專利名稱：綿羊IFN-γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA及其克隆方法和重組應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及綿羊IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶 cDNA及其克隆、表達技術(shù)。
背景技術(shù)：
GILT ( Y-干擾素誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶)是1988年由Luster等人發(fā)現(xiàn)的。 GILT是以可溶性糖蛋白前體的形式被甘露糖-6-磷酸受體傳遞到胞吞途徑后，N-和C-端 前肽被切割形成30KDa成熟形式。以II型組織相容性抗原復(fù)合物(MHC class II)為基礎(chǔ)的 抗原呈遞需要將天然蛋白加工成短肽以適合MHC的結(jié)合和T細胞受體(TCR)的識別。抗原 呈遞細胞中進行的抗原抗原的變性、去折疊、二硫鍵還原及蛋白水解。在整個加工途徑中， 二硫鍵的還原是關(guān)鍵步驟。30kDa GILT具有催化二硫鍵還原的活性，因此能夠促進天然蛋 白抗原的去折疊和進一步的蛋白酶解。GILT在抗原呈遞細胞組成型表達，在成纖維細胞、內(nèi) 皮細胞和角蛋白細胞等細胞中可被IFN-Y誘導(dǎo)表達。在專門的抗原呈遞細胞如B細胞和 巨噬細胞中，GILT在較低的pH條件下有較高的活性，并且被證明在抗原加工及免疫顯性 表位的顯示中起著重要的作用。此外，GILT在中和胞外的病原體和清除感染的細胞碎片方 面也有作用。GILT的缺失可能影響到對病毒、腫瘤、細菌、寄生蟲抗原的免疫應(yīng)答，并且可 能影響自身免疫變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental allergic enc印halomyelitis)、糖 尿病的發(fā)生發(fā)展。
目前國內(nèi)對GILT的研究較少，只獲得了豬、文昌魚、石斑魚、大黃魚、珍珠貝的GILT基 因并對用real-time PCR技術(shù)對GILT的表達分布進行鑒定，通過LPS刺激檢測GILT表達 量的變化情況。國外關(guān)于人、鼠GILT的研究進展
(I)Patrick等人研究表明人的黑色素瘤細胞中GILT的表達依賴于STATl而不依賴于 CIITA。表達MHC classll的腫瘤細胞不總是與GILT的表達相偶聯(lián)，這是因為IFN-γ刺激 細胞表面受體使其胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，這些磷酸化的酪氨酸殘基成為STATl單體的停 泊位點，從而被Jakl和2磷酸化。磷酸化的STATl 二聚化入核激活一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄包 括CIITA。而CIITA是MHC classll的總開關(guān)，它的缺失不影響GILT的表達。(2) Maric等人的研究表明GILT的上調(diào)會降低T細胞的敏感性從而減少自身免 疫。降低成熟T細胞的TCR的敏感性有助于控制自身免疫病的發(fā)生。GILT-/-的外周T細 胞能夠增加TCR的敏感性，因為降低了線粒體超氧化物歧化酶的表達導(dǎo)致活性氧的增加和 ERK1/2的磷酸化。GILT-/- T細胞的敏感性增加導(dǎo)致了高血糖癥。(3),2010 年 Reshma Singh 和 Peter Cresswell 在 Science 上發(fā)表文章證明 GILT 對促進I型組織相容性抗原復(fù)合物的呈遞抗原有作用，在GILT-/-小鼠中缺乏對病毒抗原 的交叉遞呈，影響了 CD8+T細胞對病毒抗原的應(yīng)答反應(yīng)。(4)、Su Yan等人研究表明GILT對B細胞的耐受起重要作用，臨床免疫耐受誘導(dǎo)方面有潛在價值。肽-IgG融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的脾臟B細胞能夠有效的對APCs (抗原呈遞細胞) 耐受。但是機制如何并不清楚。他們發(fā)現(xiàn)來源于肽-IgG的class II表位以GILT依賴的 方式被加工。這種體內(nèi)耐受誘導(dǎo)系統(tǒng)對多種自身免疫病(實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎、糖尿 病、血友病)模型動物有效。(5)、Reshma Singh等在nature的文章表明GILT是李斯特氏菌感染的關(guān)鍵宿主 因子。李斯特氏菌是革蘭氏陽性、胞內(nèi)、食源性病原菌能夠在人和動物體內(nèi)引起嚴重的疾 病。感染過程中被巨噬細胞吞噬并在胞內(nèi)逃離吞噬體并在胞漿中復(fù)制，然后以非裂解的機 制從一個細胞到另一個細胞傳播。穿透吞噬體膜是通過分泌溶血素(LLO)實現(xiàn)的?；罨?有裂解活性的LLO的正是GILT。在細菌感染部位，巨噬細胞能夠分泌GILT到胞外，GILT因 能夠活化那個部位的血溶素介導(dǎo)的組織破壞，可能包括因宿主防御招募過來的炎癥細胞的 裂解。綜上所述，國際上對GILT的研究是個熱點，但對GILT上游的基因調(diào)控及下游信 號通路與免疫調(diào)節(jié)機理研究比較充分，但應(yīng)用研究還是一個空白，本課題基于國內(nèi)外研究 的現(xiàn)狀以及羊的細菌感染疾病的思考提出，對羊GILT進行分子結(jié)構(gòu)、功能及免疫調(diào)節(jié)機制 方面進行研究，針對免疫力低下和炎癥感染疾病的動物，開發(fā)相關(guān)的免疫增強劑和疫苗佐 劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)，提供一種從綿羊提取的IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶 cDNA，并提供綿羊IFN- γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA的克隆方法及重組應(yīng)用。本發(fā)明從綿羊中克隆到IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所示的序列。本發(fā)明的綿羊IFN- γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA的克隆方法如下
(1)根據(jù)綿羊基因組IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶的序列設(shè)計引物
正義寡核苷酸引物 She印 GILTl :5，_ TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC -3，( SEQ ID NO. 3) 反義寡核苷酸引物 ^ie印 GILT2 :5，- CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG-3’ ( SEQ ID NO. 4)
(2)從綿羊脾臟提取總RNA；
(3)通過RT-PCR方法，以上述引物Sie印GILTl及Sie印GILT2為特異性引物，擴增出 一段cDNA序列，克隆入pMD19-T載體，并對其堿基序列進行測定。上述綿羊IFN- γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA的克隆方法具體操作如下
(1)根據(jù)綿羊基因組IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶全長CDS兩端設(shè)計的正義寡核 苷酸引物She印GILTl (5，- TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC _3，)與反義寡核苷酸引物Sie印 GILT2 (5， - CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG -3，)。(2)應(yīng)用組織RNA提取試劑盒(天根生物公司)，按照操作手冊，提取出綿羊脾臟細 胞的總RNA，
(3)應(yīng)用RT-PCR方法，以上述Sie印GILTl及Sie印GILT2為特異性引物，擴增出全長 cDNA序列，全長為73^p，克隆入pMD19-T載體，并對其堿基序列進行測定。第一步逆轉(zhuǎn)錄的 反應(yīng)條件為以總RNA為模板，在25 μ 1反應(yīng)體系中，加入5XM-MLV反應(yīng)緩沖液5 μ l、10mMdNTP 混合物 1. 5μ 1、RNase inhibitor (HRPl) 1 μ l、M_MLV(RNase F)逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara 公司)lyl、01igo (dT) 18 primer Ιμ 、及 RNA 模板 3 μ 1，補水至 25 μ 1，42°C 保溫 lh。 第二步進行用兩個特異性弓I物進行30個PCR循環(huán)(94 V變性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸 lmin)，最后于72°C延伸7 min。RT-PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑 盒回收約的DNA條帶，克隆入pMD19-T載體，挑取8個陽性克隆進行堿基序列測定。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進行相似性搜索，發(fā)現(xiàn)與已知的人、小鼠、豬 GILT序列相似率分別是60. 15%,62. 50%,73. 58%，可以確定該序列是綿羊IFN- γ誘導(dǎo)的溶 酶體巰基還原酶(She印GILT)的全長cDNA，其開放閱讀框如SEQ ID NO. 1所示。對該基因的進一步研究表明該基因主要表達在綿羊免疫器官中，包括脾臟和血 液。該基因的重組融合蛋白具有GILT的高活性功能；該基因編碼的蛋白人IgG具有明顯 的還原功能；充分表明本發(fā)明克隆得到的基因就是綿羊IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶 (Sheep GILT )的 cDNA。上述綿羊IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(She印GILT)的cDNA的重組應(yīng)用，通 過現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組Sie印GILT，作為綿羊免疫增強劑。所說的綿羊IFN-γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA通過現(xiàn)有基因工程方法，轉(zhuǎn)入 綿羊體內(nèi)，增加其免疫力，在飼養(yǎng)中應(yīng)用。


圖1是Sie印GILT全長cDNA堿基序列及推測編碼氨基酸序列。圖2是Sie印GILT與牛、人、豬、鼠、爪蟾、斑馬魚GILT全長氨基酸序列同源性比 較圖。其中灰色陰影代表保守的半胱氨酸；方框代表CXXC基序和CQHGX2ECX2NX4C特征序列。圖3是Sie印GILT mRNA在各組織中的表達水平分析圖。GAPDH作為內(nèi)參。圖4是融合蛋白His-sGILT在BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達，純化的SDS-PAGE鑒定 及鼠抗Hi%-tag的western-blotting鑒定結(jié)果，圖中泳道1是未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋 白，泳道2是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白，泳道3是經(jīng)超聲破碎后的上清；泳道4是經(jīng)過超聲 破碎后的沉淀，泳道5是純化后的重組His-sGILT蛋白，泳道6是鼠抗His6-tag單抗的 western-blotting 鑒定結(jié)果。圖5是體外展示羊GILT巰基還原酶活性。M:蛋白分子量marker ；泳道1和2 純 化的sGILT ；泳道3和4 變性的純化人IgG ；泳道5和6 :sGILT和人IgG在ρΗ4· 5條件下孵 育；泳道7和8 用DTT處理的人IgG作為陽性對照。
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā) 明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內(nèi)容相同。實施例1 綿羊(Ovis aries )，人工飼養(yǎng)。(1)引物設(shè)計應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)在NCBI的EST庫中電子克隆出IFN-γ誘 導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶全長cDNA序列用來設(shè)計的正義寡核苷酸引物Sie印GILTl (5’ -TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC -3，，SEQ ID NO. 3)與反義寡核苷酸引物 She印 GILT2 (5，-CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG -3’，SEQ ID NO. 4)。(2)提取總RNA 應(yīng)用RNA抽提試劑TRIzol (Invitrogen公司)按照其操作手冊 提取出約0. 5克綿羊脾臟細胞的總RNA，并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量和純 度，紫外分光光度計測定其濃度。(3)應(yīng)用RT-PCR方法，以上述she印GILTl及she印GILT2為特異性引物，擴增出 Sheep GILT cDNA的全長為73^p，克隆入pMD19_T載體，并對其堿基序列進行測定。第一 步逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為以總RNA為模板，在25 μ 1反應(yīng)體系中，加入5 XM-MLV反應(yīng)緩沖液 5 μ l、10mM dNTP混合物 1· 5μ 1、RNase inhibitor (HRPl) 1 μ l、M_MLV(RNase『)逆轉(zhuǎn)錄 酶(Takara 公司)1 μ l、01igo (dT)18 primer Ιμ 、及 RNA 模板 3 μ 1，補水至 25 μ 1，42°C 保溫lh。第二步進行用兩個特異性引物進行30個PCR循環(huán)(94°C變性30s，56°C退火30s， 72°C延伸lmin)，最后于72°C延伸7 min。RT-PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用 膠回收試劑盒回收約73^p的DNA條帶，克隆入pMD19-T載體，挑取8個陽性克隆進行堿基 序列測定。(6)同源檢索將所得序列向http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/提交克隆得 到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列數(shù)據(jù)庫進行相似性搜索及 同源性分析，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)與已知的牛(AAI49407)，豬(ABX79390)，鼠(NP_075552)， 人(AAH31020)，斑馬魚(AAH83267)和爪蟾(NP_001017196) GILT氨基酸序列分別是 93. 03%, 73. 58%, 62. 50%, 60. 15%, 42. 80% 和 41. 86%，可以確定該序列是綿羊 IFN- γ 誘導(dǎo) 的溶酶體巰基還原酶(sGILT)的全長cDNA。并且其開放閱讀框具有SEQ ID NO. 1序列，碥 碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。實施例2:
Sheep GILT基因在各組織的表達水平分析
采用實施例1中的提取RNA的方法，分別提取了綿羊肝(liver)、腎(kidney)、肺 (lung)、脾(spleen)、心(heat)、腸(intestine)和血液(PBMCs)的總 RNA,運用定量 RT-PCR法對Sie印GILT基因在各組織的表達水平進行了研究，結(jié)果如圖3所示，Sheep GILT基因主要表達在綿羊免疫器官中，包括血液和脾臟表。試驗中綿羊GAPDH作為內(nèi) 參，采用的引物為 GF-Pl (5 ‘ -GGGTCATCATCTCTGCACCT-3 ‘，SEQ ID N0. 5)和 GR-P2 (5 ‘ -GGTCATAAGTCCCTCCACGA-3 ‘，SEQ ID NO. 6)。RT-PCR 體系如實施例 1。可溶性Sie印GILT重組載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達
以實施例1得到的She印GILT全長cDNA為模板，設(shè)計引物沘-Pl (5 ‘ -AAAGGATCCAT GGCCTCGTCGCCTCTC-3 ‘，SEQ ID N0. 7)和 28-P2 (5 ‘ -CCCAAGCTTTCACTTCAAGTGGACTTCCTT G-3 ‘，SEQ ID N0. 8)擴增出Sie印GILT cDNA，引物分別引入酶切位點召aa/Y/#/7歷ii////， 亞克隆入pET-28a載體，構(gòu)建成重組載體pETjSa-sGILT。將此重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達 菌株BL21 (DE3)，胞漿內(nèi)表達出目的蛋白His-sGILT。重組目的蛋白的變復(fù)性變性過程
2M 尿素IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，2M 尿素。4M 尿素IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，4M 尿素。6M 尿素IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，6M 尿素。8M 尿素IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，8M 尿素。收菌后，放于-20度M小時。用PBS重旋后，超聲破碎(超聲4s，停頓8s，共150 次)，12000rpm、4度離心20min，棄上清，沉淀放于-20度或直接變性。向沉淀用2M的尿素洗三遍，用4M的尿素洗兩遍，用6M的尿素洗1遍或用6M的尿 素溶解，最后用8M的尿素溶解，溶解后加入DTT至5mM。4度搖M-36小時。每次洗的時候 加入TritonX-IOO的量為75微升/30ml蛋白液。復(fù)性過程
先用 IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，4M 尿素，ImM GSH, 0. 2Mm GSSG，0. 6mM Arg pH8. 0 透 析 24 小時，再用 IOOmM Tris, IOOmM NaH2P04，2M 尿素，ImM GSH,0. 2Mm GSSG,0. 6mM Arg pH8. 0 透析 36 小時。然后用 75mM Tris,75mM NaH2P04,1. 5M 尿素，0. 6mM Arg，25g 乳糖 /L pH8. 0 透析過夜；再用 50mM Tris, 50mM NaH2P04, IM尿素，0. 6mM Arg, 25g 乳糖 /L pH8. 0 透 析過夜。然后用25mM Tris,25Mm NaH2P04,0. 5M尿素，pH8. 0透析過夜，最后用20Mm Tris 透析過夜，后凍干。每次換透析液時12000rpm，4度，離心20min后重新裝入透析袋。western 印跡分析
Western-blot中所用一抗為鼠抗His6單抗，二抗為辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG。 其簡要步驟是將誘導(dǎo)的產(chǎn)物先行SGS-PAGE，然后以浸入式法將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 膜(NC膜)上，用記號筆標記蛋白marker各條帶，然而依次經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉lh，與 一抗孵育lh，與HRP標記的二抗IgG孵育lh，每步完成后均嚴格洗膜，最后加TMB避光顯色。 結(jié)果如圖4所示在目的蛋白位置出現(xiàn)了特異性條帶。Sheep GILT對IgG的二硫鍵還原作用
對she印GILT用25 μ M的DTT在37°C活化lOmin，將綿羊GILT與人IgG在pH4. 5， 37°C條件下反應(yīng)1小時，向反應(yīng)樣品中加入非還原性上樣緩沖液，在SDS-PAGE膠中跑電泳 結(jié)果如圖5 實施例3
將實施例1獲得的綿羊IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA通過現(xiàn)有基因工程方 法，生產(chǎn)重組Sie印GILT，作為綿羊類免疫增強劑。實施例4
將實施例1獲得的綿羊IFN- γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA通過現(xiàn)有基因工程方 法，轉(zhuǎn)入綿羊體內(nèi)，增加其免疫力，在飼養(yǎng)中應(yīng)用。按照本發(fā)明的方法可以通過現(xiàn)有基因工程技術(shù)，修飾綿羊IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體 巰基還原酶基因并用于所述研究和生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.綿羊IFN-γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA，其特征在于，它的序列如SEQID NO. 1 所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的綿羊IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA的克隆方法，其 特征在于，其步驟如下(1)根據(jù)IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶的保守序列設(shè)計引物正義寡核苷酸引物 ^ie印 GILTl :5’ - TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC -3，反義寡核苷酸引物 ^ie印 GILT2 :5’ - CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG-3’(2)從綿羊脾臟提取總RNA，(3)通過RT-PCR方法，以上述引物Sie印GILTl及Sie印GILT2為特異性引物，擴增出 一段cDNA序列，克隆入pMD19-T載體，挑取陽性克隆進行堿基序列測定。
3.一種權(quán)利要求1所述的綿羊IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA的重組應(yīng)用，是 通過現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組綿羊IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶，作為綿羊免疫增 強劑。
4.綿羊IFN-Y誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及綿羊IFN-γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA及其克隆方法和重組應(yīng)用，屬于生物基因工程領(lǐng)域。綿羊IFN-γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶具有SEQIDNO.2所示的序列，編碼它的基因如SEQIDNO.1所示。其克隆方法如下根據(jù)綿羊IFN-γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶的保守序列設(shè)計引物；從綿羊脾臟提取總RNA；通過RT-PCR方法，擴增出全長cDNA序列，克隆入pMD19-T載體，挑取陽性克隆進行測序。所述綿羊IFN-γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶cDNA可通過現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組綿羊IFN-γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶，作為綿羊免疫增強劑。
文檔編號C12N9/02GK102121021SQ201010598400
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者張雙全, 張真真, 艾洪新 申請人:南京師范大學(xué)