專利名稱：枳促分裂原活化蛋白激酶基因PtrMAPK克隆及用于提高植物抗旱能力的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及從枳(Poncirus trifoliate)中分離、 克隆得到促分裂蛋白激酶基因PtrMAPK，然后將該基因?qū)氲侥Ｊ街参餆煵葜羞M(jìn)行功能驗(yàn)證，獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗干旱能力明顯提高。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常受到外界不良環(huán)境的影響，其中干旱已被證明是最具破壞力一種非生物逆境，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育及產(chǎn)量。然而，植物受到不利的外部環(huán)境刺激時(shí)，并不是被動(dòng)地接受。事實(shí)上，植物在漫長(zhǎng)的演變過程中，已經(jīng)建立了一套應(yīng)答逆境脅迫的機(jī)制，涉及到植物對(duì)逆境信號(hào)的感受、逆境信號(hào)的傳遞，以及相應(yīng)受體對(duì)逆境信號(hào)的識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)等三個(gè)階段，此過程受一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)控。現(xiàn)在大家普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)磷酸化在植物調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)中應(yīng)對(duì)非生物逆境起著非常重要的作用，它是植物體內(nèi)一種普遍存在的適應(yīng)外界環(huán)境變化的調(diào)節(jié)機(jī)制，盡管一些家族的蛋白也參與蛋白的磷酸化， 但促分裂原蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)在植物將細(xì)胞外的刺激轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)這一轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著很重要的作用。MAPKs是一類絲氨酸/蘇氨酸6er/Thr)蛋白激酶，MAPK級(jí)聯(lián)途徑有三類激酶組成并通過依次磷酸化將逆境信號(hào)傳遞下去，即MAPKKKKs — MAPKKs — MAPKs。植物體受到外界不良環(huán)境脅迫，并將其轉(zhuǎn)化為信號(hào)刺激并傳遞給其胞內(nèi)受體，然后通過MAH(級(jí)聯(lián)途徑將信號(hào)放大并傳遞下去(Zhang et al. ,2006 ；Nadarajah and Sidek，2010)，進(jìn)而激活植物體內(nèi)一些抗逆基因的表達(dá)，使植物主動(dòng)適應(yīng)環(huán)境以生存下去。MAPKs級(jí)聯(lián)途徑的最上游激酶 MAPKKKs可以接受不同信號(hào)刺激，引起下游相應(yīng)基因MAPKKs的表達(dá)，進(jìn)而使MAPKs磷酸化激活，被激活的MAPKs根據(jù)需要有不同的去處，它轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核，在那里它磷酸化下游的蛋白質(zhì)啟動(dòng)細(xì)胞的響應(yīng)(Pedley and Martin, 2005 ；Fiil et al. ,2009 ；Nadarajah and Sidek, 2010) 0在這個(gè)意義上說，蛋白激酶MAI3K是級(jí)聯(lián)的最后一個(gè)元件，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從上游到靶基因的一個(gè)主要通道。目前已經(jīng)從高等植物中分離出數(shù)量眾多的蛋白激酶，僅在擬南芥基因組序列測(cè)定過程中就發(fā)現(xiàn)了 20種MAPKsUO種MAPKKs、60種MAPKKKs，MAPKs的家族至少可以分為A、 B、C、D 4類研究發(fā)現(xiàn)A類MAPKs主要響應(yīng)環(huán)境以及與激素有關(guān)的一些事件。對(duì)B類MAPKs 的研究相對(duì)A類要少一些，但研究發(fā)現(xiàn)B類MAPKs也參與了由環(huán)境脅迫引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，以及細(xì)胞分裂過程中的一些事件。自從植物第一個(gè)編碼MAI3K的基因上世紀(jì)90年代首先被克隆出來，到現(xiàn)在為止MAI3K已從幾種植物中分離得到(Zai’di et al.，2010 ；Nadarajah and Sidek, 2010) 0此外，一些MAPK已經(jīng)被證明參與干旱的信號(hào)傳導(dǎo)，如擬南芥中AtMPK4 和 AtMPK6 (Ichimura et al.，2000 ；Nadarajah and Sidek, 2010)，水稻中的 0sMAPK5 和 0sMAPK6 (Xiong and Yang, 2003 ；Rolila and Yang，2007)。揭開這些信號(hào)因素為抗旱的基因工程提供一個(gè)可行的方法，因?yàn)樵谄渌胤揭驯蛔C明(Umezawa et al.，2006)。
必須指出的是，雖然MAPK已經(jīng)從不同的植物當(dāng)中被克隆，但大部分蛋白激酶在干旱脅迫中的功能仍有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。另一方面，值得注意的是有關(guān)MAPK的大部份信息來源于擬南芥、水稻、煙草、番茄，但有關(guān)果樹MAH(解卻很有限。研究表明盡管MAH(信號(hào)通路在真核生物進(jìn)化有一定的保守性，但這種級(jí)聯(lián)的組成和具體組成部分的功能卻存在一定的不同(Morris，2001 ；Zaidi et al. ,2010).枳對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用廣泛的一種砧木，但是它很容易受到干旱，這就造成其在那些的水資源有限，周期性發(fā)生干旱地區(qū)的使用。雖然有較多的研究表明MAI3K基因已經(jīng)在一些植物中克隆，但在枳中尚未見該基因克隆及功能驗(yàn)證的報(bào)道，更未見應(yīng)用枳MAPK基因轉(zhuǎn)化植物提高抗旱的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于從枳(Poncirus trifoliate)中分離克隆出MAPK類促分裂蛋白激酶，申請(qǐng)人將這個(gè)蛋白激酶命名為PtrMAPK，并且通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法鑒定它的抗旱功能，為植物抗非生物逆境分子設(shè)計(jì)育種提供新的基因資源，為實(shí)施綠色農(nóng)業(yè)、節(jié)水農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發(fā)利用有利于降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本和實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的申請(qǐng)人:基于植物基因克隆技術(shù)從枳(Poncirus trifoliate)中克隆得到一個(gè)新基因PtrMAPK，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所述，在SEQ ID NO :1所述序列的 73-1200bp處為該基因的編碼區(qū)；其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，它包含 1128bp的開放閱讀框，編碼375個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5. 51，預(yù)測(cè)的分子量為43kD。申請(qǐng)人:設(shè)計(jì)了克隆上述的基因PtrMAPK的cDNA序列的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示lH向引物5，-CGGTCGACGGAGAGAGAGTAAAATGGCTGACG-3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 3)；反向引物5，-AAGGTACCGAAAGATTGTCGGCCACCTGCAG-3‘(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO :4)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將所述的基因PtrMAPK轉(zhuǎn)化模式植物(煙草)， 使該基因在煙草中超表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)生物學(xué)功能驗(yàn)證，表明本發(fā)明克隆的 PtrMAPK基因具有調(diào)控?zé)煵菘购敌缘墓δ堋Ｔ诒景l(fā)明的實(shí)施例部分，我們闡述了枳PtrMAI5K促分裂蛋白激酶的分離、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明分離自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAI^K的核苷酸序列，其中73-1200bp處為該基因的編碼區(qū)。序列表SEQ ID NO :2是本發(fā)明分離自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAI3K的編碼的氨基酸序列，它包含11 ^bp的開放閱讀框，編碼375個(gè)氨基酸。序列表SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4是克隆枳基因PtrMAPK的引物對(duì)的核苷酸序列。圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 是本發(fā)明的PtrMAI^K基因在脫水、鹽和低溫脅迫下的表達(dá)。其中圖2A是本發(fā)明的基因在枳田間苗(未轉(zhuǎn)基因)室溫下脫水不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式；圖2B是枳的田間苗(未轉(zhuǎn)基因)在4度處理下，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取樣，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析本發(fā)明的基因相對(duì)表達(dá)量；圖2C是枳的田間苗(未轉(zhuǎn)基因)在200mM氯化鈉處理下，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取樣，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析本發(fā)明基因的相對(duì)表達(dá)量。圖3 是本發(fā)明的PtrMAPK基因亞細(xì)胞定位。圖中圖3A，GFP基因(對(duì)照)在明場(chǎng)(圖左)、紫外線(UV)光(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成像；圖3B，PtrMAra基因在明場(chǎng)(左)、UV光(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成像。圖4 是本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例的超表達(dá)載體圖。圖5 是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例亞細(xì)胞定位用的載體圖。圖6 是PtrMAPK轉(zhuǎn)煙草后，選取兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系(0E2和0E19)用RT-PCR分析外源基因PtrMAPK的超表達(dá)。圖7 是本發(fā)明中實(shí)施例轉(zhuǎn)PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉(zhuǎn)基因植株(WT)生長(zhǎng)30天后室溫脫水90分鐘后失水率(圖7A)、植株表型(圖7B)和電導(dǎo)率(圖7C)。圖8 是本發(fā)明中實(shí)施PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉(zhuǎn)基因植株(WT)生長(zhǎng) 60天后干旱21天后的表型(圖8A)、電導(dǎo)率(圖8B)和葉綠素含量(圖8C)圖9 是本發(fā)明中實(shí)施例PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉(zhuǎn)基因植株(WT)生長(zhǎng)30天后干旱20天后復(fù)水3天成活率及表型。其中圖9A是轉(zhuǎn)PtrMAPK基因株系0E2和 0E19及非轉(zhuǎn)基因植株(WT)干旱20天后復(fù)水3天的成活率統(tǒng)計(jì)，圖9B是PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉(zhuǎn)基因植株(WT)干旱處理前的圖片，圖9C是0E2和0E19及非轉(zhuǎn)基因植株(WT)干旱20后復(fù)水3天的圖片。圖10 是本發(fā)明中實(shí)施例轉(zhuǎn)PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉(zhuǎn)基因植株(WT) 生長(zhǎng)30天后室溫脫水90分鐘后或移栽土壤中生長(zhǎng)60天控水21天的活性氧染色結(jié)果。圖 IOA脫水90分鐘的DAB和NBT染色。圖8B為控水21天后的NBT和DAB染色。圖11 是本發(fā)明中實(shí)施例轉(zhuǎn)PtrMAPK基因煙草0E2和0E19和非轉(zhuǎn)基因植株(WT) 控水前及控水7天后SOD (圖11A)、CAT(圖11B)和POD (圖11C)三種酶活性測(cè)定。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出詳細(xì)的描述。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下， 可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例1，PtrMAPK基因分離克隆及表達(dá)分析以MAI3K為關(guān)鍵詞搜索柑桔EST數(shù)據(jù)庫(HarvEST =Citrus ver. 0. 51),得到7個(gè)相近序列，這些由DNAstar (公用軟件)組成一個(gè)unigene，通過序列分析軟件(ORF Finder) 發(fā)現(xiàn)基因MAPK缺少5端編碼序列，利用5 ‘RACE試劑盒(Clontech，PaloAlto，CA, USA) 擴(kuò)增出一個(gè)完整的ORF 序列，該序列用Primer Premier 5. 0設(shè)計(jì)引物GSPl (GSP，5’ -C CACACATCTATTGCAGCAGTGTAGTCAG-3，)，用RT-PCR方法擴(kuò)出5端序列。將擴(kuò)增的5端序列及已有的MAPK —個(gè)unigene利用軟件DNAstar重疊成一條序列。25°C脫水下從枳葉片抽提RNA及反轉(zhuǎn)錄，所得的第一鏈cDNA用于擴(kuò)增PtrMAPK基因全長(zhǎng)。RNA抽提使用Trizol 試劑盒(購(gòu)自TakaRa，Code :D9108A，按照該試劑盒提供的操作說明書操作)，利用抽提的 IμgS RNA樣品經(jīng)IU的DNaseI (購(gòu)自Fermentas公司)室溫處理30分鐘后，加入1 μ 1 EDTA(25mM)，于65°C溫育10分鐘。第一鏈cDNA的合成用MBI反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)K1621，CN 102533811 A
購(gòu)自i^rmentas公司，按照試劑盒說明書操作)。擴(kuò)增基因PtrMAPK引物對(duì)為正向引物 PtrMAPK Forward, 5，-CGGTCGACGGAGAGAGAGTAAAATGGCTGACG-3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 2)；反向引物PtrMAPK Reverse, 5，-AAGGTACCGAAAGATTGTCGGCCACCTGCAG-3，(對(duì)應(yīng) SEQ ID NO :3)。 25 μ 1 的反應(yīng)體系中包括 IOOng cDNA, 1 X 緩沖液，2. 5mM MgCl2,0. 25mM dNTP，0. 5U Taq 聚合酶(前述緩沖液和Taq聚合酶購(gòu)自Fermentas公司，Lithuania)，0.5μ M上述引物。PCR 反應(yīng)在ΑΒΙ9700 (Applied Biosystem)擴(kuò)增儀上按以下程序完成94°C，5分鐘，94°C變性30 秒，60°C退火50秒，72°C延伸90秒，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)完成后72°C延伸15分鐘。產(chǎn)生一條單一 PCR條帶產(chǎn)物，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，用Ε. Ζ. N. A DNA凝膠回收試劑盒(購(gòu)自 Omega公司，美國(guó))回收特異帶，提取步驟參照使用說明。回收純化的DNA溶液與pMD18_T 載體(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司即TaKaRa公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，按說明書操作，連接反應(yīng)體系中插入PtrMAPK基因與pMD18-T載體的摩爾比為3 1連接反應(yīng)總體積是10 μ 1， 其中包括5μ 1的2Χ緩沖液(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)，4.5μ 1純化的PCR產(chǎn)物， 0.5μ1 T載體。16°C過夜連接。取10 μ 1連接產(chǎn)物，采用熱擊法(參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版，科學(xué)出版社，200 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，在含有50mg/L氨芐霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個(gè)克隆測(cè)序(由上海聯(lián)合基因公司完成)，測(cè)序結(jié)果表明，本發(fā)明克隆PtrMAPK基因全長(zhǎng)為1339bp (見SEQ ID NO 1所示)，通過測(cè)序、比對(duì)確定是本發(fā)明需要的目的基因，將這個(gè)基因命名為PtrMAPK，它包括lU8bp的編碼閱讀框，編碼375個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5. 51，預(yù)測(cè)的分子量為43kD。BLASTX分析該序列與已知的(所有已發(fā)表的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫)的植物序列高度同源。推導(dǎo)的PtrMAra基因的氨基酸序列與報(bào)道的楊樹 (PtMAPK, XP_002314017)、煙草(NtMAPK，BAB79636)、黃瓜(CsMAPK，AAZ57337)的序列高度同源。多序列比對(duì)結(jié)果顯示PtrMAPK基因包括11個(gè)保守的蛋白激酶亞區(qū)，在其VII和VIII 亞區(qū)之間也存在一個(gè)催化區(qū)域，其中保守的TxY基序在此起關(guān)鍵作用。Motif scan預(yù)測(cè)氨基酸PtrMAI3K有四個(gè)磷酸化位點(diǎn)，一個(gè)蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)(Protein kinases ATP-binding region signature)。為分析PtrMAI3K基因是否對(duì)脫水、鹽和低溫處理響應(yīng)，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析該基因在上述處理下的表達(dá)。結(jié)果表明，雖然鹽脅迫處理下該基因表達(dá)量變化不大(見圖2A)， 但脫水處理(見圖2A)和低溫(見圖2C)均能誘導(dǎo)該基因表達(dá)，表明它是一個(gè)逆境應(yīng)答候選基因。實(shí)施例2，PtrMAPK基因亞細(xì)胞定位本實(shí)施例利用洋蔥表皮研究PtrMAI3K基因的亞細(xì)胞定位。利用RT-PCR擴(kuò)增出 PtrMAPK基因整個(gè)0RF，并在其擴(kuò)增引物兩端加上NcoI和SpeI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。首先將擴(kuò)增產(chǎn)物裝在PMD18-T載體上，從而得到一個(gè)PMD18-TN/s-PtrMAPK重組載體。同時(shí)用NcoI 和SpeI去切PMD18-TN/s-PtrMAPK和pCAMBIA1302 (見圖3)，回收產(chǎn)物并連接，從而構(gòu)建了一個(gè)重組載體，從而得到pCAMBIA1302-PtrMAPK-GFP重組載體。在確認(rèn)序列無誤后，將 pCAMBIA1302-PtrMAPK-GFP重組載體及對(duì)照載體(pCAMBIA13(^)用熱擊法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版，科學(xué)出版社，2002)分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。 農(nóng)桿菌侵染洋蔥表皮按如下方法進(jìn)行(1).劃平板，挑單克隆(含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌) 于:3ml YEB培養(yǎng)基(含卡那霉素(KmHOyg/ml，利福平(Rif) 25mg/L)，觀°C震蕩培養(yǎng)M 小時(shí)，至OD6tltl約0.6。2.用手術(shù)刀將洋蔥內(nèi)表皮劃成Icm2大小，撕下置于報(bào)道的MS基本5/9頁
培養(yǎng)基(含3%蔗糖，0.75%瓊脂，不含激素)上暗培養(yǎng)M小時(shí)。3.按體積比為1 1000 比例，接種50 μ 1農(nóng)桿菌菌液于50ml YEB (含Km 40μ g/ml, Rif25y g/ml)中，28°C振蕩培養(yǎng)12- 小時(shí)。4. 4000rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。5.加入50mlYEB培養(yǎng)基(含有IOmM MgCl2)。將洋蔥表皮放入菌液中浸泡30分鐘。6.吸干表面菌液，置于MS基本培養(yǎng)基(含 3%蔗糖，0.75%瓊脂，不含激素)上上培養(yǎng)兩天。用Olympus BX61型顯微鏡觀察報(bào)告基因定位情況。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明含對(duì)照載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞中GFP熒光充滿整個(gè)細(xì)胞(附圖4A)，而含PtrMAPK基因載體的農(nóng)桿菌浸染的洋蔥表皮中GFP熒光只在細(xì)胞核中(附圖4B)，證明PtrMAPK是核定位基因。實(shí)施例3，植物轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建根據(jù)pMV載體(切除⑶S基因的植物二元轉(zhuǎn)化載體pBI121中，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院葉志彪教授惠贈(zèng))的多克隆位點(diǎn)和PtrMAPK基因的編碼區(qū)序列，按照一般設(shè)計(jì)引物的原則用I^imer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)出擴(kuò)增PtrMAPK基因整個(gè)編碼區(qū)的上、下游 PCR引物(該引物對(duì)就是擴(kuò)增本發(fā)明PtrMAI^K基因cDNA序列的引物對(duì))。其序列如下所示Forward primer :5，~CGGTCGACGGAGAGAGAGTAAAATGGCTGACG~3‘Reverse primer :5，~AAGGTACCGAAAGATTGTCGGCCACCTGCAG~3‘以PtrMAI3K基因的克隆子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的退火溫度為60°C。PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同實(shí)施例1。雙酶切體系反應(yīng)總體積為40 μ 1，其中含有PCR的純化產(chǎn)物 8μ 1，10ΧΤ 緩沖液(購(gòu) TakaRa 自公司)6μ 1 及 0. BSA 4 μ 1, Kpn I 及 Mil 各 2 μ 1，雙蒸水18 μ 1。在37°C酶切過夜后純化回收。pMV載體的雙酶切體系反應(yīng)總體積為 40 μ 1，其中含有經(jīng)過質(zhì)粒提取獲得的pMV載體DNA 8 μ 1，IOXM緩沖液(購(gòu)自TakaRa公司)4μ1，Κρη I及Xho I各2μ1，加雙蒸水Μμ 。于37°C酶切過夜后純化回收。連接反應(yīng)體系中插入PtrMAPK基因與載體pMV的摩爾比為3 1，反應(yīng)總體積為10 μ 1，其中含有 IOXBuffer 1 μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，PtrMAPK基因的雙酶切回收產(chǎn)物6 μ l，pMV載體的雙酶切回收產(chǎn)物2 μ 1。在16°C反應(yīng)14-16小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5 α，在含有 50mg/L卡那霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切及PCR鑒定，測(cè)序確定沒有讀碼框突變，獲得含有插入目的片段的重組克隆，將其命名為PMV-PtrMAPK重組載體， 應(yīng)用凍融法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002 年)將重組載體pMV-PtrMAPK導(dǎo)入到農(nóng)桿菌EHA105中。真核表達(dá)載體pMV-PtrMAPK構(gòu)建流程見圖5所示。實(shí)施例4，煙草的遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用凍融法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002年)將重組載體pMV-PtrMAPK導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下1.根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)取超低溫冰箱中保存的根癌農(nóng)桿菌菌液，在添加了卡那霉素 50mg/L的LB平板上劃線，刮取劃線菌斑，加入液體MS基本培養(yǎng)基中，28°C 180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，待菌液濃度達(dá)到0D_ = 0. 3 0. 8時(shí)作浸染。2.浸染取未轉(zhuǎn)基因的煙草葉片，切成0.5cmX0.5cm大小，然后放入制備好的根癌農(nóng)桿菌菌液中，浸泡8 10分鐘，期間不斷振蕩。
3.共培養(yǎng)取浸染后的煙草葉片，無菌濾紙吸干上面的的菌液，然后接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(葉背面向下)，25°C暗培養(yǎng)3天。4.篩選培養(yǎng)經(jīng)共培養(yǎng)3天后的煙草葉片，用500mg/L濃度的頭孢霉素溶液洗一遍，然后無菌水沖洗3 5次，再轉(zhuǎn)移入添加了 100mg/L卡那霉素和500mg/L頭孢霉素的篩
選培養(yǎng)基中。5.生根培養(yǎng)待篩選培養(yǎng)基上的不定芽長(zhǎng)到Icm左右時(shí)，切下并轉(zhuǎn)入添加了 100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培養(yǎng)基上。6.煙草苗轉(zhuǎn)入土培待生根后的轉(zhuǎn)化苗長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，由生根培養(yǎng)基中取出，用自來水洗凈轉(zhuǎn)化苗上的培養(yǎng)基，并栽植于滅菌的營(yíng)養(yǎng)土中。煙草轉(zhuǎn)化苗所用培養(yǎng)基見表1。表1煙草轉(zhuǎn)化苗所用培養(yǎng)基配方
培養(yǎng)基名稱組分及含量(培養(yǎng)基均含有30g/L蔗糖和0.7g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8)
萁甭涵福涵慕弱醒6: 3
篩選培養(yǎng)基上述共培養(yǎng)培養(yǎng)基+100 mg/L Km+500 mg/L Cef 生根培養(yǎng)基 MS 基本培養(yǎng)基+0.3 mg/LNAA+100 mg/L Km +500 mg/L Cef注表1中培養(yǎng)基中激素和抗生素成分的定義6-BA-6-芐基氨基嘌呤；NAA-萘乙酸；Cef-頭孢霉素；Km-卡那霉素。7.陽性轉(zhuǎn)基因煙草初步確定按照實(shí)施例4的方法得到轉(zhuǎn)PtrMAPK基因的煙草抗性芽，按如下步驟提取煙草葉片總DNA :1、煙草葉片DNA提取取適量的轉(zhuǎn)基因煙草的葉片放入1.5mL離心管中，加液氮，充分研磨后；加入 700 μ 1 65 °C預(yù)熱的DNA提取緩沖液十六烷基三乙基溴化銨(簡(jiǎn)稱CTAB，配方100mM Tris-HCKpH 8. 0)，1. 5M NaCl, 50mM EDTA(pH 8.0)溶液加 1 %聚乙烯吡咯燒酮，2% (體積)CTAB，65°C水浴充分溶解備用，用前在65°C水浴預(yù)熱后，加入(體積)巰基乙醇， 混勻)，65°C溫浴60-90分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒混勻；lOOOOg，離心10分鐘；取上清，加600 μ 1氯仿，顛倒混勻靜置3分鐘；lOOOOg，離心15分鐘；取上清450 μ 1，加入 900 μ 1預(yù)冷無水乙醇，420 μ 1 5Μ NaCl，混勻后，冰凍30分鐘，lOOOOg,離心10分鐘；棄上清后，用Iml 75%的乙醇，洗滌3次后，加適量雙蒸水溶解。陽性植株鑒定步驟如下設(shè)計(jì)引物NPTII和基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定陽性苗。鑒定為可能的陽性植株移栽后獨(dú)立收獲種子(Tl代種子)，4°C春化處理3天，取0. Ig 在1. 5ml的離心管中，先用70%酒精浸泡種子20秒，接著用滅菌雙蒸水洗一次，再加入Iml 2. 5% NaClO表面消毒7分鐘，充分振蕩，棄去NaClO后用滅菌雙蒸水洗3次，最后用接種針將滅好的種子播于50mg/l具有卡那霉素(Km)MS基本培養(yǎng)基的上，結(jié)果表明本發(fā)明獲得的抗性苗在抗性平板上能正常生長(zhǎng)，為綠色，而非抗性苗則黃化死去。成活的植株移栽再收獲 Tl代種子，T2代種子用于播種及抗性分析。實(shí)施例5，煙草轉(zhuǎn)化植株的分子及生理鑒定1、煙草葉片DNA提取
取適量煙草轉(zhuǎn)化植株的葉片放入1.5mL離心管中，加液氮，充分研磨后；加入 700 μ 1 65 °C預(yù)熱的DNA提取緩沖液十六烷基三乙基溴化銨(簡(jiǎn)稱CTAB，配方100mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，1. 5MNaCl,50mM EDTA(pH 8. 0)溶液加聚乙烯吡咯烷酮，2% (體積) CTAB，65°C水浴充分溶解備用，用前在65°C水浴預(yù)熱后，加入1-4% (體積)巰基乙醇，混勻)，65°C溫浴60-90分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒混勻；lOOOOg，離心10分鐘；取上清，加600 μ 1氯仿，顛倒混勻靜置3分鐘；IOOOOg,離心15分鐘；取上清450 μ 1,加入 900 μ 1預(yù)冷無水乙醇，420 μ 1 5Μ NaCl，混勻后，冰凍30分鐘，lOOOOg，離心10分鐘；棄上清后，用Iml75 %的乙醇，洗滌3次后，加適量雙蒸水溶解。2、陽性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)采用引物NPTII和基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列、反應(yīng)程序及體系分別見表2、表3和表4。采用特異引物進(jìn)行PCR鑒定。表2引物序列信息
權(quán)利要求
1.一種分離自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAPK，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所述。
2.一種分離自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAPK，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO 2 所述。
3.一種克隆權(quán)利要求1或2所述基因PtrMAPK的引物對(duì)，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO 4 所述。
4.權(quán)利要求1或2所述的基因在植物抗旱中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中包括在柑橘抗旱中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及從枳中分離、克隆得到枳(Poncirustrifoliata)MAPK基因(PtrMAPK)。該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示；其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示；它包含1128bp的開放閱讀框，編碼375個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.51，預(yù)測(cè)的分子量為43kD。將本發(fā)明所述的基因PtrMAPK導(dǎo)入到煙草進(jìn)行功能驗(yàn)證，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株抗旱能力明顯提高。本發(fā)明為植物抗非生物逆境分子設(shè)計(jì)育種提供了新的基因資源，為實(shí)施綠色農(nóng)業(yè)、節(jié)水農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發(fā)利用有利于降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本和實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102533811SQ20101059604
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者劉繼紅, 黃小三 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)