專利名稱：人t細胞活化蛋白基因、其編碼的多肽及制法和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的人T細胞活化蛋白，該蛋白是Ly-6抗原家族的一個新成員。
T細胞活化蛋白(T-cell-activating protein，簡稱“TAP”)是一種通過磷脂酰肌醇錨定于細胞表面的糖蛋白，它參與細胞活化的過程(Cell 47365-370，1986)。TAP并不在所有的T細胞中表達，在約10％具可的松抗性、成熟的胸腺細胞和大部分的靜止外周T細胞中表達TAP(Proc.Natl.Acad.Sci.837424-7428，1986)。編碼小鼠TAP的基因定位于Ly-6基因座，該基因座上的基因編碼一類同源性較高的T細胞分化抗原(Proc.Natl.Acad.Sci.832954-2958，1986)。
1986年，Rock小組和Reiser小組在小鼠T-T雜交瘤細胞中分離到了小鼠的TAP蛋白(Cell 47365-370；J.Exp.Med.163(2)315-333，1986)。1988年，Reiser等人克隆了小鼠TAP的cDNA序列(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。
然而迄今為止，尚沒有人公開過本申請中涉及的人的TAP序列。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼Ly-6抗原基因家族的一個新成員，本發(fā)明新的人Ly-6抗原被命名為人T細胞活化蛋白，簡稱“TAP”。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的Ly-6抗原蛋白家族成員，本發(fā)明的蛋白被命名為人TAP蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人Ly-6抗原的方法。
本發(fā)明還涉及這種人TAP抗原基因序列和多肽的應用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人TAP蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人TAP蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人TAP蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成人TAP蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人TAP蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人TAP蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為598個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于25-429位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人TAP蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中25-429位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框25-429位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中25-429位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地，在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人TAP相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人TAP蛋白多肽”指具有人TAP蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人TAP相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人TAP蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人TAP DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人TAP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人TAP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還提供了人TAP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人TAP多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人TAP蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人TAP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人TAP保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
表 1<
本發(fā)明還包括人TAP多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)人TAP的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針或引物的核苷酸分子，該分子通常具有人TAP核苷酸序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人TAP的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人TAP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應于人TAP多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。較佳地，該引物或探針序列對應于人TAP核酸序列中不同于小鼠TAP核酸序列的部分。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于” 意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人TAP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人TAP基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人TAP基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人TAP蛋白的分子，也包括那些并不影響人TAP蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人TAP基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人TAP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人TAP或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人TAP功能的抗體以及不影響人TAP功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人TAP基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人TAP基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人TAP核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的SEQ ID NO.3序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。當然，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸全長為598個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于25-429位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15′-TCTGAGAGGAACCCTTCTCTGAG-3′和反向引物B15′-ATTAGAGCACCTACCTACCCAGC-3′進行PCR，獲得598bp的目的片段。測序后得到SEQ IDNO.3的全長cDNA序列。
根據(jù)同源比較的結(jié)果，本發(fā)明的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列與小鼠TAP基因顯示了極高的同源性，因此，兩者的功能必然有密切聯(lián)系。
T細胞表面蛋白TAP可以按不依賴抗原的方式激活T細胞(J.Immunol.13891-97，1987)。小鼠的TAP基因被定位于Ly-6基因座(Immunogenetics 2047-56，1984)，其蛋白內(nèi)含有10個半胱氨酸殘基(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。TAP蛋白上的糖基可能通過O-連接方式和蛋白相連(Proc.Natl.Acad.Sci.843370-3374，1987)。TAP蛋白的C端具有和磷脂酰肌醇相連的蛋白中普遍存在的疏水區(qū)，因而可通過磷脂酰肌醇錨定于細胞表面(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。T細胞表面上與磷脂酰肌醇相連的蛋白大多具有刺激T細胞的能力(Cell 47365-370，1986)。
TAP參與的T細胞活化過程可能包括以下兩個步驟首先抗TAP的抗體誘導T細胞活化，并促進T細胞受體的刺激；然后，TAP在幾乎所有的L3T4+外周T細胞上表達(Proc.Natl.Acad.Sci.832255-2259，1988)。
TAP在個體發(fā)育中的表達情況顯示TAP在胎兒胸腺發(fā)育的早期即開始表達(J.Immunol.1371232-1238，1986)。TAP的表達在T細胞受到促有絲分裂的刺激后顯著上升，而且還受到外源γ干擾素的上調(diào)作用(Immunology 64267-271，1988)。當TAP表達缺陷時會導致產(chǎn)生一些免疫缺陷，如未成熟T細胞不應答及l(fā)pr/lpr疾病中異常的淋巴細胞。
另外，在陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥中淋巴細胞應答減弱可能和磷脂酰肌醇復合物的形成缺陷有關(Cell 52665-674，1988)。TAP所在的Ly-6基因座在脾、腎、肺中有表達，在心、腦中也有稍低的表達。Ly-6基因座上的基因在許多非淋巴組織可活性轉(zhuǎn)錄，這提示它們在這些組織中可能存在一些特殊的功能(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人TAP與小鼠TAP的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“|”標出。
圖2為本發(fā)明的人TAP與小鼠TAP的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標出，相似的氨基酸用“.”標出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人TAP的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-TCTGAGAGGAACCCTTCTCTGAG-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B15′-ATTAGAGCACCTACCTACCCAGC-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片段約為600bp的目的片段。
2. PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑷缟汐@得的PCR擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共598bp，詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于25-429位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導出人TAP的氨基酸序列，共134個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實施例2同源比較用本發(fā)明的人TAP的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+Swiss Prot+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序進行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它與小鼠TAP基因(gi|198921|gb|M18184|MUSLY62[198921])顯示了極高的同源性，如用PCGENE軟件分析，它與小鼠TAP基因在核酸水平上有97.7％的同一性(圖1)，在蛋白水平上則完全一致(圖2)，因此可以肯定本發(fā)明蛋白是人的TAP蛋白，并且具有與小鼠TAP相同或相近的的功能。
研究表明，T細胞活化可以通過T細胞上的受體識別由輔助細胞上主要組織相容性復合物呈遞的抗原而實現(xiàn)(Ann.Rev.Immunol.3237-261，1985)。而T細胞表面蛋白TAP可以按不依賴抗原的方式活化T細胞(J.Immunol.13891-97，1987)。小鼠的TAP基因被定于Ly-6基因座，該基因座編碼許多在發(fā)育過程中受調(diào)節(jié)的造血細胞表面蛋白(Immunogenetics 2047-56，1984)。
TAP是T細胞表面糖蛋白，其分子量在非還原條件下介于10-12KD，在還原條件下介于15-17KD(Proc.Natl.Acad.Sci.837424-7428，1986)。SDS-PAGE膠電泳顯示TAP蛋白的分子量在還原環(huán)境中增大，表明其蛋白內(nèi)含有二硫鍵(Cell47365-370，1986)，TAP的cDNA序列分析表明TAP蛋白中含有10個半胱氨酸殘基(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)，本發(fā)明中對應為SEQ ID NO.4中第29位、第32位、第41位、第46位、第53位、第74位、第78位、第98位、第99位和第104位的半胱氨酸(第10位與第20位半胱氨酸為信號肽序列的氨基酸)。
TAP的氨基酸序列不含有N-糖基化位點，其蛋白上的糖基可能通過O-連接方式和蛋白相連(Proc.Natl.Acad.Sci.843370-3374，1987)。TAP蛋白不含有典型的穿膜結(jié)構(gòu)域，C端具有和磷脂酰肌醇相連蛋白普遍存在的疏水區(qū)(C端富含亮氨酸以及纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等)，可通過磷脂酰肌醇錨定于細胞表面(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。實驗表明，在T細胞表面上和磷脂酰肌醇相連的蛋白的內(nèi)化作用不依賴衣被凹陷方式(coated pit-independent pathway)進行的(Eur.J.Immunol.2215-21，1992)。這些與磷脂酰肌醇相連的蛋白大多具有刺激T細胞的能力，提示磷脂酰肌醇連接方式可能代表了一種信號傳導途徑(Cell47365-370，1986)。
抗TAP的單克隆抗體可以誘導成熟胸腺細胞的增殖，其強度與伴刀豆球蛋白A的刺激反應相當(J.Immunol.1371232-1238，1986)。TAP參與的T細胞活化過程可能包括以下兩個步驟首先抗TAP的抗體誘導T細胞活化，并促進T細胞受體的刺激；然后，TAP在幾乎所有的L3T4+外周T細胞上表達。在胸腺組織，TAP的表達標志著免疫活性的獲得(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。TAP在個體發(fā)育中的表達情況顯示TAP在胎兒胸腺發(fā)育的早期即開始表達，這時候其它大多數(shù)T細胞的標志分子還未出現(xiàn)。這些早期淋巴細胞可以通過TAP分子被活化也說明，TAP的表達和免疫活性的獲得存在相關性(J.Immunol.1371232-1238，1986)。TAP的表達在T細胞受到促有絲分裂的刺激后顯著上升，也受到外源γ干擾素的上調(diào)作用。已知T細胞在活化后能分泌γ干擾素，表明TAP在活化的T細胞中表達上升是受內(nèi)源γ干擾素的自分泌作用(Immunology 64267-271，1988)。當TAP表達缺陷時會導致產(chǎn)生一些免疫缺陷，如未成熟T細胞不應答及l(fā)pr/lpr疾病中異常的淋巴細胞。另外，在陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥中淋巴細胞應答減弱可能和磷脂酰肌醇復合物形成缺陷有關(Cell 52665-674，1988)。Northern Blot實驗表明，TAP所在的Ly-6基因座在脾、腎、肺中有表達，在心、腦中也有稍低的表達。Ly-6基因座上的基因在許多非淋巴組織有活性轉(zhuǎn)錄，這提示它們在這些組織中可能存在一些特殊的功能(Proc.Natl.Acad.Sci.852255-2259，1988)。
本發(fā)明的人TAP除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人TAP還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。
針對本發(fā)明人TAP的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員，如小鼠的TAP)。
例如，本發(fā)明人TAP核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人TAP的表達水平或者抑制人TAP的過度表達。本發(fā)明的人TAP蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人TAP缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
實施例3人TAP在大腸桿菌中的表達編碼人TAP的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)或?qū)嵤├?中的擴增產(chǎn)物為模板進行擴增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCGGATCCATGGACACTTCTCACACTA-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的人TAP編碼序列的19個核苷酸；3’寡核苷酸引物序列為5’-GTTCGTCGACTCAGAGCAAGGTCTGCAGG-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和人TAP的編碼序列。
限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用BamHI和SalI消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。抽提質(zhì)粒，用PstI酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗證結(jié)果表明人TAP的cDNA插入片段已正確裝入載體。
過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人TAP。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人TAP。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小約為14KDa。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4人TAP在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼人TAP的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)或?qū)嵤├械臄U增產(chǎn)物為模板進行擴增，以合成插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCAAGCTTATGGACACTTCTCACACTA-3′(SEQ ID NO.7)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的人TAP編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為
5’-GTTCGGATCCTCAGAGCAAGGTCTGCAGG-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人TAP的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(f1 ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用HindIII、BamHI消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用PstI酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗證結(jié)果表明人TAP的cDNA插入片段已正確裝入載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小約為14KDa。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5制備抗體將如上獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人TAP基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復旦大學(ii)發(fā)明名稱人T細胞活化蛋白基因、其編碼的多肽及制法和用途(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1TCTGAGAGGA ACCCTTCTCT GAG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2ATTAGAGCAC CTACCTACCC AGC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長度598bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3TCTGAGAGGA ACCCTTCTCT GAGGATGGAC ACTTCTCACA CTACAAAGTC CTGTTTGCTG 60ATTCTTCTTG TGGCCCTACT GTGTGCAGAA AGAGCTCAGG GACTGGAGTG TTACCAGTGC 120TATGGAGTCC CATTTGAGAC TTCTTGCCCA TCAATTACCT GCCCCTACCC TGATGGAGTC 180TGTGTTACTC AGGAGGCAGC AGTTATTGTG GATTCTCAAA CAAGGAAAGT AAAGAACAAT 240CTTTGCTTAC CCATCTGCCC TCCTAATATT GAAAGTATGG AGATCCTGGG TACTAAGGTC 300AACGTGAAGA CTTCCTGTTG CCAGGAAGAC CTCTGCAATG TAGCAGTTCC CAATGGAGGC 360AGCACCTGGA CCATGGCAGG GGTGCTTCTG TTCAGCCTGA GCTCAGTCCT CCTGCAGACC 420TTGCTCTGAT GGTCCTCCCA ATGACCTCCA CCCTTGTCCT TTTATCCTCA TGTGCAACAA 480TTCTTCCTGG AGCCCTCTAG TGATGAATTA TGAGTTATAG AAGCTCCAAG GTGGGAGTAG 540TGTGTGAAAT ACCATGTTTT GCCTTTATAG CCCCTGCTGG GTAGGTAGGT GCTCTAAT 598(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度134個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Asp Thr Ser His Thr Thr Lys Ser Cys Leu Leu Ile Leu Leu 15Val Ala Leu Leu Cys Ala Glu Arg Ala Gln Gly Leu Glu Cys Tyr 30Gln Cys Tyr Gly Val Pro Phe Glu Thr Ser Cys Pro Ser Ile Thr 45Cys Pro Tyr Pro Asp Gly Val Cys Val Thr Gln Glu Ala Ala Val 60Ile Val Asp Ser Gln Thr Arg Lys Val Lys Asn Asn Leu Cys Leu 75Pro Ile Cys Pro Pro Asn Ile Glu Ser Met Glu Ile Leu Gly Thr 90Lys Val Asn Val Lys Thr Ser Cys Cys Gln Glu Asp Leu Cys Asn 105Val Ala Val Pro Asn Gly Gly Ser Thr Trp Thr Met Ala Gly Val 120Leu Leu Phe Ser Leu Ser Ser Val Leu Leu Gln Thr Leu Leu 134(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGCGGATCC ATGGACACTT CTCACACTA 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCGTCGAC TCAGAGCAAG GTCTGCAGG 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGCAAGCTT ATGGACACTT CTCACACTA 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGGATCC TCAGAGCAAG GTCTGCAGG 29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列。
4.一種分離的人TAP蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
8.一種產(chǎn)生具有人TAP蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人TAP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人TAP蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成人TAP蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人TAP蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人TAP蛋白活性的多肽。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸25-429位。
10.一種能與權(quán)利要求4所述的人TAP蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
11.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
12.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新的Ly－6抗原基因家族的成員T細胞活化蛋白(簡稱“TAP”)。本發(fā)明提供了該新的人TAP的cDNA編碼序列、該序列編碼的多肽,以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人TAP蛋白的方法。本發(fā)明還提供了這種新人TAP基因和蛋白的應用。
文檔編號C07K14/435GK1251861SQ98121529
公開日2000年5月3日 申請日期1998年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月20日
發(fā)明者余龍, 傅強, 趙勇, 張宏來, 屠強 申請人:復旦大學