毛蕊異黃酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷在制備促進(jìn)骨形成藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，公開(kāi)了毛蕊異黃酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷（CG）新的醫(yī)藥用途。經(jīng)藥理試驗(yàn)證明，CG具有促進(jìn)骨形成的作用，可用于治療骨質(zhì)疏松癥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CG能促進(jìn)ALP表達(dá)，增強(qiáng)礦化結(jié)節(jié)生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程中相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。分別在去卵巢和維甲酸腹腔注射誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠模型，發(fā)現(xiàn)CG對(duì)骨密度和骨形態(tài)學(xué)參數(shù)均有所改善，能有效改善大鼠骨質(zhì)疏松癥狀。
【專利說(shuō)明】毛蕊異黃酮-7-氧-β -D-吡喃葡萄糖苷在制備促進(jìn)骨形成藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及毛蕊異黃酮_7_氧-β -D-吡喃匍萄糖苷(CG)的新用途，特別是CG在制備促進(jìn)骨形成藥物中的用途，以及在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]骨是一種結(jié)締組織，包含成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞兩種細(xì)胞系，骨基質(zhì)是由連續(xù)的骨再建來(lái)調(diào)節(jié)，用來(lái)調(diào)控身體礦物質(zhì)的平衡。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞平衡失調(diào)導(dǎo)致骨形成和骨吸收的紊亂，導(dǎo)致多種骨相關(guān)性疾病如骨質(zhì)疏松癥、血鈣過(guò)多、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)入骨、牙周炎等疾病的發(fā)生。
[0003]黃苗Astragalus membranaceus (Fisch.)為豆科草本植物蒙古黃苗、膜莢黃苗的根，為常見(jiàn)的補(bǔ)氣中藥，具有增強(qiáng)免疫、抗菌、抗病毒、抗炎、保肝等功效。黃芪含有許多活性成分，主要包括黃酮、皂苷和多糖類。研究表明，黃芪提取物在體外可以抑制破骨細(xì)胞的發(fā)育，在骨質(zhì)疏松大鼠 中可以抑制脛骨和腰椎骨的丟失。黃芪水提液抑制去卵巢后的骨吸收，能增加體重。黃芪總黃酮具有類性激素的功能，能顯著提高維甲酸致大鼠骨質(zhì)疏松模型的骨密度，增強(qiáng)抗外力沖擊的能力。同時(shí)還能明顯的改善骨質(zhì)，增加骨密度、防治生殖器官損傷的作用。黃芪和司坦唑醇復(fù)方制劑在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的同時(shí)，能有效避免司坦唑醇對(duì)肝臟的毒性損害作用，并降低去勢(shì)手術(shù)及雌激素替代療法對(duì)大鼠子宮的不良影響。以黃芪為君藥的中成藥芪康骨寶可通過(guò)促進(jìn)骨生長(zhǎng)、抑制骨吸收的作用而對(duì)長(zhǎng)期使用潑尼松所導(dǎo)致的抑制骨生長(zhǎng)，骨量丟失等有較好的防治作用。
[0004]毛蕊異黃酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(calycosin-7-O- β -D-glucopyranoside, CG)是黃芪黃酮的一種，它的分子式為C22H22Oltl，分子量為446，化學(xué)名為3'-羥基-4'-甲氧基異黃酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。
[0005]CG在體外可以高效抑制透明質(zhì)酸酶的活性，在人的關(guān)節(jié)軟骨外植體和軟骨細(xì)胞中用黃芪提取物或CG處理后，可以顯著抑制由重組體人白細(xì)胞介素-1 β (IL-Ιβ)或透明質(zhì)酸酶導(dǎo)致的基質(zhì)降解。CN101590072公開(kāi)了 CG抗艾滋病的用途，CN1813711公開(kāi)了 CG抗柯薩奇病毒的用途，但是有關(guān)CG促進(jìn)骨形成方面的用途尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種毛蕊異黃酮-7-氧-β -D-吡喃葡萄糖苷(CG)的新用途，即CG用于制備促進(jìn)骨形成藥物的用途，尤其是CG用于制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物的用途。
[0007]所述藥物為藥物組合物，它含有有效劑量的毛蕊異黃酮-7-氧-β -D-吡喃葡萄糖苷以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
[0008]本發(fā)明以成骨條件培養(yǎng)基OBM培養(yǎng)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(ST2)，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化為體外細(xì)胞模型，首次發(fā)現(xiàn)CG能促進(jìn)ALP表達(dá)，增強(qiáng)礦化結(jié)節(jié)生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程中相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。分別在去卵巢和維甲酸腹腔注射誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠模型，首次發(fā)現(xiàn)CG對(duì)骨密度和骨形態(tài)學(xué)參數(shù)均有所改善，能有效改善大鼠骨質(zhì)疏松癥狀。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1是CG對(duì)成骨細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞增殖的影響。
[0010]圖2是CG對(duì)ST2細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。
[0011]圖3是CG對(duì)ST2細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響。
[0012]圖4是CG在ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)相關(guān)成骨性基因mRNA表達(dá)的影響。
[0013]圖5是CG在ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)相關(guān)成骨性蛋白表達(dá)的影響。
[0014]圖6是CG 給藥后對(duì)去勢(shì)大鼠骨密度的影響。
[0015]圖7是CG給藥后對(duì)去勢(shì)大鼠血清骨鈣素(BGP)影響。
[0016]圖8是CG給藥后對(duì)去勢(shì)大鼠血清總堿性磷酸酶(ALP)影響。
[0017]圖9是CG給藥后對(duì)維甲酸大鼠骨密度的影響。
[0018]圖10是CG給藥后對(duì)維甲酸大鼠血清BGP影響。
[0019]圖11是CG給藥后對(duì)維甲酸大鼠血清ALP影響。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。
[0021]實(shí)施例1
[0022]1.實(shí)驗(yàn)方法
[0023]1.1體外模型:
[0024]以小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞ST2為細(xì)胞模型，采用成骨條件培養(yǎng)基OBM (IOnM的地塞米松、50μ g/ml的L抗壞血酸和IOmM的β甘油磷酸鈉，培養(yǎng)誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，構(gòu)建成骨細(xì)胞模型，在本細(xì)胞模型上進(jìn)行以下體外實(shí)驗(yàn):
[0025](I)采用MTT法檢測(cè)不同濃度CG對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響；
[0026](2)采用PNPP法檢測(cè)不同濃度CG和對(duì)照組ST2細(xì)胞中成骨細(xì)胞成熟分化早期標(biāo)志物堿性磷酸酶(ALP)活性的表達(dá)情況；
[0027](3)采用茜素紅染色法對(duì)比分析不同濃度CG處理組和對(duì)照組ST2細(xì)胞中成骨細(xì)胞成熟分化晚期標(biāo)志物骨鈣素(OCN)的表達(dá)情況；
[0028](4)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，研究不同濃度CG和對(duì)照組對(duì)成骨性相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況的影響，選取了成骨重要調(diào)控因子RUNX2、下游基質(zhì)礦化代表物0CN、BMP信號(hào)通路中重要調(diào)控因子BMP2和Wnt信號(hào)通路中重要調(diào)控因子β -catenin這4個(gè)代表性基因；
[0029](5)通過(guò)蛋白印跡Western blot法,研究不同藥物濃度組和對(duì)照組對(duì)ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化成熟過(guò)程中相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響，選取了成骨重要調(diào)控因子RUNX2、BMP信號(hào)通路中重要調(diào)控因子Smadl/5/8和Wnt信號(hào)通路中重要調(diào)控因子β -catenin這3個(gè)代表性蛋白。
[0030]1.2體內(nèi)模型:以雄性Wister大鼠(150_180g)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別通過(guò)無(wú)菌開(kāi)腹摘除雙側(cè)卵巢和用維甲酸70mg/(kg.d)腹腔注射，構(gòu)建兩種骨缺失大鼠模型(0VX與RA)，分別研究連續(xù)灌胃高、低劑量組CG6周，對(duì)模型大鼠股骨中點(diǎn)密度(BMD)，脛骨上段靜態(tài)參數(shù)(骨小梁面積百分比Tb.Ar、骨小梁密度Tb.Th、骨小梁間隙Tb.Sp)，血清ALP和BGP的影響。具體如下:
[0031]1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與建模方法
[0032]SPF級(jí)Wister大鼠(雄性，150_180g，購(gòu)于湖北省武漢疾病預(yù)防控制中心)隨機(jī)分組成正常對(duì)照組、去勢(shì)大鼠組、去勢(shì)大鼠+CG高劑量組、去勢(shì)大鼠+CG低劑量組、維甲酸組，維甲酸組+CG高劑量組，維甲酸組+CG低劑量組，每組8只。去勢(shì)大鼠模型組:腹腔注射10 %水合氯醛(0.SmL-1OOg-1)麻醉后，在無(wú)菌的條件下，開(kāi)腹完整切除卵巢(雙側(cè))，徹底止血，逐層縫合切口并消毒。正常對(duì)照組操作同上，僅摘除卵巢周圍少許脂肪組織，不切除卵巢，每天給藥I次，連續(xù)6周。維甲酸模型組，正常對(duì)照組給予溶劑對(duì)照溶液外，其余組均用維甲酸70mg/(kg.Cf1)造模，造模同時(shí)分別給予溶劑對(duì)照溶液、CG高、低劑量，連續(xù)6周。所有大鼠在處死前第3天和第11天分別皮下注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg和鈣黃綠素5mg/kg進(jìn)行活體熒光標(biāo)記。
[0033]1.2.2指標(biāo)測(cè)定
[0034](I)分離完整左股骨，剔凈表面軟組織后_20°C冰箱保存。用DPX-1Q型骨密度儀及所附小動(dòng)物骨密度測(cè)定軟件進(jìn)行股骨BMD測(cè)量。
[0035](2)取右股骨遠(yuǎn)端100g/L中性福爾馬林固定24h，90ml/L甲酸脫鈣21d，常規(guī)石蠟切片，切片厚度4um，HE染色。顯微鏡下觀察形態(tài)變化。采用LEICA DMLA顯微鏡及LeicaQ-Win3.0圖像分析系統(tǒng)，對(duì)股骨遠(yuǎn)端干骺端內(nèi)與骺軟骨板相距1_的松質(zhì)骨進(jìn)行觀察與測(cè)量，并計(jì)算骨小梁面積百分比(Tb.Ar)、骨小梁密度(Tb.Th)和骨小梁間隙(Tb.Sp)。
[0036](3)血生化指標(biāo)的測(cè)定處死動(dòng)物前24h禁食，靜脈取血，3000r.mirT1離心10min后分離血清，保存于_20°C冰箱中待檢測(cè)。按照ELISA試劑盒分別檢測(cè)血清中BGP和ALP含量。
[0037]2.數(shù)據(jù)處理
[0038]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件,數(shù)據(jù)用X土SD表示。組間比較使用Student, s多重比較以計(jì)算顯著性差異，P ( 0.05有顯著性差異，P ^0.01有極顯著性差異。*P ( 0.05或**P ( 0.01與正常對(duì)照組比較;#P < 0.05或##P ( 0.01與模型組比較。
[0039]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0040](I)不同濃度CG在ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞增殖的影響
[0041]各組細(xì)胞增值率結(jié)果見(jiàn)圖1，結(jié)果表明各時(shí)間點(diǎn)、各藥物濃度對(duì)ST2細(xì)胞的增殖都沒(méi)有影響，對(duì)ST2細(xì)胞沒(méi)有毒性。這說(shuō)明所選取的藥物濃度范圍不在毒性范圍內(nèi)。
[0042](2)不同濃度CG對(duì)ST2細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的影響
[0043]各組ALP活性見(jiàn)圖2，CG對(duì)ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中ALP活性呈劑量依賴性，16 μ M和32 μ M組顯著的促進(jìn)了 ALP活性(P < 0.01)，說(shuō)明CG促進(jìn)成骨細(xì)胞進(jìn)一步向更成熟的方向分化。
[0044](3)不同濃度CG對(duì)ST2細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響
[0045]各組礦化結(jié)節(jié)形成見(jiàn)圖3，16 μ M和32 μ M組顏色要比對(duì)照組顏色深，而4 μ M濃度組顏色比對(duì)照組要淺，這與ALP活性第7天的檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明CG在ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并且成為成熟的成骨細(xì)胞的過(guò)程中具有促進(jìn)作用。
[0046](4)不同濃度CG在ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)相關(guān)成骨性基因mRNA表達(dá)的影響
[0047]各組各指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平見(jiàn)圖4，各藥物濃度組相對(duì)對(duì)照組而言，Runx2的mRNA表達(dá)均呈促進(jìn)趨勢(shì)，具有顯著性差異，其中8μ M藥物組Runx2的mRNA表達(dá)極顯著高于模型組(P≤0.01 )。OCL的mRNA表達(dá)均呈促進(jìn)作用，其中16 μ M藥物組OCL的mRNA表達(dá)極顯著高于模型組(P≤ 0.01)。BMP2的mRNA表達(dá)均呈促進(jìn)作用，并且呈劑量依賴性，其中16μΜ和32 4]?藥物組81^2的mRNA表達(dá)極顯著高于模型組(P ≤ 0.01)。β -catenin的mRNA表達(dá)均呈促進(jìn)作用，其中8μΜ和32μΜ藥物組β -catenin的mRNA表達(dá)顯著高于模型組(P≤0.05)。說(shuō)明CG可以促進(jìn)Runx2、0CL、BMP2和β-catenin的mRNA表達(dá)，進(jìn)而可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨的形成。
[0048](5)不同濃度CG在ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)相關(guān)成骨性蛋白表達(dá)的影響
[0049]各組各指標(biāo)的蛋白表達(dá)水平見(jiàn)圖5，各藥物濃度與對(duì)照組相比，均上調(diào)了 Runx2蛋白的表達(dá)，其中16 μ M藥物處理組蛋白表達(dá)量最高；增強(qiáng)Smadl/5/8蛋白的磷酸化，其中16 μ M組藥物對(duì)Smadl/5/8蛋白的磷酸化作用最強(qiáng)；上調(diào)β-catenin蛋白的表達(dá),其中16 μ M的CG促進(jìn)作用最明顯。
[0050](6)不同濃度CG對(duì)去勢(shì)大鼠骨密度的影響
[0051]各組骨密度結(jié)果見(jiàn)圖6，與空白對(duì)照組相比，去勢(shì)大鼠組骨密度明顯降低(P ( 0.05)，與模型組相比，CG高低濃度組均極顯著性地上調(diào)了去勢(shì)大鼠骨密度(P ( 0.01)，說(shuō)明CG能上調(diào)去勢(shì)大鼠的骨密度。
[0052](7)不同濃度CG對(duì)去勢(shì)大鼠脛骨上段骨形態(tài)靜態(tài)參數(shù)的影響
[0053]各組骨形態(tài)靜態(tài)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1，與空白對(duì)照組相比，去勢(shì)大鼠組的Ar和Th均極顯著性的降低(P≤0.01)，Sp顯著性的升高(P≤0.05)，與去勢(shì)大鼠組相比，CG高低濃度組極顯著的上調(diào)了 Ar和Th (P≤0.01)，并且抑制了 Sp (P≤0.05)，表明CG對(duì)去勢(shì)大鼠脛骨上段骨形態(tài)靜態(tài)參數(shù)有所改善。
[0054]表1不同濃度CG對(duì)去勢(shì)大鼠脛骨上段骨形態(tài)靜態(tài)參數(shù)的影響
【權(quán)利要求】
1.毛蕊異黃酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷在制備促進(jìn)骨形成藥物中的用途。
2.毛蕊異黃酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述藥物為藥物組合物，它含有有效劑量的毛蕊異黃酮-7-氧_β -D-吡喃葡萄糖苷以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61K31/7048GK104013637SQ201410152531
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】孫麗娟, 簡(jiǎn)靜, 程尋, 陳勇, 韓鳳梅 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)