治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法
【專利摘要】一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法，其步驟主要是：A、配制濃度為0.5～2.5g/L的甘露糖化殼聚糖溶液，并調PH值至3.5-5.5；B、配制濃度為0.5～4.5g/L的唑來磷酸溶液，并調PH值至7.2-7.6；C、向甘露糖化殼聚糖溶液中滴入唑來磷酸溶液；滴入的唑來磷酸與甘露糖化殼聚糖的質量比為1:3～12，攪拌15～30分鐘；然后反應液放入透析袋，再在蒸餾水中進行攪拌透析；每隔4小時換一次蒸餾水，透析48小時后，將透析袋中的液體冷凍真空干燥，即得。該法的制備流程簡單、藥物成本低，制得的藥物對惡性腫瘤具有良好的靶向性、活性成分含量高、療效好。
【專利說明】治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法。
【背景技術】
[0002]目前，惡性腫瘤的治療效果不佳。醫(yī)學、生物學、材料學等等各專業(yè)領域，均在開發(fā)各種治療新藥，以期提高治療效果。納米材料的開發(fā)是其中一個方面，近年來，殼聚糖由于其無毒、生物可降解和生物相容性，在作為基因以及藥物載體上備受關注。它作為自然界中唯一帶正電的直鏈多糖，能作為負電荷物質的吸附核心，形成納米級微粒，進而實現其藥物負載功能。通常使用離子交聯法，即:殼聚糖上的氨基陽離子與三聚磷酸鈉的磷酸基陰離子通過靜電吸引進行分子內或分子間交聯，而形成納米顆粒；并在離子交聯過程中加入抗腫瘤藥物而形成負載藥物的納米顆粒，在體內隨著殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯物的降解，負載的抗腫瘤藥物釋放而發(fā)生良好的緩釋抗腫瘤作用。
[0003]但這種具有緩釋作用的抗腫瘤納米顆粒存在如下幾個問題:1、殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯物納米材料對腫瘤的靶向性差，納米粒在體內不能較好的到達腫瘤部位發(fā)揮作用；
2、納米粒需要另外攜帶治療藥物(如化學藥品)才能發(fā)揮抗腫瘤治療效果，納米粒負載的藥物量有限、包封率低，藥物中抗腫瘤活性成分含量低，療效差；3、納米粒負載的抗癌藥物在實際應用的各個環(huán)節(jié)(如體外溶解、體內循環(huán))會有不斷脫落丟失的情況，使得納米粒的實際治療效果進一步下降。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法，該法的制備流程簡單、藥物成本低，制得的納米顆粒藥物對惡性腫瘤具有良好的靶向性、活性成分含量高、療效高，病人服藥的順從性好。
[0005]本發(fā)明實現其發(fā)明目的所采用的技術方案為，一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法，其步驟是:
[0006]A、將甘露糖化殼聚糖5~25g溶于IOL蒸餾水中，再加入50~200mL冰乙酸，并以300-500轉/分的速度，攪拌12小時；然后滴入氫氧化鈉溶液將溶液的PH值調至3.5~
5.5，最后在0.45um的過濾器中過濾，得到甘露糖化殼聚糖溶液；
[0007]B、將唑來磷酸溶于蒸餾水中配制成濃度為0.5~4.5g/L的唑來磷酸溶液，再滴加氫氧化鈉溶液將唑來磷酸溶液的PH值調至7.2-7.6 ；
[0008]C、將A步得到的甘露糖化殼聚糖溶液，以200-400轉/分的速度進行攪拌，在攪拌的過程中，滴入B步的唑來磷酸溶液；滴入的唑來磷酸與甘露糖化殼聚糖的質量比為1:3~12，滴完后繼續(xù)攪拌15~30分鐘；然后將反應液放入透析袋，透析袋在蒸餾水中以100轉/分的速度進行攪拌透析；每隔4小時換一次蒸餾水，透析48小時后，取出透析袋中的液體，在-80°C的溫度下冷凍真空干燥，即得。
[0009]本發(fā)明方法的機理為:
[0010]甘露糖化殼聚糖分子中含有大量的-NH2，甘露糖化殼聚糖在酸性溶液中質子化形成帶正電的氨基(-NH3+),并溶解。唑來膦酸分子上有多個羥基(-0H)，堿化后形成負電基團(-O—)，與殼聚糖分子內大量的正電基團(-NH3+)形成交聯，使唑來膦酸分子被甘露糖化殼聚糖分子包裹形成納米粒。該納米?？箍赡艿哪[瘤機理為:腫瘤細胞及其周圍的腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)大量表達甘露糖受體，納米粒藥物表面的甘露糖結合到甘露糖受體上，實現納米粒藥物的靶向性。隨后，腫瘤及巨噬細胞內吞納米粒，納米粒表面包裹的甘露糖化殼聚糖分子膜降解釋放出內部的唑來膦酸，唑來膦酸誘導腫瘤及巨噬細胞凋亡，從而殺滅腫瘤細胞及腫瘤相關性巨噬細胞，破壞了腫瘤細胞賴以生存的微環(huán)境，起到控制腫瘤的作用。
[0011]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0012]一、與現有的通過殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯制備納米顆粒，再在交聯過程中負載藥物發(fā)揮抗腫瘤治療作用相比，本發(fā)明直接采用甘露糖化殼聚糖與唑來膦酸進行離子交聯直接制得納米藥物顆粒，該納米藥物顆粒的交聯成分(唑來膦酸)本身即可發(fā)揮抗腫瘤，不用再另外負載藥物，從而簡化了制備流程，降低了藥物成本；制得的納米藥物顆粒徑的活性成分含量高，療效高，病人服藥的順從性好。
[0013]二、制得的納米藥物顆粒徑在幾十到1000納米之間可控。腫瘤細胞及其周圍的腫瘤相關性巨噬細胞(TAM)大量表達甘露糖受體，納米級顆粒表面的甘露糖化殼聚糖中的甘露糖能結合到甘露糖受體上，實現納米粒藥物的靶向性，可引導納米粒到達腫瘤部位，被腫瘤細胞和腫瘤相關性巨噬細胞吞噬后，在局部及以腫瘤細胞內釋放出唑來膦酸，唑來膦酸發(fā)揮細胞殺滅作用，從而實現靶向性的抗癌效果，進一步提高了藥物的抗腫瘤效果。
[0014]動物實驗也證明本發(fā)明的納米顆粒藥物有明顯的抗腫瘤作用。
[0015]上述步驟A中的甘露糖化殼聚糖由以下方法制得:
[0016]Al、配制濃度為2g/L的甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液，
[0017]A2、將40g殼聚糖溶于IL蒸餾水中，并加入IOmL的冰乙酸配制成殼聚糖濃度為40g/L的殼聚糖溶液；
[0018]A3、將甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液加入1-10倍體積的殼聚糖溶液中，以300-500轉/分的速度，攪拌24小時；
[0019]A4、將攪拌后的溶液放入20倍體積的異丙醇中，進行轉速10000-13000rmp，15-20分鐘的離心分離；
[0020]A5、將沉淀析出的球狀顆粒，再用異丙醇溶解成溶液，再進行轉速10000-13000rmp，15_20分鐘的離心分離；在重復此操作三次，最后將沉淀析出的球狀顆粒，放入真空干燥箱中干燥24小時至48小時即得甘露糖化殼聚糖。
[0021]采用以上方法使甘露吡喃異硫氰酸苯酯與殼聚糖的-NH2枝接，從而能使甘露糖穩(wěn)定的鍵合在殼聚糖分子上，得到性能更好、更穩(wěn)定的甘露糖化殼聚糖。
[0022]下面結合附圖和具體的實施方式，對本發(fā)明做進一步的說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明實施例一制得的藥物顆粒的掃描電鏡圖。[0024]圖2是本發(fā)明實施例二制得的藥物顆粒的掃描電鏡圖。
[0025]圖3是本發(fā)明實施例三制得的藥物顆粒的掃描電鏡圖。
[0026]圖4是本發(fā)明實施例四制得的藥物顆粒的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
[0027]實施例一
[0028]一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法，其步驟是:
[0029]A、將甘露糖化殼聚糖5g溶于IOL蒸餾水中，再加入50mL冰乙酸，并以300轉/分的速度，攪拌12小時；然后滴入氫氧化鈉溶液將溶液的PH值調至5.5，最后在0.45um的過濾器中過濾，得到甘露糖化殼聚糖溶液；
[0030]B、將唑來磷酸溶于蒸餾水中配制成濃度為0.5g/L的唑來磷酸溶液，再滴加氫氧化鈉溶液將唑來磷酸溶液的PH值調至7.2 ；
[0031]C、將A步得到的甘露糖化殼聚糖溶液，以200轉/分的速度進行攪拌，在攪拌的過程中，滴入B步的唑來磷酸溶液；滴入的唑來磷酸與甘露糖化殼聚糖的質量比為1:12，滴完后繼續(xù)攪拌30分鐘；然后將反應液放入透析袋，透析袋在蒸餾水中以100轉/分的速度進行攪拌透析；每隔4小時換一次蒸餾水，透析48小時后，取出透析袋中的液體，在-80°C的溫度下冷凍真空干燥 ，即得。
[0032]本例的步驟A中的甘露糖化殼聚糖由以下方法制得:
[0033]Al、配制濃度為2g/L的甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液，
[0034]A2、將40g殼聚糖溶于IL蒸餾水中，并加入IOmL的冰乙酸配制成殼聚糖濃度為40g/L的殼聚糖溶液；
[0035]A3、將甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液加入10倍體積的殼聚糖溶液中，以300轉/分的速度，攪拌24小時；
[0036]A4、將攪拌后的溶液放入20倍體積的異丙醇中，進行轉速lOOOOrmp，15分鐘的離心分離；
[0037]A5、將沉淀析出的球狀顆粒，再用異丙醇溶解成溶液，再進行轉速lOOOOrmp，15分鐘的離心分離；在重復此操作三次，最后將沉淀析出的球狀顆粒，放入真空干燥箱中干燥24小時即得甘露糖化殼聚糖。
[0038]圖1是本發(fā)明實施例一制得的藥物顆粒的掃描電鏡圖。圖1說明本例制得的藥物顆粒的大小分布不均勻，納米粒徑為200~800nm，形態(tài)為多面體。
[0039]實施例二
[0040]一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法，其步驟是:
[0041]A、將甘露糖化殼聚糖IOg溶于10L蒸餾水中，再加入IOOmL冰乙酸，并以300轉/分的速度，攪拌12小時；然后滴入氫氧化鈉溶液將溶液的PH值調至4.5，最后在0.45um的過濾器中過濾，得到甘露糖化殼聚糖溶液；
[0042]B、將唑來磷酸溶于蒸餾水中配制成濃度為lg/L的唑來磷酸溶液，再滴加氫氧化鈉溶液將唑來磷酸溶液的PH值調至7.5 ；[0043]C、將A步得到的甘露糖化殼聚糖溶液，以300轉/分的速度進行攪拌，在攪拌的過程中，滴入B步的唑來磷酸溶液；滴入的唑來磷酸與甘露糖化殼聚糖的質量比為1:8，滴完后繼續(xù)攪拌15分鐘；然后將反應液放入透析袋，透析袋在蒸餾水中以100轉/分的速度進行攪拌透析；每隔4小時換一次蒸餾水，透析48小時后，取出透析袋中的液體，在_80°C的溫度下冷凍真空干燥，即得。
[0044]本例的步驟A中的甘露糖化殼聚糖由以下方法制得:
[0045]Al、配制濃度為2g/L的甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液，
[0046]A2、將40g殼聚糖溶于IL蒸餾水中，并加入IOmL的冰乙酸配制成殼聚糖濃度為40g/L的殼聚糖溶液；
[0047]A3、將甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液加入3倍體積的殼聚糖溶液中，以350轉/分的速度，攪拌24小時；
[0048]A4、將攪拌后的溶液放入20倍體積的異丙醇中，進行轉速12000rmp，20分鐘的離心分離；
[0049]A5、將沉淀析出的球狀顆粒，再用異丙醇溶解成溶液，再進行轉速12000rmp，15分鐘的離心分離；在重復此操作三次，最后將沉淀析出的球狀顆粒，放入真空干燥箱中干燥48小時即得甘露糖化殼聚糖。
[0050]圖2是實施例二制得的藥物顆粒的掃描電鏡圖。圖2反應形成納米顆粒，顆粒大小分布欠均勻，納米粒徑最大40~450nm,形態(tài)為類球形。
[0051]實施例三
[0052]一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法，其步驟是:
[0053]A、將甘露糖化殼聚糖20g溶于IOL蒸餾水中，再加入150mL冰乙酸，并以350轉/分的速度，攪拌12小時；然后滴入氫氧化鈉溶液將溶液的PH值調至4.0，最后在0.45um的過濾器中過濾，得到甘露糖化殼聚糖溶液；
[0054]B、將唑來磷酸溶于蒸餾水中配制成濃度為3.0g/L的唑來磷酸溶液，再滴加氫氧化鈉溶液將唑來磷酸溶液的PH值調至7.6 ；
[0055]C、將A步得到的甘露糖化殼聚糖溶液，以400轉/分的速度進行攪拌，在攪拌的過程中，滴入B步的唑來磷酸溶液；滴入的唑來磷酸與甘露糖化殼聚糖的質量比為1:4，滴完后繼續(xù)攪拌20分鐘；然后將反應液放入透析袋，透析袋在蒸餾水中以100轉/分的速度進行攪拌透析；每隔4小時換一次蒸餾水，透析48小時后，取出透析袋中的液體，在_80°C的溫度下冷凍真空干燥，即得。
[0056]本例的步驟A中的甘露糖化殼聚糖由以下方法制得:
[0057]Al、配制濃度為2g/L的甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液，
[0058]A2、將40g殼聚糖溶于IL蒸餾水中，并加入IOmL的冰乙酸配制成殼聚糖濃度為40g/L的殼聚糖溶液；
[0059]A3、將甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液加入I倍體積的殼聚糖溶液中，以450轉/分的速度，攪拌24小時；
[0060]A4、將攪拌后的溶液 放入20倍體積的異丙醇中，進行轉速lOOOOrmp，18分鐘的離心分離；[0061]A5、將沉淀析出的球狀顆粒，再用異丙醇溶解成溶液，再進行轉速13000rmp，18分鐘的離心分離；在重復此操作三次，最后將沉淀析出的球狀顆粒，放入真空干燥箱中干燥40小時即得甘露糖化殼聚糖。
[0062]圖3是實施例三制得的藥物顆粒的掃描電鏡圖。圖3說明本例制得的藥物顆粒的粒徑分布均勻，納米粒徑大小在50nm左右，形態(tài)為類球形。
[0063]實施例四
[0064]一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法，其步驟是:
[0065]A、將甘露糖化殼聚糖25g溶于IOL蒸餾水中，再加入200mL冰乙酸，并以500轉/分的速度，攪拌12小時；然后滴入氫氧化鈉溶液將溶液的PH值調至3.5，最后在0.45um的過濾器中過濾，得到甘露糖化殼聚糖溶液；
[0066]B、將唑來磷酸溶于蒸餾水中配制成濃度為4.5g/L的唑來磷酸溶液，再滴加氫氧化鈉溶液將唑來磷酸溶液的PH值調至7.5 ；
[0067]C、將A步得到的甘露糖化殼聚糖溶液，以400轉/分的速度進行攪拌，在攪拌的過程中，滴入B步的唑來磷酸溶液；滴入的唑來磷酸與甘露糖化殼聚糖的質量比為1:3，滴完后繼續(xù)攪拌30分鐘；然后將反應液放入透析袋，透析袋在蒸餾水中以100轉/分的速度進行攪拌透析；每隔4小時換一次蒸餾水，透析48小時后，取出透析袋中的液體，在_80°C的溫度下冷凍真空干燥，即得。
[0068]本例的步驟A中的 甘露糖化殼聚糖由以下方法制得:
[0069]Al、配制濃度為2g/L的甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液，
[0070]A2、將40g殼聚糖溶于IL蒸餾水中，并加入IOmL的冰乙酸配制成殼聚糖濃度為40g/L的殼聚糖溶液；
[0071]A3、將甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液加入5倍體積的殼聚糖溶液中，以500轉/分的速度，攪拌24小時；
[0072]A4、將攪拌后的溶液放入20倍體積的異丙醇中，進行轉速13000rmp，20分鐘的離心分離；
[0073]A5、將沉淀析出的球狀顆粒，再用異丙醇溶解成溶液，再進行轉速13000rmp，20分鐘的離心分離；在重復此操作三次，最后將沉淀析出的球狀顆粒，放入真空干燥箱中干燥48小時即得甘露糖化殼聚糖。
[0074]圖4是實施例三制得的藥物顆粒的掃描電鏡圖。圖4說明本例制得的藥物顆粒的粒徑分布均勻，粒徑大小在75nm左右，形態(tài)為類球形。
[0075]動物實驗
[0076]體外培養(yǎng)人結腸癌細胞株HCT-8，將2X IO7個/mL人結腸癌細胞(HCT-8)懸液
0.2mL接種于BALB/c小鼠皮下，共60只，建立動物腫瘤模型，分為A組、B組、Cl組、C2組、C3組、C4組，每組10只。
[0077]A組:接種癌細胞后14天，每周經尾靜脈注射含甘露糖化殼聚糖0.1mg的溶液
0.lmL，共 4 次；
[0078]B組:接種癌細胞后14天，每周經尾靜脈注射含唑來膦酸0.1mg的溶液0.1mL,共4次。[0079]Cl組:接種癌細胞后14天，每周經尾靜脈注射含實施例1的藥物顆粒0.1mg的溶液0.lmL，共4次；
[0080]C2組:接種癌細胞后14天，每周經尾靜脈注射含實施例2的藥物顆粒0.1mg的溶液0.lmL，共4次；
[0081]C3組:接種癌細胞后14天，每周經尾靜脈注射含實施例3的藥物顆粒0.1mg的溶液0.lmL，共4次。
[0082]C4組:接種癌細胞后14天，每周經尾靜脈注射含實施例4的藥物顆粒0.1mg的溶液0.lmL，共4次。
[0083]各組實驗鼠的死亡率(接種癌細胞6周后)分別為:A組為80%，B組90%，Cl組為60%、C2 組為 50%, C3 組為 30%, C4 組為 40%。
[0084]B組死亡率高的原因是唑來膦酸雖然具有抗腫瘤作用，但由于唑來膦酸不具有靶向性，注入體內的唑來膦酸基本不能到達腫瘤部位，而無法發(fā)生作用。
[0085]與A、B兩組相比，Cl、C2、C3和C4組死亡率明顯更低，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。表明本發(fā)明的藥物顆粒具有顯著的抗腫瘤作用。
【權利要求】
1.一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法，其步驟是: A、將甘露糖化殼聚糖5~25g溶于IOL蒸餾水中，再加入50~200mL冰乙酸，并以300-500轉/分的速度，攪拌12小時；然后滴入氫氧化鈉溶液將溶液的PH值調至3.5~5.5，最后在0.45um的過濾器中過濾，得到甘露糖化殼聚糖溶液； B、將唑來磷酸溶于蒸餾水中配制成濃度為0.5~4.5g/L的唑來磷酸溶液，再滴加氫氧化鈉溶液將唑來磷酸溶液的PH值調至7.2-7.6 ； C、將A步得到的甘露糖化殼聚糖溶液，以200-400轉/分的速度進行攪拌，在攪拌的過程中，滴入B步的唑來磷酸溶液；滴入的唑來磷酸與甘露糖化殼聚糖的質量比為1:3~12，滴完后繼續(xù)攪拌15~30分鐘；然后將反應液放入透析袋，透析袋在蒸餾水中以100轉/分的速度進行攪拌透析；每隔4小時換一次蒸餾水，透析48小時后，取出透析袋中的液體，在_80°C的溫度下冷凍真空干燥，即得。
2.根據權利要求所述的一種治療惡性腫瘤的甘露糖化殼聚糖與唑來磷酸復合物納米顆粒藥物的制備方法，其特征是，所述步驟A中的甘露糖化殼聚糖由以下方法制得: Al、配制濃度為2g/L的甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液， A2、將40g殼聚糖溶于IL蒸餾水中，并加入IOmL的冰乙酸配制成殼聚糖濃度為40g/L的殼聚糖溶液； A3、將甘露吡喃異硫氰酸苯的二甲基亞砜溶液加入1-10倍體積的殼聚糖溶液中，以300-500轉/分的速度，攪拌24小時； A4、將攪拌后的溶液放 入20倍體積的異丙醇中，進行轉速10000-13000rmp，15-20分鐘的離心分離； A5、將沉淀析出的球狀顆粒，再用異丙醇溶解成溶液，再進行轉速10000-13000rmp，15-20分鐘的離心分離；在重復此操作三次，最后將沉淀析出的球狀顆粒，放入真空干燥箱中干燥24小時至48小時即得甘露糖化殼聚糖。
【文檔編號】A61P35/00GK103800289SQ201410068077
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權日:2014年2月26日
【發(fā)明者】蔣鷗, 魯雄, 孟凡智, 王振銘, 吳道全 申請人:蔣鷗