結(jié)合淋巴細(xì)胞活化基因3(lag-3)之人類(lèi)抗體及其用途
【專(zhuān)利摘要】本申請(qǐng)涉及結(jié)合淋巴細(xì)胞活化基因3（LAG-3）之人類(lèi)抗體及其用途。本披露提供了以高親和力特異性地與LAG-3相結(jié)合的分離的單克隆抗體，特別是人類(lèi)單克隆抗體。較佳的是，該等抗體結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在某些實(shí)施方案中，該等抗體結(jié)合人類(lèi)以及猴類(lèi)之LAG-3，但不結(jié)合小鼠之LAG-3。本發(fā)明提供了抗LAG-3抗體，該等抗體可抑制LAG-3與MHC?II類(lèi)分子之結(jié)合并可刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。還提供了對(duì)本發(fā)明之抗體進(jìn)行編碼的核酸分子、表達(dá)本發(fā)明之抗體之表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以及方法。還提供了包括本發(fā)明之抗體之免疫綴合物、雙特異性分子、以及藥物組合物。本披露還提供了用于檢測(cè)LAG-3之方法、連同使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體治療刺激性免疫反應(yīng)之方法。還提供了聯(lián)合治療法，其中抗LAG-3抗體與至少一種另外之免疫刺激性抗體一起共同給藥。
【專(zhuān)利說(shuō)明】結(jié)合淋巴細(xì)胞活化基因3 (LAG-3)之人類(lèi)抗體及其用途
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年08月11日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?00980139549.6、發(fā)明名稱(chēng)為“結(jié)合淋巴細(xì)胞活化基因3 (LAG-3)之人類(lèi)抗體及其用途”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]發(fā)明背景
[0003]淋巴細(xì)胞活化基因3或LAG-3 (也稱(chēng)作⑶223)系免疫球蛋白超基因家族之一員，并且在結(jié)構(gòu)上以及遺傳上與⑶4有關(guān)。LAG-3并不在休眠的外周血淋巴細(xì)胞上表達(dá)，但在被活化的T細(xì)胞以及NK細(xì)胞上表達(dá)。LAG-3系由位于染色體12的短臂的遠(yuǎn)程部分、在⑶4基因附近的一基因進(jìn)行編碼的膜蛋白，表明該LAG-3基因可能已經(jīng)藉由基因重復(fù)而進(jìn)化(Triebel et al.(1990) T.Exp.Med.171:1393-1405)。
[0004]類(lèi)似于⑶4，LAG-3已被證明與MHC 11類(lèi)分子進(jìn)行相互作用，但不像⑶4，LAG-3不與人類(lèi)免疫缺陷病毒gpl20蛋白進(jìn)行相互作用(Baixeras et al.(1992) J.Exp.Med.176:327-337 )0使用可溶的LAG-3免疫球蛋白融合蛋白(sLAG_3Ig)的研究證明了 LAG-3與在細(xì)胞表面上的MHC II類(lèi)直接并且特異的結(jié)合(Huard et al.(1996)Eur.J.1mmunol.26:1180-1186)。
[0005]在抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的體外研究中，加入抗LAG-3抗體導(dǎo)致T細(xì)胞增殖增加、活化抗原(如CD25)的更高表達(dá)、以及更高濃度的細(xì)胞因子(例如干擾素Y以及白介素4)，從而支持LAG-/MHC II類(lèi)分子相互作用在下調(diào)CD4+T淋巴細(xì)胞的抗原依賴(lài)性刺激中的作用(Huard et al.(1994)Eur.J.1mmunol.24:3216-3221)。已經(jīng)證明 LAG-3 的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)與名為L(zhǎng)AP的蛋白進(jìn)行相互作用，此蛋白被認(rèn)為是與CD3/TCR活化途徑的下調(diào)有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(1uzalen et al.(2001)Eur.J.1mmunol.31:2885-2891 )? 此外，已顯示 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tms)在活化時(shí)表達(dá)LAG-3，并且針對(duì)LAG-3之抗體在體內(nèi)以及體外均抑制由所誘導(dǎo)的T,eg細(xì)胞所產(chǎn)生的阻抑，表明LAG-3有助于Treg細(xì)胞的阻抑活性(Huang，C.etal.(2004) Immunity21:503-513)。另外，已顯示LAG-3藉由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以T細(xì)胞依賴(lài)性以及非依賴(lài)性這兩種機(jī)制對(duì)T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)(Workman, C.J.and Vignali, D.A.(2005)J.1mmunol.174:688-695)o
[0006]在某些情況下，LAG-3還已顯示出具有免疫刺激作用。例如，當(dāng)與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞相比時(shí)，移植到同系基因小鼠中的轉(zhuǎn)染了 LAG-3的腫瘤細(xì)胞顯示出顯著的生長(zhǎng)下降或完全消退，表明LAG-3在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)藉由經(jīng)由MHC II類(lèi)分子觸發(fā)抗原呈遞細(xì)胞而刺激了抗腫瘤應(yīng)答(Prigent et al.(1999)Eur.T.1mmunol.29:3867-3876)。另外地，當(dāng)與抗原一起被給予小鼠時(shí)，已顯示可溶性LAG-3Ig融合蛋白刺激體液免疫反應(yīng)以及細(xì)胞免疫反應(yīng)，說(shuō)明可溶性LAG-3Ig可作為疫苗佐劑發(fā)揮作用(El Mir and Triebel (2000)J.1mmunol.164:5583-5589)。此外,已顯示可溶性人類(lèi)LAG_3Ig擴(kuò)大了在體外產(chǎn)生I型腫瘤特異性免疫(Casati et al.(2006) Cancer Res.66:4450-4460)0 在 Triebel (2003) TrendsImmunol.Μ:619-622中對(duì)LAG-3的功能活性進(jìn)行了進(jìn)一步綜述。鑒于以上原因，用于調(diào)整LAG-3活性的另外的藥劑系令人感興趣的。
[0007]發(fā)明概述 [0008]本披露提供了分離的單克隆抗體，特別是人類(lèi)單克隆抗體，該等人類(lèi)單克隆抗體特異性結(jié)合LAG-3并且具有所希望的功能特性。該等特性包括與人類(lèi)LAG-3的高親和力結(jié)合，與人類(lèi)和猴類(lèi)LAG-3 (獼猴和/或恒河猴L(fēng)AG-3)結(jié)合，但不與小鼠LAG-3結(jié)合，抑制LAG-3與主要組織相容性(MHC)II類(lèi)分子的結(jié)合和/或刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力。例如，本發(fā)明之抗體可被用于(如，在攜帶腫瘤的受試者或攜帶病毒的受試者中)檢測(cè)LAG-3蛋白或刺激抗原特性性T細(xì)胞應(yīng)答。
[0009] 一方面，本發(fā)明涉及分離的之人類(lèi)單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體結(jié)合人類(lèi)LAG-3，并且表現(xiàn)出以下特性中的至少一種:
[0010](a)結(jié)合猴類(lèi) LAG-3 ;
[0011 ] (b)不結(jié)合小鼠LAG-3 ；
[0012](c)抑制LAG-3與主要組織相容性(MHC) II類(lèi)分子的結(jié)合；以及
[0013](d)刺激免疫反應(yīng)。
[0014]較佳的是，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(C)以及(d)中的至少兩種。更佳的是，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(C)以及(d)中的至少三種。甚至更佳的是，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(C)以及(d)中的全部四種。
[0015]在一較佳的實(shí)施方案中，該抗體刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答，例如抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答中白介素2(IL-2)之產(chǎn)生。在其它實(shí)施方案中，該抗體刺激免疫反應(yīng)，例如抗腫瘤應(yīng)答(例如在體內(nèi)腫瘤移植物模型中抑制腫瘤生長(zhǎng))或自身免疫反應(yīng)(例如在NOD小鼠中促進(jìn)糖尿病的形成)。在另一較佳的實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合人類(lèi)LAG-3的表位，該表位包括氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID N0:76)。在又另一較佳的實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合人類(lèi)LAG-3的表位，該表位包括氨基酸序列HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77)或PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78)。在仍又其它的實(shí)施方案中，該抗體以1x10_7M或更小的Kd與人類(lèi)LAG-3相結(jié)合，或以1χ10_8Μ或更小的Kd與人類(lèi)LAG-3相結(jié)合，或以5xlO_9M或更小的Kd與人類(lèi)LAG-3相結(jié)合，或以IxKT9M或更小的Kd與人類(lèi)LAG-3相結(jié)合。在一實(shí)施方案中，該抗體藉由免疫組織化學(xué)法使垂體組織染色，而在另一實(shí)施方案中，該抗體藉由免疫組織化學(xué)法不使垂體組織染色。
[0016]在另一方面，本發(fā)明涉及分離的人類(lèi)單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參考抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)而結(jié)合人類(lèi)LAG-3,其中該參考抗體包括:
[0017](a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:37，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:43 ；
[0018](b)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:38，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:44 ；
[0019](C)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:39，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:45 ；
[0020](d)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:40，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:46 ；
[0021](e)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID N0:41，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:47 ;或者
[0022](f)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:42，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:48。
[0023]在一較佳的實(shí)施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID NO: 37的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID N0:43的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實(shí)施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實(shí)施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID N0:45的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實(shí)施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQID N0:46的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實(shí)施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQID NO:41的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的輕鏈可變區(qū)。在另一較佳的實(shí)施方案中，該參照抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的重鏈可變區(qū)以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的輕鏈可變區(qū)。
[0024]在另一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)VH3-20基因、人類(lèi)VH4-34基因、人類(lèi)VH3-33基因或VH1_24基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異地結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在另一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)\ L18基因、人類(lèi)VkL6基因或人類(lèi)Vk A27基因的產(chǎn)物或是衍生于該基因，其中該抗體特異地結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在一較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括:
[0025](a)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)乂#』*基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；[0026](b)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)乂113-33基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk A27基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；
[0027](c)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)￥113_20基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L18基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；
[0028](d)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)乂^^*基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；或者
[0029](e)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因；
[0030]其中該抗體特異地結(jié)合人類(lèi)LAG-3。
[0031]在另一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括:
[0032](a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列，該氨基酸序列選自下組，其構(gòu)成為:SEQ IDNO:37 至 42 ；
[0033](b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列，該氨基酸序列選自下組，其構(gòu)成為:SEQ IDNO:43 至 48 ；
[0034]其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。
[0035]一較佳的組合包括:
[0036](a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:37 ;以及
[0037](b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:43。
[0038]另一較佳的組合包括:
[0039](a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:38 ;以及
[0040](b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:44。
[0041]另一較佳的組合包括:[0042](a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO: 39 ;以及
[0043](b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:45。
[0044]另一較佳的組合包括:
[0045](a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:40 ;以及
[0046](b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:46。
[0047]另一較佳的組合包括:
[0048](a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:41 ;以及
[0049](b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:47。
[0050]另一較佳的組合包括:
[0051](a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:42 ;以及
[0052](b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:48。
[0053]本發(fā)明之抗體可以是例如全長(zhǎng)抗體，例如IgGl、IgG2或IgG4同種型。在一較佳的實(shí)施方案中，該抗體系IgG4同種型。在另一較佳的實(shí)施方案中，該抗體系IgG4同種型,其在重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)(在與如Angal et al.(1993)Mol.1mmunol.30:105-108中所說(shuō)明的位置241對(duì)應(yīng)的位置)具有從 絲氨酸到脯氨酸的突變，這樣重鏈之間二硫橋的異質(zhì)性被減小或消除?？商娲?，該抗體可以是諸如Fab、Fab’或Fab’ 2片段之抗體片段，或單鏈抗體。
[0054]本披露還提供了免疫綴合物,該免疫綴合物包括連接到治療劑(例如細(xì)胞毒素或放射性同位素)的本發(fā)明之抗體、或其抗原結(jié)合部分。本披露還提供了雙特異性分子，該雙特異性分子包括本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分與第二功能模塊相連接，該第二功能模塊具有與所述抗體或其抗原結(jié)合部分相比不同的結(jié)合特異性。
[0055]還提供了含有本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合部分、或免疫綴合物、或雙特異性分子，以及藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
[0056]本披露還涵蓋了對(duì)本發(fā)明之抗體、或其抗原結(jié)合部分進(jìn)行編碼的核酸分子，連同包括此類(lèi)核酸的表達(dá)載體以及包括此類(lèi)表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。還提供了使用包括此類(lèi)表達(dá)載體的宿主細(xì)胞制備抗LAG-3抗體的方法，并且該等方法可包括以下步驟:(i)在該宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體以及(ii)從該宿主細(xì)胞中分離該抗體。
[0057]在另一方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體來(lái)刺激免疫反應(yīng)的方法。例如，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法包括使所述T細(xì)胞與本發(fā)明的抗體相接觸，這樣刺激了抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在一較佳的實(shí)施方案中，刺激了由抗原特異性T細(xì)胞進(jìn)行的白介素2之產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在受試者中刺激免疫反應(yīng)(例如，抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答)的方法,該方法包括給予該受試者本發(fā)明之抗體，這樣刺激了該受試者中的免疫反應(yīng)(例如，抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答)。在一較佳的實(shí)施方案中，該受試者系攜帶腫瘤的受試者，并且刺激了針對(duì)該腫瘤的免疫反應(yīng)。在另一較佳的實(shí)施方案中，該受試者系攜帶病毒的受試者，并且刺激了針對(duì)該病毒的免疫反應(yīng)。
[0058]在另一方面，本發(fā)明提供了抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括給予該受試者本發(fā)明之抗體，這樣該受試者中的腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。又在另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中病毒感染的方法，該方法包括給予該受試者本發(fā)明之抗體，這樣該受試者中的病毒感染得到治療。[0059]又在另一方面，本發(fā)明提供了在受試者中刺激免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給予該受試者抗LAG-3抗體以及至少一種另外的免疫刺激性抗體，如抗ro-1抗體、抗ro-Ll抗體和/或抗CTLA-4抗體,這樣在該受試者中刺激了免疫反應(yīng),例如以抑制腫瘤生長(zhǎng)或刺激抗病毒應(yīng)答。在一實(shí)施方案中，給予受試者抗LAG-3抗體以及抗F1D-1抗體。在另一實(shí)施方案中，給予受試者抗LAG-3抗體以及抗I3D-Ll抗體。在另一實(shí)施方案中，給予受試者抗LAG-3抗體以及抗CTLA-4抗體。在一實(shí)施方案中，抗LAG-3抗體系人類(lèi)抗體，如本披露的抗體?？商娲?，該抗LAG-3抗體可以是例如嵌合或人源化抗體。在另一實(shí)施方案中，至少一種另外的免疫刺激性抗體(例如，抗ro-Ι、抗ro-Ll和/或抗CTLA-4抗體)系人類(lèi)抗體?？商娲兀辽僖环N另外的免疫刺激性抗體可以是例如嵌合或人源化抗體。
[0060]又在另一方面中，本發(fā)明涉及制備抗LAG-3抗體的方法。該方法包括:
[0061](a)提供:(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，包括選自下組的⑶Rl序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID N0:1至6，選自下組的CDR2序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO:7至12，和/或選自下組的⑶R3序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO: 13至14、GGYU6至18 ;和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，包括選自下組的⑶Rl序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID N0:19至24，選自下組的⑶R2序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO:25至30，和/或選自下組的⑶R3序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO:31 至 36 ；
[0062](b)改變?cè)谥劓溈勺儏^(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基，以產(chǎn)生至少一種被改變之抗體序列；并且
[0063](C)將被改變之抗體序列表達(dá)成蛋白質(zhì)。
[0064]從以下詳細(xì)的說(shuō)明以及實(shí)施例中本披露的其它特征及優(yōu)點(diǎn)將是清楚的，該等說(shuō)明與實(shí)施例不得被解釋為限制性的。本申請(qǐng)全文引用的所有參考文獻(xiàn)、Genbank條目、專(zhuān)利、以及已公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容都明確地藉由引用結(jié)合在此。
[0065]附圖簡(jiǎn)述
[0066]圖1A示出了 25F7人類(lèi)單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:49)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:37)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:1)、CDR2 (SEQ ID N0:7)、以及CDR3 (SEQ ID NO: 13)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來(lái)源。
[0067]圖1B示出了 25F7人類(lèi)單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:55)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:43)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:19)、CDR2 (SEQ ID N0:25)、以及CDR3 (SEQ ID NO:31)區(qū)，并指明了 V與J的種系來(lái)源。
[0068]圖2A示出了 26H10人類(lèi)單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:50)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:38)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:2)、CDR2 (SEQ ID N0:8)、以及CDR3 (SEQ ID NO: 14)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來(lái)源。
[0069]圖2B示出了 26H10人類(lèi)單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO:56)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:44)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:20)、CDR2 (SEQ ID勵(lì):26)、以及0)1?3 (SEQ ID NO:32)區(qū)，并指明了 V與J的種系來(lái)源。
[0070]圖3A示出了 25E3人類(lèi)單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:51)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:39)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:3)、CDR2 (SEQ ID N0:9)、以及⑶R3區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來(lái)源。
[0071]圖3B示出了 25E3人類(lèi)單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:57)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:45)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:21)、CDR2 (SEQ ID N0:27)、以及CDR3 (SEQ ID NO:33)區(qū)，并指明了 V與J的種系來(lái)源。
[0072]圖4A示 出了 8B7人類(lèi)單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO: 52)以及氨基酸序列(SEQ ID NO:40)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:4)、CDR2 (SEQ ID NO: 10)、以及CDR3 (SEQ ID NO: 16)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來(lái)源。
[0073]圖4B示出了 8B7人類(lèi)單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:58)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:46)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:22)、CDR2 (SEQ ID N0:28)、以及CDR3 (SEQ ID NO:34)區(qū)，并指明了 V與J的種系來(lái)源。
[0074]圖5A示出了 11F2人類(lèi)單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:53)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:41)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:5)、CDR2 (SEQ ID NO: 11)、以及CDR3 (SEQ ID NO: 17)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來(lái)源。
[0075]圖5B示出了 11F2人類(lèi)單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:59)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:47)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:23)、CDR2 (SEQ ID N0:29)、以及CDR3 (SEQ ID NO:35)區(qū)，并指明了 V與J的種系來(lái)源。
[0076]圖6A示出了 17E5人類(lèi)單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:54)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:42)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:6)、CDR2 (SEQ ID NO: 12)、以及CDR3 (SEQ ID NO: 18)區(qū)，并指明了 V、D、以及J的種系來(lái)源。
[0077]圖6B示出了 17E5人類(lèi)單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:60)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:48)。描繪了 CDRl (SEQ ID N0:24)、CDR2 (SEQ ID N0:30)、以及CDR3 (SEQ ID NO:36)區(qū)，并指明了 V與J的種系來(lái)源。
[0078]圖7示出了 25F7的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 37)與人類(lèi)種系VH4_34以及JH5b氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:61以及62)的比對(duì)。
[0079]圖8示出了 25F7的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)與人類(lèi)種系Vk L6以及JK2氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:63以及64)的比對(duì)。
[0080]圖9示出了 26H10的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 38)與人類(lèi)種系VH3_33以及JH6B氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:65以及66)的比對(duì)。
[0081]圖10示出了 26H10的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID N0:44)與人類(lèi)種系VkA27以及JK3氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:67以及68)的比對(duì)。
[0082]圖11示出了 25E3的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 39)與人類(lèi)種系VH3_20以及JH4b氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:69以及70)的比對(duì)。
[0083]圖12示出了 25E3的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO:45)與人類(lèi)種系Vk L18以及JK2氨基酸序列(分別是SEQ ID NO: 71以及64)的比對(duì)。
[0084]圖13示出了 8B7的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID N0:40)與人類(lèi)種系VH4_34以及JH5b氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:61以及62)的比對(duì)。
[0085]圖14示出了 8B7的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO:46)與人類(lèi)種系Vk L6以及JK4氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:63以及72)的比對(duì)。
[0086]圖15示出了 11F2的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)與人類(lèi)種系VH1_24以及JH4b氨基酸序列(分別是SEQ ID NO: 73以及70)的比對(duì)。
[0087]圖16示出了 11F2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)與人類(lèi)種系Vk L6以及JKl氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:63以及74)的比對(duì)。
[0088]圖17示出了 17E5的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 42)與人類(lèi)種系VH3_33以及2-2氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:65以及70)的比對(duì)。
[0089]圖18示出了 17E5的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID N0:48)與人類(lèi)種系Vk L6氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:63以及75)的比對(duì)。
[0090]圖19示出由猴類(lèi)LAG-3cDNA的克隆pa23_5(SEQ ID N0:93)編碼的蛋白質(zhì)序列與Genbank 存儲(chǔ)的恒河猴 LAG-3 蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO:94)(Genbank 登錄號(hào) ΧΜ_001108923)的比對(duì)。外環(huán)肽區(qū)以及跨膜結(jié)構(gòu)域標(biāo)有下劃線。在兩條序列之間的一處氨基酸差異(氨基酸位置419)以加粗強(qiáng)調(diào)。
[0091]發(fā)明詳述
[0092]本披露涉及分離的單克隆抗體，特別是人類(lèi)單克隆抗體，該等抗體結(jié)合人類(lèi)LAG-3并且具有所希望的功能特性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明之抗體來(lái)源于特定的重鏈和輕鏈種系序列和/或包含特定的結(jié)構(gòu)特征，例如包括特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本披露提供了分離的抗體、制備這種抗體的方法、包括這種抗體的免疫綴合物以及雙特異性分子以及包括本發(fā)明之抗體、免疫綴合物或雙特異性分子的藥物組合物。本披露還涉及使用該等抗體(例如檢測(cè)LAG-3蛋白)的多種方法，連同使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體(單獨(dú)或與其它免疫刺激性抗體組合)來(lái)刺激免疫反應(yīng)的多種方法。因此，本披露還提供了使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體來(lái)例如抑制腫瘤生長(zhǎng)或治療病毒感染的多種方法。
[0093]為了可以更容易地理解本披露，首先定義了某些術(shù)語(yǔ)。其它定義在整個(gè)詳細(xì)說(shuō)明中給出。
[0094]術(shù)語(yǔ)“LAG-3”指淋巴細(xì)胞活化基因3。術(shù)語(yǔ)“LAG-3”包括變體、同等型、同源物、直向同源物、以及旁系同源物。例如，在某些情況下，對(duì)人類(lèi)LAG-3蛋白特異之抗體可能與來(lái)自于非人類(lèi)的物種的LAG-3蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，對(duì)人類(lèi)LAG-3蛋白特異之抗體可能對(duì)人類(lèi)LAG-3蛋白完全特異，并且可能不表現(xiàn)出物種或其它類(lèi)型的交叉反應(yīng)性，或可能與來(lái)自某些其它物種但不是所有其它物種的LAG-3進(jìn)行交叉反應(yīng)(例如與猴類(lèi)LAG-3而非小鼠LAG-3進(jìn)行交叉反應(yīng))。術(shù)語(yǔ)“人類(lèi)LAG-3”指人類(lèi)序列LAG-3，如具有Genbank登錄號(hào)NP_002277的人類(lèi)LAG-3的完整氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“小鼠LAG-3”指小鼠序列LAG-3，如具有Genbank登錄號(hào)NP_032505的小鼠LAG-3的完整氨基酸序列。LAG-3在本領(lǐng)域還稱(chēng)作例如CD223。人類(lèi)LAG-3序列可通過(guò)具有例如保守的突變或在非保守區(qū)的突變而不同于Genbank登錄號(hào)NP_002277的人類(lèi)LAG-3，而LAG-3具有基本上與Genbank登錄號(hào)NP_002277的人類(lèi)LAG-3的生物功能相同的生物功能。例如，人類(lèi)LAG-3的一項(xiàng)生物功能系在LAG-3的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中具有一個(gè)表位,該表位被本披露的一種抗體特異性地結(jié)合或者人類(lèi)LAG-3的一項(xiàng)生物功能系與MHC II類(lèi)分子結(jié)合。
[0095]術(shù)語(yǔ)“猴類(lèi)LAG-3”旨在涵蓋由舊世界猴以及新世界猴所表達(dá)的LAG-3蛋白，包括但不限于獼猴L(fēng)AG-3以及恒河猴L(fēng)AG-3。猴類(lèi)LAG-3的一種代表性序列系在圖19以及SEQID NO: 85中示出的恒河猴L(fēng)AG-3氨基酸序列，它還被儲(chǔ)存為Genbank登錄號(hào)ΧΜ_001108923。猴類(lèi)LAG-3的另一種代表性序列系在圖19以及SEQ ID NO:84中示出的克隆pa23_5的可替代的恒河猴序列，如在實(shí)施例3A第3小節(jié)所說(shuō)明而被分離。當(dāng)與Genbank所存儲(chǔ)的序列比較時(shí)，這個(gè)可替代的恒河猴序列在位置419上顯示出一處單個(gè)氨基酸的差別。[0096]一種特定的人類(lèi)LAG-3序列與Genbank登錄號(hào)為NP_002277的人類(lèi)LAG-3在氨基酸序列上通常會(huì)有至少90%的同一性，并且包含多個(gè)氨基酸殘基，當(dāng)與其它物種(如鼠類(lèi))的LAG-3氨基酸序列相比時(shí)，該等氨基酸殘基將該氨基酸序列鑒定為是人源的。在某些情況下，一種人類(lèi)LAG-3與Genbank登錄號(hào)為NP_002277的LAG-3在氨基酸序列上可具有至少95%，或者甚至至少96%、97%、98%或99%的同一性。在某些實(shí)施方案中，與Genbank登錄號(hào)為NP_002277的LAG-3序列相比，一種人類(lèi)LAG-3序列會(huì)展示出不超過(guò)10個(gè)氨基酸差異。在某些實(shí)施方案中，與Genbank登錄號(hào)為NP_002277的LAG-3序列相比，該人類(lèi)LAG-3可展示出不超過(guò)5個(gè)，或者甚至不超過(guò)4、3、2或I個(gè)氨基酸差異。百分比同一性可以如在此處所說(shuō)明進(jìn)行確定。
[0097]術(shù)語(yǔ)“免疫反應(yīng)”指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、以及由以上細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子、以及補(bǔ)體)的作用，該作用導(dǎo)致對(duì)侵入性病原體、被病原體感染的細(xì)胞或組織、癌性細(xì)胞、或者在自身免疫或病理炎癥情況下的正常人類(lèi)細(xì)胞或組織的選擇性損害、破壞或?qū)⑺鼈儚娜梭w中清除。
[0098]“抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答”指由T細(xì)胞產(chǎn)生的應(yīng)答，該應(yīng)答產(chǎn)生于用對(duì)該T細(xì)胞特異的抗原對(duì)該T細(xì)胞的刺激。由T細(xì)胞在抗原特異性刺激時(shí)產(chǎn)生的反應(yīng)的非限制性實(shí)例包括增殖以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生(例如IL-2的產(chǎn)生)。
[0099]此處所指之術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整抗體以及它們的任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或它們的單鏈。完整抗體系包括由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈以及兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每一條重鏈均包括一個(gè)重鏈可變區(qū)(在此縮寫(xiě)為Vh)以及一個(gè)重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2、以及CH3構(gòu)成。每一條輕鏈均包括一個(gè)輕鏈可變區(qū)(在此縮寫(xiě)為以及一個(gè)輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個(gè)結(jié)構(gòu)域，(^ Vh以及\區(qū)可以進(jìn)一步被細(xì)分為多個(gè)高可變性區(qū)，被稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其間散布有更為保守的被稱(chēng)為框架區(qū)(FR)的多個(gè)區(qū)。每個(gè)Vh以及\均由三個(gè)CDR及四個(gè)FR構(gòu)成，按照以下順序從氨基端至羧基端排布:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該等抗體的恒定區(qū)能介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，該等宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)以及經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。
[0100]此處使用之術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱(chēng)為“抗體部分”)，是指抗體保留特異性結(jié)合抗原(例如LAG-3蛋白)的能力的一或多種片段。已發(fā)現(xiàn)抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”所涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括:(i)Fab片段，由'、VH、(^及ChI結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii)F(ab’)2片段，包括通過(guò)在鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fab’片段，它實(shí)質(zhì)上是帶有鉸鏈區(qū)部分的Fab (見(jiàn)，F(xiàn)UNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed.1993) ；(iv)由 Vh 及 ChI 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(V)由抗體的單臂的\及\結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(vi) dAb片段(Wardet al., (1989) Nature341:544-546),它由Vn結(jié)構(gòu)域構(gòu)成:(vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R);以及(viii)納米抗體(nanobody),含有單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域'和Vh系由多個(gè)分開(kāi)的基因進(jìn)行編碼的，但是使用重組方法藉由合成接頭可 以將它們連接起來(lái)，使它們形成單條蛋白鏈，其中 '和Vh區(qū)進(jìn)行配對(duì)形成單價(jià)分子(被稱(chēng)為單鏈Fv (scFv);參見(jiàn)例如Bird et al.(1988) Science242:423-426:以及 Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USAM: 5879-5883)。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”也旨在涵蓋此類(lèi)單鏈抗體。該等抗體片段系使用本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，并且對(duì)該等片段采用與完整抗體相同的方式進(jìn)行有用性篩選。
[0101]此處所使用之“分離之抗體”旨在表示如下的抗體，它基本上不含具備不同的抗原特異性的其它抗體(例如，特異性結(jié)合LAG-3蛋白的分離之抗體基本上不含特異性結(jié)合除LAG-3蛋白以外的抗原之抗體)。然而，特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3蛋白的分離之抗體對(duì)于其它抗原(如來(lái)自其它物種的LAG-3蛋白)可具有交叉反應(yīng)性。此外，分離之抗體可以基本上不含其它細(xì)胞材料和/或化學(xué)物。
[0102]此處使用之術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指具有單一分子組成之抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物展示了針對(duì)某一特定表位的單一結(jié)合特異性及親和力。
[0103]此處使用之術(shù)語(yǔ)“人類(lèi)抗體”旨在包括具有如下可變區(qū)之抗體，在該等可變區(qū)中，框架區(qū)及CDR區(qū)均衍生自人類(lèi)種系免疫蛋白序列。此外，如果該抗體包括恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也衍生自人類(lèi)種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人類(lèi)抗體可以包含不是由人類(lèi)種系免疫球蛋白序列所編碼的氨基酸殘基(例如，由體外隨機(jī)誘變或定點(diǎn)誘變引入的突變或藉由體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，在此所使用之術(shù)語(yǔ)“人類(lèi)抗體”并非旨在包括這樣之抗體，其中衍生自另外的哺乳動(dòng)物物種(如小鼠)的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人類(lèi)框架序列上。[0104]術(shù)語(yǔ)“人類(lèi)單克隆抗體”指展示出單一結(jié)合特異性之抗體，該等抗體具有如下可變區(qū)，其中框架區(qū)以及CDR區(qū)均衍生自人類(lèi)種系免疫球蛋白序列。在一實(shí)施方案中，人類(lèi)單克隆抗體系由雜交瘤產(chǎn)生的，該雜交瘤包括融合至永生化細(xì)胞的從轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)處獲得的B細(xì)胞，具有包括人類(lèi)重鏈轉(zhuǎn)基因及輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。
[0105]此處使用之術(shù)語(yǔ)“重組人類(lèi)抗體”包括藉由重組的手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生、或分離的所有人類(lèi)抗體，例如(a)從動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備出的雜交瘤(以下將進(jìn)一步說(shuō)明)中分離之抗體，該動(dòng)物對(duì)于人類(lèi)免疫球蛋白基因系轉(zhuǎn)基因性的或轉(zhuǎn)染色體性的、(b)從被轉(zhuǎn)化以表達(dá)人類(lèi)抗體的宿主細(xì)胞(例如，從轉(zhuǎn)染瘤)中分離之抗體、(C)從重組的組合的人類(lèi)抗體文庫(kù)中分離之抗體、以及(d)藉由任何其它方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離之抗體，該等方法涉及將人類(lèi)免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列上。此類(lèi)重組的人類(lèi)抗體具有如下可變區(qū)，其中框架區(qū)及CDR區(qū)均衍生自人類(lèi)種系免疫球蛋白序列。然而，在某些實(shí)施方案中，此類(lèi)重組的人類(lèi)抗體能經(jīng)受體外誘變(或者，當(dāng)使用對(duì)于人類(lèi)Ig序列而言轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，經(jīng)受體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且因此，重組抗體的Vh和 '區(qū)的氨基酸序列系這樣的序列，該等序列也許并不自然地存在于體內(nèi)的人類(lèi)抗體種系全集之中，盡管該等序列衍生自人類(lèi)種系的Vh和Vl序列及與其相關(guān)。
[0106]術(shù)語(yǔ)“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因進(jìn)行編碼之抗體的種類(lèi)(例如IgM或IgGl)。
[0107]短語(yǔ)“識(shí)別抗原的抗體”以及“對(duì)抗原特異的抗體”此處可以與術(shù)語(yǔ)“特異地結(jié)合抗原的抗體”互換使用。
[0108]術(shù)語(yǔ)“人類(lèi)抗體衍生物”指人類(lèi)抗體的任何已修飾的形式，例如，該抗體與另一試劑或抗體的綴合物。
[0109]術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”旨在表示以下抗體，其中衍生自另一哺乳動(dòng)物物種(如小鼠)的種系的CDR序列已被移植到人類(lèi)框架序列上?？梢栽谌祟?lèi)框架序列中進(jìn)行另外的框架區(qū)修飾。
[0110]術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”旨在表示以下抗體，其中可變區(qū)序列系衍生于一物種而恒定區(qū)序列系衍生于另一物種，例如如下抗體，其中可變區(qū)序列衍生于小鼠抗體而恒定區(qū)序列衍生于人類(lèi)抗體。
[0111]在此所使用“特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3”之抗體意指如下抗體，它結(jié)合人類(lèi)LAG-3蛋白(并且可能是來(lái)自一或多種非人類(lèi)物種的LAG-3蛋白)，但基本上不結(jié)合非LAG-3蛋白。較佳的是，該抗體以“高親和力”(也就是以1x10_7M或更小的Kd)結(jié)合人類(lèi)LAG-3蛋白，更佳地為5χ10-8Μ或更小，更佳地為3χ10-8Μ或更小，更佳地為IxKT8M或更小，更佳地為5xl(T9M或更小，或甚至更佳地為1χ10_9Μ或更小。
[0112]此處使用之術(shù)語(yǔ)“基本上不結(jié)合”蛋白質(zhì)或細(xì)胞是指不結(jié)合或不以高親和力結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞，即，以1χ10_6Μ或更大，更佳地為1χ10_5Μ或更大，更佳地為1χ10_4Μ或更大，更佳地為1χ10_3Μ或更大，甚至更佳地為1χ10_2Μ或更大的Kd結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞。
[0113]此處使用之術(shù)語(yǔ)“Kass。。”或“Ka”旨在表示特定之抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而此處使用之術(shù)語(yǔ)“Kdis”或“Kd，”旨在表示特定之抗體-抗原相互作用的解離速率。此處使用之術(shù)語(yǔ)“KD，”旨在表示解離常數(shù)，它系由Kd與Ka之比卿Kd/Ka)得到，并被表示為摩爾濃度(M)。抗體的Kd值可以使用本領(lǐng)域已經(jīng)充分確認(rèn)的方法進(jìn)行確定。確定抗體的Kd的一較佳方法系藉由使用表面等離子共振，較佳地是使用例如Biawwew系統(tǒng)的生物傳感器系統(tǒng)。 [0114]術(shù)語(yǔ)IgG抗體的“高親和力”是指對(duì)于靶抗原而言抗體具有的Kd為I X IO-7M或更小，更佳地為5X 10_8M或更小，甚至更佳地為I X 10_8M或更小，甚至更佳地為5X 10_9M或更小，并且甚至更佳地為1x10_9M或更小。然而，對(duì)于其它抗體同種型而言，“高親和力”結(jié)合可以發(fā)生變化。例如，對(duì)于IgM同種型而言，“高親和力”結(jié)合是指抗體具有的Kd為10_6M或更小，更佳地為10_7M或更小，甚至更佳地為10_8M或更小。
[0115]術(shù)語(yǔ)“受試者”包括任何人類(lèi)或非人類(lèi)動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“非人類(lèi)動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物及非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類(lèi)、綿羊、犬、貓、牛、馬、雞、兩棲動(dòng)物、以及爬行動(dòng)物，盡管哺乳動(dòng)物系較佳的，如非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)、綿羊、犬、貓、牛、以及馬。
[0116]在以下各分部中進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明了本發(fā)明的不同方面。
[0117]具有特定功能特性的抗LAG-3抗體
[0118]本發(fā)明抗體之特征為抗體特定的功能性特征或特性。例如，該等抗體與人類(lèi)LAG-3特異地結(jié)合，并且可與來(lái)自某些其它物種的LAG-3相結(jié)合，例如猴類(lèi)LAG-3 (例如獼猴、恒河猴)，但是基本上不與來(lái)自某些其它物種的LAG-3 (例如小鼠LAG-3)相結(jié)合。較佳的是，本發(fā)明之抗體以高親和力與人類(lèi)LAG-3相結(jié)合。
[0119]該抗體刺激免疫反應(yīng)(如抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答)的能力可藉由(例如)該抗體在抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答中刺激白介素2 (IL-2)的產(chǎn)生來(lái)說(shuō)明。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與人類(lèi)LAG-3結(jié)合并且表現(xiàn)出刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與人類(lèi)LAG-3結(jié)合但并不表現(xiàn)出刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力。評(píng)估抗體刺激免疫反應(yīng)的能力的其它手段包括該抗體(如在體內(nèi)腫瘤移植物模型中)抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力(參見(jiàn)，例如實(shí)施例6)或該抗體刺激自身免疫反應(yīng)的能力，例如在自身免疫模型中促進(jìn)自身免疫疾病的發(fā)生的能力，例如在NOD小鼠模型中促進(jìn)糖尿病的發(fā)生的能力(參見(jiàn)，例如實(shí)施例7)。
[0120]本發(fā)明之抗體與LAG-3的結(jié)合可用本領(lǐng)域已充分確認(rèn)的一或多種技術(shù)進(jìn)行評(píng)估。例如，在一較佳的實(shí)施方案中，抗體可用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)試，其中該抗體與表達(dá)人類(lèi)LAG-3的細(xì)胞系進(jìn)行反應(yīng)，例如已經(jīng)被轉(zhuǎn)染而能在它們的細(xì)胞表面表達(dá)LAG-3(例如人類(lèi)LAG-3、猴類(lèi)LAG-3 (例如，恒河猴或獼猴)或小鼠LAG-3)的CHO細(xì)胞(參見(jiàn)，例如實(shí)施例3A中適宜的測(cè)定)。在流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定中使用的其它適宜的細(xì)胞包括表達(dá)天然LAG-3的由抗CD3刺激的CD4+活化的T細(xì)胞。另外地或可替代地，抗體的結(jié)合，包括結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如Kd值)可在BIAcore結(jié)合測(cè)定中進(jìn)行測(cè)試(參見(jiàn)，例如實(shí)施例3B中適宜的測(cè)定)。還有其它適宜的結(jié)合測(cè)定包括ELISA測(cè)定，例如使用重組的LAG-3蛋白(參見(jiàn)，例如實(shí)施例1中適宜的測(cè)定)。
[0121]較佳的是，本發(fā)明之抗體以5xlO_8M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以2xlO_8M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以5x10_9M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以4xlO_9M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以3x10_9M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以2xlO_9M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以1x10_9M或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，以δχ10,Μ或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合，或1χ10,Μ或更小的Kd與LAG-3蛋白結(jié)合。
[0122]典型地，本發(fā)明的抗體與淋巴樣組織(如扁桃體、脾臟或胸腺)中的LAG-3相結(jié)合，這可藉由免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。另外地，如在實(shí)施例8中進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的某些抗LAG-3抗體如藉由免疫組織化學(xué)法所測(cè)量使垂體組織染色(例如，被保留在垂體中)，而本發(fā)明的其它抗LAG-3抗體如藉由免疫組織化學(xué)法所測(cè)量不使垂體組織染色(例如，不被保留在垂體中)。因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藉由免疫組織化學(xué)法使垂體組織染色的人類(lèi)抗LAG-3抗體，而在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藉由免疫組織化學(xué)法不使垂體組織染色的人類(lèi)抗LAG-3抗體。
[0123]本發(fā)明較佳之抗體系人類(lèi)單克隆抗體。另外地或可替代地，該抗體可以是(例如)嵌合或人源化單克隆抗體。
[0124]單克降杭體25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5
[0125]較佳的本發(fā)明之抗體系如在實(shí)施例1和2中所說(shuō)明進(jìn)行分離以及結(jié)構(gòu)表征的人類(lèi)單克隆抗體 25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5的 Vh 氨基酸序列分別示于 SEQ ID N0:37 至 42 中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5的Vk氨基酸序列分別示于SEQ ID NO:43至48中。
[0126]考慮到該等抗體中的每一種均可結(jié)合人類(lèi)LAG-3，可將V1^P '序列進(jìn)行“混合并匹配”以產(chǎn)生本發(fā)明的其它抗LAG-3結(jié)合分子。較佳的是，當(dāng)V1^P '鏈被混合并匹配時(shí)，來(lái)自特定VH/VL對(duì)的Vh序列被結(jié)構(gòu)相似的Vh序列代替。同樣地，較佳的是來(lái)自特定/\對(duì)的Vl序列被結(jié)構(gòu)相似的\序列代替。
[0127]因此，一方面，本披露提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括:
[0128](a)重鏈可變區(qū)，包括一條氨基酸序列，該氨基酸序列選自下組，其構(gòu)成為:SEQ IDNO: 37至42 ;以及
[0129](b)輕鏈可變區(qū)，包括一條氨基酸序列，該氨基酸序列選自下組，其構(gòu)成為:SEQ IDNO:43 至 48 ；
[0130]其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。[0131]較佳的重鏈及輕鏈組合包括:
[0132](a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:37，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:43 ；
[0133](b)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:38，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:44 ；
[0134](C)重鏈可變區(qū),包括氨基酸序列SEQ ID NO:39,以及輕鏈可變區(qū),包括氨基酸序列 SEQ ID NO:45 ；
[0135](d)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:40，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:46 ；
[0136](e)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID N0:41，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:47 ;或者
[0137](f)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO:42，以及輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列 SEQ ID NO:48。
[0138]在另一方面，本披露提供了多種抗體，該等抗體包括25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的重鏈及輕鏈的CDRl、CDR2及CDR3，或它們的組合。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及 17E5的VH CDRl 的氨基酸序列分別示于 SEQ ID N0:37 至 42 中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的Vh CDR2的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO:43至48中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的Vh CDR3的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO: 13至14、GGY以及16至18中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的Vk CDRl的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO: 19 至 24 中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5的VK CDR2 的氨基酸序列示于 SEQ ID NO:25 至 30 中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5 的 Vk CDR3 的氨基酸序列分別示于SEQ ID N0:31至36中。CDR區(qū)系用Kabat系統(tǒng)繪出的(Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department ofHealth and Human Services, NIH Publication N0.91-3242)。
[0139]在該等抗體中每一種均能結(jié)合人類(lèi)LAG-3、并且抗原結(jié)合特異性主要由⑶Rl、CDR2、及CDR3區(qū)提供的條件下，Vh CDRl、CDR2、以及CDR3序列與\ CDRl、CDR2、以及CDR3序列可以被“混合并匹配”(即，來(lái)自不同抗體的CDR可以被混合并匹配，盡管每種抗體均必須包含Vh⑶R1、⑶R2、以及⑶R3以及\⑶R1、⑶R2，以及⑶R3)，以產(chǎn)生本發(fā)明的其它抗LAG-3結(jié)合分子。使用以上所說(shuō)明及實(shí)例中的結(jié)合測(cè)定(例如，ELISA、:BiacweK分析)可以測(cè)試此類(lèi)“混合并匹配”之抗體的LAG-3結(jié)合。較佳的是，當(dāng)Vh⑶R序列被混合并匹配時(shí)，來(lái)自特定Vh序列的CDRl、CDR2和/或CDR3序列被結(jié)構(gòu)上相似的一或多種CDR序列代替。類(lèi)似地，當(dāng)Vl⑶R序列被混合并匹配時(shí)，來(lái)自特定Vl序列的⑶Rl XDR2和/或⑶R3序列較佳的是被結(jié)構(gòu)上相似的一或多種CDR序列代替。對(duì)于普通技術(shù)人員非常清楚的是，藉由用來(lái)自在此披露的單克隆抗體25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的CDR序列的結(jié)構(gòu)類(lèi)似序列代替一或多個(gè)Vh和/或\ CDR區(qū)序列可以產(chǎn)生新穎的Vh以及\序列。
[0140]因此，在另一方面，本披露提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括:
[0141](a)重鏈可變區(qū)⑶R1，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO:1至6 ；
[0142](b)重鏈可變區(qū)⑶R2，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO: 7至12 ；
[0143](c)重鏈可變區(qū)⑶R3，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO: 13至14、GGY以及16至18 ;
[0144](d)輕鏈可變區(qū)⑶R1，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO: 19至24 ；
[0145](e)輕鏈可變區(qū)⑶R2，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO:25至30 ;以及
[0146](f)輕鏈可變區(qū)⑶R3，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID N0:31至36 ；
[0147]其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。
[0148]在一較佳的實(shí)施方案中，該抗體包括:
[0149](a)重鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO:1 ；
[0150](b)重鏈可變區(qū) CDR2，包括 SEQ ID NO:7 ； [0151](c)重鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO: 13 ；
[0152](d)輕鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO: 19 ；
[0153](e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO: 25 ;以及
[0154](f)輕鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID N0:31。
[0155]在另一較佳的實(shí)施方案中，該抗體包括:
[0156](a)重鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO:2 ；
[0157](b)重鏈可變區(qū) CDR2，包括 SEQ ID N0:8 ；
[0158](c)重鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO: 14 ；
[0159](d)輕鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO:20 ；
[0160](e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO: 26 ;以及
[0161](f)輕鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO:32。
[0162]在另一較佳的實(shí)施方案中，該抗體包括:
[0163](a)重鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO:3 ；
[0164](b)重鏈可變區(qū) CDR2，包括 SEQ ID N0:9 ；
[0165](c)重鏈可變區(qū)⑶R3，包括GGY ；
[0166](d)輕鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO:21 ；
[0167](e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID N0:27;以及
[0168](f)輕鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID N0:33。
[0169]在另一較佳的實(shí)施方案中，該抗體包括:
[0170](a)重鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO: 4 ;
[0171](b)重鏈可變區(qū) CDR2，包括 SEQ ID NO: 10 ；
[0172](c)重鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO: 16 ；
[0173](d)輕鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO:22 ；
[0174](e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO: 28 ;以及
[0175](f)輕鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID N0:34。
[0176]在另一較佳的實(shí)施方案中，該抗體包括:[0177](a)重鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO:5 ；
[0178](b)重鏈可變區(qū) CDR2，包括 SEQ ID NO: 11 ；
[0179](c)重鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO: 17 ；
[0180](d)輕鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO:23 ；
[0181](e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID N0:29;以及
[0182](f)輕鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID N0:35。
[0183]在另一較佳的實(shí)施方案中，該抗體包括:
[0184](a)重鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID N0:6 ；
[0185](b)重鏈可變區(qū) CDR2，包括 SEQ ID NO: 12 ；[0186](c)重鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID NO: 18 ；
[0187](d)輕鏈可變區(qū) CDRl，包括 SEQ ID NO:24 ；
[0188](e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO: 30 ;以及
[0189](f)輕鏈可變區(qū) CDR3，包括 SEQ ID N0:36。
[0190]在本領(lǐng)域中熟知的是，⑶R3結(jié)構(gòu)域，獨(dú)立于⑶Rl和/或⑶R2域，可以單獨(dú)確定抗體對(duì)關(guān)聯(lián)抗原的結(jié)合特異性，并且可預(yù)測(cè)地產(chǎn)生多種抗體，該等抗體具有基于共同的⑶R3序列的相同的結(jié)合特異性。參見(jiàn)，例如Klimka et al.，British J.0fCancer83 (2): 252-260 (2000) ；Beiboer et al., J.Mol.Biol.2%: 833-849 (2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.迎:8910-8915 (1998) ；Barbas etal., J.Am.Chem.Soc.116: 2161-2162 (1994) ；Barbas et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.92:2529-2533 (1995) ；Ditzel et al..T.1mmunol.157:739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal旦:Scientific Review8(2001) ；Igarashi et al.,J.Biochem(Tokyo) 117:452-7(1995) !Bourgeois et al., J.Virol72:807-10 (1998) ；Leviet al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.90:4374-8 (1993) ；Polymenis and Stol ler, J.1mmunol.152:5218-5329(1994)及Xu and Davis, Immunityl3:37-45 (2000)。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，951，646 ;6，914，128 ;6，090，382 ;6，818，216 ;6，156，313 ;6，827，925 ;5，833，943 ；5，762，905以及5，760，185。該等參考文獻(xiàn)中每一篇的全文均藉由引用由此結(jié)合。
[0191]因此，本披露提供的單克隆抗體包括來(lái)自如下抗體的一或多個(gè)重鏈和/或輕鏈CDR3域，該抗體衍生自人類(lèi)或非人類(lèi)動(dòng)物，其中該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在某些方面，本披露提供的單克隆抗體包括來(lái)自非人類(lèi)抗體(如小鼠或大鼠抗體)的一或多個(gè)重鏈和/或輕鏈CDR3域，其中該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合LAG-3。在一些實(shí)施方案中，此類(lèi)創(chuàng)造性之抗體包括來(lái)自非人類(lèi)抗體的一或多個(gè)重鏈和/或輕鏈CDR3域，與相應(yīng)的親本的非人類(lèi)抗體比較，(a)能與其競(jìng)爭(zhēng)而進(jìn)行結(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合到相同的表位；和/或(d)具有相似的結(jié)合親和力。
[0192]在其它方面，本披露提供的單克隆抗體包括來(lái)自人類(lèi)抗體(例如，獲自非人類(lèi)動(dòng)物的人類(lèi)抗體)的一或多個(gè)重鏈和/或輕鏈CDR3域，其中該人類(lèi)抗體能夠特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在其它方面，本披露提供的單克隆抗體包括來(lái)自第一人類(lèi)抗體(例如獲自非人類(lèi)動(dòng)物的人類(lèi)抗體)的一或多個(gè)重鏈和/或輕鏈CDR3域，其中該第一人類(lèi)抗體能夠特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3，并且其中來(lái)自該第一人類(lèi)抗體的CDR3域替換在缺乏針對(duì)LAG-3的結(jié)合特異性的人類(lèi)抗體中的CDR3域，以產(chǎn)生能特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3的第二人類(lèi)抗體。在一些實(shí)施方案中，此類(lèi)創(chuàng)造性之抗體包括來(lái)自該第一人類(lèi)抗體的一或多個(gè)重鏈和/或輕鏈CDR3域，與相應(yīng)的親本的第一人類(lèi)抗體相比較，(a)能與其競(jìng)爭(zhēng)而進(jìn)行結(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合到相同的表位；和/或(d)具有相似的結(jié)合親和力。
[0193]具有特定種系序列之抗體
[0194]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明之抗體包括來(lái)自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來(lái)自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。
[0195]例如，在一較佳的實(shí)施方案中，本披露提供分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部位，包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vh3-20基因、人類(lèi)Vh4-34基因、人類(lèi)Vh3-33基因或人類(lèi)Vh1-24基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在另一較佳的實(shí)施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L18基因、人類(lèi)Vk L6基因或人類(lèi)Vk A27基因的產(chǎn)物或是衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在又一較佳的實(shí)施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vh3-20基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L18基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在又一較佳的實(shí)施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)VH4-34基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在又一較佳的實(shí)施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vh3-33基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)乂!^ A27基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在又一較佳的實(shí)施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vh1-24基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。在又一較佳的實(shí)施方案中，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vh3-33基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，并包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L6基因的產(chǎn)物或衍生于該基因，其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)LAG-3。
[0196]此類(lèi)抗體還可以擁有一或多項(xiàng)以上詳細(xì)說(shuō)明的功能特征，例如高親和力與人類(lèi)LAG-3結(jié)合、與猴類(lèi)LAG-3結(jié)合、缺乏與小鼠LAG-3的結(jié)合、抑制LAG-3與MHC II類(lèi)分子結(jié)合的能力、和/或刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力。
[0197]分別具有￥113_20及￥1? L18的Vh及Vl之抗體的實(shí)例系25E3抗體。分別具有乂^^斗及Vk L6的Vh及\之抗體的實(shí)例系25F7抗體以及8B7抗體。分別具有VH3_33及Vk A27的Vh及\之抗體的實(shí)例系26H10抗體。分別具有Vh1-24及Vk L6的Vh及\之抗體的實(shí)例系11F2抗體。分別具有Vh3-33及Vk L6的Vh及\之抗體的實(shí)例系17E5抗體。
[0198]如在此所用，如果人類(lèi)抗體的可變區(qū)從使用特定人類(lèi)種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得，則該抗體包含如下重鏈或輕鏈可變區(qū)，該等可變區(qū)系該種系序列的“產(chǎn)物”或者“衍生于”該種系序列。此類(lèi)系統(tǒng)包括用所感興趣的抗原對(duì)攜帶人類(lèi)免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫，或 者用所感興趣的抗原對(duì)在噬菌體上進(jìn)行展示的人類(lèi)免疫球蛋白基因文庫(kù)進(jìn)行篩選。人類(lèi)抗體系人類(lèi)種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或“衍生于”該序列，藉由將該人類(lèi)抗體的氨基酸序列與人類(lèi)種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，并選擇在序列上最接近(即最大％同一性)該人類(lèi)抗體的序列的人類(lèi)種系免疫球蛋白序列，就可以將該人類(lèi)抗體鑒定為是此類(lèi)抗體。人類(lèi)抗體系特定的人類(lèi)種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或“衍生于”該序列，與該種系序列相比，該人類(lèi)抗體可含有氨基酸差異，由于例如自然發(fā)生的體細(xì)胞突變或故意引入的定點(diǎn)突變。然而，經(jīng)定的人類(lèi)抗體典型地與由人類(lèi)種系免疫球蛋白基因進(jìn)行編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90%的同一性，并且當(dāng)與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠類(lèi)種系序列)進(jìn)行比較時(shí)，該選定的人類(lèi)抗體包含將該人類(lèi)抗體鑒定為人類(lèi)的氨基酸殘基。在某些情況中，人類(lèi)抗體與由該種系免疫球蛋白基因進(jìn)行編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上可具有至少95%、或甚至至少96%、97%、98%，或99%的同一性。典型地，與由特定的人類(lèi)種系免疫球蛋白基因進(jìn)行編碼的氨基酸序列相比，衍生于該人類(lèi)種系序列的人類(lèi)抗體會(huì)展示不超過(guò)10處氨基酸差異。在某些情況中，與由該種系免疫球蛋白基因進(jìn)行編碼的氨基酸序列相比，該人類(lèi)抗體可以展示出不超過(guò)5處，或甚至不超過(guò)4處、3處、2處，或I處氨基酸差異。
[0199]同源杭體
[0200]在又另一實(shí)施方案中，本發(fā)明之抗體包括含有與此處說(shuō)明的較佳抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及輕鏈可變區(qū)，并且其中該抗體保留本發(fā)明的抗LAG-3抗體的所希望的功能特性。例如，本披露提供了分離的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合部分，包括重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，其中:
[0201](a)該重鏈可變區(qū)包括氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的同源性，該組的構(gòu)成為SEQ ID NO: 37至42 ；
[0202](b)該輕鏈可變區(qū)包括氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的同源性，該組的構(gòu)成系:SEQ ID NO:43至48 ;以及
[0203](c)該抗體特異性地結(jié)合人類(lèi)LAG-3。
[0204]另外地或可替代地，該抗體還可以擁有一或多項(xiàng)以上所討論的以下功能特性，例如高親和力與人類(lèi)LAG-3結(jié)合、與猴類(lèi)LAG-3結(jié)合、缺乏與小鼠LAG-3的結(jié)合、抑制LAG-3與MHC II類(lèi)分子結(jié)合的能力、和/或刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力。
[0205]在不同的實(shí)施方案中，該抗體可以是(例如)人類(lèi)抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
[0206]在其它實(shí)施方案中，Vh和/或'氨基酸序列可與以上給出的序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。與以上給出的序列的Vh與\區(qū)具有高(即，80%或更大)同源性的Vh與\區(qū)之抗體，可以藉由以下方式獲得:對(duì)編碼SEQ ID NO:49至54或55至60的核酸分子進(jìn)行誘變(例如，定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)，接著使用在此說(shuō)明的功能測(cè)定針對(duì)保留的功能(即，以上所給出的功能)測(cè)試所編碼的經(jīng)改變之抗體。
[0207]如在此所使用，兩條氨基酸序列之間的百分比同源性等同于兩條序列之間的百分比同一性。在這兩條序列之間的百分比同一性系該等序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同源性=相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)目xlOO)，考慮到缺口(gap)的數(shù)目、以及每個(gè)缺口的長(zhǎng)度，需要將它們引入用于這兩條序列的最佳比對(duì)。正如在以下的非限制性實(shí)例中說(shuō)明，使用數(shù)學(xué)算法可以完成兩條序列之間的序列比較以及百分比同一性的確定。
[0208]使用已經(jīng)被整合至ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller (Comput.Appl.Biosc1., 4:11-17 (1988))的算法，使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長(zhǎng)度罰分為12以及缺口罰分為4，可以確定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同一性。此外，使用已經(jīng)被整合至GCG軟件包(可在WWW.gcg.com上獲得)中的GAP程序里的Needleman和Wunsch (J.Mol.Biol.M: 444-453 (1970))的算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及缺口權(quán)重16、14、12、10、8、6、或4以及長(zhǎng)度權(quán)重1、2、3、4、5、或6，可以確定兩條氨基酸序列之間的百分比同一I"生。
[0209]另外地或者可替代地，本披露的蛋白質(zhì)序列可以作為“查詢(xún)序列”進(jìn)一步被使用，對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，例如來(lái)鑒定相關(guān)序列。使用Altschul，et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)可以進(jìn)行此類(lèi)檢索。BLAST蛋白質(zhì)檢索可采用XBLAST程序，記分=50，字長(zhǎng)=3而進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明之抗體分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的缺口比對(duì)，可如在Altschul et al., (1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402中所說(shuō)明地使用帶缺口的BLAST。當(dāng)使用BLAST及帶缺口的BLAST程序時(shí)，對(duì)應(yīng)的程序(例如XBLAST及NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)系有用的。見(jiàn)mm.ncb1.nlm.nih.gov ο
[0210]具有保守性修飾之抗體
[0211]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明之抗體包括含有⑶R1XDR2及⑶R3序列的重鏈可變區(qū)以及含有CDRl、CDR2及CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中該等CDR序列中的一或多個(gè)包括基于在此所說(shuō)明的較佳抗體(例如，25F7、26H10、25E3、8B7、11F2、17E5)的限定的氨基酸序列、或它們的保守性修飾，并且其中所述抗體保留了本發(fā)明的抗LAG-3抗體的所希望的功能特性。在本領(lǐng)域中所理解的是，可以進(jìn)行某些保守性序列修飾，該等保守性序列修飾并不去除抗原結(jié)合。參見(jiàn)，例如Brummell et al.(1993)Biochem32:1180-8 ；de Wildt et al.(1997)Prot.Eng.10:835-41:Komissarov et al.(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870 ；Hall etal.(1992)J.1mmunol.149:1605-12 ；Kelley and 0’ Connell (1993)Biochem.32:6862-35:Adib-Conquy et al.(1998) Int.1mmunol.10:341-6 以及 Beers et al.(2000) Clin.Can.Res.2835-43。因此，本披露提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，包括含有⑶R1、⑶R2、以及⑶R3序列的重鏈可變區(qū)以及含有⑶R1、⑶R2、以及⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中:
[0212](a)該重鏈可變區(qū)CDR3序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:氨基酸序列SEQ ID NO: 13至14、GGY、以及16至18，以及它們的保守性修飾；
[0213](b)該輕鏈可變區(qū)CDR3序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:氨基酸序列SEQ ID NO: 31至36，以及它們的保守性修飾；以及
[0214](c)該抗體特異性地結(jié)合人類(lèi)LAG-3。
[0215]另外地或可替代地，該抗體還可以擁有以上所說(shuō)明的以下功能特性中的一或多項(xiàng)，例如高親和力與人類(lèi)LAG-3結(jié)合、與猴類(lèi)LAG-3結(jié)合、缺乏與小鼠LAG-3的結(jié)合、抑制LAG-3與MHC II類(lèi)分子結(jié)合的能力和/或刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力。
[0216] 在一較佳的實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)⑶R2序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:氨基酸序列SEQ ID No:7至12，以及它們的保守性修飾；并且該輕鏈可變區(qū)⑶R2序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:氨基酸序列SEQ ID No: 25至30，以及它們的保守性修飾。在另一較佳的實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)CDRl序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:氨基酸序列SEQ ID No:1至6，以及它們的保守性修飾；并且該輕鏈可變區(qū)CDRl序列包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:氨基酸序列SEQ IDNo: 19至24，以及它們的保守性修飾。
[0217]在不同的實(shí)施方案中，該抗體可以是例如人類(lèi)抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
[0218]如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“保守性修飾”旨在表示氨基酸修飾，該等修飾不顯著影響或改變包含該氨基酸序列之抗體的結(jié)合特征。此類(lèi)保守性修飾包括氨基酸的替代、插入、以及刪除。修飾可藉由本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如，定點(diǎn)誘變以及PCR介導(dǎo)的誘變)被引入本發(fā)明之抗體中。保守性氨基酸替代系以下該等替代，其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。該等家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，以及具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在本發(fā)明之抗體的CDR區(qū)中的一或多個(gè)氨基酸殘基可以被來(lái)自相同側(cè)鏈家族的其它氨基酸殘基所替換，并且使用在此說(shuō)明的功能測(cè)定可以針對(duì)保留的功能(即，以上給出的功能)測(cè)試被改變之抗體。
[0219]與抗LAG-3抗體結(jié)合到相同的表位上之抗體
[0220]在另一實(shí)施方案中，本披露提供了如下抗體，它們?cè)贚AG-3上所結(jié)合的表位與本發(fā)明的抗LAG-3單克隆抗體中的任何抗體在LAG-3上所結(jié)合的表位相同(B卩，該等抗體有能力與本發(fā)明的該等單克隆抗體中的任何抗體進(jìn)行交叉競(jìng)爭(zhēng)而與人類(lèi)LAG-3相結(jié)合)。在較佳的實(shí)施方案中，用于交叉競(jìng)爭(zhēng)研究的參考抗體可以是單克隆抗體25F7、26Η10、25Ε3、8Β7、11F2 或 17Ε5。
[0221] 此類(lèi)交叉競(jìng)爭(zhēng)之抗體可基于它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)LAG-3結(jié)合測(cè)定中與25F7、26H10、25E3、8B7、11F2和/或17E5交叉競(jìng)爭(zhēng)的能力被鑒定。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定，其中將重組的人類(lèi)LAG-3蛋白固定在板上，該等抗體之一用熒光進(jìn)行了標(biāo)記，并且評(píng)價(jià)了未被標(biāo)記之抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)使被標(biāo)記之抗體脫離結(jié)合(off the binding)的能力。另外地或可替代地,也可以使用BIAcore分析來(lái)評(píng)價(jià)抗體的交叉競(jìng)爭(zhēng)的能力。測(cè)試抗體抑制(例如)25F7、26H10、25E3、8B7、11F2和/或17E5與人類(lèi)LAG-3相結(jié)合的能力證明該測(cè)試抗體能與25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 和 / 或 17E5 競(jìng)爭(zhēng)而結(jié)合人類(lèi) LAG-3，并因此與 25F7、26H10、25E3、8B7、11F2和/或17E —樣結(jié)合人類(lèi)LAG-3上的相同表位。在一較佳的實(shí)施方案中，與25F7、26H10、25E3、8B7、11F2和/或17E5 —樣結(jié)合人類(lèi)LAG-3上的相同表位之抗體系一人類(lèi)單克隆抗體。如在實(shí)施例中所說(shuō)明，可以對(duì)此類(lèi)人類(lèi)單克隆抗體進(jìn)行制備并分離。
[0222]如在實(shí)施例3C中進(jìn)一步所討論，已經(jīng)將25E3、25F7以及8E7與人類(lèi)LAG-3的結(jié)合定位(map)于人類(lèi)LAG-3的第一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的“額外(extra)環(huán)”區(qū)。該額外環(huán)區(qū)的序列在SEQ ID N0:79中給出。使用肽掃描實(shí)驗(yàn)將25E3與額外環(huán)區(qū)的結(jié)合定位于以下氨基酸序列:PGHPLAPG (SEQ ID NO: 76)，而將25F7與額外環(huán)區(qū)的結(jié)合定位于以下氨基酸序列:HPAAPSSff (SEQ ID NO: 77)，并且8B7與額外環(huán)區(qū)的結(jié)合定位于以下氨基酸序列:PAAPSSWG(SEQ ID NO:78)。因此，在一較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗LAG-3抗體，該抗體結(jié)合人類(lèi)LAG-3的如下表位，該表位包括氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID NO:76)。在另一較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗LAG-3抗體，該抗體結(jié)合人類(lèi)LAG-3的如下表位，該表位包括氨基酸序列 HPAAPSSW (SEQ ID NO: 77)或 PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78)。
[0223]經(jīng)工稈處理及經(jīng)修飾之杭體
[0224]可以進(jìn)一步藉由下述方式制備本發(fā)明之抗體:使用具有在此披露的V1^P/或'序列中的一或多個(gè)之抗體作為起始材料，對(duì)經(jīng)修飾之抗體進(jìn)行工程處理，這種經(jīng)修飾之抗體可具有與起始抗體不同的特性。藉由在一或兩個(gè)可變區(qū)(即％和/或')中，例如在一或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)和/或在一或多個(gè)框架區(qū)內(nèi)中修飾一或多個(gè)殘基，可以對(duì)抗體進(jìn)行工程處理。另外地或可替代地，藉由在一或多個(gè)恒定區(qū)中修飾殘基，例如改變?cè)摽贵w的一或多項(xiàng)效應(yīng)器功能，可以對(duì)抗體進(jìn)行工程處理。
[0225]在某些實(shí)施方案中，可以使用CDR移植對(duì)抗體的可變區(qū)進(jìn)行工程處理?？贵w與靶抗原主要藉由位于六個(gè)重鏈及輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基進(jìn)行相互作用。由于這一原因，CDR中的氨基酸序列在各個(gè)抗體之間比在CDR之外的序列更具有多樣性。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，所以藉由構(gòu)建包括被移植至框架序列(來(lái)自具有不同特性的不同抗體)上的來(lái)自特異的自然發(fā)生之抗體的CDR序列的表達(dá)載體，表達(dá)模擬特異的自然發(fā)生之抗體的特性的重組抗體系可能的(參見(jiàn)，例如Riechmann et al.(1998)Nature332:323-327 ；Jones et al.(1986)Nature321:522-525:Queenet al.(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，225，539 ；5, 530，101 ；5, 585，089 ；5，693，762 以及 6，180，370)。[0226]因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，包括包含⑶R1XDR2、以及⑶R3序列的重鏈可變區(qū)，該⑶R1XDR2以及⑶R3序列包含選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成分別為:SEQ ID N0:1至6，SEQ ID NO:7至12，以及SEQ ID NO: 13至14、GGY、以及16-18，以及包含⑶R1、⑶R2、以及⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，該⑶R1、⑶R2以及⑶R3序列包含選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成分別為:SEQ ID NO: 19至24、SEQID NO:25 至 30，以及 SEQ ID N0:31 至 36。因此，包含單克隆抗體 25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的Vh以及\⑶R序列的此類(lèi)抗體可包含不同于該等抗體的框架序列。
[0227]此類(lèi)框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫(kù)或已公開(kāi)的參考文獻(xiàn)中獲得。例如，針對(duì)人類(lèi)重鏈及輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在“Vbase”人類(lèi)種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)中找到(在互聯(lián)網(wǎng)在http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)，連同在以下獻(xiàn)中找到:如上所引述的Kabat et al.(1991) ；Tomlinson et al.(1992) ^TheRepertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VhSegments with Different Hypervariable Loops" L Mol.Biol.227:776-798:以及 Cox etal.(1994)〃A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias intheir Usage〃Eur.J.1mmunol.24:827-836 ;該等文獻(xiàn)中每一篇的內(nèi)容均明確地藉由引用結(jié)合在此。作為另一實(shí)例，針對(duì)人類(lèi)重鏈及輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中找到。例如，在HCo7HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的以下重鏈種系序列在所附的Genbank登錄號(hào)中可獲得:1-69 (NG_0010109、NT_024637 以及 BC070333)、3_33 (NG_0010109&NT_024637)、以及3-7 (NG_0010109&NT_024637)。作為另一實(shí)例，在HCol2HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的以下重鏈種系序列在所附的Genbank登錄號(hào)中可獲得:1-69 (NG_0010109, NT_024637以及 BC070333),5-51 (NG_0010109&NT_024637),4-34 (NG_0010109&NT_024637),3-30.3(CAJ556644)，以及 3-23 (AJ406678)。
[0228]使用被稱(chēng)為帶缺口的BLAST (Altschul et al.(1997)，如上所述)的序列相似性檢索方法之一將抗體蛋白序列與已編制的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言系熟知的。
[0229]在本發(fā)明之抗體中使用的較佳框架序列系那些結(jié)構(gòu)上與由本發(fā)明的選定之抗體所使用的框架序列相似的框架序列，例如類(lèi)似于由本發(fā)明較佳的單克隆抗體所使用的Vh3-20 (SEQ ID N0:69)、Vh4-34 (SEQ ID NO:61 )、VH3_33 (SEQ ID NO:65)、或 VH1_24 (SEQID 勵(lì):73)框架序列和/或￥418 (SEQ ID N0:71)、VK L6 (SEQ ID N0:63)或 Vk A27 (SEQID NO:67)框架序列。Vh CDR1、CDR2、以及CDR3序列，以及Vk CDR1、CDR2、以及CDR3序列可以被移植至如下框架區(qū)上，該等框架區(qū)具有與在從中衍生出該框架序列的種系免疫球蛋白基因中所發(fā)現(xiàn)的序列相同的序列，或者該等CDR序列可以被移植至如下框架區(qū)上，該等框架區(qū)與該等種系序列相比含有一或多處突變。例如，已發(fā)現(xiàn)在某些情況下在框架區(qū)內(nèi)對(duì)殘基進(jìn)行突變可能是有益的，以保持或增強(qiáng)該抗體的抗原結(jié)合能力(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，530，101 ;5，585，089 ;5，693，762 以及 6，180，370)。
[0230]另一類(lèi)型的可變區(qū)修飾系在VdP/或' ⑶R1XDR2和/或⑶R3區(qū)中對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行突變，由此改善所感興趣之抗體的一或多項(xiàng)結(jié)合特性(例如親和力)?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變來(lái)引入一或多處突變，并且對(duì)抗體的結(jié)合、或其它所感興趣的功能特性的作用可以如在此說(shuō)明的以及在實(shí)施例中提供的體內(nèi)或體外測(cè)定中進(jìn)行評(píng)估。引入較佳的是保守性修飾(如以上所討論)。該等突變可以是氨基酸替代、插入、或刪除，但較佳地是替代。此外，典型地在⑶R區(qū)中改變不超過(guò)一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)殘基。
[0231]因此，在另一實(shí)施方案中，本披露提供了分離的抗LAG-3單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包括:(a)Vh CDRl區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO:1至6，或與SEQ ID NO:1至6相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；(b)Vh CDR2區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO: 7至12，或與SEQ ID NO: 7至12相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；(C)VH CDR3區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID N0:13至14、GGY以及16至18，或與SEQ ID NO: 13至14、GGY以及16至18相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；
(d)VlCDRI區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO: 19至24，或與SEQ IDNO: 19至24相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；
(e)VLCDR2區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID NO: 25至30，或與SEQID N0:25至30相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列；以及⑴八CDR3區(qū)，包括選自下組的氨基酸序列，該組的構(gòu)成為:SEQ ID N0:31至36，或與SEQ ID N0:31至36相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸替代、缺失或刪除的氨基酸序列。
[0232] 本發(fā)明的工程化之抗體包括以下抗體:其中在V1^P/或'內(nèi)已經(jīng)對(duì)框架殘基進(jìn)行了修飾，例如改善了抗體的特性。典型地進(jìn)行了此類(lèi)框架修飾，以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法系使一或多個(gè)框架殘基進(jìn)行“回復(fù)突變”為對(duì)應(yīng)的種系序列。更具體地說(shuō)，已經(jīng)經(jīng)歷了體細(xì)胞突變之抗體可以包含與從中衍生出抗體的種系序列不同的框架殘基。此類(lèi)殘基可以藉由將該抗體框架序列與從中衍生出抗體的種系序列進(jìn)行比較而被鑒定。
[0233]例如，表A示出了不同于種系的框架區(qū)氨基酸位置(使用Kabat編號(hào)系統(tǒng))的區(qū)域，
并示出這個(gè)位置如何藉由所指示的替代而回復(fù)突變?yōu)樵摲N系:
[0234]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人類(lèi)淋巴細(xì)胞活化基因。3(LAG-3)，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 37具有至少80%氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)序列和與SEQ ID NO: 43具有至少80%氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)序列。
2.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人類(lèi)LAG-3，其中該抗體包含與SEQ ID NO:37具有至少85%氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)序列和與SEQ ID NO:43具有至少85%氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)序列。
3.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人類(lèi)LAG-3，其中該抗體包含與SEQ ID NO:37具有至少90%氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)序列和與SEQ ID NO:43具有至少90%氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)序列。
4.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人類(lèi)LAG-3，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 37具有至少95%氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)序列和與SEQ ID NO:43具有至少95%氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)序列。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其抑制LAG-3與主要組織相容性(MHC) II類(lèi)分子的結(jié)合和/或刺激免疫應(yīng)答。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其以1x10_9M或更小之Kd與人類(lèi)LAG-3蛋白結(jié)合。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其以δχΙΟ,Μ或更小之Kd與人類(lèi)LAG-3蛋白結(jié)合。
8.一種組合物，其包含前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分及藥學(xué)可接受載體。
9.權(quán)利要求8的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種別的免疫刺激劑。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述免疫刺激劑為抗ro-1抗體、抗ro-Li抗體和/或抗CTLA-4 抗體。
11.權(quán)利要求?ο的組合物，其中所述免疫刺激劑為抗ro-1抗體。
12.一種免疫綴合物，其包含連接至治療劑的權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。
13.一種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分的可變區(qū)。
14.一種表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求第13的核酸分子。
15.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求14的表達(dá)載體，前提是該宿主細(xì)胞不是存在于人類(lèi)身體中的。
16.—種用于制備抗LAG-3抗體的方法,其包括在權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體，并自該宿主細(xì)胞分離該抗體。
17.一種刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的體外方法，其包括使所述T細(xì)胞與權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分或權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的組合物接觸，使得刺激了抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
18.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分或權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的組合物制備用于刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的藥物的用途。
19.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分或權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的組合物制備用于在受試者中刺激免疫應(yīng)答的藥物的用途。
20.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分或權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的組合物制備用于抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物的用途。
21.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分或權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的組合物制備用于治療受試者中病毒感染的藥物的用途。
22.權(quán)利要求18至21中任一項(xiàng)的用途，其中權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分或權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的組合物與至少一種別的免疫刺激劑組合。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述免疫刺激劑為抗ro-1抗體、抗ro-Ll抗體和/或抗CTLA-4 抗體。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述免疫刺激劑為抗I3D-1抗體。
25.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括: (a)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)乂#^*基因之產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變 區(qū)系人類(lèi)Vk L6基因之產(chǎn)物或衍生于該基因；或 (b)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)乂113-33基因之產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk A27基因之產(chǎn)物或衍生于該基因；或 (c)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)￥113-20基因之產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L18基因之產(chǎn)物或衍生于該基因；或 (d)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)乂“^*基因之產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L6基因之產(chǎn)物或衍生于該基因；或 (e)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)系人類(lèi)￥113-33基因之產(chǎn)物或衍生于該基因，以及輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)系人類(lèi)Vk L6基因之產(chǎn)物或衍生于該基因； 其中該抗體特異性結(jié)合人類(lèi)之LAG-3。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103923213SQ201410132483
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2008年8月11日
【發(fā)明者】肯特.B.蘇迪厄姆, 艾倫.J.科曼, 海迪.勒布蘭克, 馬克.亞馬納卡, 馬克.塞爾比, 凱拉.D.曾斯 申請(qǐng)人:梅達(dá)雷克斯有限責(zé)任公司