專利名稱：棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16的克隆及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GAM4尸《M的克隆、重組 及轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽能力的分析和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
我國農(nóng)作物生產(chǎn)中的淡水、土地等資源嚴重匱乏已嚴重制約著我國農(nóng)業(yè)的 可持續(xù)發(fā)展，可耕地中有近三分之一面積的土地受到不同程度鹽漬化的影響， 而且鹽漬化耕地面積還在逐年增加。此外，我國還有15億畝以上的荒地和灘涂 是鹽堿地。據(jù)保守估計，鹽堿、低溫等環(huán)境脅迫造成的我國主要農(nóng)作物減產(chǎn)每 年高達總產(chǎn)的15%以上，其中土壤含鹽量是限制農(nóng)作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。高濃 度的鹽溶液能引起植物的高滲透脅迫，導(dǎo)致植物發(fā)育不良，生長緩慢，甚至死 亡，以致大大降低農(nóng)作物產(chǎn)量。因此，提高農(nóng)作物的抗鹽能力越來越受到人們 的重視。早期提高作物抗鹽能力的措施主要是改善土壤結(jié)構(gòu)、改進栽培管理技 術(shù)和傳統(tǒng)的雜交育種。通過改善土壤結(jié)構(gòu)來增強作物適應(yīng)性的措施周期長、成 本高。通過改進栽培管理技術(shù)來提高植物的抗鹽能力的措施也收效甚微。而傳 統(tǒng)的育種方式由于育種周期長、工作量大、成本高，加之絕大多數(shù)植物缺少抗 鹽或耐鹽基因，因此，通過傳統(tǒng)的育種方式來提高植物的抗鹽能力已遠遠無法 滿足人們的要求。近年來，植物分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展給植物抗鹽 育種開辟了新途徑。尋找與抗鹽相關(guān)的基因并研究其具體功能，通過轉(zhuǎn)基因技 術(shù)提高作物的抗鹽能力已成為一種行之有效的方法。
植物能產(chǎn)生一系列主動適應(yīng)機制來應(yīng)對各種內(nèi)外因素的影響，并將信號在細胞內(nèi)與細胞間進行快速傳遞。20世紀90年代以來，細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究引起 了國內(nèi)外生物界極為廣泛的關(guān)注。近年來的研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是一個立 體網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，促絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)途徑位于網(wǎng)絡(luò)中心，它 通過磷酸化和去磷酸化將多種脅迫信號逐級放大并傳遞到靶分子，引起細胞的 一系列抗逆反應(yīng)。植物中的MAPK級聯(lián)途徑與機械損傷、干旱、低溫、高鹽、 植物激素、生長發(fā)育以及病原物的侵染等各種刺激反應(yīng)相關(guān)聯(lián)(Jonak et al.， 2004; Xiong and Yang， 2003; Agarawal et al., 2002; Zhang and Klessig, 1998;彭立新等， 2003)。當植物受到高鹽脅迫時，MAPK基因會被誘導(dǎo)而高效表達。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從棉花幼葉中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)國際基因庫中 已發(fā)布的其它植物中促絲裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，設(shè)計兼并 引物，進行常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)。將PCR產(chǎn)物 與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，篩選重組子，進行序 列分析。然后通過3'和5'末端快速擴增(Rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技術(shù)分別獲得3'和5'端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根據(jù)cDNA 的3'和5'端序列設(shè)計特異引物，以棉花幼葉的cDNA為模板進行PCR擴增，得 到cDNA全長序列，將該cDNA命名為GAM4/^/6。
該基因的全長cDNA為2030 bp,其中開放閱讀框部分為1662 bp。由此推 得，該基因具有554個氨基酸。將其氨基酸序列在GenBank中檢索，發(fā)現(xiàn)與已 發(fā)表的OsMPK16-l (水稻，EU779804) 、 ZmMPK6 (玉米，NM_001111768)、 AtMPK16 (擬南芥，NM一121906)相比，氨基酸同源性分別為73.84 %、 76.02 %、 75.31%。由此表明，經(jīng)過上述克隆步驟得到了編碼棉花促絲裂原活化蛋白激酶的基因(^M4i^M。 該基因序列如下 序列表
(l)SEQ. ID.NO. 1的信息
(a)序列特征 長度2030 bp
類型核酸
鏈型雙鏈
拓撲結(jié)構(gòu)線性
0>)分析類型CDNA
(C)假設(shè)否
(d)反義否
0)最初來源棉花
(f)序列描述SEQ.ID.NO. 1aacttggtttctactattactttgggggct
caaagttttgatgctaag|atg|cagcctgat
tttttcactgaatatggtgagggaagcagg
agctatggtgttgtttgttcagcgtatgac
AAAATCAATGATATATTTGAACATGTATCT
cttctcaggctcctacgtcatccagacatt
tcaagaagggaatttaaagatatatacgtg
caggttatca
cttcttgggggcctgaaatacattcacaca
aaaaatatcttagccaatgctgattgcaaa
gtagcttttaatgacacccccactgcaata
tcctgtttga tgccaattgt tttctgtttc 60
cagagaagaa agtcagctgc ggatgtagm 120
tatagaatag aggaagtaat tggaaaagga 180
actcatactg gagaaaaggt tgctattaag 24 0
gacgccaccc gaatcctcag agagattaaa 300
gttgagatca agcacatatt gttccctcct 360
gtmttgaac ttatggaatc tgatttacac 4 20
ccagaacact accagtttct tctttmcag 4 80
gctaatgttt ttcatcggga tctaaagccg 540
ctgaagatct gtgattttgg gcttgcaaga 600
ttctggacgg actatgttgc aacaagatgg 660TACAGGGCTC CGGGATTGTG TGGATCCTTT TGGAGCATTG GGTGCATCTT TGCTGAACTT AATGTTGTCC ATCAZVTTGGA TCTGATGACT ATTGCTAGGG TGCGTAATGA GAAAGCTCGG CCAATTCCTC TCTCCCACAA GTTCCCTAAT AGGATGCTTG CTTTTGAACC CAAGGATCGA TATTTCAAGG GGTTGGCCAA AGTTGAAAGG GAATTTGAGT TTGAGAGACG TAGGATTACA GAAATTCTTG AGTATCATCC TAAAATGTTG GGCTTCATGT ATCCAAGTGC GGTTGACCAT CACTATGGAA ATGGTACGAC TGCAGCTCCA CCATGTGTGT TATATTCAGA TAATTCAGTA TCTAAATGTT CCATCAAGGA AACTGAGAAA ATGTCAAGGC TTCCCCCTCA AGTTCCTCAA GTAGTTGGAT CAGTMTGCG ATACAACAAT GAACAGCGAA GAATGGCTCG GAATCCTTCA TCATATCCAC GGAGAAATCC TGTCTGTAAA CCCCAGTACA TGGCTAGGAA AGTTGCTGCT fTG牟CTAATA TCAACTACAA ATGGCCAACA TGCTCTTCCT ACTGCTGGTT GAGGAAAGCT TAATTTATAG CACTAATTTC AAAGAGATGA GTGAAAGTTA GAGACTTGAG GAAAAGGCAA CTCTACTTTA TTTATTCTTT ATTAACACCC
其中透明方框內(nèi)的為起始密碼子:
(3) SEQ.ID.NO.2的信息
(a)序列特征 長度554個氨基酸 類型氨基酸
TTCTCCAAGT ATACCCCAGC AATAGATATA 7 20
CTAACAGGGA AACCTCTGTT TCCTGGAAAA 780
GATCTTTTGG GAACACCATC TGCTGAAGCC 840
AGATACTTGA GCAGCATGCG AAAGAAAAAG 900
GCAGATCCTC TTGCTGTTCT TTTGTTAGAA 960
CCTAGTGCTG AAGAGGCCCT AGCTGATCCA 1020
GAGCCTTCCG CACAACCAGT TACCAAGATG 1080
AAGGAAGATG TTAGGGAGCT CATATACCGT 114 0
AAAGAGTATC TGGAAGGATC AGAGCCAACT 1200
TTCAAGAAGC AGTTTGCCTT CCTTGAGGAG 1260
CTTGAGAGAC AACATGCATC TTTGCCAAGG 1320
CAAAACTCAA CAGATGTGAC AGATAACTTA 1380
CCCCAACCAG AGAGAAGCTT TCCAATCCCT 14 40
AGCATCCAAG GTGCTGCCAG ACCTGGGAAA 1500
TGTGGGGCAG TAGCCGCAGG TGAGGCTCTT 1560
GTTCCAACTC AGTATACTGC CACAAATTGT 1620
GATGATGAAG AAAATGAATT GCAGCCAAAA 1680
GCCCAAGGTG GMCAAGAAG TCAGTGGTM 1740
AAAAAGGCCG GTGAGGATTT ACTCCCAAAT 1800
CAGACAAGTT ACAAGTGAAG CTATGCATTG 1860
AACTGTGCCT TCTTATCCTT CATAAGATAT 1920
AAGTGAACTC TGTAACTTAT GAAGTTGGTT 1980
TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2030
灰色方框內(nèi)的為終止密碼子。鏈型單鏈 拓撲結(jié)構(gòu)線性
(b) 分析類型蛋白質(zhì)
(c) 序列描述SEQ.ID,NO-2
Met 1
Thr
Gin Pro Asp Gin Arg Arg Lys Ser Ala Ma Asp Val Asp Phe Phe
Glu Tyr
Lys Gly
Glu
Asp
65
His
Lys
50
Ala
Ser 35 Val
Gly 20 Tyr
5
G丄u
Gly Ser
Gly Val Val
Ma工le Lys
Thr Arg lie
Pro Asp lie
Arg Glu Phe
Leu His Gin 115
Gin Phe Leu 130
Ala Asn Val 145 Ala
Lys 100 Val
Val
85
Asp
Leu 70 Glu
!Lys 55 Arg
Arg Tyr 25
Cys Ser 40
工le Asn
10 Arg
Glu lie Lys
工le L<ys His
lie Tyr
工le Lys Ala
Leu Tyr Gin
Val Val 105 Asn Asp 120
Leu Arg
工le
Leu !Lys Pro
Asp Cys Lys
Phe Asn Asp
Leu 135
Phe His Arg Asp 150
Leu Lys lie Cys Asp Phe 165 170 Thr Pro Thr Ala lie Phe Trp 180 185
工le Glu Glu
Ala Tyr
Asp工le
Leu
75
Leu
Asp Thr
45 Phe Glu 60
Leu Arg
Val 30 His
15 lie
Gly
Thr Gly
His Val Ser
!Leu Leu
Phe Pro Pro
Glu Leu Met
Asp Leu
Gly Leu
Thr Pro 125 !Lys Tyr 140 Lys Asn lie 155
Gly Leu Ala Thr Asp Tyr
Glu 110 Glu
Ser 95 Ser
80 Arg
Asp
His Ty:c
lie His Thr
Leu Ala
Arg
Val 190
Val 175 Ma
160 Ala
ThrArg Trp Tyr Arg 195
Thr Pro Ala lie 210
Leu Thr Gly Lys 225
Asp Leu Met Thr
Als Pro
Asp工le
Arg Val Arg
Lys Lys Pro 275
Ala Val Leu
290 Pro Ser Als 305
Lys Val Glu
Glu Phe Glu
Tyr Arg Glu 355
Glu Gly Ser
370 Phe Lys Lys 385
Thr Ma Ala
Asn 260 工le
Pro
Asp 245 Glu
Leu 230 Leu
Lys
Pro Leu
Leu Leu Glu
Glu Glu
340 工le
Glu 325
Ala 310 Pro
Leu Glu
Glu Pro Thr
Gin Phe
Pro
Ala 390 Glu
Leu 405
Val Leu Tyr Ser Asp Asn Ser Val
Gly Leu Cys Gly 200
Trp Ser lie Gly 215
Phe Pro Gly Lys
Leu Gly Thr Pro 250
Ala Arg Arg Tyr 265
Ser His Lys Phe 280
Arg Met Leu Ala 295
Leu Ala Asp Pro
Gin Pro 330 !Lys Glu
Pro Lys
Met Tyr
Glu Glu
His Ala 410 Gin Asn
Arg工le Thr
Tyr His 360 Gly Phe 375
Phe Leu Arg Gin
Ser Phe Phe Ser Lys Tyr 205
Cys工le 220 Asn Val 235
Ser Ala
Phe
Ala Glu Leu
Val His
Glu Ala
Leu Ser Ser
Pro Asn
Phe Glu 300 Tyr Phe 315
Val Thr
Ala 285 Pro
Met 270 Asp
Gin Leu
lie Ala 255
Arg Lys Pro Leu
Lys Asp Arg
Lys Gly
Lys Met
Asp Val Arg
Met Leu
Pro Ser 380 His Tyr 395
Ser I^u
Lys Ala
Glu 350 Glu
Leu Ala 320 Glu Phe 335
Leu 工le Tyr Leu
Val Asp His
Gly Asn
Pro Arg
Ser Thr Asp Val
Gly Thr 400 Pro Cys 415
Thr Asp420 425 430
i\sn Leu Ser !Lys Cys Ser lie Lys Glu Thr Glu Lys Pro Gin Pro Glu
435 440 445
Arg Ser Phe Pro lie Pro Met Ser Arg Leu Pro Pro Gin Val Pro Gin
450 455 460
Ser工le Gin Gly Ala Ala Arg Pro Gly Lys Val Val Gly Ser Val Leu 465 470 475 480
Arg Tyr Asn Asn Cys Gly Ala Val Ala Ala Gly Glu Ala Leu Glu Gin
485 490 495
Arg Arg Met Ala Arg Asn Pro Ser Val Pro Thr G丄n Tyr Thr Ala Thr
500 505 510
Asn Cys Ser Tyr Pro Arg Arg Asn Pro Val Cys Lys Asp Asp Glu Glu
515 520 525
Asn Glu Leu Gin Pro Lys Pro Gin Tyr Met Ala Arg Lys Val Ala Ala
530 535 540
Ala Gin Gly Gly Ser Arg Ser Gin Trp Tyr 545 550
本發(fā)明還提供了編碼促絲裂原活化蛋、白激酶基因G/2M4尸ia6在農(nóng)作物中應(yīng)
用的方法，可提高作物的抗鹽能力。步驟為
(a) 利用棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因(^M4Pia6，將cDNA序列置于 CaMV35S啟動子之下，構(gòu)建植物表達載體。
(b) 將表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞。
(c) 利用(b)獲得的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化植物，得到轉(zhuǎn)基因植株。 本發(fā)明從棉花中分離出一種編碼促絲裂原活化蛋白激酶的基因
(GAM4尸iW6)，將該cDNA序列構(gòu)建在由組成型CaMV35S強啟動子控制的 真核轉(zhuǎn)化載體pBI121上，構(gòu)建了 G/zM4P尺i6的正義表達載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草栽培品種NC89。對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進行抗鹽能力分析表 明，轉(zhuǎn)基因煙草中G7zM4尸K/6的過量表達能提高其抗鹽能力。在含200 mMNaCl 的GM固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草可正常生長，而非轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)育遲緩。在 土壤中生長6周后對其定時定量澆灌濃度為200 mM的NaCl溶液，相對于非轉(zhuǎn) 基因煙草，轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的抗鹽能力。該基因轉(zhuǎn)化棉花、小麥、玉米等 農(nóng)作物，可提高其抗鹽能力，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重大的經(jīng)濟價值和社會 價值。
四

圖1.棉花中GhMAPK16氨基酸序列與幾種其它植物的MAPK氨基酸序列 的比較結(jié)果。其中相同的氨基酸殘基用黑底表示。它們在GenBank中的注冊號 及其物種來源分別為OsMPK16-l (水稻，EU779804) 、 ZmMPK6 (玉米， NM—001111768) 、 AtMPK16 (擬南芥，NM—121906)。
圖2.煙草正義表達載體的構(gòu)建程序。
圖3.部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果。CK-:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?；CK+: pBI121 質(zhì)粒作為陽性對照；1-12:轉(zhuǎn)基因煙草植株M: markerDL2000
圖4.過量表達GAM1P《7(5的轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草在含200 mM NaCl的GM固體培養(yǎng)基上的生長狀況比較。A:轉(zhuǎn)基因煙草；B:非轉(zhuǎn)基因煙草
圖5.轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草在土壤中的生長狀況。生長6周后對其澆 灌濃度為200 mM的NaCl溶液，每次定量澆30 ml，每周澆2-3次，維持3周。 然后用清水澆灌，使其恢復(fù)一周。A:轉(zhuǎn)基因煙草；B:非轉(zhuǎn)基因煙草
五具體實施例方式
實施方式(一) 一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhM4戶jn6的克隆方法
1. RNA的提取利用TRIZOL試劑盒提取棉花總RNA
2. cDNA第一鏈的合成
在0.25 ml離心管中加入下列試劑
mRNA
oligo d(T)引物 DEPC-H20
4^1
2|Lll
6 pi
吸打混勻后65。C水浴5min，冰上冷卻5 min，輕離心，加入下列試劑:
;xFirst-Strand Buffer
Rnasin Ribonuclease Inhibitor
10mMdNTP
EasyScript Reverse Transcriptase
4|ul 1 pi
1 |Lll
1 ^
0.1 MDTT
輕輕敲打混勻，稍離心后，42"保溫lh， 3. cDNA的5'加尾反應(yīng)
2^1
然后-20。C保存?zhèn)溆?
(a)反應(yīng)體系:
cDNA
5 xTdT Buffer 0.1%BSA lOOmMdCTP TdT
ddH20 Up to
20 |il 10 pi 5^1 1 pi 1 |il 50 |ul(b) 37。C保溫30min。
(c) 加100iil無水乙醇，-20。C沉淀30min。
(d) U,000rpm，室溫離心5min。棄上清，干燥后加適量ddH20回溶。 4. cDNA全長序列的獲得
4.1用兼并引物進行PCR反應(yīng)獲得G/2M4P《76中間片段 體系如下
10xEasy7b《buffer 2.5 jal
dNTP mixture (10 mM) 1 pi
MPl(lO 一) 1 nl
MP2(10juM) 1 cDNA 1 pl
r"《E 0.25 (^1
ddH20 Up to 25 pi
反應(yīng)程序為:
<formula>formula see original document page 12</formula>反應(yīng)完畢后，電泳檢測結(jié)果并回收正確片段。將所得片段連入pMD18-T， 取PCR產(chǎn)物4 pi與pMD18-T載體連接，操作步驟按照TaKaRa公司產(chǎn)品 pMD18-T Vector說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞， 在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落至 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h，進行菌液PCR鑒定。將正確的菌樣在含有氨芐青霉 素(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。堿法小量提取質(zhì)粒DNA,酶切 鑒定后進行序列測定。
4.2 5'RACE獲得5'端序列
(a)用上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR，體系如下
10xEasyra《buffer 2.5 [il
dNTP mixture (10 mM) 1 pi
AAP(10岸) 1^1 5P1 (10岸) 1 pi
cDNA 1 pi
E 0.25 pi
ddH20 Up to 25 jal
(bO反應(yīng)程序為
94。C 5 min
94 °C 1 min 52°C 1 min 72 。C 1 min
、
卜35個循環(huán)
72 °C 5 min(c) 同樣的體系和反應(yīng)程序以第一次PCR產(chǎn)物為模板做二次PCR，引物為 AUAP和5P2。
(d) 將所得片段連入pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，對生長的 菌落進行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切鑒定，然后進行序列測定。
4.3 3'RACE獲得3'端序列
(a)用上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR，體系如下
10xEasy7b《buffer 2.5 pil
dNTP mixture (10 mM) 1 jnl
B26(10闊 1
3P1 (10 )iM) 1
cDNA 0.5 pl
7b《E 0.25 pl
ddH20 Up to 25 pi
(b)反應(yīng)程序為
94 。C 5 min
94 °C 1 min
52°C 1 min ^ 35個循環(huán)
72 °C 1 min
72 °C 5 min(c) 以同樣的體系和反應(yīng)程序，用第一次PCR產(chǎn)物為模板做二次PCR，引物 為B25和3P2。
(d) 將所得片段連入pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，對生長的 菌落進行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切鑒定，然后進行序列測定。
4.4 cDNA全長序列的獲得
根據(jù)已測定序列及其重疊區(qū)域，拼出目的基因的全長cDNA，設(shè)計引物HP1 和引物HP2， PCR擴增全長序列作進一步的驗證。， (a)反應(yīng)體系
(b)反應(yīng)程序:
10xEasyra《buffer2.5 |il
dNTP mixture (10 mM)1 pi
HPl(10jiM)1 jLll
HP2(10 jiM)1 pi
cDNA0.5 pi
7b《E0.25 pi
ddH20 Up to50 pi
94 °C 5 min
94。C 30 sec ，
55°C 30 sec> 35個循環(huán)
72 °C 90 sec」
72 °C 5 min(c)將所得片段連入pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5(x感受態(tài)細胞，對生長的 菌落進行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切鑒定，然后進行序列測定。
5.同源檢索利用BLAST軟件將分離出的全長cDNA序列與GenBank中
的序列進行比較。
實施方式(二)棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因G^M4尸i^6的序列見SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2。
實施方式(三)表達載體的構(gòu)建
(1) 根據(jù)分離出的棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因的核苷酸序列，設(shè)計引
物
正向引物5 '畫TCTAGAGGGGCTTCCTGTTTGATGCC國3'
劃橫線部分為i酶切位點
反向引物5 '-GTCGACGGGGCTTCCTGTTTGATGCC-3'
劃橫線部分為1酶切位點
以棉花幼葉的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)。
(2) 取PCR產(chǎn)物4 pi與pMD18-T Simple載體連接，操作步驟按照TaKaRa 公司產(chǎn)品pMD18-T Simple Vector說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素(50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。挑取 白色菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h，進行菌液PCR鑒定。將正確的菌樣在含 有卡那霉素(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。堿法小量提取質(zhì)粒DNA， 酶切鑒定后進行序列測定。
(3) 將PCR擴增得到目的片段用^" I和5W I酶切，與用相同的限制性內(nèi) 切酶酶切的pBI121表達載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，然后在含卡那霉素(50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對生長的菌落進行PCR鑒 定和質(zhì)粒DNA的酶切鑒定。
(4)將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，本發(fā)明采用的 是凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
實施方式(四)轉(zhuǎn)基因植物的獲得
(1) 煙草NC89種子，播種于MS基本培養(yǎng)基中，至5-6片真葉期，備用。
(2) 挑取農(nóng)桿菌(攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落)接種于含有50mg/L卡 那霉素的YEP培養(yǎng)基中，28°C， 250rpm，振蕩培養(yǎng)約48 h，至對數(shù)生長后期； 將菌液用MS培養(yǎng)液稀釋10倍，待用。
(3) 取煙草葉片，剪成小塊(0.5 x0.5cm)，將剪好的煙草葉片，置于MS 預(yù)分化培養(yǎng)基中，28°C，光照時間16h/d，光照強度2,000 Lux，預(yù)培養(yǎng)2d。
(4) 將預(yù)培養(yǎng)后的煙草葉片浸入菌液5-10min，然后用滅菌的濾紙吸干多 余菌液，接入MS基本培養(yǎng)基；弱光下，28'C共培養(yǎng)2d。
(5) 共培養(yǎng)后的外殖體先用含羧芐青霉素250 mg/L的無菌水洗滌3次，再 用含羧芐青霉素250 mg/L的MS培養(yǎng)液洗1次，然后用滅菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)入含 有卡那霉素100 mg/L，羧節(jié)青霉素250 mg/L的MS選擇培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)(條 件同預(yù)培養(yǎng))；每15 d更換一次培養(yǎng)基。
(6) 待芽長至lcm左右時，切下，移入MS生根培養(yǎng)基(附加卡那霉素 50mg/L，羧芐青霉素250 mg/L)中，促其生根。
(7) 根系發(fā)育好后(5-6片葉)，移入盛有無菌土的花盆中，溫室常規(guī)管理。 實施方式(五)轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽能力分析
(1)將T2代轉(zhuǎn)基因株系種子種在200mMNaCl的GM培養(yǎng)基上，觀察其生長狀況。
(2)觀察轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草在土壤中的生長狀況。生長6周后對
其澆灌濃度為200 mM的NaCl溶液，每次定量澆30 ml，每周澆3次，維持3 周。然后用清水澆灌，使其恢復(fù)一周。
通過轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽能力分析看出，轉(zhuǎn)基因植株相對于非轉(zhuǎn)基因煙草具有 明顯的抗鹽能力。該基因轉(zhuǎn)化棉花、小麥、玉米等農(nóng)作物，可提高其抗鹽能力， 提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重大的經(jīng)濟價值和社會價值。序列表
<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因G/zM4戶iW6的克隆及其應(yīng)用
<160〉2
<210〉1
<211>2030
<212>cDNA
<213>棉花((？0，/7/麵/ >加廳) <221>1國2030 <400〉1
AACTTGGTTT CTACTATTAC CAAAGTTTTG ATGCTAAGAT TTTTTCACTG AATATGGTGA AGCTATGGTG TTGTTTGTTC AAAATCAATG ATATATTTGA CTTCTCAGGC TCCTACGTCA TCAAGAAGGG AATTTAAAGA CAGGTTATCA AAGCAAATGA CTTCTTCGGG GCCTGAAATA AAAAATATCT TAGCCAATGC GTAGCTTTTA ATGACACCCC TACAGGGCTC CGGGATTGTG TGGAGCATTG GGTGCATCTT AATGTTGTCC ATCAATTGGA ATTGCTAGGG TGCGTAATGA CCAATTCCTC TCTCCCACAA
19
TTTGGGGGCT TCCTGTTTGA GCAGCCTGAT CAGAGAAGAA GGGAAGCAGG TATAGAATAG AGCGTATGAC ACTCATACTG ACATGTATCT GACGCCACCC TCCAGACMT GTTGAGATCA TATMACGTG GTATTTGAAC TGATTTGACC CCAGAACACT CATTCACACA GCTAATGTTT TGATTGCAAA CTGAAGATCT CACTGCAATA TTCTGGACGG TGGATCCTTT TTCTCCAAGT TGCTGAACTT CTAACAGGGA TCTGATGACT GATCTTTTGG GAAAGCTCGG AGATACTTGA GTTCCCTAAT GCAGATCCTC
TGCCAATTGT TTTCTGTTTC 60 AGTCAGCTGC GGATGTAGAT 120 AGGAAGTAAT TGGAAAAGGA 180 GAGAAAAGGT TGCTATTAAG 24 0 GAATCCTCAG AGAGATTAAA 300 AGCACATATT GTTCCCTCCT 360 TTATGGAATC TGATTTACAC 420 ACCAGTTTCT TCTTTATCAG 4 80 TTCATCGGGA TCTAAAGCCG 54 0 GTGATTTTGG GCTTGCAAGA 600 ACTATGTTGC AACAAGATGG 660 MACCCCAGC AATAGATATA 7 20 AACCTCTGTT TCCTGGAAAA 780 GAACACCATC TGCTGAAGCC 840 GCAGCATGCG AAAGAAAAAG則 TTGCTGTTCT TTTGTTAGAA 960AGGATGCTTG CTTTTGAACC CAAGGATCGA TATTTCAAGG GGTTGGCCAA AGTTGAAAGG GAATTTGAGT TTGAGAGACG TAGGATTACA GAAATTCTTG AGTATCATCC TAAAATGTTG GGCTTCATGT ATCCAAGTGC GGTTGACCAT CACTATGGAA ATGGTACGAC TGCAGCTCCA CCATGTGTGT TATATTCAGA TAATTCAGTA TCTAAATGTT CCATCAAGGA AACTGAGAAA ATGTCAAGGC TTCCCCCTCA AGTTCCTCAA GTAGTTGGAT CAGTATTGCG ATACAACAAT GAACAGCGAA GAATGGCTCG GAATCCTTCA TCATiVTCCAC GGAGAAATCC TGTCTGTAAA CCCCAGTACA TGGCTAGGAA AGTTGCTGCT TGACCTAATA TCAACTACAA ATGGCCAACA TGCTCTTCCT ACTGCTGGTT GAGGAAAGCT TAATTTATAG CACTAATTTC AAAGAGATGA GTGAAAGTTA GAGACTTGAG GAAAAGGCAA CTCTACTTTA TTTATTCTTT ATTAACACCC
CCTAGTGCTG AAGAGGCCCT AGCTGATCCA 1020 GAGCCTTCCG CACAACCAGT TACCAAGATG 1080 AAGGAAGATG TTAGGGAGCT CATATACCGT 114 0 AAAGAGTATC TGGAAGGATC AGAGCCAACT 1200 TTCAAGAAGC AGTTTGCCTT CCTTGAGGAG 1260 CTTGAGAGAC AACATGCATC TTTGCCAAGG 1320 CAAAACTCAA CAGATGTGAC AGATAACTTA 1380 CCCCAACCAG AGAGAAGCTT TCCAATCCCT 14 4 0 AGCATCCAAG GTGCTGCCAG ACCTGGGAAA 1500 TGTGGGGCAG TAGCCGCAGG TGAGGCTCTT 1560 GTTCCAACTC AGTATACTGC CACAAATTGT 1620 GATGATGAAG AAAATGAATT GCAGCCAAAA 1680 GCCCAAGGTG GATCAAGAAG TCAGTGGTAT 17 4 0 AAAAAGGCCG GTGAGGATTT ACTCCCAAAT 1800 CAGACAAGTT ACAAGTGAAG CTATGCATTG 18 60 AACTGTGCCT TCTTATCCTT CATAAGATAT 1920 AAGTGAACTC TGTAACTTAT GAAGTTGGTT 1980 TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2030
<210>2
<211>554
<212>PRT
<213>棉花((？,，',
<221>l-554
<400>2
Met Gin Pro Asp Gin Arg Arg Lys Ser Ala Ala Asp Val Asp Phe Phe 15 10 15Gly Val Val
Ala工le !Lys
Arg
lie
Lys 100 Val
lie Leu
70 Val Glu 85
Asp 工le
Lys 55 Arg
lie
Tyr
工le Lys Ala
Thr Glu Tyr Gly Glu Gly Ser 20
Lys Gly Ser Ty;t 35
Glu Lys Val 50
Asp Ala Thr 65
His Pro Asp
Arg Glu Phe
Ijeu His Gin 115
Gin Phe Leu 130
Ala Asn Val 145
Ala Asp Cys
Phe Asn Asp
Arg Trp Tyr 195
Thr Pro Ala
210 Leu Thr Gly 225
Asp Leu Met
Leu Tyr Gin
Phe
Lys
Thr 180 Arg
His Arg 150 Leu Lys 165
Pro Thr
Leu 135 Asp
工le
Ala
Ala Pro Gly
Arg Tyr Arg lie Glu
25
Cys Ser Ala Tyr Asp 40
工le Asn Asp工le Phe 60
Glu 工le Lys Leu Leu 75
Lys His lie Leu Phe 90
Val Val Phe 105
Asn Asp Asp 120
Leu Arg Gly
Glu Val lie Gly 30
Thr
45
Glu
His
Thr Gly
His Val Ser
Arg Leu
Pro Pro
Glu Leu Met
Leu Arg
80 Ser Arg 95
Ser Asp
Glu 110
Leu Thr Pro Glu His Tyr
125 Tyr
Leu Lys 140
Leu Lys Pro Lys Asn lie Leu 155
Gly L eu
lie His Thr
Cys Asp Phe 170
工le Phe Trp 185
Leu Cys Gly 200
Ser lie Gly
Ala Arg
Thr Asp Tyr
Ala Asn 160 Val Ala 175
Ala Thr
Val 190
Ser Phe Phe Ser Lys Tyr 205
Phe Ala Glu Leu
lie Asp lie Trp Ser lie Gly Cys lie
215 220 '
Lys Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn Val Val His Gin Leu 230 235 240
Thr Asp Leu Leu Gly Thr Pro Ser Ala Glu Ala工le AlaArg Val Arg
Lys Lys
Ala Val 290 Pro Ser 305
Lys Val
Pro 275 Leu
Asn 260 lie
245 250 Glu Lys Ala Arg Arg Tyr 265
Ser His Lys
280 Arg Met
Pro Leu
Leu Ljeu Glu
Ala Glu
Glu Arg
Glu Phe Glu
Tyr Arg
Glu Gly
370 Phe !Lys 385
Thr Ala
Glu 355 Ser
Arg 340 工le
Glu Ala 310 Glu Pro 325
Arg Arg
295 Leu
Glu Pro Thr
Lys Gin
Ala Pro
Val Leu Tyr
Asn Leu
Arg Ser 450 Ser工le 465
Ser 435 Phe
Ser 420 Lys
Phe Ala 390 Leu Glu 405
Asp Asn
Gly 375 Phe
Cys Ser工le
Pro 工le Pro
Gin Gly
Ala Ala 470
Met 455 Arg
Ala Asp Pro
Ser Ala Gin
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Leu Glu Tyr
His 360 Phe
Pro 330 !Lys Glu 345
Pro !Lys Met Tyr
!Leu Glu Glu
Arg Gin
Ser Val
His Ala 410 Gin Asn 425
!Lys Glu Thr 440
Ser Arg Leu Pro Gly Lys
Leu Ser Ser
Phe Pro Asn
Leu Ala
Phe Glu 300 Tyr Phe 315
Val Thr
Ala 285 Pro
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255 Arg
Lys
Pro ;Leu
Lys Asp Arg
Lys Gly Leu
Lys Met
Asp Val Arg
Met Leu
Pro Ser 380 His Tyr 395
Ser Leu
Lys 365 Ala
Glu 350 Glu
Glu 335 Leu
Ala 320 Phe
工le
Tyr Leu
Val Asp His
Gly Asn Gly
Pro Arg
Ser Thr Asp
Glu L'ys
Pro Pro 460 Val Val 475
Pro 445 Gin
Val 430 Gin
Pro 415 Thr
Thr 400 Cys
Asp
Pro Glu
Val Pro Gin
Gly Ser Val
Leu 480Arg Tyr Asn Asn Cys Gly Ala Val Ala Ala Gly Glu Ma Leu Glu Gin
485 490 495
Arg Arg Met Ala Arg Asn Pro Ser Val Pro Thr Gin Tyr Thr Ala Thr
500 505 510
Asn Cys Ser Tyr Pro Arg Arg Asn Pro Val Cys Lys Asp Asp Glu Glu
515 520 525
Asn Glu Leu Gin Pro Lys Pro Gin Tyr Met Ala Arg Lys Val Ala Ala
530 535 540
Ala Gin Gly Gly Ser Arg Ser Gin Trp Tyr 545 550
權(quán)利要求
1.一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK16，其特征在于它具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.1；具有氨基酸序列SEQ.ID.NO.2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所示的核苷酸序列，其特征在于該基因選自棉花。
3. 實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種克隆棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因的方 法，步驟為A、根據(jù)國際基因庫中已發(fā)布的其它植物中促絲裂原活化蛋白激酶基因的保 守氨基酸序列，設(shè)計兼并引物；B、棉花幼葉中提取總RNA，進行常規(guī)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)；C、將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細胞，篩選重組子，進行序列分析；D、通過3'和5'末端快速擴增技術(shù)分 別獲得3'和5'端序列，并拼接成完整的cDNA序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼促絲裂原活化蛋白激酶基因G/zM4Pia(5的應(yīng) 用，其特征在于該基因在煙草栽培品種NC89中過量表達，能提高轉(zhuǎn)基因煙草抗 鹽能力，該基因可應(yīng)用在農(nóng)作物中以提高其抗鹽能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因的克隆、重組及抗鹽性功能分析和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從棉花幼葉中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)其它植物中促絲裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，設(shè)計兼并引物，進行常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選重組子，進行序列分析，再通過3′和5′末端快速擴增技術(shù)獲得全長cDNA。進一步構(gòu)建植物正義表達載體，轉(zhuǎn)化煙草栽培品種NC89，轉(zhuǎn)基因煙草具有明顯的抗鹽能力，將該基因轉(zhuǎn)化棉花、小麥、玉米等農(nóng)作物，可提高作物抗鹽能力，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重大的經(jīng)濟價值和社會價值。
文檔編號C12N15/54GK101608184SQ200910019779
公開日2009年12月23日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者良 張, 靜 石, 郭興啟 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 被以下專利引用 (2),