糖，而第二部分是免疫原性載體，例如載體蛋白。所述結(jié)合可通過(guò)分子之間的共價(jià)化學(xué)鍵或通過(guò)采用連接基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)，非排他地包括二氨基烷和一種或多種氨基酸，其中一種提供游離的硫氫基、羧基、氨基或其它基團(tuán)用于偶聯(lián)至載體。出于本發(fā)明目的，一般而言，術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)物”指的是共價(jià)連接至載體蛋白的細(xì)菌抗原，特別是細(xì)菌糖或多糖。一般，糖與載體的共價(jià)偶聯(lián)增強(qiáng)糖的免疫原性，因?yàn)檫@將糖由T非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門-依賴性抗原，由此能夠引發(fā)免疫記憶。偶聯(lián)對(duì)于兒科疫苗特別有用[例如參考文獻(xiàn)23]，而且是公知技術(shù)[例如在參考文獻(xiàn)24-32中綜述]。因此，本發(fā)明的方法可包括將經(jīng)純化糖與載體分子偶聯(lián)的其他步驟。已廣泛報(bào)道GBS糖的偶聯(lián)，例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)2-103。GBS糖偶聯(lián)的典型現(xiàn)有技術(shù)方法通常涉及將純化的糖還原性胺化到載體蛋白，例如破傷風(fēng)類毒素(TT)或CRM197[3]。還原胺化涉及載體氨基酸側(cè)鏈上的胺基與糖上的醛基。由于GBS莢膜糖在其天然形式中不包括醛基，通常是在偶聯(lián)之前通過(guò)糖唾液酸殘基的一部分(如5-40％,特別10-30％,優(yōu)選約20％)發(fā)生氧化(如高碘酸鹽氧化)產(chǎn)生醛基[3,33]。已顯示此方法制備的偶聯(lián)物疫苗就各GBS血清型Ia、Ib、II、III和V而言在人體中安全且具有免疫原性[11]。通常，以這種方式制備本發(fā)明所述免疫原性組合物中的所有偶聯(lián)物。然而，當(dāng)本發(fā)明使用脫唾液酸化的血清型V莢膜糖時(shí)，那么可在這種糖中生成醛基，然后通過(guò)氧化(如高碘酸鹽氧化)部分(如5-40％,特別10-30％,優(yōu)選約20％)糖半乳糖殘基來(lái)偶聯(lián)[2,33]。一個(gè)替代的偶聯(lián)過(guò)程涉及利用糖中的-NH2基團(tuán)(來(lái)自去N-乙酰化或在引入胺后)以及雙功能接頭，如文獻(xiàn)34中所述。在這些實(shí)施方式中，以這種方式制備本發(fā)明所述免疫原性組合物中的一種或多種偶聯(lián)物。參考文獻(xiàn)15和16中記載了另一種替代方法。在這個(gè)過(guò)程中，所述通過(guò)溫和去氨基切割從II型或III型莢膜糖解聚的末端2,5-脫水-D-甘露糖殘基的游離醛基用于還原性氨化的偶聯(lián)。在這些實(shí)施方式中，以這種方式制備本發(fā)明所述免疫原性組合物中的一種或多種偶聯(lián)物?？赏ㄟ^(guò)分開的方法制備偶聯(lián)物，并將其合并至單一劑量制劑中。載體蛋白本發(fā)明涉及載體蛋白的應(yīng)用。盡管多糖本身具有免疫原性，多糖與載體蛋白的偶聯(lián)能夠促進(jìn)或加強(qiáng)免疫原性。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”指的是一種免疫原性物質(zhì)，當(dāng)其與抗原(例如多糖)偶聯(lián)并給予動(dòng)物時(shí)，將誘導(dǎo)或加強(qiáng)該動(dòng)物中的免疫應(yīng)答，尤其是保護(hù)性免疫應(yīng)答，并且引發(fā)產(chǎn)生特異性結(jié)合至所述抗原(例如，上述多糖)的抗體。有用的載體蛋白包含細(xì)菌毒素或類毒素，如白喉毒素或破傷風(fēng)類毒素。還可使用毒素或類毒素的片段，例如破傷風(fēng)類毒素的片段C[35]。白喉毒素的CRM197突變體[36-38]是可用于本發(fā)明的特別特別有用的載體。白喉是一種急性、常致命的細(xì)菌性疾病，由白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)引起，該疾病的臨床表現(xiàn)主要緣于循環(huán)白喉類毒素的存在。一般而言，針對(duì)白喉的主動(dòng)免疫程序基于通過(guò)對(duì)白喉類毒素進(jìn)行甲醛解毒產(chǎn)生的包含白喉類毒素的制劑(見(jiàn)下文)。這些交叉反應(yīng)的物質(zhì)(CRM197)是白喉毒素的基因工程脫毒化制劑。CRM197與白喉毒素(DT)僅有單個(gè)氨基酸差異，因而與DT具有高度交叉反應(yīng)性(CRM＝交叉反應(yīng)物質(zhì))。白喉毒素的該突變體并不需要用甲醛脫毒，并且能夠容易地獲得純化抗原的均質(zhì)制備物，例如，來(lái)自酪蛋白氨基酸和酵母提取物培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的白喉棒狀桿菌菌株C7(beta197)的培養(yǎng)物?；蛘?，可根據(jù)US5,614,382來(lái)重組制備CRM197。CRM197是經(jīng)許可用于人類應(yīng)用的用于若干莢膜多糖抗原的載體蛋白，并且是通過(guò)甲醛處理制備的傳統(tǒng)白喉類毒素的潛在替代物。如下文所述，CRM197作為載體的應(yīng)用可能是有利的，因?yàn)樵撦d體能夠引發(fā)產(chǎn)生針對(duì)白喉棒狀桿菌的抗體。其他合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白復(fù)合物[39]、合成肽[40,41]、熱激蛋白[42,43]、百日咳蛋白[44,45]、細(xì)胞因子[46]、淋巴因子[46]、激素[46]、生長(zhǎng)因子[46]、人血清白蛋白(優(yōu)選重組的)、包含多種來(lái)自各種病原體衍生抗原的人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白[47]例如N19[48]、來(lái)自流感嗜血桿菌(H.influenzae)的蛋白D[49,50]、肺炎球菌表面蛋白PspA[51]、肺炎球菌溶血素[52]、攝鐵蛋白[53]、來(lái)自艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B[54]、重組綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[55]、GBS蛋白(特別是GBS67)[56]等等。優(yōu)選通過(guò)-NH2基團(tuán)與載體連接，例如在載體蛋白中賴氨酸殘基側(cè)鏈或精氨酸殘基側(cè)鏈或在N末端的-NH2基團(tuán)。也可通過(guò)-SH基團(tuán)，如半胱氨酸殘基側(cè)鏈中的-SH基團(tuán)連接?？梢允褂枚嘤谝环N的載體蛋白，例如用于降低載體抑制的風(fēng)險(xiǎn)。因此，不同的載體蛋白可用于不同的GBS血清型，如血清型Ia糖可以偶聯(lián)至CRM197，而血清型Ib糖可以偶聯(lián)至破傷風(fēng)類毒素。也可以對(duì)特定糖抗原使用多于一種的載體蛋白，例如血清型III糖可以分為兩組，一些偶聯(lián)于CRM197且其它偶聯(lián)于破傷風(fēng)類毒素。然而，一般對(duì)所有糖采用相同的載體蛋白。一種載體蛋白可攜帶多于一種的糖抗原[57,58]。例如，單個(gè)載體蛋白可以偶聯(lián)于來(lái)自血清型Ia和Ib的糖。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，可以在偶聯(lián)反應(yīng)之前混合不同糖。然而，通常優(yōu)選各血清組的分開的偶聯(lián)物,不同的糖在偶聯(lián)之后混合。分開的偶聯(lián)物可基于同一載體。通常使用糖:蛋白質(zhì)之比(w/w)為1:5(即蛋白質(zhì)過(guò)量)-5:1(即糖過(guò)量)的GBS偶聯(lián)物，特別是比率1:5-2:1。若本發(fā)明采用GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的GBS偶聯(lián)物，則糖:蛋白質(zhì)的比率(w/w)通常是約1:1-1:2，特別是約1:1.3。類似地，若本發(fā)明采用GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，則所述比例通常是約1:1-1:2，特別是約1:1.3。若本發(fā)明采用GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，則糖:蛋白質(zhì)的比率(w/w)通常是約3:1-1:1，特別是約2:1。然而也可使用糖:蛋白質(zhì)比率(w/w)約1:1-1:5(特別是約1:3.3)的GBS血清型III與載體蛋白的偶聯(lián)物。若本發(fā)明采用GBS血清型II莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，則所述比率通常是約2:1～1:1。最后，若本發(fā)明采用GBS血清型V的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，則所述比率通常是約2:1～1:1，特別是約1.1:1。因此通常糖過(guò)重，特別對(duì)較長(zhǎng)的糖鏈而言。組合物可包含少量游離的載體[59]。當(dāng)本發(fā)明組合物中給定的載體蛋白同時(shí)以游離和偶聯(lián)形式存在時(shí)，未偶聯(lián)形式通常不多于整體組合物中載體蛋白總量的5％，例如，以重量計(jì)少于2％。偶聯(lián)后，可將游離和偶聯(lián)的糖分開。有許多合適的方法，包括疏水色譜、切向超濾、透析等。[也參見(jiàn)參考文獻(xiàn)60和61等]。參考文獻(xiàn)62中記載了優(yōu)選方法。若本發(fā)明組合物包含解聚寡糖，優(yōu)選在偶聯(lián)前進(jìn)行解聚。一種或多種抗原“抗原”是一種化合物、組合物或物質(zhì)，其刺激體內(nèi)的免疫應(yīng)答，尤其是通過(guò)刺激產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞應(yīng)答的保護(hù)性免疫應(yīng)答。當(dāng)上述的細(xì)菌多糖偶聯(lián)物是抗原時(shí)，如本文一般所用的術(shù)語(yǔ)“抗原”用于指白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、細(xì)胞百日咳抗原、非細(xì)胞百日咳抗原和脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原，包括下文描述的失活的脊髓灰質(zhì)炎抗原。因此，該術(shù)語(yǔ)將用于將主要提供抵抗無(wú)乳鏈球菌的偶聯(lián)的組分與提供抵抗白喉棒狀桿菌、破傷風(fēng)梭菌、百日咳博代氏桿菌和/或脊髓灰質(zhì)炎病毒的保護(hù)的組分區(qū)分開。本文所用的術(shù)語(yǔ)“一種(個(gè))或多種(個(gè))”指的是一種(個(gè))、兩種(個(gè))、三種(個(gè))、四種(個(gè))、五種(個(gè))、六種(個(gè))、七種(個(gè))、八種(個(gè))、九種(個(gè))、十種(個(gè))或更多種(個(gè))。白喉類毒素白喉是由白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)，一種革蘭氏陽(yáng)性無(wú)孢子需氧菌產(chǎn)生的。該生物體表達(dá)原噬菌體編碼的ADP-核糖基化外毒素(“白喉毒素”)，(例如用甲醛)處理后得到無(wú)毒但保留抗原性的類毒素，能夠在注射后刺激特異性抗毒素抗體的產(chǎn)生。參考文獻(xiàn)63的第13章更詳細(xì)地揭示了白喉類毒素。優(yōu)選的白喉類毒素是通過(guò)甲醛處理而制備的那些。采用可補(bǔ)充牛提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如Fenton培養(yǎng)基，或Linggoud和Fenton培養(yǎng)基)培養(yǎng)白喉棒桿菌(C.diphtheriae)，接著進(jìn)行甲醛處理、超濾和沉淀，可獲得白喉類毒素。然后可通過(guò)包括無(wú)菌過(guò)濾和/或透析的方法來(lái)處理該類毒素物質(zhì)。可用國(guó)際單位(IU)來(lái)表示白喉類毒素的量。例如，NIBSC[64]提供了"吸附的白喉類毒素的第三國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品1999"[65,66]，其包含160IU/安瓿。作為IU系統(tǒng)的替代形式，“Lf”單位(“絮凝單位”、“邊界絮凝劑量”或“絮凝限值”)定義為與一個(gè)國(guó)際單位的抗毒素混合時(shí)，產(chǎn)生最優(yōu)絮凝混合物的類毒素量[67]。例如，NIBSC提供了‘白喉類毒素，普通(Plain)’[68]，其包含300LF/安瓿，還提供了“用于絮凝試驗(yàn)的白喉類毒素的第一國(guó)際基準(zhǔn)試劑”[69]，其包含900Lf/安瓿。IU與Lf系統(tǒng)間的轉(zhuǎn)換取決于具體的類毒素制劑。白喉棒狀桿菌的培養(yǎng)過(guò)程中采用牛材料時(shí)，它們應(yīng)獲自未患牛海綿狀腦病(BSE)或其他傳染性海綿狀腦病(TSE)的來(lái)源。本發(fā)明免疫原性組合物中的白喉類毒素通常以在給予時(shí)能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的量存在。理想上，白喉類毒素能引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明免疫原性組合物中的白喉類毒素的量通常是1-50Lf/劑量。用于青少年和成人的加強(qiáng)疫苗通常包含4Lf/ml～8Lf/ml的白喉類毒素，例如，2.5Lf，優(yōu)選4Lf/0.5ml劑量。小兒疫苗通常包含20～50Lf/ml的白喉類毒素，例如10Lf或25Lf/0.5ml劑量。對(duì)于小兒聯(lián)合疫苗而言，白喉類毒素與破傷風(fēng)類毒素的比通常大于1(即，小兒疫苗中通常具有過(guò)量的白喉類毒素)并且一般是2:1～3:1(以Lf單位計(jì))，例如，2.5:1。相反，對(duì)于給予青少年或成人(其通常已經(jīng)至少一次接受過(guò)包含白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素小兒聯(lián)合疫苗)的加強(qiáng)疫苗而言，白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素的比率通常大于1(即，加強(qiáng)疫苗通常具有過(guò)量的破傷風(fēng)類毒素)并且一般是1.5:1～2.5:1，例如2:1。白喉類毒素通常是未偶聯(lián)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，“白喉組分”，換言之是用于引發(fā)提供抵抗白喉棒狀桿菌的保護(hù)的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物的部分，可以以CRM197、白喉類毒素或其組合的形式提供。在一些實(shí)施方式中，若CRM197以載體蛋白形式存在，即，作為偶聯(lián)物的部分，則可減少本發(fā)明的組合物中的未偶聯(lián)的(“游離”)白喉類毒素的量。在其它實(shí)施方式中，若CRM197以載體蛋白形式存在，即，作為偶聯(lián)物的部分，則白喉類毒素不存在并且可以不含在本發(fā)明的組合物中，但該免疫原性組合物仍能夠引發(fā)免疫應(yīng)答來(lái)提供抵抗白喉棒狀桿菌的保護(hù)。因此，若免疫原性組合物同時(shí)包含未偶聯(lián)的和偶聯(lián)的白喉類毒素和/或CRM197，則白喉類毒素/CRM197的總量可等于1-50Lf/劑量，濃度在4Lf/ml到8Lf/ml，例如2.5Lf/0.5ml劑量或4Lf/0.5ml劑量，濃度為20～50Lf/ml，例如10Lf/0.5ml劑量或25Lf/0.5ml劑量。在具體實(shí)施方式中，若不存在白喉類毒素，則存在的CRM197的量可等于1-50Lf/劑量，濃度為4Lf/ml到8Lf/ml，例如2.5Lf/0.5ml劑量或4Lf/0.5ml劑量，濃度為20～50Lf/ml，例如10Lf/0.5ml劑量或25Lf/0.5ml劑量?？墒拱缀眍惗舅匚街翚溲趸X佐劑上。通常而言，包含白喉類毒素抗原的免疫原性組合物基本不含任何含汞防腐劑。破傷風(fēng)類毒素破傷風(fēng)是由破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)，一種革蘭氏陽(yáng)性出芽孢桿菌產(chǎn)生的。該生物體表達(dá)內(nèi)肽酶(“破傷風(fēng)毒素”)，經(jīng)處理后得到無(wú)毒但保留抗原性的類毒素，能夠在注射后刺激特異性抗毒素抗體的產(chǎn)生。參考文獻(xiàn)1的第27章更詳細(xì)地公開了破傷風(fēng)類毒素。優(yōu)選的破傷風(fēng)類毒素是通過(guò)甲醛處理而制得的那些。采用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如衍生自牛酪蛋白的Latham培養(yǎng)基)培養(yǎng)破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)，然后進(jìn)行甲醛處理、超濾和沉淀，能夠獲得破傷風(fēng)類毒素。然后可通過(guò)包括無(wú)菌過(guò)濾和/或透析的方法處理此物質(zhì)。可用國(guó)際單位(IU)表示破傷風(fēng)類毒素的量。例如，NIBSC[70]提供了"吸附的破傷風(fēng)類毒素的第三國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品2000"[71,72]，其包含469IU/安瓿。作為IU系統(tǒng)的替代形式，“Lf”單位定義為與一個(gè)國(guó)際單位的抗毒素混合時(shí)，產(chǎn)生最優(yōu)絮凝混合物的類毒素量[73]。例如，NIBSC提供了“用于絮凝試驗(yàn)的破傷風(fēng)類毒素的第一國(guó)際參比試劑”[74]，其含有1000LF/安瓿。IU與Lf系統(tǒng)間的轉(zhuǎn)換取決于具體的類毒素制劑。破傷風(fēng)梭菌的培養(yǎng)過(guò)程中采用牛材料時(shí)，它們應(yīng)獲自未患牛海綿狀腦病(BSE)或其他傳染性海綿狀腦病(TSE)的來(lái)源。本發(fā)明免疫原性組合物中的破傷風(fēng)類毒素通常以在給予時(shí)能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的量存在。理想上，破傷風(fēng)類毒素能引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明免疫原性組合物中的破傷風(fēng)類毒素的量通常是1-20Lf/劑量。用于青少年和成人的加強(qiáng)疫苗通常包含5Lf的破傷風(fēng)類毒素/0.5ml劑量。小兒疫苗通常包含5～10Lf的破傷風(fēng)類毒素/0.5ml劑量。破傷風(fēng)類毒素通常是未偶聯(lián)的。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在一些實(shí)施方式中，破傷風(fēng)類毒素能夠同時(shí)以游離的(未偶聯(lián)的)和偶聯(lián)的形式存在，或主要以偶聯(lián)形式存在，即多于80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的破傷風(fēng)類毒素以偶聯(lián)形式存在。因此，本發(fā)明免疫原性組合物中的破傷風(fēng)類毒素可指單獨(dú)的未偶聯(lián)破傷風(fēng)類毒素、單獨(dú)的偶聯(lián)的破傷風(fēng)類毒素，或未偶聯(lián)和偶聯(lián)的破傷風(fēng)類毒素的總和。破傷風(fēng)類毒素可以但不必定吸附于氫氧化鋁佐劑(例如，可使用占破傷風(fēng)類毒素總量0-10％的吸附)。通常而言，包含破傷風(fēng)類毒素抗原的免疫原性組合物基本不含任何含汞防腐劑。百日咳類毒素百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)是一種可引起百日咳的革蘭氏陰性無(wú)孢子需氧菌。如參考文獻(xiàn)1的第21章中詳細(xì)記錄的那樣，抗百日咳博德特菌的疫苗已存在許多年，分為細(xì)胞(wP)和非細(xì)胞兩類(aP)。細(xì)胞疫苗包含完整百日咳博德特菌細(xì)胞，經(jīng)殺死和滅活(例如通過(guò)用福爾馬林和/或加熱處理)，而非細(xì)胞疫苗包含特異性純化的百日咳博德特菌，從天然細(xì)菌純化或在重組宿主中表達(dá)后純化。細(xì)胞百日咳抗原本發(fā)明可使用以失活的百日咳博代氏桿菌細(xì)胞形式的細(xì)胞百日咳抗原。細(xì)胞百日咳抗原的制備已有詳盡記載(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)1的第21章)，例如，可通過(guò)熱滅活百日咳博德特菌(B.pertussis)的I期培養(yǎng)物獲得?？捎脟?guó)際單位(IU)表示wP抗原的量。例如，NIBSC提供了'百日咳疫苗的第三國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品'[75]，其含有46IU/安瓿。各安瓿含有2.0ml水溶液等份的凍干殘留物，所述等份取自用8升M/15Sorensen緩沖液pH7.0稀釋的10升細(xì)菌懸液(根據(jù)美國(guó)不透明標(biāo)準(zhǔn)，等同于180不透明單位)的水溶液。作為IU系統(tǒng)的替代形式，也采用'OU'單位("不透明單位")(如4OU可約為1IU)。本發(fā)明免疫原性組合物中的細(xì)胞百日咳抗原通常以在給予時(shí)能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的量存在。理想上，所述細(xì)胞百日咳抗原能引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明免疫原性組合物中的wP抗原的量通常是至少4IU/劑量。可使所述細(xì)胞百日咳抗原吸附至或與磷酸鋁佐劑混合。非細(xì)胞百日咳抗原通常本發(fā)明的單一疫苗中可采用一種以上的非細(xì)胞百日咳(aP)抗原，例如兩種或三種下述公知且充分表征的百日咳博德特菌抗原：(1)脫毒的百日咳毒素(百日咳類毒素或“PT”)；(2)絲狀血細(xì)胞凝集素(“FHA”)；(3)百日咳桿菌粘附素(也稱為“69千道爾頓外膜蛋白”)。最優(yōu)選使用所有三種抗原。優(yōu)選從改良的Stainer-Scholte液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的百日咳博德特菌培養(yǎng)物中分離制備這三種抗原。PT和FHA可從發(fā)酵液中分離(如通過(guò)吸附于羥基磷灰石凝膠)得到，而百日咳桿菌粘附素可通過(guò)加熱處理和絮凝(如采用氯化鋇)從細(xì)胞中提取?？捎煤罄m(xù)的色譜和/或沉淀步驟純化抗原。PT和FHA可通過(guò)疏水層析法、親和層析法和尺寸排阻層析法來(lái)純化。百日咳桿菌粘附素可通過(guò)離子交換層析、疏水性層析和大小排阻層析來(lái)純化。在根據(jù)本發(fā)明而使用之前，可用甲醛處理FHA和百日咳桿菌粘附素。優(yōu)選地，通過(guò)用甲醛和/或戊二醛進(jìn)行處理而使PT脫毒。作為這種化學(xué)脫毒方法的替代形式，PT可以是通過(guò)誘變降低了酶活性的突變PT[76]，但優(yōu)選用化學(xué)處理脫毒。可以使用的其他非細(xì)胞百日咳抗原包括菌毛(如凝集原2和3)。aP抗原可以未吸附狀態(tài)使用，但優(yōu)選它們?cè)谑褂弥拔皆谝环N或多種鋁鹽佐劑。aP抗原優(yōu)選吸附在氫氧化鋁佐劑上。通常而言，包含aP抗原的免疫原性組合物基本不含汞防腐劑(例如柳硫汞)。本發(fā)明免疫原性組合物中的非細(xì)胞百日咳抗原通常以在給予時(shí)能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的量存在。理想上，所述非細(xì)胞百日咳抗原能引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。非細(xì)胞百日咳抗原的量通常用微克表示。疫苗中PT的濃度通常是5～50μg/ml。PT濃度通常是5μg/ml、16μg/ml、20μg/ml或50μg/ml。疫苗中FHA的濃度通常是10～50μg/ml。FHA濃度通常是10μg/ml、16μg/ml或50μg/ml。疫苗中百日咳桿菌粘附素的濃度通常是5～16μg/ml。百日咳桿菌粘附素的濃度通常是5μg/ml、6μg/ml或16μg/ml。例如，用于青少年和成人的加強(qiáng)疫苗通常每0.5ml劑量包含2.5～8μgPT、4～8μgFHA和2.5～8μg百日咳桿菌粘附素。通常而言，每0.5ml劑量的加強(qiáng)疫苗包含4μgPT、4μgFHA和8μg百日咳桿菌粘附素，更優(yōu)選地，5μgPT、2.5μgFHA和2.5μg百日咳桿菌粘附素。小兒疫苗通常每0.5ml劑量包含7μgPT、10μgFHA和10μg百日咳桿菌粘附素。若水性組分包含各PT、FHA和百日咳桿菌粘附素，則其重量比是可變的，但可以是例如約16:16:5，約5:10:6，約20:20:3，約25:25:8，或約10:5:3(PT:FHA:PRN)。滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原脊髓灰質(zhì)炎可由三種類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒中的一種引起。這三種類型是相似的并且引起相同的癥狀，但它們的抗原性差異很大，被一種類型病毒感染后不能防止免受其它類型病毒的感染。如參考文獻(xiàn)1第24章所述，本發(fā)明免疫原性組合物優(yōu)選采用三種脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原：1型脊髓灰質(zhì)炎病毒(如Mahoney毒株)、2型脊髓灰質(zhì)炎病毒(如MEF-1毒株)和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒(如Saukett毒株)。本發(fā)明的免疫原性組合物可包含失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。脊髓灰質(zhì)炎病毒可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。優(yōu)選的培養(yǎng)物是Vero細(xì)胞系，它是從猴腎中得到的連續(xù)細(xì)胞系?？煞奖愕貙ero細(xì)胞培養(yǎng)成為微載體。病毒感染之前和感染期間的Vero細(xì)胞的培養(yǎng)可能涉及使用來(lái)自牛的材料，例如小牛血清，使用乳球蛋白水解產(chǎn)物(例如由乳球蛋白酶降解得到的產(chǎn)物)。這些來(lái)源于牛的材料應(yīng)從不患有BSE或其它TSE的來(lái)源獲取。優(yōu)選地，使脊髓灰質(zhì)炎病毒在不含動(dòng)物源性組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中生長(zhǎng)。生長(zhǎng)后可用諸如超濾、滲濾和層析等技術(shù)來(lái)純化病毒顆粒。在給予患者之前，必須將脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活，這可以通過(guò)在把病毒用于本發(fā)明組合物之前用甲醛處理而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地對(duì)三種脊髓灰質(zhì)炎病毒單獨(dú)地進(jìn)行培養(yǎng)、純化和滅活，然后合并而得到用于本發(fā)明的混合物。可使合并的脊髓灰質(zhì)炎病毒吸附至鋁鹽佐劑上。通常而言，包含IPV抗原的免疫原性組合物基本不含汞防腐劑(例如柳硫汞)。一般用“DU”單位(“D-抗原單位”[77])表示IPV抗原的量。本發(fā)明免疫原性組合物中的IPV抗原通常以在給予時(shí)能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的量存在。理想上，所述IPV抗原能引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。聯(lián)合疫苗通常包含1-100DU/脊髓灰質(zhì)炎病毒/類型劑量，例如，約40DU的1型脊髓灰質(zhì)炎病毒，約8DU的2型脊髓灰質(zhì)炎病毒和約32DU的3型脊髓灰質(zhì)炎病毒，但能夠采用低于所述這些的劑量[78,79]，例如，10-20DU的1型，2-4DU的2型和8-20DU的3型。優(yōu)選地，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗包含“低劑量”的脊髓灰質(zhì)炎病毒。對(duì)于1型脊髓灰質(zhì)炎病毒，這表示組合物中病毒的濃度≤20DU/ml，例如<18、<16、<14、<12、<10等。對(duì)于2型脊髓灰質(zhì)炎病毒，這表示組合物中病毒的濃度≤4DU/ml，例如<3、<2、<1、<0.5等。對(duì)于3型脊髓灰質(zhì)炎病毒，這表示組合物中病毒的濃度≤16DU/ml，例如<14、<12、<10、<8、<6等。在所有三種1型、2型和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒存在的情況下，這三種抗原可以分別以5:1:4的DU比率或其它任意合適比率而存在，例如當(dāng)使用Sabin毒株時(shí)的比率為15:32:45[80]。低劑量的來(lái)源于Sabin毒株的抗原是特別有用的，各單位劑量(通常是0.5ml)中含有≤10DU的1型病毒，≤20DU的2型病毒，和≤30DU的3型病毒。若采用IPV組分并且脊髓灰質(zhì)炎病毒在Vero細(xì)胞上生長(zhǎng)，則疫苗組合物優(yōu)選包含少于10ng/ml，優(yōu)選≤1ng/ml，例如≤500pg/ml或≤50pg/ml的Vero細(xì)胞DNA，例如，少于10ng/ml的Vero細(xì)胞DNA，其長(zhǎng)度≥50堿基對(duì)。本發(fā)明的特定免疫原性組合物特定設(shè)想的本發(fā)明的免疫原性組合物包括：·i)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，和(iv)白喉類毒素?！)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，和(iv)破傷風(fēng)類毒素?！)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，(iv)白喉類毒素和(v)破傷風(fēng)類毒素?！)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，(iv)白喉類毒素，(v)破傷風(fēng)類毒素，(vi)細(xì)胞百日咳抗原?！)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，(iv)白喉類毒素，(v)破傷風(fēng)類毒素，(vi)非細(xì)胞百日咳抗原。·i)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，(iv)白喉類毒素，(v)破傷風(fēng)類毒素，(vi)脫毒的百日咳毒素，(vii)絲狀血細(xì)胞凝集素和(viii)百日咳桿菌粘附素?！)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，(iv)白喉類毒素，(v)破傷風(fēng)類毒素，(vi)非細(xì)胞百日咳抗原和(vii)失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原?！)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，(iv)白喉類毒素，(v)破傷風(fēng)類毒素，(vi)脫毒的百日咳毒素，(vii)絲狀血細(xì)胞凝集素，(viii)百日咳桿菌粘附素和(ix)失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。·i)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，(iv)白喉類毒素，(v)破傷風(fēng)類毒素，(vi)脫毒的百日咳毒素，(vii)絲狀血細(xì)胞凝集素，(viii)百日咳桿菌粘附素，(ix)脊髓灰質(zhì)炎病毒1型毒株的抗原，(x)脊髓灰質(zhì)炎病毒2型毒株的抗原和(xi)脊髓灰質(zhì)炎3型毒株的抗原?！)GBS血清型Ia的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；ii)GBS血清型Ib的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物；iii)GBS血清型III的莢膜糖與載體蛋白偶聯(lián)的偶聯(lián)物，(iv)白喉類毒素，(v)破傷風(fēng)類毒素，(vi)非細(xì)胞百日咳抗原，(vii)脊髓灰質(zhì)炎病毒1型毒株的抗原，(viii)脊髓灰質(zhì)炎病毒2型毒株的抗原和(ix)脊髓灰質(zhì)炎3型毒株的抗原。包含來(lái)自GBS血清型Ia莢膜糖的莢膜糖的GBS偶聯(lián)物中的載體蛋白、包含來(lái)自GBS血清型Ib莢膜糖的GBS偶聯(lián)物中的載體蛋白，和包含GBS血清型III莢膜糖的GBS偶聯(lián)物中的載體部分通常是CRM197。本發(fā)明的其它示例性免疫原性組合物包括：一種組合物，其包含：(a)來(lái)自GBS血清型Ia的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；b)來(lái)自GBS血清型Ib的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；c)來(lái)自GBS血清型III的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物和(d)白喉類毒素,特別是所述白喉類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖。一種組合物，其包含：(a)來(lái)自GBS血清型Ia的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；b)來(lái)自GBS血清型Ib的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；c)來(lái)自GBS血清型III的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物和(d)破傷風(fēng)類毒素,特別是所述破傷風(fēng)類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖。一種組合物，其包含：(a)來(lái)自GBS血清型Ia的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；b)來(lái)自GBS血清型Ib的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；c)來(lái)自GBS血清型III的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；(d)白喉類毒素,特別是通過(guò)用甲醛處理白喉毒素制得的白喉類毒素，特別是白喉類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖，和(e)破傷風(fēng)類毒素,特別是所述破傷風(fēng)類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖。一種組合物，其包含：(a)來(lái)自GBS血清型Ia的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；b)來(lái)自GBS血清型Ib的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；c)來(lái)自GBS血清型III的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；(d)白喉類毒素,特別是通過(guò)用甲醛處理白喉毒素制得的白喉類毒素，特別是白喉類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖；(e)破傷風(fēng)類毒素,特別是所述破傷風(fēng)類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖和(f)細(xì)胞性百日咳抗原或非細(xì)胞性百日咳抗原。一種組合物，其包含：(a)來(lái)自GBS血清型Ia的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；b)來(lái)自GBS血清型Ib的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；c)來(lái)自GBS血清型III的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；(d)白喉類毒素,特別是通過(guò)用甲醛處理白喉毒素制得的白喉類毒素，特別是白喉類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖；(e)破傷風(fēng)類毒素,特別是所述破傷風(fēng)類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖；(f)脫毒的百日咳毒素，(g)絲狀血細(xì)胞凝集素，(h)百日咳桿菌粘附素，和可選的(i)滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。一種組合物，其包含：(a)來(lái)自GBS血清型Ia的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；b)來(lái)自GBS血清型Ib的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；c)來(lái)自GBS血清型III的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；(d)來(lái)自GBS血清型II的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；(e)來(lái)自GBS血清型V的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；(f)白喉類毒素,特別是通過(guò)用甲醛處理白喉毒素制得的白喉類毒素，特別是白喉類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖和/或(g)破傷風(fēng)類毒素,特別是所述破傷風(fēng)類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖；可選的(h)細(xì)胞性百日咳抗原或非細(xì)胞性百日咳抗原；可選的(i)脫毒的百日咳毒素；可選的(j)絲狀血細(xì)胞凝集素；可選的(k)百日咳桿菌粘附素和可選的(l)滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。一種組合物，其包含：(a)來(lái)自GBS血清型Ia的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；b)來(lái)自GBS血清型Ib的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；c)來(lái)自GBS血清型III的莢膜糖與CRM197偶聯(lián)的偶聯(lián)物；(d)來(lái)自GBS血清型II的莢膜糖與CRM197或破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)的偶聯(lián)物；(e)來(lái)自GBS血清型V的莢膜糖與CRM197或破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)的偶聯(lián)物；(f)白喉類毒素,特別是通過(guò)用甲醛處理白喉毒素制得的白喉類毒素，特別是白喉類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖和/或(g)破傷風(fēng)類毒素,特別是所述破傷風(fēng)類毒素不偶聯(lián)GBS莢膜多糖；可選的(h)細(xì)胞性百日咳抗原或非細(xì)胞性百日咳抗原；可選的(i)脫毒的百日咳毒素；可選的(j)絲狀血細(xì)胞凝集素；可選的(k)百日咳桿菌粘附素和可選的(l)滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。藥學(xué)方法和應(yīng)用本發(fā)明的免疫原性組合物還包含藥學(xué)可接受的載體。通?！八帉W(xué)上可接受的載體”包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體一般是代謝慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[81]、海藻糖[82]、乳糖和脂質(zhì)聚集體(如油滴或脂質(zhì)體)。這種載體為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。疫苗也可含有稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此外，也可存在輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。無(wú)菌、無(wú)熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水是一種典型載體。關(guān)于藥學(xué)上可接受賦形劑的全面討論參見(jiàn)參考文獻(xiàn)83。本發(fā)明組合物可以是水性形式(即溶液或懸浮液)或干燥形式(如凍干)。如果使用干燥的疫苗，則在注射前將其在液體介質(zhì)中重建。凍干偶聯(lián)物疫苗為本領(lǐng)域已知，如所述MenjugateTM產(chǎn)物以凍干形式存在。當(dāng)本發(fā)明免疫原性組合物包括含有來(lái)自多于一種GBS血清型的莢膜糖的偶聯(lián)物時(shí)，這些偶聯(lián)物通常單獨(dú)制備、混合和然后凍干。以此方式可以制備包含兩種、三種或四種等本文所述偶聯(lián)物的凍干組合物。為使偶聯(lián)物在冷凍干燥的過(guò)程中穩(wěn)定，可在冷凍干燥之前添加無(wú)活性組分(例如，作為穩(wěn)定劑)。所包含的穩(wěn)定劑優(yōu)選地是乳糖、蔗糖和甘露醇及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。因此，通過(guò)凍干物質(zhì)的水性重建得到的最終疫苗可能含有乳糖和/或蔗糖。當(dāng)制備凍干疫苗時(shí)，優(yōu)選使用無(wú)定形賦形劑和/或無(wú)定形緩沖液[84]?？赡軆?yōu)選在組合物中納入例如1mg/ml-30mg/ml(如約25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)和/或二糖(如蔗糖或海藻糖)。使用蔗糖作為GBS偶聯(lián)物疫苗的穩(wěn)定劑已有推薦(參考文獻(xiàn)85)。然而，本發(fā)明的穩(wěn)定劑通常是甘露醇。當(dāng)干燥疫苗在注射前于液體介質(zhì)中重建時(shí)，殘留甘露醇的濃度通常是約2-20mg/ml，如3.75mg/ml、7.5mg/ml或15mg/ml。組合物可裝在藥瓶中，或者可裝在填充好的注射器中。注射器可裝有或未裝有針頭。注射器可包含單個(gè)組合物劑量，而小瓶可包含單一劑量或多個(gè)劑量。優(yōu)選以0.5ml單位劑量給予患者本發(fā)明組合物。應(yīng)理解，0.5ml的劑量包括正常差異，如0.5ml±0.05ml。對(duì)于多劑量的情況，多個(gè)劑量的量被共同提取和包裝在單個(gè)容器中，例如5ml供10劑量的多劑量容器(或5.5ml，超量10％)。本發(fā)明的水性組合物也適用于從凍干形式重建其它疫苗。本發(fā)明組合物用于所述臨用前重建時(shí)，本發(fā)明提供藥盒，其可包括兩個(gè)藥瓶，或可包括一個(gè)已填充注射器和一個(gè)藥瓶，其中在注射前用所述注射器的內(nèi)容物再活化藥瓶的內(nèi)容物。也可以如下形式制備疫苗，其中所述疫苗可在使用時(shí)間/地點(diǎn)通過(guò)將兩種組分混合在一起臨時(shí)制備。這種雙組分實(shí)施方式包括液體/液體混合和液體/固體混合，例如通過(guò)混合水性物質(zhì)和凍干物質(zhì)。因此，可用于本發(fā)明的試劑盒包含含有一種或多種GBS偶聯(lián)物的第一組分；和含有選自下組的一種或多種抗原的第二部分：a)細(xì)胞或非細(xì)胞百日咳抗原，b)破傷風(fēng)類毒素，c)白喉類毒素和d)失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原；其中所述兩種組分于分開的容器(例如，小瓶和/或注射劑)中。第一組分中的GBS偶聯(lián)物可以是凍干的。在一些實(shí)施方式中，第一組分不含佐劑。第二組分可包含水性抗原。在一些實(shí)施方式中，第二組分包含佐劑，例如，鋁鹽佐劑?？捎糜诒景l(fā)明的另一種試劑盒可包含不含抗原的第一成分，從而最終免疫原性組合物中的全部抗原性組分均源自第二組分。例如，試劑盒可包含含有水性抗原的第一組分和含有水性佐劑的第二組分，所述第一組分包含(i)一種或多種GBS偶聯(lián)物和(ii)選自下組的一種或多種抗原：a)細(xì)胞或非細(xì)胞百日咳抗原，b)破傷風(fēng)類毒素，c)白喉類毒素和d)失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。本發(fā)明的免疫原性組合物可通過(guò)將第一組分和第二組分混合來(lái)制備。本發(fā)明還提供一種用于制備本發(fā)明免疫原性組合物的方法，所述方法包括：將包含一種或多種GBS偶聯(lián)物的第一組分和包含一種或多種抗原的第二組分混合，所述一種或多種抗原選自：a)細(xì)胞或非細(xì)胞百日咳抗原，b)破傷風(fēng)類毒素，c)白喉類毒素和d)失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原。第一組分中的GBS偶聯(lián)物可以是凍干的。第二組分可包含水性抗原。所述方法還可包括用第二組分的水性抗原重建第一組分中的凍干的GBS偶聯(lián)物的步驟。第一組分可不包含佐劑。第二組分可包含佐劑，例如，鋁鹽佐劑。本發(fā)明組合物可以包裝成單位劑型或多劑型。就多劑型而言，與預(yù)填充注射器相比更優(yōu)選藥瓶?？捎贸Ｒ?guī)方法確定有效劑量體積，但組合物的人用注射劑量一般為0.5ml體積，例如用于肌內(nèi)注射時(shí)。所述組合物的pH優(yōu)選為6-8，優(yōu)選約7。可使用緩沖劑來(lái)維持穩(wěn)定的pH。給予患者的水性組合物能具有5.0-7.5的pH，更通常為5.0-6.0以最優(yōu)化穩(wěn)定性；在白喉類毒素和/或破傷風(fēng)類毒素存在的情況下，pH值理想地在6.0和7.0之間。本發(fā)明的免疫原性組合物通常包含磷酸二氫鉀緩沖液。所述磷酸二氫鉀緩沖液可以包含約1-10mM磷酸二氫鉀，如1.25mM、2.5mM或5.0mM。當(dāng)組合物包含氫氧化鋁鹽時(shí)，優(yōu)選采用組氨酸緩沖液[86]。所述組合物可以是無(wú)菌和/或無(wú)熱原的。本發(fā)明的組合物可以與人體等張。本發(fā)明組合物有免疫原性，更優(yōu)選是疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性(即預(yù)防感染)或治療性(即治療感染)疫苗，但通常是預(yù)防性疫苗。預(yù)防性疫苗不保證完全保護(hù)免于疾病，因?yàn)榧幢慊颊甙l(fā)展出抗體，在免疫系統(tǒng)能夠擊退感染之前也可能有滯后和延遲。因此，為了避免疑問(wèn)，術(shù)語(yǔ)預(yù)防性疫苗還可指改善未來(lái)感染的影響的疫苗，例如，通過(guò)降低此類感染的嚴(yán)重性或縮短感染時(shí)間。術(shù)語(yǔ)“抵抗感染的保護(hù)”和/或“提供保護(hù)性免疫力”指的是對(duì)象的免疫系統(tǒng)已被引發(fā)(例如，通過(guò)疫苗接種)來(lái)觸發(fā)免疫應(yīng)答并擊退感染。具體而言，被觸發(fā)的免疫應(yīng)答能夠擊退針對(duì)若干病原體，例如不同細(xì)菌菌株的感染。因此，經(jīng)疫苗接種的對(duì)象可能被感染，但能夠比對(duì)照對(duì)象更好地?fù)敉嗽摳腥?。用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它組分?！懊庖邔W(xué)有效量”是指以單一劑量或一系列劑量的部分給予個(gè)體的對(duì)治療或預(yù)防有效的量。一般而言，所需的結(jié)果是產(chǎn)生抗原(例如病原體)-特異性的免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答能夠保護(hù)對(duì)象抵抗該病原體。該量根據(jù)所治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、所治療個(gè)體的分類組(例如，非人的靈長(zhǎng)動(dòng)物、靈長(zhǎng)動(dòng)物等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗配方、治療醫(yī)生對(duì)醫(yī)學(xué)情況的評(píng)估和其它相關(guān)因素而變化。預(yù)計(jì)所述量將落入可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)可確定的相對(duì)較寬范圍內(nèi)。本文所述組合物可以各種形式制備。例如，可將所述組合物制備為液體溶液或懸浮液形式的注射劑。所述組合物可以制備成使用細(xì)粉或噴霧的肺部給藥制劑，例如吸入劑。所述組合物可制備為栓劑或子宮托。該組合物可制備成用于鼻腔、耳部或眼部給藥的制劑，例如噴霧劑、滴劑、凝膠劑或粉末劑[如參考文獻(xiàn)87和88]。已報(bào)道成功地經(jīng)鼻給予肺炎球菌糖[89，90]、Hib糖[91]、MenC糖[92]和Hib和MenC糖偶聯(lián)物的混合物[93]。本發(fā)明組合物可包含抗微生物劑，特別是以多劑量形式包裝時(shí)。本發(fā)明組合物可包含去污劑，如吐溫(聚山梨酯)，如吐溫80。去污劑的含量水平通常較低，如<0.01％。本發(fā)明組合物可含有鈉鹽(如氯化鈉)以產(chǎn)生張力。NaCl濃度通常為10±2mg/ml。在一些實(shí)施方式中，可以使用濃度為4-10mg/ml的NaCl，如9.0、7.0、6.75或4.5mg/ml。組合物的滲透壓通常為200mOsm/kg-400mOsm/kg，優(yōu)選為240-360mOsm/kg，更優(yōu)選為280-320mOsm/kg。雖然以前報(bào)道過(guò)滲透壓對(duì)疫苗接種引起的疼痛無(wú)影響[94]，但仍優(yōu)選地將滲透壓保持在此范圍內(nèi)。本發(fā)明組合物通常包括緩沖劑。一般是磷酸鹽緩沖劑。本發(fā)明組合物可與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)用。具體說(shuō)，組合物包括一種或多種佐劑。這類佐劑包括但不限于：A.含有礦物質(zhì)的組合物適用作本發(fā)明佐劑的含有礦物質(zhì)的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽(或其混合物)。鈣鹽包括磷酸鈣(如參考文獻(xiàn)95公開的“CAP顆粒)?！变X鹽包括氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等，所述鹽可采用任何合適形式(例如凝膠、結(jié)晶、無(wú)定形等)。優(yōu)選吸附于這些鹽。也可將含有礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽的顆粒[96]。可采用稱為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是常規(guī)名稱，但僅為使用方便，因?yàn)槠渚皇浅霈F(xiàn)的實(shí)際化合物的精確描述(例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)97的第9章)。本發(fā)明可采用通常用作佐劑的任何“氫氧化物”或“磷酸鹽”佐劑。稱為“氫氧化鋁”的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽(通常至少部分為晶體)。稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，也常常含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)。其可通過(guò)沉淀獲得，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度影響磷酸根取代所述鹽中羥基的程度。氫氧化鋁佐劑呈典型的纖維形態(tài)(例如電子透射顯微照片所見(jiàn)的)。氫氧化鋁佐劑的pI通常約11，即在生理pH下佐劑本身具有表面正電荷。據(jù)報(bào)道，在pH7.4時(shí)，氫氧化鋁佐劑的吸附能力為1.8-2.6mg蛋白質(zhì)/mgAl+++。磷酸鋁佐劑的PO4/Al摩爾比通常為0.3-1.2，優(yōu)選0.8-1.2，更優(yōu)選0.95±0.1。磷酸鋁通常是無(wú)定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是PO4/Al摩爾比為0.84-0.92的無(wú)定形羥基磷酸鋁，包含0.6mgAl3+/ml。磷酸鋁通常是顆粒(如在透射電子顯微鏡照片上觀察到的板狀形態(tài))?？乖胶箢w粒直徑一般是0.5-20μm(如約5-10μm)。據(jù)報(bào)道，pH7.4時(shí)磷酸鋁佐劑的吸附容量為0.7-1.5mg蛋白質(zhì)/mgAl+++。磷酸鋁的零電點(diǎn)(PZC)與磷酸根取代羥基的程度逆相關(guān)，且這種取代程度可根據(jù)用于通過(guò)沉淀制備鹽的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度而變化。也通過(guò)改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根＝更多酸性PZC)或加入緩沖劑如組氨酸緩沖劑(使PZC堿性更強(qiáng))來(lái)改變PZC。本發(fā)明所用的磷酸鋁的PZC通常為4.0至7.0，更優(yōu)選為5.0至6.5，例如約為5.7。用于制備本發(fā)明組合物的鋁鹽懸浮液可以但不必需，含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸或Tris緩沖液)。優(yōu)選所述懸浮液是無(wú)菌且無(wú)熱原的。懸浮液可含有游離的水性磷酸根離子，如存在濃度為1.0-20mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約10mM。所述懸浮液也可含有氯化鈉。本發(fā)明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。在這種情況下，磷酸鋁比氫氧化鋁多，例如重量比為至少2:1，例如≥5:1、≥6:1、≥7:1、≥8:1、≥9:1等。給予患者的組合物中Al+++的濃度優(yōu)選小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。優(yōu)選的范圍是0.3至1mg/ml。優(yōu)選最大值0.85mg/劑量。通常佐劑磷酸鋁佐劑是無(wú)定形羥基磷酸鋁，PO4/Al摩爾比為0.84-0.92，包括約0.6mgAl3+/ml?？刹捎玫蛣┝苛姿徜X吸附，如每劑量50-100μgAl3+/偶聯(lián)物。B.皂苷制劑[參考文獻(xiàn)97的第22章]皂苷制劑也可以用作本發(fā)明的佐劑。皂苷是在許多種類植物的樹皮、葉、莖干、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的甾醇糖苷和三萜糖苷的異質(zhì)群體。已廣泛研究了作為佐劑的分離自皂樹(Quillaiasaponaria)Molina樹皮的皂苷。皂苷也可購(gòu)自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophillapaniculata)(婚紗花)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21，以及脂質(zhì)制劑如ISCOM。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術(shù)純化的特定純化組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷優(yōu)選QS21。制備QS21的方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)98。皂苷制劑也可包含甾醇，如膽固醇[99]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)97的第23章]。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任意已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM優(yōu)選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻(xiàn)99-101中進(jìn)一步描述了ISCOM。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[102]?；谠碥盏淖魟╅_發(fā)的綜述可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)103和104。C.病毒小體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可以用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常包含任選與磷脂組合或一起配制的一種或多種病毒蛋白質(zhì)。其通常無(wú)病原性，非復(fù)制型，且通常不含任意天然病毒基因組。所述病毒蛋白可重組生成或分離自全病毒。這些適用于病毒體或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾沃克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、Qβ-噬菌體(如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白p1)的蛋白。參考文獻(xiàn)105-110進(jìn)一步描述了VLP。病毒體在(例如)參考文獻(xiàn)111中有進(jìn)一步描述。D.細(xì)菌或微生物衍生物適合用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，例如，免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒化的衍生物。適用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過(guò)磷酸鍵與鳥苷連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激作用。CpG可以包含核苷酸修飾/類似物如硫代磷酸酯修飾，且可以是雙鏈或單鏈。參考文獻(xiàn)112、113和114公開了可能的類似物取代，例如用2’-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻(xiàn)115-120中進(jìn)一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可針對(duì)TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[121]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)，如CpG-AODN，或更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)，如CpG-BODN。參考文獻(xiàn)122-124中討論了CpG-A和CpG-BODN。優(yōu)選CpG為CpG-AODN。優(yōu)選構(gòu)建CpG寡核苷酸從而5’末端可被受體識(shí)別。任選將兩個(gè)CpG寡核苷酸序列的3’端相連接形成“免疫聚體”。參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)121和125-127。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可以用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選所述蛋白衍生自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT”)、霍亂菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。參考文獻(xiàn)128中描述了脫毒的ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的應(yīng)用，參考文獻(xiàn)129中描述了其作為胃腸外佐劑的應(yīng)用。所述毒素或類毒素優(yōu)選全毒素形式，包含A和B亞基。A亞基優(yōu)選含有脫毒突變；B亞基優(yōu)選不突變。佐劑優(yōu)選脫毒的LT突變體如LT-K63、LT-R72和LT-G192。參考文獻(xiàn)130-137中描述了將ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐劑。氨基酸取代的數(shù)字基準(zhǔn)優(yōu)選是根據(jù)參考文獻(xiàn)138所示ADP-核糖基化毒素的A和B亞基排列，該參考文獻(xiàn)特定通過(guò)引用全文納入本文。E.人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[139]等)[140]、干擾素(如干擾素-γ)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。F.生物粘著劑和粘膜粘著劑生物粘著劑和粘膜粘著劑也可以用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質(zhì)酸微球[141]或粘膜粘著劑如聚(丙烯酸)交聯(lián)衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[142]。G.微顆粒微粒也可以用作本發(fā)明的佐劑。微粒(即直徑～100nm至～150μm，更優(yōu)選～200nm至～30μm，最優(yōu)選～500nm至～10μm的顆粒)由生物可降解的無(wú)毒材料(例如聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己內(nèi)酯等)形成，優(yōu)選聚(丙交酯-共-乙交酯共聚物)，并任選經(jīng)處理而具有帶負(fù)電荷的表面(例如用SDS處理)或帶正電荷的表面(例如用陽(yáng)離子去污劑處理，如CTAB)。H.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)97的第13和14章)適用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見(jiàn)參考文獻(xiàn)143-145所述。I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[146]。這種制劑還包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑和辛苯糖醇[147]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯糖醇[148]的組合。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下組：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。J.聚磷腈(PCPP)PCPP制劑描述于例如參考文獻(xiàn)149和150。K.胞壁酰肽適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。L.咪唑并喹啉化合物適用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")，其進(jìn)一步描述于參考文獻(xiàn)151和152。M.縮氨基硫脲化合物縮氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和篩選所有適用作本發(fā)明佐劑的化合物的方法包括參考文獻(xiàn)153所述內(nèi)容?？s氨基硫脲在刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-α方面特別有效。N.色胺酮化合物色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和篩選所有適用作本發(fā)明佐劑的化合物的方法包括參考文獻(xiàn)154所述內(nèi)容。色胺酮化合物在刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-α方面尤其有效。本發(fā)明也可包含以上鑒定的一種或多種佐劑各方面的組合。用作免疫刺激劑的其它物質(zhì)公開于參考文獻(xiàn)97的第7章。特別優(yōu)選使用鋁鹽佐劑，抗原通常吸附于這類鹽?？杀景l(fā)明組合物中使某些抗原吸附于氫氧化鋁，而使另一些抗原結(jié)合磷酸鋁。然而，通常優(yōu)選只使用一種鹽，如氫氧化物或磷酸鹽，但二者不同時(shí)使用。不需要所有偶聯(lián)物都被吸附，即某些或全部偶聯(lián)物可游離在溶液中。治療方法本發(fā)明還提供了一種在哺乳動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)的方法，包含將本發(fā)明的藥物組合物給予所述哺乳動(dòng)物。免疫反應(yīng)優(yōu)選為保護(hù)性，優(yōu)選涉及抗體。所述方法可以產(chǎn)生加強(qiáng)的應(yīng)答。優(yōu)選以0.5ml劑量給予患者本發(fā)明組合物(如上所述)。所述哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。當(dāng)疫苗用于預(yù)防性用途時(shí)，人優(yōu)選為兒童(例如，幼童或嬰兒，尤其是新生兒)或青少年；當(dāng)疫苗用于治療用途時(shí)，人優(yōu)選為成人。意圖用于兒童的疫苗也可給予成年人，例如，以評(píng)估安全性、劑量、免疫原性等。優(yōu)選治療的一類人是育齡女性(如青少年和更大)。另一種優(yōu)選類別是妊娠女性。老年患者(如大于50、60、70、80或90等年齡特別是大于65歲年齡的那些),特別是生活在GBS感染風(fēng)險(xiǎn)可能增加的療養(yǎng)院中那些([155])，是另一類優(yōu)選治療的人。在一些實(shí)施方式中，所述患者已經(jīng)用白喉類毒素或其衍生物進(jìn)行預(yù)免疫。在其它實(shí)施方式中，所述患者已經(jīng)用破傷風(fēng)類毒素或其衍生物進(jìn)行預(yù)免疫。本發(fā)明也提供用作藥物的本發(fā)明組合物。藥物優(yōu)選能夠引起哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)(即它是一種免疫原性組合物)，并且更優(yōu)選是疫苗。本發(fā)明也提供本發(fā)明組合物在制備引起哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。這些應(yīng)用和方法優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療由無(wú)乳鏈球菌和選自白喉棒狀桿菌、破傷風(fēng)桿菌、百日咳博德特氏菌和脊髓灰質(zhì)炎病毒中的一種或多種所致的疾病。由無(wú)乳鏈球菌所致的疾病可以是新生兒敗血癥或菌血癥、新生兒肺炎、新生兒腦膜炎、子宮內(nèi)膜炎、骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎等。白喉棒狀桿菌會(huì)導(dǎo)致白喉；破傷風(fēng)桿菌會(huì)導(dǎo)致破傷風(fēng)；百日咳博德特氏菌會(huì)導(dǎo)致百日咳；而脊髓灰質(zhì)炎病毒會(huì)導(dǎo)致脊髓灰質(zhì)炎。所述預(yù)防疾病的對(duì)象可以與接受本發(fā)明免疫原性組合物的對(duì)象不相同。例如，可以給予女性(妊娠前或妊娠期間)免疫原性組合物，以保護(hù)后代(所謂的‘母體免疫’[156-158])。妊娠女性的免疫通過(guò)被動(dòng)母體免疫來(lái)為嬰兒提供抗體介導(dǎo)的免疫。當(dāng)母方抗體通過(guò)胎盤轉(zhuǎn)移至胎兒時(shí)，自然發(fā)生被動(dòng)免疫。被動(dòng)免疫對(duì)于嬰兒特別重要，因?yàn)樗麄兂錾鷷r(shí)不具有任何主動(dòng)獲得的免疫力。向妊娠女性給予本發(fā)明的組合物增強(qiáng)該女性的免疫力，并且抗體通過(guò)胎盤到達(dá)新生兒，使該嬰兒具有被動(dòng)母體免疫力。然而，嬰兒的被動(dòng)免疫僅僅是臨時(shí)性的，并且在出生最初數(shù)周或數(shù)月之后開始減少。因?yàn)楸粍?dòng)免疫僅是暫時(shí)性的，嬰兒接受給予的本發(fā)明的組合物是重要的，以在該被動(dòng)免疫減少之前誘導(dǎo)嬰兒內(nèi)的主動(dòng)免疫。在出生后給予嬰兒第二次免疫原性組合物誘導(dǎo)該嬰兒內(nèi)的主動(dòng)免疫，并且延長(zhǎng)妊娠過(guò)程中從母親傳遞過(guò)來(lái)的免疫力。本文中所述，嬰兒是年齡低于一歲的個(gè)體(例如，小于1天、1周、2周、3周、4周、兩個(gè)月、三個(gè)月、四個(gè)月、五個(gè)月、六個(gè)月、七個(gè)月、八個(gè)月、九個(gè)月、十個(gè)月、11個(gè)月、小于12個(gè)月)?？蓪?duì)所述妊娠女性在其妊娠過(guò)程中的任何時(shí)間給予本發(fā)明的組合物。例如，可對(duì)該女性在其妊娠的第一、第二或第三個(gè)三月期給予所述組合物。在一些實(shí)施方式中，對(duì)所述女性在妊娠的末6-12周(例如，28周孕期、29周孕期、30周孕期、31周孕期、32周孕期、33周孕期、34周孕期、35周孕期、36周孕期、37周孕期、38周孕期、39周孕期)給予該組合物。特別地，在嬰兒出生前至少四周將本發(fā)明的組合物給予妊娠女性。在一些實(shí)施方式中，在第32周～36周孕期給予該妊娠女性一劑量方案。在其它實(shí)施方式中，給予該妊娠女性二劑量方案，其中第一劑量在約32周孕期時(shí)給予，而第二劑量在約36周孕期時(shí)給予?？稍诔錾蟮谝荒甑娜魏螘r(shí)間對(duì)嬰兒給予所述組合物，之后可按需給予。一般而言，在嬰兒出生后第一年中對(duì)該嬰兒給予一次、兩次、三次、四次或更多次所述組合物。例如，可在選自嬰兒出生時(shí)、2周齡、4周齡、6周齡、2月齡、3月齡、4月齡、6月齡、9月齡和12月齡的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間給予該嬰兒本發(fā)明組合物。具體而言，在母方抗體已減少到非保護(hù)效價(jià)之前的某一時(shí)刻給予嬰兒本發(fā)明的組合物。可在任何所需的確定時(shí)間進(jìn)行后續(xù)給予。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供保護(hù)嬰兒抵抗由無(wú)乳鏈球菌和選自棒狀白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、百日咳博德特氏菌和脊髓灰質(zhì)炎病毒中的一種或多種所致的疾病的方法，所述方法包括如下步驟(a)向懷有所述嬰兒的妊娠期間的女性給予本發(fā)明的組合物；和(b)任選地向由該妊娠出生的嬰兒給予本發(fā)明的組合物。因此，還提供了保護(hù)嬰兒抵抗由無(wú)乳鏈球菌和選自白喉、破傷風(fēng)、百日咳和脊髓灰質(zhì)炎中的一種或多種所致的疾病的方法，所述方法包括如下步驟(a)向懷有所述嬰兒的妊娠期間的女性給予本發(fā)明的組合物；和(b)任選地向由該妊娠出生的嬰兒給予本發(fā)明的組合物。本發(fā)明中的優(yōu)選組合物能在可接受百分比的人對(duì)象中產(chǎn)生超出各抗原組分血清保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)的抗體效價(jià)。眾所周知抗原的關(guān)聯(lián)抗體效價(jià)，高于該效價(jià)就認(rèn)為宿主針對(duì)所述抗原發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，該類效價(jià)由諸如WHO的組織公布。優(yōu)選多于80％的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的對(duì)象樣品發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，更優(yōu)選多于90％，更優(yōu)選多于93％，最優(yōu)選96-100％。本發(fā)明的組合物通常直接給予患者?？梢酝ㄟ^(guò)胃腸外注射(例如，皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或給予到組織間隙)，或通過(guò)直腸、口服、陰道、外用、透皮、鼻內(nèi)、眼部、耳部、肺部或其它粘膜給藥途徑完成直接遞送。優(yōu)選肌肉內(nèi)給予到大腿或上臂。注射可以通過(guò)針頭(例如皮下針頭)進(jìn)行，但也可以采用無(wú)針注射。肌內(nèi)劑量通常是0.5ml。本發(fā)明可用來(lái)引發(fā)全身和/或粘膜免疫。本發(fā)明所述免疫原性組合物可以單個(gè)或多個(gè)劑量給予。本發(fā)明中優(yōu)選單劑量給予。或者，第一單位劑量后接另一個(gè)單位劑量可能是有效的。通常，所述第二(或第三、第四、第五等)單位劑量與第一單位劑量相同。本發(fā)明的免疫原性組合物通常以三個(gè)單位劑量給予。通常，本發(fā)明免疫原性組合物能肌肉內(nèi)給予，例如，肌肉內(nèi)給予到大腿或上臂。多劑量可用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。初次給藥方案之后，可以進(jìn)行加強(qiáng)給藥方案?？梢猿Ｒ?guī)確定初次劑量之間(例如4-16周)以及初次和加強(qiáng)劑量之間的適當(dāng)時(shí)機(jī)。為充分發(fā)揮功效，典型的初次免疫方案(特別對(duì)于兒童)可包括給予一次以上的劑量。例如，可在以下時(shí)間給予：0和6個(gè)月(時(shí)間0是第一次劑量)；在0、1、2和6個(gè)月；在0天、21天然后第三次劑量在6和12個(gè)月之間；在2、4和6個(gè)月；在3、4和5個(gè)月；在6、10和14周；在2、3和4個(gè)月；或者在0、1、2、6和12個(gè)月。小兒組合物還可用作加強(qiáng)劑，例如對(duì)兒童而言在出生第二年內(nèi)使用。組合物還可用作加強(qiáng)劑，例如對(duì)兒童而言在出生第二年內(nèi)使用。本發(fā)明的青少年加強(qiáng)疫苗組合物以單劑量給予10歲和更年長(zhǎng)的人。本發(fā)明的免疫原性組合物可作為加強(qiáng)疫苗給予先前已針對(duì)白喉和破傷風(fēng)(并且優(yōu)選也針對(duì)百日咳)已接種疫苗的患者?？筛鶕?jù)對(duì)上述疫苗的免疫學(xué)記憶應(yīng)答來(lái)分辨這些患者與普通人群。所述患者在接受本發(fā)明疫苗之前最近一次接受白喉和/或破傷風(fēng)疫苗可能已經(jīng)是至少5年以前。因此，接受疫苗的患者的年齡可以是4-65歲，例如11-64歲，10-18歲等?？刹捎萌魏魏线m的給予途徑。例如，組合物可肌肉內(nèi)給予、腹膜內(nèi)給予、皮下給予、經(jīng)皮給予或皮內(nèi)給予。必要時(shí)，所述組合物可通過(guò)粘膜內(nèi)途徑，例如口內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)和直腸內(nèi)途徑給予。對(duì)妊娠女性和嬰兒的給予可通過(guò)相同途徑或不同途徑?？赏ㄟ^(guò)肌肉內(nèi)注射到例如注射進(jìn)入手臂或腿中來(lái)給予本發(fā)明的組合物。本發(fā)明制備的疫苗可作為分開疫苗同時(shí)給予患者，例如，與肺炎球菌偶聯(lián)物疫苗例如PREVNARTM同時(shí)給予，與流感疫苗同時(shí)給予，與輪狀病毒疫苗同時(shí)給予，與MMR疫苗同時(shí)給予等。當(dāng)本發(fā)明組合物包含鋁基佐劑時(shí)，在貯存過(guò)程中組分可能會(huì)發(fā)生沉淀。因此，在給予患者之前應(yīng)振蕩該混合物。振蕩過(guò)的組合物是混濁的白色懸液。概述術(shù)語(yǔ)“包括”涵蓋“包含”以及“由……組成”，例如，“包括”X的組合物可以僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。術(shù)語(yǔ)“由……組成”指“僅由……組成”。組合物"由X組成"可不包含任何其它組分。組合物"基本由X組成"可不包含任何其它活性組分。術(shù)語(yǔ)“基本由……組成”意味著組合物、方法或結(jié)構(gòu)可包括額外的成分、步驟和/或部分，但僅在所述額外成分、步驟和/或部分不會(huì)實(shí)質(zhì)性改變所要求的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新穎的特征才可以。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“約”表示例如，x±10％。術(shù)語(yǔ)“基本”不排除“完全”，如“基本不含”Y的組合物可能完全不含Y。必要時(shí)，可以從本發(fā)明定義中略去詞語(yǔ)“基本”。應(yīng)理解糖環(huán)可以是開放或閉合形式，而且雖然本文結(jié)構(gòu)式中顯示的是閉合形式，但本發(fā)明也包括開放形式。類似的，應(yīng)理解糖可以吡喃糖和呋喃糖形式存在，而且雖然本文的結(jié)構(gòu)式中顯示的是吡喃糖形式，但也包括呋喃糖形式。還可包含糖的不同異頭形式。除非另有明確說(shuō)明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的工藝不要求任何特定的混合順序。因此，組分可以任何順序混合。在有三種組分時(shí)，可將兩種組分相互合并，然后可將組合與第三種組分混合等?？贵w通常對(duì)于其靶標(biāo)是特異性的。因此，其對(duì)靶標(biāo)的親和性高于無(wú)關(guān)對(duì)照蛋白，例如牛血清白蛋白。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“約”表示例如，x±10％。將描述組分“吸附”至佐劑時(shí)，優(yōu)選該抗原至少被吸附50％(以重量計(jì))，例如50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或更多。若組分完全吸附，則在離心后的組合物上清液中應(yīng)檢測(cè)不到該組分。除非另有明確說(shuō)明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的工藝不要求任何特定的混合順序。因此，組分可以任何順序混合。在有三種組分時(shí)，可將兩種組分相互合并，然后可將組合與第三種組分混合等。偶聯(lián)物的含量通常是以糖質(zhì)量的形式表示(即，偶聯(lián)物(載體+糖)作為整體的劑量高于所述劑量)，從而避免載體選擇引起的變化。在本發(fā)明中使用的含磷基團(tuán)可以多種質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式存在，取決于周圍環(huán)境的pH值，例如溶解它們的溶劑的pH值。因此，雖然本文可能表示特定的形式，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，除非另外指出，這些說(shuō)明僅僅是代表性的并且不限制特定的質(zhì)子化或去質(zhì)子化形式。例如，在磷酸基的情況下，磷酸基被表示為-OP(O)(OH)2，但是該定義包含可能在酸性條件下存在的質(zhì)子化形式-[OP(O)(OH2)(OH)]+和-[OP(O)(OH2)2]2+以及可能在堿性條件下存在的去質(zhì)子化形式-[OP(O)(OH)(O)]-和[OP(O)(O)2]2-。本發(fā)明包括所有這些形式。將化合物作為組合物的一部分給予機(jī)體時(shí)，該化合物或可由合適的前藥替代。將動(dòng)物(且特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，其應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來(lái)源。附圖說(shuō)明圖1顯示表1中所述小鼠組中針對(duì)(A)GBSIa,(B)GBSIb和(C)GBSIII的IgG效價(jià)。第5組和第6組中的全組小鼠匯集血清。GMT效價(jià)由中間短線指示。較高和較低短線指示95％置信區(qū)間。圖2顯示表1中所述的小鼠組中針對(duì)(A)白喉類毒素，(B)破傷風(fēng)類毒素，(C)百日咳類毒素，(D)百日咳FHA和(E)百日咳69K的IgG效價(jià)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性由*(p<0.05)指示。GMT效價(jià)由中間短線指示。較高和較低短線指示95％置信區(qū)間。圖3顯示表1中所述小鼠組中針對(duì)(A)GBSIa,(B)GBSIb和(C)GBSIII的OPK效價(jià)。對(duì)每次實(shí)驗(yàn)，各組(除第5組和第6組)從全組小鼠匯集血清(實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次)。分別匯集第5組和第6組的兩次實(shí)驗(yàn)的血清。GMT效價(jià)由中間短線指示。圖4顯示表3中所述小鼠組中針對(duì)(A)GBSIa,(B)GBSIb和(C)GBSIII的IgG效價(jià)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性由*(p<0.05)指示。GMT效價(jià)由中間短線指示。較高和較低短線指示95％置信區(qū)間。圖5顯示表3中所述的小鼠組中針對(duì)(A)白喉類毒素，(B)破傷風(fēng)類毒素，(C)百日咳類毒素，(D)百日咳FHA和(E)百日咳69K的IgG效價(jià)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性由**(p<0.01)和*(p<0.05)指示。GMT效價(jià)由中間短線指示。較高和較低短線指示95％置信區(qū)間。圖6顯示表3中所述小鼠組中針對(duì)(A)GBSIa,(B)GBSIb和(C)GBSIII的OPK效價(jià)。各組中從全組小鼠匯集血清用于各實(shí)驗(yàn)。GMT效價(jià)由中間短線指示。圖7顯示表5中所述小鼠組中針對(duì)(A)GBSIa,(B)GBSIb和(C)GBSIII的IgG效價(jià)。第5、6和7組各組匯集血清。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性由**(p<0.01)指示。GMT效價(jià)由中間短線指示。較高和較低短線指示95％置信區(qū)間。圖8顯示表5中所述的小鼠組中針對(duì)(A)破傷風(fēng)類毒素和(B)白喉類毒素的IgG效價(jià)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性由*(p<0.05)指示。GMT效價(jià)由中間短線指示。較高和較低短線指示95％置信區(qū)間。圖9顯示表5中所述小鼠組中針對(duì)(A)GBSIa,(B)GBSIb和(C)GBSIII的OPK效價(jià)。各組中從全組小鼠匯集血清用于各實(shí)驗(yàn)。GMT效價(jià)由中間短線指示。具體實(shí)施方式材料和方法疫苗用于下述實(shí)驗(yàn)的GBS三價(jià)疫苗具有各自與CRM197偶聯(lián)的源自三種主要血清型Ia、Ib和III的莢膜多糖。TdaP(H4)疫苗佐以氫氧化鋁并且包含破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素和非細(xì)胞百日咳抗原(PT、FHA和69K)。TdaP(H4)-IPV疫苗佐以氫氧化鋁并且包含破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、非細(xì)胞百日咳抗原(PT、FHA和69K)和脊髓灰質(zhì)炎抗原(IPV1、IPV2和IPV3)。可采用市售可得的破傷風(fēng)和破傷風(fēng)/白喉液體疫苗。ELISA來(lái)自經(jīng)免疫小鼠的血清中針對(duì)GBS多糖Ia、Ib和III的IgG效價(jià)用ELISA檢測(cè)，如參考文獻(xiàn)159所述。ELISAIgGAbs和OPK效價(jià)之間一般有良好關(guān)聯(lián)。調(diào)理吞噬殺傷(OPK)試驗(yàn)評(píng)估疫苗功效的一種可行方法是采用保護(hù)的替代，在GBS情況中這種替代是血清抗體的調(diào)理活性。調(diào)理吞噬殺傷試驗(yàn)檢測(cè)補(bǔ)體存在下血清抗體調(diào)理GBS以通過(guò)效應(yīng)細(xì)胞殺傷的能力。用于檢測(cè)在免疫小鼠中針對(duì)GBS多糖Ia、Ib和III引發(fā)的抗體的功能活性的OPK試驗(yàn)采用HL-60(一種髓細(xì)胞白血病前體細(xì)胞系，獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,CCL-240))進(jìn)行。菌株GBS515、GBSH36b和GBSCOH1分別用來(lái)檢測(cè)血清型Ia、Ib和III分離物的殺傷。在熱失活補(bǔ)體存在下或在抗體或效應(yīng)細(xì)胞不存在時(shí)，或采用免疫前或安慰劑血清進(jìn)行陰性對(duì)照反應(yīng)。反應(yīng)鋪板于胰酶解酪蛋白大豆瓊脂板，并測(cè)定細(xì)菌計(jì)數(shù)。殺傷的百分比計(jì)算為(T0時(shí)的平均CFU-T60時(shí)的平均CFU)/(T0時(shí)的平均CFU)。OPK效價(jià)表達(dá)為導(dǎo)致50％細(xì)菌殺傷的血清稀釋度的倒數(shù)。根據(jù)參考文獻(xiàn)160中所述的基于殺傷的調(diào)理吞噬試驗(yàn)(kOPK)方案進(jìn)行OPK試驗(yàn)?；贚uminex的多通路試驗(yàn)采用對(duì)破傷風(fēng)、白喉和百日咳抗原進(jìn)行IgG定量的基于Luminex的多通路試驗(yàn)。使白喉類毒素(DT)、破傷風(fēng)類毒素(TT)、百日咳類毒素(PT)、百日咳FHA和百日咳69K抗原各自共價(jià)偶聯(lián)至微球(德克薩斯州奧斯汀的Luminex公司)。分析小鼠血清樣品以評(píng)估特異性各抗原特異性的抗體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)以兩次重復(fù)進(jìn)行，并且對(duì)兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的值取平均。通過(guò)匯集來(lái)自用TdaP抗原+鋁免疫的CD1小鼠的血清來(lái)制備參比血清。研究1：在TdaP和TdAP-IPV中重建GBS該研究考察凍干的GBS三價(jià)疫苗(Ia、Ib、III多糖偶聯(lián)至CRM197)的免疫原性，疫苗用如下物質(zhì)重建：(i)包含破傷風(fēng)、白喉和非細(xì)胞百日咳抗原的含鋁佐劑的液體疫苗(TdaP)，和(ii)包含破傷風(fēng)、白喉、非細(xì)胞百日咳和脊髓灰質(zhì)炎抗原的含鋁佐劑的液體疫苗(TdaP-IPV)。該免疫方案報(bào)告于表1，并且重復(fù)兩次。在各次實(shí)驗(yàn)中，在第0和21天，采用表1中所示的2劑量所述疫苗對(duì)六組各8只CD1雌性小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫，并且在第0和35天取血。表1.研究1的免疫方案。通過(guò)ELISA分析來(lái)自免疫小鼠的血清的針對(duì)各GBS血清型特定抗原(Ia、Ib和III型)的IgG抗體的存在。通過(guò)Luminex試驗(yàn)來(lái)定量針對(duì)破傷風(fēng)類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)和非細(xì)胞百日咳抗原(PT、FHA和69K)的抗體。通過(guò)調(diào)理吞噬殺傷(OPK)試驗(yàn)評(píng)價(jià)針對(duì)GBS抗原的抗體的功能活性。圖1和2顯示研究1中測(cè)試的六組小鼠針對(duì)不同抗原的IgG效價(jià)(從兩次試驗(yàn)中8+8只小鼠獲得的合并結(jié)果)。GMT效價(jià)如下表2中所示。表2：研究1中測(cè)試的小鼠內(nèi)進(jìn)行兩次免疫之后的GMT血清IgG效價(jià)。第1組第2組第3組第4組第5組第6組GBSIa1129787821313GBSIb561972291851313GBSIII6835376257621313DT187.5548.94N/AN/A<LLOQ89.95TT560.67268.97N/AN/A<LLOQ626.72PT280.43121.10N/AN/A2.10232.60FHA789.00450.81N/AN/A<LLOQ749.9569K789.0450.8N/AN/A<LLOQ88.6<LLOQ＝低于定量下限總體而言，全部疫苗制劑均具有與對(duì)照可比的免疫原性，并且沒(méi)有觀察到顯著的免疫學(xué)干擾。對(duì)于第二次免疫之后針對(duì)GBSIa、Ib和III的IgG效價(jià)而言，通過(guò)曼-惠特尼U檢驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)到疫苗組之間在任何血清型的Ig應(yīng)答上存在顯著差異，這指示不存在干擾。對(duì)于第二次免疫之后針對(duì)DT、TT、PT、FHA和69K的IgG效價(jià)而言，GBS+TDaP引發(fā)的GMT效價(jià)是GBS+TDaP+IPV的兩倍高(P<0.05，通過(guò)曼-惠特尼U檢驗(yàn))，表明IPV對(duì)全部TDaP抗原的較小負(fù)面作用。此外，對(duì)于TT而言，疫苗TDaP+IPV產(chǎn)生的效價(jià)是TDaP+IPV+GBS的兩倍高(U檢驗(yàn)，P<0.026)，表明在IPV存在下GBS對(duì)TT具有較小負(fù)面作用。圖3顯示研究1中測(cè)試的六組動(dòng)物的針對(duì)GBSIa、Ib和III的OPK效價(jià)。如圖所示，對(duì)于任何疫苗制劑而言，均沒(méi)有檢測(cè)到針對(duì)GBSIa、Ib或III的OPK效價(jià)中具有較大差異(在試驗(yàn)和生物變異性范圍內(nèi))。研究2：TdaP中重建GBS該研究探討不同量的凍干GBS三價(jià)疫苗(與CRM197偶聯(lián)的Ia、Ib、III多糖)的免疫原性，疫苗用包含破傷風(fēng)、白喉和非細(xì)胞百日咳抗原的含鋁佐劑液體疫苗(TdaP)重建。在第0、21和35天，用3劑量疫苗對(duì)八組各16只CD1雌性小鼠皮下免疫，并且在第0、35(第2次后)和49(第3次后)天取血。免疫方案見(jiàn)表3。表3.研究2的免疫方案.圖4和5顯示對(duì)研究2中測(cè)試的小鼠組進(jìn)行3次免疫之后，所有組針對(duì)不同抗原的IgG效價(jià)。GMT效價(jià)如下表4中所示。表4：研究2中測(cè)試的小鼠內(nèi)進(jìn)行三次免疫之后的GMT血清IgG效價(jià)。第1組第2組第3組第4組第5組第6組第7組第8組GBSIa155.512.5237.0N/A598.6418.320.412.5GBSIb107.515.190.6N/A250.4271.715.712.5GBSIII588.212.5677.7N/A958.9946.423.112.5DT141.3164.3164.5228.2N/AN/AN/A0.1TT333.6382.1457.2509.6N/AN/AN/A0.1PT191.4187.1149.9128.1N/AN/AN/A0.2FHA423.8544.6476.1314.9N/AN/AN/A0.169K374.7435.4328.2337.9N/AN/AN/A0.1對(duì)于第三次免疫后針對(duì)GBSIa、Ib和III的IgG效價(jià)，首先觀察到的是第7組中的兩只小鼠可能誤接受了疫苗(顯示針對(duì)全部三種抗原的高IgG效價(jià)，在先前的相似安慰劑組中從未觀察到該情況)。第二，相較于不采用TdaP的GBS疫苗而言，觀察到在用TdaP重建的組中對(duì)全部三種GBS抗原具有較低IgG效價(jià)的趨勢(shì)(2-4倍GMT,在一些情況中P<0.05)。對(duì)于針對(duì)所有血清型的第2次后IgG效價(jià)觀察到了相同的趨勢(shì)。對(duì)于第三次免疫后分別針對(duì)DT、TT、PT、FHA和69K的IgG效價(jià)而言，通過(guò)曼-惠特尼檢驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)到任何組之間的IgG應(yīng)答存在顯著差異，指示完全不存在干擾。對(duì)于DT和TT而言沒(méi)有觀察到劑量應(yīng)答，而觀察到百日咳PT、FHA和69K抗原的較高劑量具有相比較低劑量略高的效價(jià)。當(dāng)比較第5組和第6組中針對(duì)GBSIa、Ib和III的IgG效價(jià)中，比較對(duì)GBS1μg(高，L)和0.25μg(低，L)疫苗劑量的應(yīng)答，對(duì)GBSIa和Ib的個(gè)體應(yīng)答中的變異性高于GBSIII的情況。對(duì)于任何血清型沒(méi)有觀察到低劑量和高劑量之間存在顯著差異，而對(duì)于所有血清型而言，相較后-2，檢測(cè)到第3次后相比第2次后的非應(yīng)答者數(shù)量更少且應(yīng)答顯著較高(曼-惠特尼U檢驗(yàn))。圖6顯示研究2中測(cè)試的七組小鼠的針對(duì)GBSIa、Ib和III的OPK效價(jià)。相較于單獨(dú)GBS而言，用TdaP制備的GBS疫苗中有略低效價(jià)的趨勢(shì)。研究3：在破傷風(fēng)和破傷風(fēng)/白喉液體疫苗中重建的GBS該研究考察凍干GBS三價(jià)疫苗(與CRM197偶聯(lián)的Ia、Ib、III多糖)的免疫原性，所述疫苗用包含(i)破傷風(fēng)抗原或(ii)破傷風(fēng)和白喉抗原的含鋁佐劑液體疫苗重建。該免疫方案報(bào)告于表5，并且重復(fù)兩次。在各方案中，采用表5中所示的2劑量所述疫苗在第0和21天對(duì)七組各8只CD1雌性小鼠進(jìn)行皮下免疫，并且在第0和35天取血。表5：研究3的免疫方案。圖7和8顯示研究3中測(cè)試的全部組小鼠針對(duì)不同抗原的IgG效價(jià)(從兩次試驗(yàn)中8+8只小鼠獲得的合并結(jié)果)。GMT效價(jià)如下表6中所示。表6：研究3中測(cè)試的小鼠內(nèi)進(jìn)行兩次免疫之后的GMT血清IgG效價(jià)。第1組第2組第3組第4組第5組第6組第7組GBSIa65162458235131313GBSIb217402550417131313GBSIII85410181186924131313TT742.00882.70N/AN/A6.601295.001038.00DT7.49111.6N/AN/A<LLOQ<LLOQ28.52<LLOQ＝低于定量下限對(duì)于由ELISA檢測(cè)的針對(duì)GBSIa、Ib和III的IgG效價(jià)而言，曼-惠特尼檢驗(yàn)并未顯示除血清型Ia以外的疫苗組之間存在任何顯著差異，對(duì)于血清型Ia，由單獨(dú)GBS建立的疫苗(第3組)產(chǎn)生的效價(jià)顯著高于包含GBS加破傷風(fēng)類毒素的疫苗。在OPK試驗(yàn)中，對(duì)于任何疫苗制劑而言，針對(duì)GBSIa、Ib或III的OPK效價(jià)未檢測(cè)到較大差異(在試驗(yàn)和生物變異性范圍內(nèi))。相較于單獨(dú)TT，在包含GBS疫苗和TT的組中，針對(duì)TT的IgG效價(jià)顯著較低(P＝0.03)，盡管GMT效價(jià)中的差異小于兩倍。對(duì)于針對(duì)DT的IgG應(yīng)答而言，在包含GBS疫苗的組中較高，正如由CRM197(脫毒化的DT)的影響所期望的那樣。圖9顯示研究3中測(cè)試的全部小鼠組血清中針對(duì)GBSIa、Ib和III的OPK效價(jià)。如圖所示，對(duì)于任何疫苗制劑而言，針對(duì)GBSIa、Ib或III的OPK效價(jià)均沒(méi)有檢測(cè)到較大差異(在試驗(yàn)和生物變異性范圍內(nèi))。結(jié)論對(duì)于在研疫苗制劑的免疫原性得出如下觀察結(jié)論：·GBS三價(jià)、白喉、破傷風(fēng)和百日咳疫苗在用全部在研制劑免疫的小鼠中引發(fā)針對(duì)相應(yīng)抗原的特異性抗體。·在研究1(用2個(gè)疫苗劑量腹膜內(nèi)免疫)和2(用2和3個(gè)疫苗劑量皮下免疫)中研究了GBS和破傷風(fēng)/白喉/百日咳/脊髓灰質(zhì)炎聯(lián)合疫苗之間的免疫學(xué)干擾。研究1中沒(méi)有觀察到干擾，其中對(duì)GBS、白喉、破傷風(fēng)和百日咳抗原的IgG和功能抗體應(yīng)答各自相當(dāng)，無(wú)論其應(yīng)用是單獨(dú)或是聯(lián)合應(yīng)用。在研究2中，我們觀察到相較于單獨(dú)GBS，對(duì)于用TdaP重建的全部三種GBS抗原的IgG效價(jià)具有較低的趨勢(shì)，盡管GMT效價(jià)差異從未高于4倍。·GBS和破傷風(fēng)或破傷風(fēng)/白喉疫苗之間的免疫學(xué)干擾于研究3中探討。曼-惠特尼檢驗(yàn)并未揭示任何疫苗組(血清型Ia除外)之間GBS應(yīng)答具有顯著差異，對(duì)于血清型Ia，用單獨(dú)GBS建立的疫苗產(chǎn)生的效價(jià)顯著高于包含GBS加破傷風(fēng)類毒素的疫苗。相同研究顯示GBS疫苗對(duì)TT稍有干擾(包含GBS疫苗的組相比單獨(dú)TT而言，兩倍GMT差異，對(duì)于針對(duì)TT的IgG效價(jià)中的差異而言P＝0.03)。對(duì)于針對(duì)DT的IgG應(yīng)答而言，在包含GBS疫苗的組中較高，正如由CRM197(脫毒化的DT)的影響所期望的那樣?？偠灾谌魏卧谘幸呙缰g沒(méi)有顯示強(qiáng)干擾的證據(jù)。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)可對(duì)之進(jìn)行修改。參考文獻(xiàn)[1]Vaccines.(《疫苗》)(Plotkin和Orenstein編).第4版,2004,ISBN:0-7216-9688-0.[2]Paoletti等.(1990)JBiolChem265:18278-83.[3]Wessels等.(1990)JClinInvest86:1428-33.[4]Paoletti等.(1992)InfectImmun60:4009-14.[5]Paoletti等.(1992)JClinInvest89:203-9.[6]Wessels等.(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:9170-4.[7]Wang等.(2003)Vaccine21:1112-7.[8]Wessels等.(1993)InfectImmun61:4760-6[9]Wessels等.(1995)JInfectDis171:879-84.[10]Baker等.(2004)JInfectDis189:1103-12.[11]Paoletti和Kasper(2003)ExpertOpinBiolTher3:975-84.[12]WO2012/035519[13]WO2006/050341[14]Guttormsen等.(2008)ProcNatlAcadSciUSA.105(15):5903-8.電子公開2008年3月31日.[15]WO96/40795[16]Michon等.(2006)ClinVaccine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